Determinarea dioxinelor polychlorinated dibenzo-p-

dioxins(PCDD), polychlorinated dibenzo-d-furans (PCDF) si

polychlorinated biphenyls in laptele de bivolita

Francesca Santelli · Floriana Boscaino · Domenico Cautela · Domenico

Castaldo · Antonio Malorni

Received: 1 April 2005 / Revised: 20 June 2005 / Accepted: 2 July 2005 /

Published online: 21 January 2006

In total au fost analizate 43 de mostre de lapte aduse din 40 de laptarii din sudul

Italiei, din regiunea Caserta, din supermarket-urile Reggio Calabria.

Metoda de extractie si de curatare s-a dovedit eficienta in a separa PCDD/Fs si

PCB de alte componente care ar putea interfera cu analiza instrumentala.

Analiza a fost efectuata folosind o metoda de dilutie izotopica in asociatie cu

cromotografia de gaze de inalta rezolutie-spectrometria de masa de inalta rezolutie.

Cinci din alte 41 de mostre analizate au aratat arderi ale toxicitatii mai mari decat

maximul limitei legale. In martie 2003 mai multor ferme din aceasta regiune le-au fost

confiscate produsele contaminate cu dioxina de catre autoritatile locale din cauza

posibilei raspandiri ale contaminarii si pericolul pentru sanatatea publica.

Polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDD) si polychlorinated dibenzo-p-furans

(PCDFs), cunoscute si ca “dioxine” si “dioxin-like” polychlorinated byphenyls (PCB)

sunt contaminanti organici extrem de stabili si de omniprezenti in mediu. Acestia sunt

lipofili si hidrofobi, motiv pentru care sunt concentrati in tesuturile grasoase si se

raspandesc in lantul trofic.

Materiale si metode.

Materiale

-hexan, toluen, diclorometan si nonane

-silica gel - a fost spalat cu diclorometan si activat peste noapte la cuptor la 130º

C. Granule de hidroxid de potasiu au fost cumparate din Applichem (Darmstadt,

Germania) si folosit pentru a prepara gelul silica modificat cu o baza. Acid sulfuric

concentrat, adus din Milan, Italia, a fost folosit pentru a prepara gel silica modificat cu

un acid. Ambele au fost preparate in laborator cu gel silica activat.

-carbon activ – obtinut din Milan, Italia (Carlo Erba Reagents)

-alumina bazica din Fluka (Steinheim, Germania). A fost activata intr-un cuptor la

400-450º C, peste noapte, si folosit in ziua activarii.

Prepararea mostrelor

O portie de mostra de aproximativ 1 litru de lapte a fost folosit pentru analiza.

Mostrele au fost omogenizate, inghetate la -20ºC, uscate folosind un Heto Lyolab3000 ,

omogenizat din nou si depozitat la tempreatura camerei pana la efectuarea analizei.

Cantitatea de grasime din mostra a fost determinata prin metoda AOAC.

Figura 1. PCDD/Fs and PCDD/Fs+ PCBs upper levels WHO-TEQ pg/g fat in buffalo’s Milk samples

Tabel 1. Metoda de analiza

Factori care influenteaza nivelul de contaminare a laptelui matern cu compusi organici poli-clorurati

J. M. C. Albers L*, I. A. Kreis 2, A. K. D. Liem 3, E van Zoonen 3

1 Department of Chronic Disease and Environmental Epidemiology, National Institute of Public Health and Environmental Protection, Bilthoven, The Netherlands2 Illawara Public Health Unit, University of Wollongong, Keiraville NSW, Australia3 Laboratory of Organic-Analytical Chemistry, National Institute of Public Health and Environmental Protection, Bilthoven, The Netherlands

Received: 25 February 1995/Revised: 27 July 1995

Compuși organici policlorurați (POC) sunt acumulati in tesuturile cu un continut bogat

de grasimi. Bebelusii nou nascuti sunt expusi la POC prin grasimile din laptele matern.

Nivelele de expunere sunt estimate a depasi limitele acceptabile pentru doza zilnica pe

parcursul vietii. Cu toate acestea, mamele sunt inca incurajate sa alapteze.

