culture in vitro

D . CORNU - M . BOULAY

LA MULTIPLICATION VGTATIVE TECHNIQUES HORTICOLES ET CULTURE IN VITRO

La multiplication vgtative repose sur l'aptitude d'un vgtal pouvoir reconstituer un individu, identique lui-mme, partir d'un organe (tige, racine, feuille . . .), d'un tissu ou d'une cellule. Elle est, depuis des sicles, largement utilise pour reproduire de nombreuses espces en horticulture, arboriculture . . . Pour la fort, seules quelques espces sont multiplies de faon routinire depuis des dcennies (Saules, Peupliers, Cryptomeria japonica) . Les progrs raliss dans les quipements de multiplication et dans les connaissances en physiologie des vgtaux ligneux ont fait progresser les techniques pas de gants . A l'heure actuelle, de nombreux programmes d'amlioration et de production intgrent ou reposent sur la multiplication vgtative.

TECHNIQUES HORTICOLES DE MULTIPLICATION VGTATIVE

En dehors du bouturage et des techniques de culture in vitro dvelopps plus loin, diffrentes mthodes de multiplication sont applicables aux arbres forestiers . Nanmoins, en raison de leur cot et de la difficult de leur mise en oeuvre, elles sont restreintes aux programmes d'amlioration ou certaines espces. Greffage, marcottage, drageonnage Le greffage est une des plus anciennes techniques horticoles, restreinte cependant l'tablissement de collections de clones et de vergers graines chez les espces forestires . Le succs varie suivant les espces, selon le type de greffe effectue et l'poque de greffage . Le greffage en tte est recommand pour l'tablissement des vergers graines, afin d'obtenir une croissance rapide et harmonieuse des plants et de raccourcir les dlais ncessaires la production de graines (Pinus, Picea . . .). Certaines espces (Douglas . . .) prsentent des phnomnes d'incompatibilit plus ou moins long terme . Dans ce cas, on slectionne des porte-greffes compatibles qui seront produits par semis ou boutures. Le marcottage consiste provoquer la formation de racines sur un rameau non dtach de l'arbre-mre . Aprs annlation de l'corce et traitement l'aide de substances rhizognes, le milieu ncessaire au dvetoppement des racines est install sous forme de buttes (marcottage en cpe) ou de manchons (marcottage arien) autour des rameaux . Le plant sera spar du pied-mre une fois enracin . C'est une technique complexe et coteuse qui ne peut tre envisage que dans le cas d'chec des autres mthodes (Noyer, par exemple). Naturellement, certaines espces comme le Merisier, les Peupliers de la section Leuce, . .. produisent de jeunes pousses sur leurs racines, conduisant la formation de bouquets constitus par un seul clone . C'est le drageonnage .60

