determinación de la curva de crecimiento por modelo de gompertz

DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA

Sacharomyces cerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE LOS PRODUCTOS

AGROINDUSTRIALES

PROFESOR: ING. SÁNCHEZ GONZALES, JESÚS ALEXANDER

CICLO: IX

HORARIO: JUEVES 11-1PM

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

TRUJILLO-2012

Determinación de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando el modelo de Gompertz UNT

INTEGRANTES

ALFARO LAYZA MASSIEL

AROCA CASTILLO RONALD

BANCES NÚÑEZ PEDRO

CALDAS REYES PATRICIA

CERQUÍN RODRÍGUEZ DIEGO

COLLANTES ARANA LUIS

ESQUIVEL PEREA VIRGINIA

ESPINOZA ROMERO DIEGO

GORDILLO SILVA CARLOS

GUERRERO MEDINA NEIVER

GUTIERREZ MARIN VIVIANA

IZÁZIGA LUNA NARDY

JARA PONTE ANÍVAL

LEÓN PICÓN BRUCE

LÁZARO HARO DANNY

LUCAS FLORES YOVEN

MARTÍNEZ SALDAÑA YURICO

MÉNDEZ SOSA JIMMY

MORALES NARVÁEZ CARLOS

RODRÍGUEZ ANTICONA ROBERTO

RODRÍGUEZ LEÓN ANDRÉ

SANTILLÁN HONORIO HILBAR

VARGAS RAFAEL ANGIE


DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA

Sacharomyces cerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

I. INTRODUCCIÓN:

La microbiología predictiva de alimentos (MPA) es un área multidisciplinaria

emergente de la microbiología de alimentos, que surge como alternativa a la

necesidad de acortar tiempos de respuestas, reducir costos económicos,

reemplazar metodologías dispendiosas y disminuir la laboriosidad en los análisis de

la microbiología clásica de alimentos. Es un área multidisciplinaria ya que abarca

distintas disciplinas como la microbiología, matemática, estadística, informática,

bioquímica, etc., con el fin de desarrollar y aplicar modelos de simulación que

permitan predecir las respuestas de los microorganismos ante diversos factores

medioambientales.

La microbiología predictiva se basa en la siguiente premisa: “las respuestas de los

microorganismos ante los cambios en los factores ambientales pueden ser

reproducidas de forma controlada en el laboratorio”, de esta forma, a través de

diversos modelos es posibles posible predecir cuál será el comportamiento de estos

microorganismos cuando cambian las condiciones ambientales que les rodea.

Los modelos matemáticos considerados en el ámbito de la microbiología predictiva

se pueden clasificar según distintos criterios, usos y finalidades. Existen modelos

probabilísticos (que permiten estimar los límites de crecimiento/no crecimiento o

producción/no producción de toxina), modelos cinéticos de crecimiento, de

supervivencia o de inactivación (para determinar el número de microorganismos en

función del tiempo). Tras ajustar la curva de crecimiento microbiana mediante

funciones matemáticas (modelos primarios) y estudiar sus parámetros según

cambios en las condiciones ambientales (modelos secundarios), es posible

modelizar el comportamiento microbiano en función de la temperatura, el pH, la

actividad del agua y otros factores, independientemente del alimento y a partir de

estos datos predecir lo que sucederá durante el almacenamiento, procesado, etc.


II. OBJETIVOS

Preparar medios de cultivo y manejar adecuadamente la autoclave.

Confeccionar la gráfica de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae

mediante el modelo de “GOMPERTZ.”

Se conoció el modelo de Gompertz para el cálculo de la curva de crecimiento

de las levaduras.

Identificar cada una de sus fases.

Calcular el Tiempo de Generación por el método gráfico.

III. MARCO TEÓRICO

A) FORMULACIÓN DE MEDIOS DE FERMENTACIÓN

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una

etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Donde los

componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza

química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con

los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además

suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.

No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los

nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las siguientes

categorías de componentes:

a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que están

representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.

b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo,

Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o

microgramos por litro.

c) Factores de crecimiento, que están constituídos generalmente por componentes

orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni

metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función


metabólica específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no

saturados, etc.

Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los

componentes, en:

Medios sintéticos o medios químicamente definidos.

Medios complejos, en cuya composición intervienen sustancias de origen

animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz,

harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas,

pero que son químicamente indefinidas y de composición variable

B) CRECIMIENTO CELULAR

Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos porque

es necesario poder predecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir

consumiéndose el substrato y cómo se va a ir acumulando el producto de una

fermentación. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un

fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que

no podemos predecir qué va a pasar, cuándo va a completarse el crecimiento, cómo

se va a acumular el producto, etc.

Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado

van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez

que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en

cuanto han podido duplicar su masa y su material genético. El tiempo que tarda una

célula en hacer. Cada vez que transcurre un tiempo de generación, el número de

células se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.

Si llamamos N0 al número de células inicial, y g al número de generaciones

transcurridas, el número de células final (N) será:

Llamando T al tiempo de generación y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuación

anterior puede transformarse en la siguiente:

⁄


Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente, por ello

es mejor transformarlas en algo más simple, como puede ser una recta.

Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los

dos términos y resulta:

Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón

de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generación T es muy grande, el

crecimiento tendrá poca pendiente (será lento) y si T es pequeño el crecimiento será

rápido.Esto es: el incremento en el número de células, en la biomasa de cultivo y en

la acumulación de metabolitos primarios, proteínas, ácidos nucleicos etc., es

paralelo.

Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número

de células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que

describe la cinética es la siguiente:

Esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es

proporcional al número de células presentes en el cultivo (N). A la constante de

proporcionalidad (µ) se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo

así como la probabilidad de que una célula se divida en un tiempo determinado la

transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo

siguiente:

Esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente

con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad µ. Comparando esta

ecuación con la similar presentada más arriba, podemos concluir que µ = ln2/T y,

por consiguiente, que T = ln2/µ. Es decir, que hay una correlación inversa entre el

valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo de generación.


Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa

celular, etc. después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ; o bien, poder

calcular la tasa de crecimiento µ a partir de medidas experimentales del incremento

en el número de células, biomasa, etc.

Figura 1. Crecimiento celular

El gráfico representa la variación de la biomasa (o número de células, etc.) de un

cultivo (línea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un

substrato cuya concentración (línea azul) decrece de forma proporcional al

crecimiento de la biomasa.

C) CINÉTICA DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA

Una fermentación aeróbica tipo batch o discontinua puede ser considerada como

un sistema cerrado. En el tiempo inicial el medio de cultivo estéril dentro del

fermentador se inocula con microorganismos y la incubación se da bajo condiciones

fisiológicas óptimas. En el transcurso de toda la fermentación, solo se adiciona

oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante, y un ácido o base para el

control del pH, con el fin de garantizar las condiciones óptimas de operación que

permitan obtener una alta concentración celular. La composición del medio de

cultivo, la concentración de biomasa, y la concentración del metabolito cambia

constantemente como resultado del metabolismo celular. En el transcurso de la

fermentación hay 4 fases de crecimiento, por las cuales pasa el microorganismo a

través el tiempo, como se muestra en la figura 4: fase lag, fase exponencial, fase

estacionaria y fase de muerte (Sánchez, 2003).

Figura 2. Curva de crecimiento de los microorganismos.

Fase Lag o de adaptación: también llamada fase de latencia. Cuando las

células son transferidas de un medio a otro, no hay inicialmente un incremento

en el número de células. Durante esta fase los microorganismos se toman un

tiempo para adaptarse a su nuevo ambiente fisicoquímico y en ocasiones se

sintetizan nuevas enzimas o componentes estructurales (Sánchez, 2003;

Duarte, 1998). La duración de esta fase puede variar dependiendo del

crecimiento de las células en el inóculo, el cual debe tener una edad tal que la

mayor parte de las células que contiene deben encontrarse en fase exponencial

y metabólicamente activas (Barrera, 2004). Es recomendable utilizar inóculos

entre aproximadamente 5 y 10% del volumen total del reactor con el fin de

reducir el tiempo de latencia (Soto, 2004).

Fase Exponencial o log: Al finalizar la fase lag, las células se han adaptado a

las nuevas condiciones de crecimiento. En este punto las células se reproducen

sin limitación de sustancias nutritivas a velocidad máxima. El crecimiento de las

células se puede describir cuantitativamente como la duplicación del número de

células o biomasa por unidad de tiempo. A través de esta fase las células

alteran el medio constantemente tomando los sustratos y excretando los

productos metabolizados. El crecimiento permanece constante durante esta

fase. La velocidad de crecimiento es independiente de la concentración de

sustrato mientras exista sustrato en el medio y se correlaciona con la velocidad

de crecimiento específico μ y la concentración de células x [células/ mL] según

la ecuación número 1.

(1)


La velocidad de crecimiento específico μ, es generalmente una función de tres

parámetros: la concentración del sustrato limitante S , la tasa de crecimiento

máxima max μ , y la constante especifica de sustrato s K , en cuya concentración

se obtiene la mitad de la máxima velocidad específica de crecimiento (μ = 0.5 máx.