In 1988, un studiu privind contaminarea laptelul matern cu POC a fost efectuat in Olanda.

Pesticide organoclorine, opt bifenili policlorurati(PCB) congeneri, 17 dibenzodioxin

policlorurata(PCDD) si –dibenzofuran (PCDF) au fost determinati folosindu-se tehnicile

de cromatografie cu gaz cu captura de electroni sau detectare cu spectrometrie de masa.

Informatii privind unii factori ce ar putea influenta nivelul contaminarii laptelui au fost

obtinute prin chestionare. Pentru a investiga asociatii intre factorii determinanți

și contaminanții specifici a fost utilizata analiza de regresie. Aceasta a aratat ca varsta

memei este asociata cu concentratiile POC. O dieta omnivora traditionala a fost asociata

cu concentratii scazute de POC comparativ cu alte tipuri de diete.

Materiale si metode

Strategia prin mostre

In sistemul ostretical olandez, majoritatea femeilor prefera sa fie acasa in momentul

nasterii fatului sau, cel putin, cat mai repede posibil dupa. Ingrijirea post-natala in Olanda

este organizata de centrele maternale. Pe perioada ingrijirii post natale exista un contact

strans intre un centru maternal si o mama care alapteaza. Astfel s-a decis colectarea de

mostre in cooperare cu centrele maternale. Bazat pe distributia geografica si gradul de

urbanizare, 30 de centre au fost invitate sa coopereze in proiect. In fiecare centru, toate

femeile care au nascut pe 1 martie 1988 sau dupa au fost invitate sa participe.

Recipientele pentru mostrele de lapte au fost asigurate de laborator. Pentru controlul

puritatii sticlariei, rectivilor si a solventilor folositi in timpul preparatii mostrelor ,

recipientele goale au fost analizate inaintea analizarii seriilor de mostre. Fiecare

respondent a primit un chestionar si un recipient (cu o substanta e conservare). Numerele

persoanelor le-au fost oferite aleatoriu. Respondentii au fost rugati sa colecteze 100 ml de

lapte si sa ofere informatii despre data nasterii mamei si a copilului, durata sarcinii,

greutatea copilului la nastere, numarul total de copii alaptati, perioada de lactatie

cumulata in care ceilalti copii au fost alaptati, greutatea dinaintea sarcinii si dupa sarcina,

inaltimea mamei, dieta, consumul de peste, educatia, ocupatia si locul de resedinta.

Analiza a fost bazata pe extractia mostrei, urmata de purificarea extractului de grasime si

analizarea folosind tehnici de cromatografie cu gaz. Extractia mostrelor au urmat o

schema comuna pentru toate reziduurile ce au fost analizate. Aceasta a inclus o extractie

lichid-lichid cu acetona si eter de petrol pentru a izola fractia de grasime. Analiza

dioxinei si al furnanului a fost executata intr-o selectie de 120 de mostre (10 maternitati x

12 mostre). Formarea mostrelor s-a realizat folosind folosit 40 ml de alicot pentru

compunerea a 10 mostre.

Factori

determinanti

Numar de

observatii

Min-Media-Maxim Media- 90 la suta

Varsta la care a

nascut (ani)

329 21-30-43 30-35

Perioada de lactiati

cumulata (luni)

178 1-8.2-33 7-18

IMC post-sarcina

(kg/m²)

290 17.0-23.9-35.5 23.4-28.1

Durata sarcinii

(saptamani)

326 36-40-43 40-41

Studiu de intercomparare al laptelui praf fortificat cu PCDD și PCDF

H. Schimmel 1, B. Griepink 1, E.A. Maier 1, G.N. Kramer 2, A.H. Roos 3, and L.G.M.T. Tuinstra 3

1 Commission of the European Communities, Community Bureau of Reference, 200 Rue de la Loi, B1049 Brussels, Belgium2 Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM), B-2440 Geel, Belgium3 State Institute for Quality Control of Agricultural Products (RIKILT-DLO), P.O. Box 230, NL-6700 AE Wageningen, The NetherlandsReceived April 26, 1993

Pentru a afla stadiul tehnicii analizei dioxinei in laptele de vaca BCR a fost

organizata o comparative intre laptele praf natural si laptele praf fortificat.