OBJECTIFS, MTHODES ET STRATGIES - LES OUTILS

Les Peupliers Leuce (en particulier les hybrides interspcifiques Populus tremula x Populus alba ou Populus tremuloides) font l'objet d'une telle production . Sur de jeunes plants (2 ans), 50 100 racines courtes de 8 cm (installes en serre) ou 2 3 racines longues de 20 cm (installes en ppinire) peuvent tre prleves pour reconstituer un plant. Le bouturage Technique traditionnelle en horticulture, ce n'est que rcemment qu'elle est utilise dans les programmes d'amlioration et de multiplication de nombreuses espces forestires dans le monde (pica, Eucalyptus, divers Pins, Merisier . . .). Facteurs conditionnant la russite au bouturage Ceux-ci peuvent tre endognes (lis l'tat de dveloppement du matriel vgtal), ou exognes (en particulier conditions de bouturage et traitements). Facteurs endognes L'enracinement des boutures dcrot avec l'augmentation de l'ge des pieds-mres . Excellent pour de jeunes semis, le taux d'enracinement peut chuter trs rapidement (cas du Noyer) ou plus graduellement (pica, Mlze . . .) et il est pratiquement nul pour des arbres adultes . Cette dcroissance s'accompagne toujours d'une diminution importante de la qualit (racines faibles et peu nombreuses . . .) et du dveloppement des boutures (croissance mdiocre, plagiotropie I" . . .). Ce phnomne de maturation sous contrle gntique et physiologique constitue le problme le plus dlicat rsoudre pour les arbres forestiers . Nous dvelopperons plus loin diffrentes stratgies de multiplication qui en ont dcoul. Toutes les pousses d'un plant ne sont pas susceptibles de fournir de bonnes boutures . Les gros rameaux mal aots comme ceux trs petits conduisent des rsultats faibles . Chez les conifres, les pousses des dernires ramifications comportant 3 5 bourgeons donnent les meilleurs pourcentages d'enracinement . Il en est de mme pour les boutures prleves dans la portion basse de la couronne . Elles sont considres comme plus juvniles. L'tat physiologique des boutures conduisant un bon enracinement varie selon la saison de prlvement . En gnral, les meilleurs rsultats sont enregistrs pour les conifres (picas, Douglas . . .) juste avant le dbourrement au printemps et, pour les feuillus (Chnes, Merisiers . . .) et les Mlzes, en phase active de croissance en t . Une deuxime vague d'enracinement est frquemment obtenue en fin d't quand l'longation a cess et que la lignification commence. On peut parfois tendre la priode favorable au bouturage en jouant sur les conditions d'environnement (confinement . . .) lors de sa ralisation (exemple : bouturage herbac de l'pica). Facteurs exognes De trs nombreux milieux de bouturage sont utiliss, soit inertes et simples (sable, gravier, perlite . . .), soit composites base de tourbe, de terreau ou d'corces . Le choix est conditionn par de nombreux critres dont : La capacit de rtention en eau et la disponibilit en air en fonction du systme d'irrigation utilis . Dans le cas de pulvrisations grossires, l'utilisation de milieux filtrants (graviers . . .) est prconiser . Un milieu trop riche en eau conduit toujours des pertes par pourritures et attaques de pathognes. La mthode de production adopte . L'utilisation de conteneurs par exemple ncessite l'emploi de milieux fibreux ayant plus de tenue pour le repiquage.

(1) Conserve un port de branche par opposition l'orthotropie pour laquelle le port est redress. 61

R .F.F . XXXVIII - n sp . 1986


Tout en conduisant un mme taux d'enracinement, les milieux peuvent influer diffremment sur la qualit des racines produites . Pour le Douglas, le gravier conduit des racines blanches paisses et peu ramifies, fragiles au repiquage, et des milieux composites base de tourbe favorisent la formation de racines fines, lignifies et ramifies trs favorables la reprise. L'environnement dans lequel sont places les boutures joue un rle important . Deux facteurs sont prpondrants : l'humidit et la temprature. L'absence de racine ne permet pas la bouture de pouvoir maintenir son taux de turgescence. L'entretien d'un taux hygromtrique lev (couverture plastique, systmes de brumisation ou de fog . . .), tout en veillant ne pas saturer le milieu en eau, permet de rduire le stress hydrique et de favoriser l'enracinement. En horticulture, de nombreuses tudes ont t conduites sur l'effet d'une chaleur de fond. L'idal est souvent compris entre 20 et 25C . Nanmoins, elle agit plus sur la vitesse que sur le taux d'enracinement . La temprature ambiante est plus difficile contrler . Les boutures peuvent tolrer de larges fluctuations condition qu'il y ait suffisamment d'humidit . Cependant, une temprature uniforme, mme relativement peu leve (20"C) est nettement plus favorable pour l ' enracinement. La majorit des espces ncessite l'emploi de substances rhizognes . Diffrents composs acides : indol-butyrique (A .I .B .), naphtyl-actique (A .N .A .), ou indol-actique (A .I .A .) , simples ou en mlanges et diffrentes mthodes d'applications (poudre, solutions concentres et trempage rapide ou dilues et trempage long) sont utilisables . Dans tous les cas, le traitement doit tre expriment et adapt l'espce . au clone et modul selon l'ge ou l'tat physiologique de la bouture . Par exemple, les picas ainsi que le Mlze jeunes ne ncessitent pas de traitement, mais 0,1 % d'A .I .B . (en poudre) est ncessaire ds l'ge de 5 ans environ . Le Douglas ainsi que de nombreux feuillus difficiles bouturer (Frne, Chne . . .) demandent des doses plus leves (0,5 1 % d'A .I .B . en poudre). Les principaux facteurs prsents ci-dessus sont troitement corrls et le changement d'une condition ncessite l'ajustement des autres pour maintenir un succs lev . Nanmoins, les progrs raliss ces vingt dernires annes ont permis la mise en place de standards de multiplication pour de nombreuses espces (pica, Merisier, Squoia, Eucalyptus . . .).