μ ). Esta relación puede ser expresada por medio de la ecuación de Monod (2):

La velocidad máxima de crecimiento específico max μ es de considerable

importancia a nivel industrial, debido a que es en este punto donde se obtiene el

valor máximo de μ a niveles de saturación de sustrato, relacionando la dependencia

de los microorganismos con las condiciones del fermentador, donde a medida que

aumenta la densidad de población decrece la concentración del sustrato limitante

del crecimiento, causando un descenso de μ . Fase estacionaria: ocurre cuando se

agota una sustancia nutritiva y el sustrato se ha metabolizado, cuando se han

formado sustancias tóxicas o ha ocurrido un cambio de condiciones como pH,

temperatura y concentración de oxígeno disuelto. El crecimiento celular desciende

lentamente o para completamente y en el caso en el que aun pueda estar

ocurriendo crecimiento, este se contrarresta por la rapidez de muerte o lisis celular.

La biomasa incrementa sólo gradualmente o permanece constante durante la fase

estacionaria, aunque la composición de las células puede cambiar (Sánchez, 2003;

Duarte, 1998).

Fase de muerte: también llamada fase de decaimiento. En esta fase la reserva

de energía de las células se ha acabado, debido a condiciones de inanición o

como consecuencia del metabolismo de mantenimiento de algunas células. El

tiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte depende del

microorganismo y el proceso utilizado (Sánchez, 2003; Duarte, 1998).

D) CONSUMO DE SUBSTRATOS LA LEVADURA Sacchharomyces cerevisiae

La levadura Sacchharomyces cerevisiae es capaz de asimilar una gran variedad de

monosacáridos. También puede hidrolizar y consumir algunos carbohidratos

mayores, como la sacarosa, maltosa, rafinosa, maltotriosa y pectina, pero carece de

las enzimas necesarias para utilizar la lactosa, el glucan y el almidón. Estos últimos

(2)


substratos deben ser desdoblados previamente, ya sea por hidrólisis ácida y calor

(pH 2.5), o por la actividad de enzimas exógenas de origen microbiano o vegetal:

lactasa, glucanasa, a y b-amilasas o glucoamilasa. En los mostos de procesos

industriales, las concentraciones de carbohidratos fermentables fluctúan

generalmente entre 6-12% (p/v).

Los carbohidratos asimilados son degradados y oxidados durante el catabolismo a

través del ciclo de la Glucólisis (o vía Embden-Meyerhof-Parnas). La levadura

aprovecha la energía liberada de cada mol de glucosa: para formar dos moles de

ATP y los usa en la etapa anabólica. El ciclo se estabiliza al reducir finalmente dos

moles de NAD+, mientras forma los productos de la fermentación.

Además de la fuente de carbono, la levadura requiere que el medio de cultivo tenga

fuentes apropiadas y suficientes de otros macronutrientes: N, O, H, S y P; de

micronutrientes: Na, K, Ca, Mg, Mn y Fe; de elementos traza y de vitaminas. Se ha

observado un mejor aprovechamiento del nitrógeno cuando sus fuentes son

aminoácidos libres o péptidos pequeños, en comparación con las proteínas, porque

las proteasas de la levadura tienen actividad limitada.

La velocidad de consumo de substrato limitante (fuente de carbono) está ligada

directamente a la velocidad de crecimiento de la levadura. Al entrar en la célula, el

substrato tiene tres destinos: para funciones de mantenimiento, para crecimiento

microbiano y para la formación de productos excretados. En un cultivo sumergido

discontinuo (cinética) la cinética de consumo de substrato limitante se representa

así:

⁄

⁄

⁄

⁄

Dónde:

qs: Velocidad específica de consumo de substrato

m: Tasa de mantenimiento

Velocidad de consumo de substrato para el crecimiento microbiano:

⁄


Velocidad de consumo de substrato para la formación de los productos ligados al

crecimiento microbiano:

⁄

E) CRECIMIENTO DE LA LEVADURA

El proceso de reproducción normal de Saccharomyces cerevisiae es asexual

(mitosis) y se llama gemación. En éste se observa la formación de yemas o

blastosporas que dan origen a nuevas células haploides al crecer. Sólo en

condiciones críticas se combinan dos células para formar un cigoto diploide, y

después de la reducción de cromosomas (meiosis) se forman 4 esporas sexuales

(ascosporas) que al germinar producen nuevas células haploides.

Saccharomyces cerevisiae es anaerobia facultativa, por lo que se obtiene un mayor

rendimiento de biomasa en aerobiosis que en anaerobiosis. El cultivo aerobio es

importante durante la propagación del inóculo, llamado también cultivo semilla

El cultivo principal se realiza en condiciones anaerobias o microaerófilas

El valor de la velocidad específica de crecimiento microbiano (m) en anaerobiosis

fluctúa entre: 0.13 y 0.408 h-1. El rendimiento aproximado de biomasa con respecto

al consumo de substrato en estas condiciones es:

Y el de producción de ATP es de:

⁄

F) CRECIMIENTO Y SÍNTESIS DEL PRODUCTO EN PROCESOS INDUSTRIALES.

