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TURMA P2, GRUPO 3 CATARINA CRUZ V AZ FILIPA GLÁUCIA RODRIGUES LEMOS MICAELA F ARIA FREITAS Crystal structure of Clostridium perfringens enterotoxin displays features of β-pore-forming toxins ESTUDOS DE CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE PROTEÍNAS: ANÁLISE DE UMA PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA LABORATÓRIO DE BIOFÍSICA/BIOQUÍMICA LICENCIATURA EM BIOQUÍMICA 2º ano, 2º semestre 29 de Maio de 2013

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TURMA P2, GRUPO 3

CATARINA CRUZ VAZ FILIPA GLÁUCIA RODRIGUES LEMOS MICAELA FARIA FREITAS

Crystal structure of Clostridium perfringens enterotoxin displays features of β-pore-forming toxins ESTUDOS DE CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE PROTEÍNAS: ANÁLISE DE UMA PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA

LABORATÓRIO DE BIOFÍSICA/BIOQUÍMICA LICENCIATURA EM BIOQUÍMICA 2º ano, 2º semestre 29 de Maio de 2013

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Qual o mecanismo de β-pore-forming adoptado pela CPE e as características estruturais dos poros transmembranares

formados, causadores de danos na permeabilidade selectiva das células-alvo?

Crystal structure of Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) displays features of β-pore-forming toxins THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 3 DE JUNHO DE 2011

QUESTÃO-PROBLEMA

Clostridium perfringens enterotoxin (CPE)

Toxina β-pore-forming (β-PFT)

A CPE é um agente causador de intoxicações alimentares ao alterar a permeabilidade selectiva das células-

alvo do epitélio intestinal.

O mecanismo de acção e as características estruturais dos poros formados não estão ainda devidamente

documentadas

EM CONTEXTO…

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ABORDAGEM EXPERIMENTAL

CONSTRUÇÃO DE 2 PRIMERS

NcoCPE5`-aaaaccatggcgATGCTTAGTAACAATTTAAATC-3` CPEXhoI5`-aaactcgagAAATTTTTGAAATAATATTGAATAA-3`

Figura 1: Técnica de PCR

OBTENÇÃO DA CPE

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ABORDAGEM EXPERIMENTAL

CLONAGEM

Recorrendo a:

pCR2.1-TOPO TA

SEQUENCIAÇÃO

Figura 2: Plasmídeo pCR2.1-TOPO TA

OBTENÇÃO DA CPE

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ABORDAGEM EXPERIMENTAL

Aplicação de enzimas de restrição

NcoI e XhoI

Inserção no plasmídeo pET-28a(+)

Inserção da tag His6

Figura 3: Plasmídeo pET-28a (+)

OBTENÇÃO DA CPE

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ABORDAGEM EXPERIMENTAL

E. Coli BL21-CondonPlus (DE3)-RIL(Stratagene)

Transformada com pET28a-CPEwt

Deixada durante a noite 1 L LB medium c/ 50 µg/mL de canamicina e 50 µg/mL de cloranfenicol

Incubação a 37 ⁰C em agitação vigorosa até que Abs600 nm = 0,6.

Inoculação 10mL

OBTENÇÃO DA CPE

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ABORDAGEM EXPERIMENTAL

Adição de IPTG até uma concentração final de 1 mM

5000 rpm 20 min, 4⁰C

• Lavagem das células com água fria • Ressuspensão em 50 mM de tampão Na2PO4 pH 8,0, incluindo

0,3 M NaCl e 1 mM imidazole

12000 rpm 20 min, 4⁰C Sonifier S-350 a 4⁰C

6h depois

Indução da expressão da proteína recombinante com IPTG

Centrifugação

Sonicação

ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO

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ABORDAGEM EXPERIMENTAL

12000 rpm 20 min, 4⁰C

Sobrenadante

Cromatografia em gel de níquel-ácido nitrilotriacético

Proteína recombinante eluída por gradiente de

concentração de imidazole 1-500 mM

Diálise 10 mM Tris-HCl, pH 8,0

Fracção com CPE

Electroforese 12,5% PAGE

Centrifugação

ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO

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ABORDAGEM EXPERIMENTAL

Cristalização Sitting-drop vapour diffusion

Cristais obtidos ao fim de algumas semanas Forma triangular, de dimensões máximas 0.3 x 0.3 x 0.2 Å

Monitorização inicial: método da matriz dispersa

Gotas de 1 µL solução CPE e 1 µL solução utilizada com 25% (v/v) de polietilenoglicol 3350, 0,2M de NaCl e 0,1M de Tris-HCl, pH=8,0, a 25ºC, em equilíbrio com 500µL da solução de cristalização

Solução 8 mg/mL CPE His-tagged C-terminal em 0,01 M Tris-HCl pH 8.0

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ABORDAGEM EXPERIMENTAL

Clostridium perfringens

Manipulação genética Proteína recombinante

Gene: CPE Gene ID: 3897031

Escherichia coli Plasmídeo pET28a(+)

Inserção

Transformação

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Figura 5: Sequência de aminoácidos e estruturas secundárias

Fonte da proteína estudada: Clostridium perfringens

Método de obtenção: Manipulação genética – produção de uma proteína recombinante.