Diffrentes stratgies de bouturage Multiplication clonale d'arbres gs S'ils ont alors exprims toutes leurs potentialits permettant une bonne slection, les boutures prleves directement sur de tels sujets s'enracinent difficilement et conduisent des plants de qualit mdiocre. Diffrentes mthodes sont dveloppes pour librer le dveloppement de bourgeons initis depuis de nombreuses annes mais maintenus rprims, ou pour briser les corrlations au niveau de l'architecture de l'arbre . Elles permettent un retour du clone un certain tat de juvnilit, partiel ou total, compatible avec un bon enracinement . Ainsi les tailles svres, le recpage permettent la multiplication d'espces rsineuses (Squoia, Pins . . .) et feuillues (Chne, Frne, Tulipier, Noyer . . .) . Une certaine rjuvnilisation peut tre aussi obtenue par des greffages ritrs sur de jeunes semis (Douglas, Eucalyptus, Pin . . .). Nanmoins, ces techniques sont lourdes mettre en oeuvre et coteuses . Elles sont en gnral limites la confection de parcs pieds-mres de boutures ou la ralisation de programme d'amlioration .62


Multiplication de matriel juvnile Les deux principales stratgies dveloppes sont schmatises dans la figure 1 . Elles permettent de bnficier de taux d'enracinement levs et d'une bonne restitution de l'orthotropie. La multiplication avec slection clonale en ppinire (figure la) a t la premire mise en place pour l'pica commun en Allemagne . La difficult de slectionner valablement un stade trs jeune entrane la ncessit de prlever un nombre lev de clones (plusieurs milliers) dont la slection dfinitive sera diffre au stade des tests clonaux . La constitution de varits polyclonales de production ne peut ainsi intervenir que de nombreuses annes plus tard. Les clones doivent, de plus, jusqu' leur utilisation tre maintenus juvniles . Deux techniques principales sont utilises : le bouturage cyclique (figure la) ou le maintien des clones sous forme de haies . II semble cependant que ces techniques ne peuvent empcher (au plus retarder) une certaine maturation des clones. La multiplication en vrac (Bulk propagation) (figure lb) de provenances ou de descendances sans slection clonale dcoule directement de l'tat d'avancement des programmes d'amlioration . L'amplification par bouturage des meilleures sources de graines peut permettre de produire rapidement des plants de qualit et performants.

Figure 1

MULTIPLICATION VGTATIVE DE MATRIEL JUVNILE 1 .a Multiplication clonale

B

E B

TC

//TC

Ei

B //-'"Tc

E y8

R

B

E

(A)Clones slectionns

2 3 () 5 Prslection en ppinire

Multiplication

et

Slection

Production

1 .b Multiplication en vracLots de graines M11tatatlt

BB_ .

E BB . E

R R

Semis 2 ; ;-

~trtTi~1T1~~I

-

}s}}t}}m

Semis -- MMMt1f} BB ..Semis

Renouvellement des lots slectionns - - - - - - - - - - - - - - - Slection

Multiplication et production

B Bouturage BB . . . : Bouturage successif sur 1 3 ans partir des mmes pieds-mres. E : Elevage des boutures en ppinire TC : Test clonai PC : Plantation comparative

R : Reboisement.