Hay dos tipos fundamentales de productos metabólicos: primarios y secundarios. Un

metabolito primario es el que se forma durante la fase primaria del crecimiento del

microorganismo, mientras que un metabolito secundario es el que se forma cerca

del final de la fase de crecimiento, frecuentemente cerca de, o en la fase

estacionaria del crecimiento. Las diferencias entre un metabolito primario y un

metabolito secundario se ilustran en la imagen de la izquierda.


Metabolitos primarios microbianos.

Un proceso microbiano típico, en el que el producto se forma durante la fase

primaria del crecimiento, es el alcohol (etanol) obtenido por fermentación*. El etanol

es un producto del metabolismo anóxico de la levadura y de algunas bacterias y se

forma como parte del metabolismo de la energía. Debido a que el crecimiento sólo

puede tener lugar si puede producirse energía, la formación de etanol tiene lugar en

paralelo con el crecimiento.

Metabolitos secundarios microbianos.

Un tipo más complejo de productos industriales es aquel en el que el producto

deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase

estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan

metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos más comunes y más

importantes de interés industrial. Mientras que el metabolismo primario es

generalmente similar en todas las células, el metabolismo secundario presenta

claras diferencias entre un organismo y otro. Las características reconocidas del

metabolismo secundario son:

Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos

organismos.

Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el

crecimiento y la reproducción.

Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo

de estructuras estrechamente relacionadas.

Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproducción de

metabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados

como están al metabolismo primario, usualmente no se pueden

superproducir de una manera tan espectacular.


G) MEDIO DE CULTIVO.

La producción de levadura, requiere además de unas condiciones ambientales

óptimas, de una variedad de nutrientes esenciales y vitaminas (Gómez, 2003). Los

nutrientes existentes en los medios de cultivo dan a la célula microbiana todos los

ingredientes requeridos para que produzca más células semejantes a ella misma

(Ramírez y Pedroza, 2001). Por lo tanto, es conveniente considerar un diseño de

medio de fermentación que genere las mejores garantías de crecimiento, el mejor

desarrollo para el microorganismo y el máximo rendimiento de producción. El medio

debe satisfacer los requerimientos nutricionales y ambientales del microorganismo,

además de las restricciones técnico-económicas para minimizar los costos de

separación y purificación. La determinación de los requerimientos nutrimentales,

ambiéntales y la composición, dependen de la estequiometría de crecimiento y

formación de producto (Duarte, 1998).

En la Figura 3, se muestran los requerimientos básicos de nutrientes para los

microorganismos y las formas comunes de satisfacerlos en los cultivos

Figura 3. Requerimientos nutrimentales para los medios de cultivo

Determinación de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando el modelo de Gompertz

UNT

Los medios se clasifican de acuerdo a la naturaleza de los componentes, en: 1)

medios sintéticos o también llamados medios químicamente definidos y 2)

medios complejos, en cuya composición intervienen sustancias de origen

animal y vegetal, como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz,

harina de soya, de pescado, de sangre, extracto de carne, entre otros, que

aportan las sustancias fundamentales (macro y micronutrientes) (Ramírez y

Pedroza, 2001).

La formulación del medio tiene que ver con los aspectos cuantitativos,

estableciendo las concentraciones y cantidades de cada componente. Para

promover el crecimiento celular son requeridos factores esenciales en los

medios de cultivo como ciertos aminoácidos y vitaminas (Ramírez y Pedroza,

2001). En el caso de la célula de levadura, para su desarrollo ésta requiere de

nutrientes como el nitrógeno (sales de amonio, sulfato de amonio y urea),

fósforo (fosfato diamónico y ácido fosfórico), magnesio (sales de magnesio),

potasio, calcio, azufre, hidrocarburos y trazas de hierro, zinc, cobre, manganeso

y molibdeno (Guilliermond, 1920; CNMA, 1998). En cuanto a las vitaminas son

necesarias la biotina, inositol, ácido pantotenoico y tiamina (Asenjo, 1995;

CNMA, 1998).

Para la fabricación industrial de levadura de panadería las principales materias

primas son el cultivo puro de levadura y la melaza de caña que constituye la

principal fuente de carbono del medio de cultivo, debido a su alto contenido de

azúcares fermentables (45 a 55% en peso) en forma de sacarosa, glucosa y

fructosa (CNMA, 1998). A nivel de laboratorio S. cerevisiae se cultiva en medios

complejos que aportan a la célula los nutrientes necesarios para su crecimiento,

entre los que se destacan YM, Goering y Van Soest y el de Pell y Pschofield.

Sin embargo, la composición de los medios de cultivo debe ser constantemente

adaptada a los procesos de fermentación (Ramírez y Pedroza, 2001).