Gene: CPE (Gene ID – 3897031)

Hospedeiro: Escherichia coli

Vector hospedeiro: plasmídeo pET28a(+)

Características da estrutura depositada no PDB

Coordenadas atómicas depositadas no Protein Data Bank (PDB),

sob o código 3AM2

Imagens obtidas com recurso ao software PyMol®

Classificação: enterotoxina

Método: Difracção de raios-X, resolução 2.51 Å

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Em síntese…

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Crystal structure of Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) displays features of β-pore-forming toxins

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 3 DE JUNHO DE 2011

17 folhas β e 5 α-hélices 319 aminoácidos (35 N-terminal s/ observação de densidade electrónica)

Figura 6: Monómero de CPE, com distinção dos respectivos domínios

Verde: domínio I; Azul: domínio II; Rosa: domínio III

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

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Crystal structure of Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) displays features of β-pore-forming toxins

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Ligação do domínio I às claudinas Tyr306, Tyr310, Tyr312 e Leu315

Figura 7: Resíduos envolvidos na ligação às claudinas assinalados a vermelho na imagem

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RESULTADOS EXPERIMENTAIS

Domínio II e III Semelhança com outras toxinas

• Aerolisinas • ε-toxina da C.perfringens • Lectina hemolítica do fungo

lactiporus sulfareus

Figura 8: Domínio II (azul) e domínio III (rosa).

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Figura 9: Arg208 inserida na α-hélice 2

Estabilização do trímero

• Maiores interacções entre o domínio

I e III

• O domínio III interage com a

estrutura β-barril do domínio I

• A Arg208 está inserida na α-hélice 2

• A Phe268 está inserida

hidrofobicamente na hélice 310b do

domínio III

Figura 10: Phe268 inserida na hélice 310b do domínio III

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

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DISCUSSÃO

Mecanismo de β-pore-forming

1ª hipótese

O poro forma-se através da conduta que se estabelece através da Glu94 e Glu110.

Figura 11: Resíduos de aminoácidos; E94 E E110 referem-se aos resíduos de Glu94 e Glu110, respectivamente

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DISCUSSÃO

Mecanismo de β-pore-forming

1ª hipótese

Figura 12: Resíduos de aminoácidos Glu94 e Glu110 (ampliada)

O poro forma-se através da conduta que se

estabelece através da Glu94 e Glu110.

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DISCUSSÃO

Mecanismo de β-pore-forming

2ª hipótese

Tinha como base o canal que se formava quando a CPE se apresentava sobre a forma de trímero.

Evidências que descartaram esta hipótese:

• O canal não está rodeado por estruturas rígidas como α-hélices e barris-β • O comprimento do trímero não é suficiente para atravessar a membrana • A toxina encontra-se sobre a forma de monómero em solução

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DISCUSSÃO

Mecanismo de β-pore-forming

3ª hipótese

• Semelhança que existe entre os domínios II e III com os de outras toxinas • Padrão de alternância de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos que conferem

características anfipáticas

Figura 13: Formação de poros por outras toxinas

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DISCUSSÃO

Mecanismo de β-pore-forming Região Anfipática: Val81 à Ile106

Figura 14: Região anfipática, obtida por Jmol, representada com cores mediante a estrutura secundária para o trímero.

Figura 15: Trímero com a região anfipática no centro. Monómeros representados com cores diferentes. Estrutura obtida por Jmol.

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DISCUSSÃO

Região Anfipática: Val81 à Ile106

Figura 16 e 17: Trímeros com a representação da região anfipática representada com uma forma estrutural diferente, numa visualização horizontal e vertical. Estrutura obtida por Jmol para o trímero de CPE (3AM2).

Mecanismo de β-pore-forming

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Crystal structure of Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) displays features of β-pore-forming toxins

RESPOSTA À QUESTÃO-PROBLEMA

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 3 DE JUNHO DE 2011

Mecanismo de β-pore-forming está possivelmente associado à região anfipática

β4 + α1 e loop correspondente

Organização de um complexo oligomérico pré-pórico

Dobra no domínio II permite inserção da região anfipática na superfície da membrana

Citolisinas dependentes do colesterol

(modelo de comparação à CPE)

Carácter β-PFT da CPE

Mecanismo a partir da estrutura ?