Laboratoarele (11 la numar) au utilizat propriile metode si standarde.

Determinarea diozinelor este dificila. In laptele de vaca izomerii substituiti trebuie

determinati. Diozinele solubile in grasime trebuie extrase din matrice. In literatura au fost

descrise mai multe proceduri pentru obtinerea unui extract suficient de pur pentru

determinarea finala utilizand spectrometria de masa cromatografica de gaze capilara.

Curatarea necesita doi pasi cromatografici, bazati pe principii diferite. In ultimii 3-4 ani

folosire spectometriei de masa de inalta rezolutie a fost preferabila.

Prepararea

A fost necesar: lapte natural (lot A), lapte slab fortificat (lot b) si lapte mediu

fortificat (lot C). O solutie de dioxina, continand 12 izomeri, preparat la SCK (Studie

Centru voor Kernenergie) Mol, Belgium a fost folosita pentru imbogatirea laptelui cu

dioxine. Pentru prepararea laptelui pentru lotul A s-a folosit ulei de unt natural. Pentru

lotul B si C s-a adaugat 500g de ulei de unt natural si s-a amestecat complet pana la

omogenizare.

Ambelei uleiuri de unt fortifiate si un lot de ulei de unt original natural au fost

transportate catre NIZO (Netherlands Institute for Dairy Research) pentru prepararea a

trei loturi de lapte praf.

Lotul A a fost pregatit prin adaugarea de 16 kg de ulei de unt original natural in

384 kg de lapte degresat. Omogenizarea a fost efectuata la o temperatura de 60º C la o

presiune de 200 bari intr-o prima parte, iar apoi la o persiune de 10 bari in a doua parte.

Aceleasi conditii au fost folosite si pentru loturile B si C.

Lotul B a fost pregatit prin adaugarea de 15.5 kg de ulei de unt original natural in

384 kg de lapte degresat si 494.4 g de ulei de unt fortificat continand 4.3795g de solutie

de dioxina.

Lotul C a fost pregatit prin adaugarea de 15.5 kg de ulei de unt original natural in

384 kg de lapte degresat si 498.6g de ulei de unt fortificat continand 4.795 g de solutie de

dioxina.

Din fiecare lot, 80 de litrii de lapte au fost separati pentru liofilizare (uscarea prin

congelare). Laptele pasteurizat a fost trimis la IRMM, Geel , Belgia, in bidoane de

polietilena bine sigilate. Cele trei loturi au fost depozitate pentru maxim 3 zile la 4º C.

Tabel 1. Concentratia de PCDD/F intr-un mix standard

Izomer Concentratie (ng/g)

2378TCDD12378 PCDD123478 HCDD123678 HCDD123789HCDD2378 TCDFF12378 PCDF23478 PCDF123478 HCDF123678 HCDF123789HCDF234678 HCDF

D48 D 54 D66 D67 D 70 F 83 F 94 F I14 F 118 F 121 F 124 F 130

6.4815.408.2523.078.117.620.8533.5019.4917.520.4622.35

Tabel 2. Metode de curatare si de fractionare (numerele din tebel dau secventa de aplicatie)Lab. No.

A B C D E F G H I J K L M N O P

1 - - - - 1. - - - 3. - - - - 2. - -

2 - 3. - - - - - - - - - - 1. - 2. -

3 - - 2. - - - - - - - - - 3. - - 1.

4 - 2. - - - - - - - - - - 1. - - -

5 5. - - - 1+2 - - - - 4. - - - 3. - -

6 - 3. - - - - - - - - - - 2. - - 1.