UNT

IV. MATERIALES Y METODOLOGÍA

A. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales

Sacarosa

Harina de soya

fosfato de amonio

Tiosulfato de sodio

Ácido fosfórico

Ácido cítrico

Agua destilada

Levaduras Fleshman

Equipo:

Microscopio

Cámara de Neubauer.

Bioreactor

Balanza analítica.

Cocina.

Otros:

Lámina cubreobjetos

Jeringa de carga

Balón

Vaso de precipitación


UNT

B. METODOLOGÍA

Procedimientos

Cálculos

En primer lugar se procedió hacer los cálculos el medio de cultivo, tomando en

cuenta las necesidades de la levadura Sacharomyces Cerevisae y teniendo

en cuenta que la levadora se trató de calcular un medio lo más natural posible.

Preparación del medio de cultivo (ver en Anexos)

Se procedió a pesar los materiales necesarios en base a nuestros cálculos,

para la preparación el medio de cultivo los cuales son los siguientes:

200g de sacarosa

100g de harina de soya

8.117g fosfato de amonio pentahidratado

8.96g Tiosulfato de sodio

469g Ácido fosfórico

800g agua destilada

En un recipiente se combinó los materiales, la harina de soya fue agregada

poco apoco y paralelamente se fue removiendo con el fin de que no quedase

ningún grumo por la harina de soya.

Enseguida se procedió a medir los grados Brix del medio, el cual fue de 20º

Brix y con un pH de 6.2, se ajustó el pH con Ácido cítrico hasta que llegase a

un pH de 5.

Luego esta solución se puso en un balón de vidrio con un corcho en la boca, el

cual tenía un pequeño orificio para el termómetro.


UNT

Paralelamente en una olla se puso a calentar agua hasta que llegue a una

temperatura de 50ºC.

A esta temperatura de 50ºC recién se puso el balón conteniendo el medio de

cultivo, y se siguió calentando hasta que la solución dentro del balón llegase a

80 ºC y se conservó a esta temperatura por 15min con el fin de pasteurizar el

medio de cultivo.

Luego se dejó enfriar el medio de cultivo hasta 30ºC.

Activación de las levaduras

Se hizo una solución de 20 ºbrix, con el fin de activar la levadura en polvo.

Se adiciono la levadura en polvo, se removió y se dejó reposar por unos

minutos.

Después de algunos minutos se notó rápidamente el crecimiento y la

activación de la levadura, puesto que la levadura la espuma que daba la

levadura (CO2) rebosó el vaso de precipitación donde se estaba

preparando el medio de cultivo.

Luego se hizo un recuento en la cámara de neubauer, pero no se pudo

contabilizar pues eran demasiadas. Motivo por lo cual se procedió a hacer

una dilución de 1/10 para que la concentración llegara 107 levaduras/mL

esto de acuerdo a las indicaciones del docente.

Crecimiento de las levaduras en el birreactor

Luego que se llegó a enfriar medio de cultivo a 30ºC recién se agregó las el

10% de levaduras en función al medio.

En seguida se agregó esta solución al birreactor, el cual estaba en

constante agitación.

Seguidamente por un lapso de 2 horas se extrajo muestra cada 15

minutos. La primera muestra extraída con una jeringa fue vertida en la


UNT

cámara de Neubauer sobre una laminilla y luego fue colocada en el

microscopio

Luego procedimos con un aumento de 40X se realizó el conteo respectivo

de células

Pasada ya las 2 horas las se iniciaron a extraer las muestras cada 30

minutos.

Después de unas horas el crecimiento de la población aumento

considerablemente por ello se consideró realizar una dilución 10 -1.

Finalmente se procede a realizar la respectiva curva de crecimiento para la

producción de levadura.


UNT

V. RESULTADOS DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA Sacharomyces

cerevisae , APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

TABLA 1. Datos de los números de levaduras de Sacharomyces cerevisae, tomadas al azar

MEDIDAS NÚMEROS DE LEVADURAS AL AZAR TOTAL PROMEDIO VOLUMEN DILUCIÓN MUESTRA ORIGINAL

1 79 88 73 77 83 400 80 0.000004 - 20000000

2 132 120 81 75 101 509 101.8 0.000004 - 25450000

3 16 20 22 13 13 84 16.8 0.000004 10 42000000

4 17 23 18 12 16 86 17.2 0.000004 10 43000000

5 16 14 15 17 9 71 14.2 0.000004 10 35500000

6 25 19 7 12 26 89 17.8 0.000004 10 44500000

7 25 26 23 24 22 120 24 0.000004 10 60000000

8 22 18 17 20 21 98 19.6 0.000004 10 49000000

9 25 21 28 25 24 123 24.6 0.000004 10 61500000

10 24 28 21 29 24 126 25.2 0.000004 10 63000000

11 27 28 23 25 27 130 26 0.000004 10 65000000

12 27 25 26 22 32 132 26.4 0.000004 10 66000000

13 41 43 40 38 35 197 39.4 0.000004 10 98500000

14 40 41 37 46 43 207 41.4 0.000004 10 103500000

15 42 46 35 39 47 209 41.8 0.000004 10 104500000


UNT

TABLA 2. Determinación de los parámetros de crecimiento de levaduras Sacharomyces cerevisae del medio de cultivo.