63R.F.F . XXXVIII -

n sp. 1986

D . CORNU - M. BOULAY

Bouturage d'picas communs gs de 3 ans, en serre plastique, sur gravier et sous brumisation . Photo D CORNU - INRA - ORLEANS Cette mthode a t mise au point au Canada sur Picea mariana et en Angleterre sur Picea sitchensis . De jeunes semis forcs en serre peuvent fournir 2 3 gnrations de boutures par an . Le facteur d'amplification est trs lev et peut atteindre l'ordre de 50 100 fois sur une anne en 3 cycles de bouturage chez Picea mariana, et 250 1 000 fois sur 4 6 ans en 2 cycles de bouturage chez Picea sitchensis . Elle permet, de plus, de s'affranchir de la gestion de parcs pieds-mres maintenir juvniles . Ds l'apparition de symptmes de maturation au niveau du bouturage, les plants peuvent tre remplacs par de nouveaux semis issus du mme lot de graines . De mme, toute nouvelle source de matriel plus performant peut tre immdiatement exploite en la substituant la prcdente . Nanmoins, cette technique ncessite (surtout dans le modle Picea mariana) des quipements lourds, tant pour l'levage et le forage des plants que pour la ralisation du bouturage (boutures herbaces plus fragiles). Diffrentes stratgies de multiplication viennent d'tre prsentes . Le choix de l'une ou l'autre dpend, comme nous l'avons vu, de nombreux facteurs mais aussi du prix de revient des plants bouturs . En dehors du cot rel de production (largement conditionn par le volume de la production), le cot supportable dpend de l'espce, de sa raret et des gains que l'on peut attendre d'une production par multiplication vgtative . A de rares exceptions, ce sont les deux dernires stratgies qui conduisent des cots de production rivalisant avec ceux de semis . En Allemagne, le prix d'une bouture d'pica commun est estim une fois et demie celui d'un semis quivalent et, au Canada, les essais de multiplication en vrac de Picea mariana ont permis de produire des plants au mme prix que celui de semis en conteneurs.

LA CULTURE IN VITRO

Cette technique englobe deux modes de multiplication (conforme et non conforme), prsents sur la figure 2 . Seuls sont dvelopps actuellement pour les essences forestires le bourgeonnement axillaire (dpart des mristmes situs l'aisselle des feuilles) et le bourgeonnement64


adventif (induction de mristmes de tiges sur des organes n'en possdant pas) chez Pinus radiata en particulier, l'exprimentation n'en tant qu' ses dbuts pour les autres mthodes. Plusieurs tapes sont incluses dans la micropropagation in vitro . Certaines s'apparentent la multiplication classique (prtraitement du pied-mre, rhizognse, acclimatation), d'autres sont propres la culture in vitro (choix de l'expiant le plus ractif, strilisation de l'organe vgtal, choix de la technique de propagation). Prtraitement du pied-mre et choix des expiants Selon la littrature, la multiplication in vitro de la plupart des essences forestires se fait partir de gnotypes jeunes ou trs jeunes (semis, graines) . Comme en propagation classique, le phnomne de maturation des pieds-mres et les problmes associs (manque de ractivit des expiants, fortes contaminations, etc . . .) sont souvent surmonts par l'application de techniques de rajeunissement ou de ractivation des pieds-mres (taille, recpage, greffages ritrs ou non . . .) . La slection de tissus ou organes jeunes et vigoureux facilite l'introduction in vitro du matriel vgtal et sa multiplication ultrieure . Des succs ont t ainsi obtenus en utilisant des rejets de souches (Sequoia sempervirens, Noyer), des drageons (Merisier), des pousses obtenues aprs taille (Pin maritime), etc . .. Le choix des expiants dpend de la mthode de multiplication utilise . Ceux-ci peuvent tre, pour le bourgeonnement axillaire, des noeuds (2 5 cm de long), jusqu' des mristmes (0,1

Figure 2

DIFFRENTES MTHODES

DE CULTURE IN VITRO

Cellules sexuelles(Pollen Sac embryonnaire)