7 - 3. - 2. - - 1. 4. - - - - - - - -

8 - 3. - - - 2. - - - - - - 1. - - -

9 - 2+4 - - - - - - - - 1. 3. - - - -

10 4. - - - - - - - - 3. - -- 2. - - -

11 - 3. - 1. - - - - - - - 2. - - -

A, alumină acidă; B, alumină bazică superactivă; C, alumină bazică ( 7 % apă); D, dioxid de siliciu; E, K2SiO3- dioxid de siliciu; F-AgNO3-dioxid de siliciu; G-40% H2SO4-dioxid de siliciu agitat; H- 40% H2SO4 dioxid de siliciu; I-40% H2SO4 –dioxid de siliciu/ K2SiO3- Florisil; J, Cs-silicat/H2SO4-dioxid de siliciu; K, 33% NaOH- dioxid de siliciu/44% H2SO4- dioxid de siliciu (1:10); L, 33% NaOH-dioxid de siliciu/act. dioxid de siliciu/44% H2SO4-dioxid de siliciu/22% H2SO4-dioxid de siliciu (11.2: 1: 14.6:20); M, carbon activ; N, carbon activate pe fibri de sticla; O, reflux extraction; P, GPC (BioBeads SX3)

Determinarea dioxinelor / furanilor prin gaz-

cromatografie cuplatã cu spectrometrie de masã

S-au fãcut investigatii privind nivelul de PCDD si PCDF continut în uleiuri de motor, în uleiuri prerafinate si soluri contaminate cu deseuri de ulei [16], dar si asupra emisiilor de dioxinã, furani sau PCB de tip dioxinã provenite de la sinterizarea fierului în Anglia, de la tratarea termicã a deseurilor solide sau de la un incinerator din Danemarca . Aceste studii, ca si multe altele, au în vedere reducerea compusilor organici în emisii gazoase si materii reziduale provenite din incinerarea deseurilor (utilizând adsorbanti de cãrbune), precum si controlul emisiilor în instalatiile de tratare a deseurilor (utilizând senzori de detectie specifici).

Tehnica folositã în analiza poluantilor organici persistenti (POP) este cromatografia, care reprezintã o metodã de separare a componentilor unui amestec. Au fost utilizate pânã în prezent metode de separare de tipul lichid-lichid (NP-LC; RP-LC), lichid-solidã (LC), gaz-lichid (GC), gaz-solid (GC), cu fluide supercritice (SFC).

Una dintre etapele standard de analizã a poluantilor organici persistenti este extractia. Tipurile de extractie care au fost utilizate au fost lichid / lichid, în fazã solidã, cu Soxhlet, cu fluide supercritice, cu ultrasunete.

Pentru identificarea si cuantificarea probelor sunt utilizate gaz cromatografia de înaltã rezolutie cuplatã cu spectrometria de masã de înaltã rezolutie (HRGC/ HRMS) pentru separare si detectare, combinatã cu dilutia izotopilor din probã la diferite trepte pentru a cuantifica PCDD/ PCDF din probã.

În prezent, aceastã tehnicã oferã suficientã sensibilitate, selectivitate si specificitate pentru determinarea cantitãtilor exacte de PCDD/ PCDF din proba prelevatã. Parametrii gaz cromatografiei oferã informatia pentru identificarea izomerilor (pozitia atomului de clor) în timp ce parametrii spectrometriei de masã permit diferentierea între congenerii omologi ai dibenzo-p-dioxinelor policlorurate si dibenzofuranilor cu un numãr diferit de substituenti de clor. Spectrometrul de masã foloseste tehnica impactului electronic.

Lucrãrile efectuate demonstreazã o deosebitã preocupare a cercetãtorilor asupra acestei problematici privind dioxinele, cercetãrile efectuate necesitând o gamã de metode utilizate în studiul acestora, însã experimentele de laborator efectuate rezidã în acuratetea aspectului privind identificarea si cuantificarea dioxinei.

Partea experimentalãMateriale si metodãDioxinele analizate în aceastã lucrare au fost prelevate din emisiile provenite de la

incineratoare (gaz prelevat din incinerator izocinetic) pe un filtru corespunzãtor sistemului de prelevare.

Toate pãrtile sistemului care intrã în contact cu fluxul de gaz sunt din cuart (ele putând fi si din sticlã sau titan).

Filtrul este marcat prin distribuirea solutiei standard de prelevare si plasat în spatele duzei (în cos) sau dupã sondã (în afara cosului), acesta este tinut sub temperatura de 125oC, dar la o temperaturã mai mare decât cea a punctului de rouã din fluxul de gaz. Un condensor este atasat în partea de jos a sistemului pentru a rãci proba de gaz.