TABLA 3. Parámetros para cálculo de gráfica de Gompertz

MUESTRAS TIEMPO (h) MUESTRA ORIGINAL

LOG( N/N0)(UFC/g) N

1 0.166667 20000000 0

2 0.333333 25450000 0.104657791

3 0.500000 42000000 0.322219295

4 0.666667 43000000 0.33243846

5 0.833333 35500000 0.249198357

6 1.000000 44500000 0.347330015

7 1.166667 60000000 0.477121255

8 1.333333 49000000 0.389166084

9 1.500000 61500000 0.48784512

10 2.000000 63000000 0.498310554

11 2.500000 65000000 0.511883361

12 3.000000 66000000 0.51851394

13 3.500000 98500000 0.692406235

14 4.000000 103500000 0.713910354

15 4.500000 104500000 0.718086295

a 0.676447

b 0.706306

c 1.095409

µ máximo 0.74098544

λ -0.2681135

G 0.93543968


UNT

Figura 4. Determinación de la Curva de Crecimiento de la Sacharomyces cerevisae aplicando modelo de Gompertz


UNT

Figura 5. Tiempo (horas) vs Log (UFC/g) en Sacharomyces cerevisae

y = 0.2099ln(x) + 0.3749 R² = 0.9256

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.0000000.5000001.0000001.5000002.0000002.5000003.0000003.5000004.0000004.5000005.000000

Log(

N/N

0)(

UFC

/g)

Tiempo (horas)


UNT

Según Ventanas (2000); nos cuenta que el desarrollo de los microorganismos

puede representarse mediante una gráfica que corresponde a una función

matemática relativamente compleja. El estudio de estas funciones matemáticas

tiene gran interés desde el punto de vista microbiológico, ya que puede servir para

predecir el crecimiento de los microorganismos, y de este modo saber mediante

un simple cálculo matemático, con un ordenador, la evolución que tendrían los

microorganismo de interés en un producto determinado. De hecho, se está

haciendo un considerable esfuerzo para diseñar y validar los modelos

matemáticos que permiten establecer el desarrollo microbiano y que son de gran

valor a la hora de tomar decisiones respecto al diseño de instalaciones y procesos,

adquisición de equipos o características de los productos. Una de las fórmulas

más ampliamente utilizadas es la ecuación de Gompertz. Así mismo; en la Figura

4 podemos observar los resultados arrojados por STATISTICA validados para el

modelo de Gompertz; donde, el valor de a es igual a 0.676 nos indica el numero

inicial de microorganismos viables. El valor de b nos indica una velocidad de

crecimiento relativa de 0.706 en unidades de 1/horas a la velocidad máxima de

crecimiento en las condiciones trabajadas. La diferencia entre el número inicial y el

recuento máximo que se puede alcanzar en el medio está indicado por el valor c

que es 1.095.

Según Hernández (2008), nos dice que la curva de crecimiento de un

microorganismo representa el comportamiento de su crecimiento a través del

tiempo. Con base en ella, se determina cuando se produce la mayor cantidad de


UNT

biomasa o de metabolitos (primarios o secundarios). Si hacemos un contraste

entre la curva de la figura 1 obtenida en el software statistica 7; y la curva de

crecimiento extraída de bibliografía (Figura 5); observamos que la fase de latencia

que presentó la levadura no fue tan marcada, casi imperceptible, esto se debe a

que la levadura presente en el inóculo entró al biorreactor en una fase logarítmica,

esto porque se puso a la levadura en un medio con sustrato (azúcar) y a la misma

temperatura que se trabajó en el biorreactor para que vaya adaptándose antes de

ser vertido en el reactor. En un proceso de obtención de biomasa la fase de mayor

importancia es la fase logarítmica, pues de la velocidad de cómo se de ésta

dependen factores como el costo. En la figura 4 se aprecia que la mayor pendiente

de la curva de crecimiento, es decir la máxima velocidad de crecimiento de la

levadura Saccharomyces cerevisiae se da entre los tiempos de 0.5 y 1 horas, es

decir el mayor crecimiento se dio entre los 30 min y 60min.

