Cryopreservation in 96­Well Plates  

Purpose: To cryopreserve large libraries of 384 agar plates by first inoculating them into 96­liquid format, add a cryoprotective agent using the BioMek FX, and then store indefinitely in liquid nitrogen.  

Important Notes:  This protocol was optimized by Spencer, Leif, and most recently, Sean and Rebecca.  Address all questions to Rebecca.  Preparation for Inoculation:  Purpose: To add TAP and lids to 660 96­well plates.    Materials: Sterile, polypropylene, conical bottom 96­well plates (E&K ­ EK­21261) Sterile lids for 96­well plates (E&K ­ EK­26161) Sterile 20­200uL tip boxes for Biomek (USA scientific ­ 1062­2410) TAP Spray Bottle w/ 70% Ethanol Paper Towels Germicidal UV lamp Ziplock Bags (1 gallon zipper slider storage bag) BioMek FX (Beckman Coulter Biomek FX Robotic Liquid Handler)  Clear Plastic Boxes (16­5/8­by­11­3/4­by­7­Inch)   Protocol: 1.  Add 120 uL of TAP to each well for all 660 plates.  This is accomplished with the Biomek, using the “120816­TAPfor96Cryo” method in project “Library”.  This step takes approximately 10 minutes per 12 plates.   See Figure 1 for deck layout. 

a. NOTE: The reason we use 120uL is that we expect ~20uL to evaporate  over the course of outgrowth.  2.  Store the plates in ziplock bags (to reduce evaporation)  in clear plastic boxes, 6 stacks of 8 plates per box.  This will be enough plates to inoculate 4 384 plates in triplicate.  Note: for smaller scale 96 well freezing (~20 plates), it is more efficient to use a multichannel pipette to fill the wells.   Inoculation:  Purpose: To inoculate 55 library 384­plates into 660 96­well plates and allow them to grow for 2 weeks.  For this step, we use the Singer RoToR’s “4:1 Breakdown” program 3 times for each plate.  Each 96­well plate gets its own 96­long pad.    Important Notes:  Piasecki et. al. (2009) showed that the recovery rate from LN2 of some walled strains of chlamydomonas (ours is cell wall deficient­­so it’s unclear if this data is relevant) drops off rapidly at cell densities above 2 x 10^6 cells/mL. Rebecca and Sean tested this protocol with cultures at three time points between 0.5 and 1.8 x 10^6 cells/mL, and got ~100% recovery for all three.  We highly recommend that your cultures be within this range when frozen.  Materials: Full copy of the 1/10th scale library 660 96­long pads for RoToR (Singer ­ RePads 96 Long REP­001) Ethanol­resistant Marker Singer RoToR Spray Bottle w/ 70% Ethanol Paper Towels 

 Protocol: 1.  Turn on the RoToR and UV for 1 hour.  During this time, bring all needed materials to the RoToR room.  2.  Plates must be labelled with the library plate number, replicate number, and a letter A­D indicating which quarter of the 384 plate it represents.  For example:  “1/10th Scale Library Plate 4­3C”.  Be sure  to draw thickly with ethanol­resistant marker, since label must be remain legible after years of storage at ­196C.  3.  Choose the following RoToR options: Source Plate : 384 Dry Target Plate: 96 Liquid Pad: 96­Long Program: 4:1 Breakdown Source 

Pinning Pressure: 20% Speed: 19mm/sec Overshoot: 1mm Repeat: 1 time 

Dry Mix Clearance: 0.5 mm Diameter: 1 mm Cycles: 3 rotations 

Target Pinning 

Speed: 19 mm/sec Backoff: 0.5 mm Repeat Pin: 1 time 

Wet Mix Diameter: 1 mm Speed: 24 mm/sec Cycles: 3 Travel: 1  (3D) 