Pãrtile gazoase si sub formã de aerosoli ale PCDD/PCDF sunt captate de adsorbanti solizi.

Adsorbantii solizi folositi au fost XAD-2, spumã uretanicã sau alti adsorbanti solizi (exemplu: Porapak PS), iar ca absorbanti lichizi s-au utilizat 2-metoxietanol, 2-etoxietanol sau 2,2- oxibisetanol (dietilen glicol).

Parametrii de lucruVolumul minim de gaz prelevat este de 4 m3/h (pentru a atinge limita de

detectie).Timpul minim de prelevare este 6 h, iar cel maxim 8h. Marcarea liniei de

prelevare se face cu 13C12 (masele standardelor adãugate sunt 400 pg pentru PeCDF si HxCDF si 800 pg pentru HpCDF, fiecare pe o bazã de 10 m3 de volum de gaz (gaz uscat) si pentru a mãsura concentratia de 0,1 ng I-TEQ/m3; solutia standard de prelevare contine 4% tetradecan ca antioxidant si trebuie sã aibã un volum de cel putin 100 l.

Fatorul echivalent toxic international (I-TEF) stabilit pentru 2,3,7,8-TCDD este 1.

Prelucrarea probelorExtractia este prima operatiune pentru a izola PCDD/ PCDF din probã si a-i

colecta într-un solvent de un volum corespunzãtor.Procedurile de extractie folosite în aceste experimente sunt bazate pe extractia

„soxhlet” a filtrantilor si adsorbantilor si pe extractia lichidã a produsilor de condensare.Purificarea probelor colectate pentru acest studiu s-a realizat prin tehnica de

cromatografie în multi -coloane, utilizând un sir de adsorbanti, urmãrindu-se astfel îndepãrtarea componentilor matriceali din proba primarã extrasã care pot supraîncãrca metoda de separare, perturbã cuantificarea sau au un impact asupra performantei metodei de identificare si cuantificare. Purificarea are ca rezultat o îmbogãtire cu substantele de analizat în proba finalã.

Pentru a realiza o limitã de detectie bunã, extractul de probã purificatã a fost concentrat la un volum de 50 mL.

Aparatura de analizãAparatura pe care s-au executat analizele este cuplajul gaz-cromatograf

spectrometru de masã, tip Varian Saturn 3900/2100T. Gaz cromatograful este echipat cu injector split-splitless, coloanã capilarã Factor Four VF-5 ms, cu di = 0,25 mm, L = 30 m, film fazã stationarã = 0,25 m.

Regimul de temperaturã al coloanei 60 (1min) - 15oC/ min – 300 (13min)Temperatura injectorului = 250ºCGaz purtãtor Heliu calitate 6.0 (ultrapur) Întârzierea de pornire (sd) = 3 min.Splitare 2 mL/min. pânã la 4 minute apoi 25 mL/min. Spectrometrul de masã are

detector trapã ionicã cu o sensibilitate de 10 pg HCB (hexaclorbenzen).

Rezultate si discutiiIdentificarea poluantilor organici clorurati persistenti, respectiv dioxine si furani,

se realizeazã folosind gaz-cromatografia cuplatã cu spectrometria de masã (GC-MS) prin scanare MS de rezolutie înaltã folosind tehnica impactului cu electroni (EI). Prezenta si concentratiile izomerilor specifici, cum este 2,3,7,8 - TCDD, pot fi determinate din rapoartele anumitor fragmente de masã.

Nivelul de emisie al PCDD/PCDF provenite de la surse fixe (incinerator) este de aproximativ 0,1 ng I-TEQ/m3 si o concentratie în pulberi de la 1 pânã la 15 mg/m3.

Legislatia impune ca PCDD/PCDF sã nu depãseascã 0,1 ng I- TEQ/m3; în mediu, PCDD/PCDF apar ca un amestec complex asociat cu alti compusi înruditi structural, cum ar fi PCB.