65 R .F.F. XXXVIII - n sp. 1986


0,2 mm) . Tous possdent un mristme caulinaire prexistant, mais il est possible, dans le cas du bourgeonnement adventif, d'induire la formation de mristmes sur d'autres organes tels que feuilles, cotyldons, hypocotyles . .. Strilisation Le milieu de culture contenant une source de carbone (saccharose en gnral), il est ncessaire de dbarrasser l'organe mis en culture de la flore bactrienne et fongique qui lui est associe. Ceci est ralis par bains, de dure variable, dans une solution de dsinfectant . Cette opration dlicate, dont dpend en majeure partie la russite de la multiplication, doit prendre en compte l'tat du matriel vgtal (ligneux ou herbac) et la nature de l'expiant . Des contaminations survenant aprs plusieurs transferts ont amen certains auteurs choisir un expiant aussi petit que possible et protg de l'extrieur : le mristme. Multiplication Peu d'essences forestires ont t rgnres par noformation de bourgeons sur cal . Ce sont presque toutes des Angiospermes (Populus en particulier) et le matriel est gnralement prlev sur un semis . L'embryognse somatique (obtention de pseudo-graines ') a t obtenue sur diffrentes espces (Ulmus americana, Liquidambar, Santal, Noisetier, Marronnier) . Dans ce cas aussi, le matriel est souvent issu de sujets trs jeunes (embryons matures et immatures, hypocotyles, ovaires immatures, etc . . .) . Au niveau des conifres, des rsultats rcents ont montr la possibilit d'obtenir des structures embryonnaires en utilisant comme source d'expiant l'embryon immature (Picea abies, Douglas et Mlze). Le bourgeonnement adventif a t obtenu sur de nombreux conifres en utilisant comme matriel de dpart : cotyldons, hypocotyles, embryons, etc . . . L'application la plus importante est actuellement faite en Nouvelle Zlande pour multiplier des descendants de croisements contrls de Pinus radiata . D'autres productions pilotes ont t faites sur Douglas et sur Pinus taeda . Cette mthode a t peu utilise chez les feuillus qui rpondent mieux au bourgeonnement axillaire . Celui-ci a t appliqu avec succs jusqu'au niveau commercial, au Merisier, au Tremble, l'Eucalyptus . . . Chez les conifres, seul le Sequoia sempervirens rpond bien ce type de production . Toutes ces mthodes ont pour but d'obtenir partir d'un expiant des pousses feuilles, qui sont remultiplies priodiquement par transfert sur des milieux nutritifs complexes (sels minraux, vitamines, sucre, hormones . . .) liquides ou gloss. longation, rhizognse et transfert Pour quelques espces, longation et enracinement prennent place sur le mme milieu (Peuplier, Saule, Tremble) . II est cependant souvent ncessaire de dfinir un milieu permettant une longation de la pousse feuille avant d'entamer le processus d'enracinement . Celui-ci peut se drouler en conditions striles et un repiquage sur milieu glos riche en auxine est alors ncessaire, ou en conditions horticoles (substrat classique de bouturage en serre l'touffe ou sous brouillard) . Le choix de la technique est fonction de la ractivit de l'espce . Ainsi, pour le Merisier, l'enracinement se fait in vitro et les plantes enracines sont acclimates, alors que pour le Sequoia sempervirens, l'enracinement se fait en serre aprs prtraitement pralable 10-15C des pousses feuilles sur milieu d'longation. Quelle que soit la mthode d'enracinement choisie, les plants obtenus doivent tre acclimats aux conditions extrieures . Cette tape est souvent dlicate, car il s'agit pour la plante de passer des conditions d'humidit saturante du tube de culture celles de l'extrieur . Un sjour de 15 jours 1 mois en atmosphre confine ou sous brouillard en serre, suivi d'un sevrage progressif permettent le transfert de nombreuses espces.66