Según Scragg (1996), nos dice que la fase “lag”, es un tiempo de aparente no

crecimiento, el cual se da en nuestro caso para la primera 0.5 hora, pero estudios

bioquímicos demuestran actividad metabólica, indicando que las células están en

proceso de adaptación a las condiciones ambientales y que un nuevo crecimiento

comenzará, eventualmente. Existe, luego, una fase de aceleración transitoria

cuando el inóculo comienza a crecer que es seguida, rápidamente, por una fase

de crecimiento exponencial, esta fase exponencial se aprecia a un tiempo de 4

horas aproximadamente, ya que luego comienza a decaer. Esta fase final del ciclo,

es la fase de muerte, cuando la velocidad de crecimiento ha cesado. Y según el

mismo autor, la mayoría de los procesos biotecnológicos por lotes se detiene

antes de esta fase, debido a la disminución en el metabolismo y a la lisis celular.

Según Hidalgo (2003), nos recalca que los azúcares fermentables por las

levaduras son la principal fuente de alimentación carbonadas, especialmente la

glucosa y la fructosa como azucares mayoritarios, sirviendo de base para la

síntesis de los compuestos que necesitan, así como también de fuente de energía

para atender sus funciones vitales como en el caso de la práctica que se le añadió


UNT

soya que es un alimento con alto contenido de nitrógeno; además de fósforo,

azufre y amonio que se apoyó de compuestos químicos tales como el ácido

sulfúrico, fosfato de amonio y tiosulfato de sodio. Así el autor nos dice que en

medios muy pobre, con menos de 10 gramos/litro, la velocidad es muy lenta,

acelerando hasta concentraciones de 20 gramos/ litros, donde a partir de este

valor la velocidad se mantiene hasta los 200 gramos/ litro. Después de esta

cantidad la velocidad de fermentación decrece a medida que la concentración

aumenta, cesando totalmente a partir de los 600 gramos/litro por la elevada

presión osmótica presente en el medio. Esto se nota en la experimentación ya que

según la curva de crecimiento, existe un punto en el cual el crecimiento aumenta

la velocidad de crecimiento y otro punto en el cual este se detiene.

Según Doran (1998), nos afirma que una de las condiciones que se tiene que

tener en cuenta en el biorreactor para el crecimiento de la biomasa es el aporte de

oxígeno, y si analizamos lo que se dio en nuestra practica podemos decir que este

fue continuo para ayudar al aporte de estas (levaduras) y para evitar la

fermentación y así conllevar a la producción de alcohol y CO2. El autor también

expresa que este aporte de oxigeno además de evitar la fermentación, sirve para

mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen del cultivo a

fin de prevenir la sedimentación o la flotación, mantener constante y homogénea la

temperatura.

Según IICA (1989), la biomasa de microorganismos es una excelente fuente de

nutrientes (proteínas, grasa, vitaminas, minerales y otros factores). Por lo tanto,

siempre ha existido un interés de incorporarla al sistema alimentario humano tanto

en forma directa como indirecta (a través de animales). Entre ellas, es la

proveniente de levaduras la que posiblemente se ha estudiado con mayor

profundidad. Por lo dicho se puede afirmar que no solo es un proceso previo a la

fermentación de un vino, cerveza o cualquier bebida alcohólica el hecho de poner

en un biorreactor un inóculo de levaduras con el fin de aumentar el número de

células y hacer más factible la fermentación alcohólica; si no es un proceso que


UNT

puede manejarse a nivel alimentario con el fin de obtener una fuente rica en

proteínas como lo son las levaduras, para ello se necesitaría producción de

grandes cantidades de biomasa en cortos tiempos. Todo esto se podría llevar a

cabo evaluando los mejores parámetros de temperatura, pH y nutrientes que

necesitan las levaduras.

VI. CONCLUSIONES

Se preparó un medio de cultivó basado en soja, azúcar rubia y demás

componentes y se manejó adecuadamente la autoclave.

Se confeccionó la gráfica de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae

mediante el modelo de Gompertz, obteniendo el modelo matemático de

y=0.2099Ln(x)+0.3749, con un R2 de 0.9256, un valor alto que se acerca a

uno, lo cual nos indica un índice de confianza aceptable. En las cuadros 1 y 2

se puede observar cómo va creciendo la levadura hasta llegar a un valor donde

se tiende a hacerse constante, lo cual nos indica que ha llegado a su punto

máximo de crecimiento.

Se conoció un poco más acerca del método de Gompertz en el crecimiento de

levadura Sacharomyces cerevisae.

Se identificó sus fases, las cuales se pueden apreciar en la Figura 1. Curva de

crecimiento microbiano, utilizando el método de Gompertz, las cuales son:Fase

Lag: Del Punto inicial hasta la intersección del punto 0.0-0.1. Fase exponencial:

Desde el segundo punto (0.0-0.1) hasta la lectura del punto 13. Fase

Estacionaria: Desde el punto 13 hasta el punto 15 donde tiene una tendencia a

mantenerse constante. Fase Muerte: No se determinó dado que solo se obtuvo

hasta Fase Estacionaria.