Determinarea de PCDD/PCDF se bazeazã pe cuantificarea prin tehnica dilutiei izotopice, folosind GS/ MS. Izomerii 2,3,7,8 clor PCDD/PCDF cu carbon marcat 13C12 sunt adãugati în diferite etape pe parcursul metodei. Pierderile care au loc în timpul extractiei si purificãrii pot fi detectate si compensate prin utilizarea izomerilor marcati ca etaloane interne si care se cuantificã o datã cu etaloanele injectate înainte de analiza la GC/MS.

Scopul pentru care se folosesc standardele marcate este acela de a identifica anomaliile care pot apãrea pe timpul prelevãrii. Acestea nu sunt folosite pentru cuantificare.

Pentru determinarea poluantilor organici persistenti, respectiv a dioxinelor si identificarea lor în cantitãti foarte mici, s-au prelevat si urmãrit probe din diferite locatii ale aceleiasi zone.

Figura 1. Prelucrarea cromatogramei de dioxina standard.

Figura 2. Spectrul dioxinei standard.

În cadrul acestui studiu s-a realizat prelucrarea cromatogramei de dioxinã standard (fig. 1), oferind astfel posibilitatea ca pe baza ionului caracteristic (cu sarcina specificã m/z = 322) sã se obtinã spectrul dioxinei standard (fig. 2), precum si identificarea dioxinei în bibliotecile standard NIST si WILEY.

De asemenea s-a prelucrat cromatograma dioxinei marcate cu 13C12 si spectrul de masã al acesteia, intensitatea ionului molecular cu sarcina specificã m/z = 334, fiind maximã ca si în cazul spectrului de masã realizat pentru fragmentul de masã m/z = 322.

Probele au fost prelucrate si studiate în raport cu standardul de dioxinã 2,3,7,8, tetraclorodibenzo-p-dioxinã. Prelucrarea acestor probe s-a realizat aplicând o metodã originalã, aceea de extractie a ionului molecular cu sarcina specificã m/z = 322 din cromatograma pentru 2,3,7,8, tetraclorodibenzo-p-dioxinã, urmãrindu-se astfel absenta sau prezenta de dioxinã si concentratia acesteia în analiza probelor prelevate.

Figura 3. Comparatie intre spectrul elalon si proba prelevata.

Figura 4.Cromatograma probei “DIOXIN” prelevata de la un incinerator. Extractia ionului molecular cu sarcinã specificã m/z = 322

Figura 5. Cromatograma prelucrata a probei “DIOXIN”

Figura 6. Spectrul dioxinei rezultat din prelucrarea picului de bazã

În figura 4 este redatã cromatograma extractiei ionului molecular cu sarcina specificã m/z = 322, putându-se realiza astfel cromatograma prelucratã a probei “DIOXIN” (fig. 5) prin urmãrirea fragmentului caracteristic 322, care se afã în zona finalã a picului de bazã cu timp de retentie 16,391 min.

S-a obtinut, de asemenea, spectrul de masã al dioxinei rezultat prin prelucrearea picului de bazã cu timpul de retentie 16,437 min. (fig. 6)

Experimentele efectuate demonstreazã eficienta optimã a metodei utilizatã în acest studiu pentru identificarea si determinarea concentraþiei de dioxinã în urme. Astfel, proba de dioxinã standard are aria de 83990 (u.a) corespunzãtoare la 1ng/m3, iar în proba “DIOXIN” aria este de 10626 (u.a), indicând o concentraþie de dioxinã sub 1ng/m3, respectiv de 0,1265 ng/m3.

Concluzii

Pentru determinarea concentratiei de dioxinã în probele prelevate, precum si pentru determinarea nivelului de contaminare al unei suprafete de sol cu dioxinã s-a utilizat metoda extractiei ionului de fragmentare m/z = 322 din cromatogramã pentru 2,3,7,8, tetracloro-dibenzo-p-dioxinã.

Experimentele efectuate asupra probei “DIOXIN” prelevatã din altã locatie a aceleiasi zone aratã o concentratie de dioxinã de 0,1265 ng/m3.

Metoda dovedeste astfel eficientã optimã pentru determinarea concentratiei de dioxinã în urme, gãsindu-se cã în proba “DIOXIN” concentratia de dioxinã este sub 1ng/m3.