OBJECTIFS, MTHODES ET STRATGIES - LES OUTILS Conclusions L'application des techniques in vitro aux essences forestires est relativement rcente . Elle est souvent limite la multiplication de sujets juvniles (cas des conifres par exemple) . Cependant des applications commerciales importantes ont t faites sur les essences rpondant bien ces techniques (Merisier et Sequoia sempervirens en France et Tremble en Allemagne) et, dans ce cas, la propagation de matriel slectionn l'tat adulte est possible. Une des limitations de l'application de ces mthodes, hormis les problmes techniques, est sans doute le cot de la plante produite, qui est souvent nettement suprieur celui obtenu par les techniques classiques de multiplication . Ainsi l'heure actuelle, l'application commerciale est limite la propagation d'essences prcieuses (Merisier par exemple) ou celles pour lesquelles les techniques de multiplication et la constitution de parcs pieds-mres de boutures sont difficiles (Sequoia sempervirens). Nanmoins le dveloppement de certaines techniques (embryognse somatique par exemple) ou la mcanisation de la micropropagation devrait permettre de diminuer les prix des plants produits . Enfin, dans un autre domaine, la possibilit de slection in vitro, d'hybridation somatique, etc . . . peut ouvrir d'autres voies aux gnticiens et permettre ces biotechniques d'avoir une utilisation trs large en matire forestire .

Culture in vitro

Figure 3 MTHODES DE MULTIPLICATION VGTATIVE DU MERISIER (Prunus avium L.) Jeune plant de Merisier enracin in vitro avant repiquage en serre. Photo D. CORNU - I.NRA - ORLEANS

67 R .F.F. XXXVIII - n sp. 1986

D . CORNU - M. BOULAY Les diffrentes mthodes de multiplication vgtative dveloppes ci-avant, loin d'tre concurrentes, sont frquemment utilises de manire complmentaire au sein des programmes d'amlioration et de production des espces forestires . Le Merisier tudi l'I .N .R .A . en est une trs bonne illustration (figure 3) . Si le drageonnage et la culture in vitro sont essentiellement utiliss pour la rcolte des clones adultes slectionns en fort, le bouturage de racines, le bouturage herbac et la culture in vitro peuvent assurer la production de plants pour le reboisement . l'heure actuelle, la majorit de ceux-ci provient de culture in vitro.

D . CORNUStation d'Amlioration des Arbres forestiers CENTRE DE RECHERCHES FORESTIRES (I .N .R .A .) ARDON 45160 OLIVET

M . BOULAYASSOCIATION FORT-CELLULOSE Domaine de l'tanon 77370 NANGIS

BIBLIOGRAPHIE AUGE (R .), BEAUCHESNE (G .), BOCCON-GIBOD (J .), DECOURTYE (L .), DIGAT (B .), GALANDRIN (J .Cl .), MINIER (R .), MORAND (J .Cl .), VIDALIE (H .) . La culture in vitro et ses applications horticoles . Paris : J .B.Baillire, 1984 . 152 p. BONGA (J .M .), DURZAN (D .J .) . Tissue culture in forestry . The Hague : Martinus Nijhoff, 1982 . 420 p. CHAUSSAT (R .), BIGOT (C .) . La multiplication vgtative des plantes suprieures . Paris : Gauthier-Villars Ed ., 1980 . 277 p. HARTMAN (H .T .), KESTER (D .E .) . Plant propagation . Principles and practices . 4 dition . Prentice-Hall, 1983 . 727 p. HUHTINEN (O .) . Colloque international sur la culture in vitro des essences forestires . I .U .F .R .O ., Fontainebleau, 1982 . Nangis : AFOCEL, 1982 . - 363 p. KLEINSCHMIT (J .) . Proceedings of the IUFRO joint meeting of working parties on Genetics about breeding strategies including multiclonal varieties >> . Staufenberg-Echerode (R .F .A .) : Lower Saxony Forest Research Institute, 1982 . 238 p. KRUGMAN (S .L .) . Special issue on vegetative propagation . Proceeding of the IUFRO meeting in Rotorua in 1973 on reproductive processes . New Zealand Journal of Forest Science, vol . 4, n 2, 1974, pp . 120-458. MARGARA (J .) . Bases de la multiplication vgtative : les mristmes et l ' organognse . Paris : Institut national de la Recherche agronomique, 1981 . 262 p.

68

culture in vitro

Documents