Se calculó el tiempo de generación mediante el modelo:

y=0.2099Ln(x)+0.3749; donde Y= Log (N/No) – X=tiempo.


UNT

VII. BIBLIOGRAFÍA

ASENJO A. (1995). Microbiología de las fermentaciones industriales. (7ª ed.).

Zaragoza: Editorial Acribia.

DORAN, P. (1998) .Principios De Ingeniería De los Bioprocesos. Edit.Acribia. S.A

Zaragoza- España.

DUARTE P. (1998). Biotecnología de la fermentación, Primera Edición, Editorial

Acriba S.A., Zaragoza (España).

GOMEZ E. (2003), ASPECTOS BÁSICOS DE BIOTECNOLOGÍA. Instituto

Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente, A

HERNÁNDEZ, A. (2008). Microbiología Industrial.

Hidalgo J. (2003) Tratado de etnología Editoria: Mundi-Prensa Libros S.A., México.

IICA (1989). Oportunidades de las biotecnologías Agropecuarias en América

Central. Programa II; Generación y Transferencia de Tecnología.

RAMÍREZ O. PEDROZA M. (2001). Evaluación De Parámetros Cinéticos Para La

Sacharomyces Cerevisiae Utilizando Agua De Coco Como Sustrato, San José,

Costa Rica.

SANCHEZ A. (2003). Las biotecnologías: desafíos y promesas Investigaciones

Biológicas. La Habana..

SCRAGG, A.(1996). Biotecnología. Edit. El Manual Moderno. México D.F.

VENTANAS, J. (2000). Tecnología del jamón Ibérico: Delos sistemas tradiciones a

la explotación racional del sabor y el aroma. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid.

España.


UNT

ANEXOS

ANEXO 01.Diseño de un medio de cultivo

Reacción general

A C12H22O11 +BO2 +C NH3 C3.72H6.11O1.95N0.61 +D CO2 +E H2O

Donde:

Si:

100g sacarosa 100g levadura 10,4 (NH3)102,6g (O2)

Para el diseño de un medio se necesita de ciertos componentes tales como Macronutrientes

(CHONPS) y Micronutrientes (P y S) teniendo

Materiales.

Harina de soya (100g)

Fuente.

P 0.61g

Mg 0.27g

S 0.42

Zn 0.5g

Proteína 43g

Proteína

Sacarosa (azúcar rubia) 200g 20ªBrix

Fosfato de amonio (NH3)4 PO4 ≈ 163g/mol

Acido fosfórico H3PO4 ≈ 98g/mol

Tiosulfato de sodio Na2S2O3 ≈ 164g/mol

Levadura

90.5g (90%)

10g (10%)

≈ 100g


UNT

Requerimientos

Macronutrientes

Fosforo (P) 4g

Azufre (S) 4g

Amonio (NH3) 10.4g

Sacarosa 200g

Oxigeno 102.6g

Micronutrientes

Zinc (Zn) 5mg

Magnesio (Mg) 5mg

Dónde: la harina de soya se completa los requerimientos de Zn (5mg), de P(faltaría 3,39g), de Mg

se completa , de S (falta 3,5g) y del NH3 ( faltaría 2.g)

Entonces calculamos para completar:

NH3

Azufre

Fosforo

g P

Entonces nos faltaría

3,39-1.905=1.485g P

Finalmente nuestras moléculas para el medio de cultivo serian.

200g sacarosa

100g harina de soya

8.117g fosfato de amonio

8.96g tiosulfato de sodio

469g

Buffer

El cual se encontrara en agitación constante

800g H2O


UNT

Figura 6. Materiales para el diseño

del medio de cultivo

Figura 7. Harina de Soya para

el medio de cultivo

Figura 8. Pesado de la

Harina de Soya.

Figura 9. Pesado de los

materiales

Figura 10. Preparación del

Medio de Cultivo

Figura 11. Medio de Cultivo

Figura 12. Medio de cultivo 2 Litros Figura 13. Medición de la

temperatura del medio de

cultivo

Figura 14. Medio de Cultivo en

Cocción.


UNT

Figura 13. Pesaje del

Cultivo para la medición

de Levaduras

Figura 14. Medio de Cultivo Figura 15. Materiales para el conteo

de Levaduras Sacharomyces

cerevisae

TUTORIAL MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA GOMPERTZ


UNT


UNT

Model is: YA=a*exp(-exp(b-c*TA))

OK , OK


UNT

OK


UNT

Summary: Parameter estimates


UNT

determinación de la curva de crecimiento por modelo de gompertz

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