4.  When loading the 96­well plates in the lazy susan, MAKE SURE TO LOAD THEM IN THE PROPER ORIENTATION, since, unlike 384 plates, they can fit in two ways.  Also make sure to load them in the correct spots (A = Red, B = Blue, C = Yellow, D = Green.)  5.  Perform the 4:1 breakdown three times for each library plate.    6.  Store the 96­well plates in ziplock bags + sterilite boxes in the algae house at ~5uE.  After ~4 days, begin checking the cell density to make sure you freeze all plates in the 0.5­1.8 x 10^6 cells/mL range.  CPA Preparation:  Purpose: To prepare the CryoProtective Agent, a sterile 5% methanol in TAP solution, in sufficient quantities for all plates to be frozen (9.6 mL per 96­well plate.) Try to make fresh before each time.  Materials: TAP Methanol 99.9%, for HPLC gradient grade (1L) Vacuum Pump (in Grossman lab) .22 uM vacuum filter with 500mL bottles 1L autoclaved glass bottles Tin foil  Protocol: 1. In a sterile hood, cover all autoclaved 1L bottles in foil and label.   In a separate container, mix together CPA (5% methanol final 

volume in TAP.) ex: 50 ml MeOH in 950 ml TAP 

 2. Screw on a .22uM PES vacuum filter to the top of a 1L bottle and pour in CPA.  Apply vacuum pump.  3.  Store vacuum­filtered CPA at 4 degrees C.  CPA Addition and Cryopreservation:  Purpose: To add cryoprotective agent to all plates and freeze them down at ­196C.  Important Notes: Before you begin, make sure you know where in the LN2 tanks your plates will go, and that you record this information in the database in GoogleDocs (Lab/Reagent and Supplies/Lab Chlamy Strains.)  Also, make sure to minimize the time spent with the tanks open, and also minimize consecutive removal of adjacent towers.  We have not shown experimentally that this hurts recovery, but we have had problems recovering plates from the large LN2 tank that could be explained by these issues.  Super Important Note: Count cell density of multple plates and make sure cells are at ~2.0x10^6 cells/ml. This is the optimal cell density to be frozen down at. It takes 6­7 days for cells to reach that density (if inoculation from plates that are <1 month old).  Materials: Cryoprotective agent (5% methanol in TAP) Sterile 20­200uL tip boxes for BioMek (USA scientific:1062­2410) Sterile, adhesive foil plate­covers and roller (VWR 89049­034) 5 styrofoam boxes (room for 4 plates each) and an empty shelf @ ­80C BioMek FX Spray Bottle w/ 70% Ethanol Paper Towels Germicidal UV lamp ­80 Degree Freezer LN2 Tank  1. Turn on computer, turn on Biomek, open air flow, turn on Biomek software.  Home all axes.  2.  Open project “library” and method “120710Cryopreservation”.  Make sure the deck is set up as indicated in Figure 2, with the inverted tip box lids filled with CPA.  3.  Before pressing play, make sure there is a clear shelf in the ­80 freezer for your plates, and that you have a plan for bringing plates from ­80 to LN2 in a quick, organized manner that minimizes warming in the LN2 tank, as stated in the “important notes” earlier.  4.  Press play.  After adding CPA to the first four plates, the BioMek will pause.  Add foil adhesive to these plates, making sure to apply firmly with the roller.  Press “OK” on BioMek software, and bring these plates to ­80 while CPA is added to the next 4 plates.  5.  Place 4 plates in a styrofoam box.  There should be room for 5­6 such boxes on a single shelf in the ­80 freezer.  6.  After the plates have been at ­80 for 1.5 hours, move them to the LN2 tank.  Make sure you do this transfer quickly, minimizing time spent with the towers removed, and also minimizing consecutive removal of adjacent towers.   Thawing:  See protocol entitled  “96­well cryopreservation recovery”. 

 Figure 1:  Instrument Setup for TAP transfer Biomek method: “120816­TAPfor96Cryo”. 

 Figure 2: Instrument Setup for CPA addition Biomek method “120710Cryopreservation”.  The method adds CPA to the first 4 (left) plates, then pauses.  This allows user to foil these plates and then resume method while bringing said plates to ­80C freezer.