CromatografiaCromatografiaScrittura del colore Scrittura del colore

Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo

Le tecniche sono molto utilizzate, permettendo l’analisi di miscele complesse come sono la maggior parte dei campioni di natura organica

Cenni storici 1903-1906: nascita “Cromatografia” grazie a un botanico russo (M. Tswett)

1938: introduzione della T.L.C. e della cromatografia a scambio ionico

1941: cromatografia di ripartizione liquido-liquido

1944: cromatografia su carta

1950: cromatografia a fase inversa

1951: gas-cromatografia

1959: cromatografia a permeazione di gel

1965: cromatografia liquida ad alte prestazioni

Principi della cromatografia

-la differente velocità di migrazione dei componenti costituenti una miscela (equilibrio dinamico)

-Fase mobile (MP), liquida o gassosa

-Fase stazionaria (SP), solida o liquida, stratificata su vetro o alluminio o impaccata in una colonna

Fase fissa A Fase mobile

Fase fissa B Fase mobile

Fase fissa C Fase mobile

-Spostamento della fase mobile determina l’avanzamento del soluto in essa contenuto mentre le molecole che sono distribuite nella fase stazionaria resteranno momentaneamente ferme

XXMM X Xss

Soluto Soluto XX migrerà con una velocità proporzionale a migrerà con una velocità proporzionale a KKxx

o coefficiente di distribuzione tra le due fasi o coefficiente di distribuzione tra le due fasi (dipendente dal tempo che X spende nelle due fasi)(dipendente dal tempo che X spende nelle due fasi)

m

sX [X]

[X]K

Il Il coefficiente di distribuzionecoefficiente di distribuzione del componente X è del componente X è definito come:definito come:

Quale componente ha K maggiore?

A: il campione viene iniettato all’entrata della colonnaB D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria

A B C D

Flu

sso

de

l sol

vent

e

KA ≠ KB ≠ KC

VA = 1

VM + VS KA

[A]S = 0 A non ha alcuna affinità per la fase

fissa e si muove con il fronte della fase mobile

[A]M = 0 A non ha alcuna affinità per la fase mobile per cui si distribuisce

completamente nella fase fissa senza spostarsi

Riportando il segnale in funzione del tempo si ottiene il cromatogramma

Se [X]f=0 allora Vx è max e uguale alla Veluente e il Volume dell’eluente necessario a eluire X è pari al volume dello spazio interstiziale non occupato dalla fase fissa detto volume interstiziale o Vm.

Se [X]f≠0 allora Vx è < di Veluente e il Volume dell’eluente necessario a eluire X volume di ritenzione VR sarà maggiore del Vm.

Allora VR-Vm = VR’ o volume netto di ritenzione

Tempo di ritenzione

tM = t0 = tempo morto

tR’ = tR - t0 = tempo netto di ritenzione, tempo trascorso da un dato soluto nella fase stazionaria

Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector.

Relazioni che quantificano l’interazione di un dato soluto con la fase stazionaria

VR = tR . F Vm = t0 . F

F (velocità di flusso)

FATTORE di CAPACITA’V = velocità lineare media di migrazione di un soluto = L/tR

U = velocità lineare media di flusso della fase mobile = L/t0

V = u . (frazione di tempo che il soluto passa nella fase mobile)

V = u . [CM.VM/CMVM+CSVS]

1

1 + CSVS/CMVM

V = u .

L/tR = L/t0 .1

1 + K VS/VM

tR = t0 (1 + K VS/VM) = t0 (1 + K’)

M

MR

ttt

K'

Fattore di ritenzione o rapporto di distribuzione di massa

k’ dipende:•dalla T°•dalla natura delle fasi•dalle caratteristiche dell’impaccamento•dalla granulometria e dallo spessore della fase stazionaria

k’ non dipende:•dalla lunghezza della colonna •dal flusso

La La selettivitàselettività quantifica l’entità della separazione fra due specie: quantifica l’entità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (tdelle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (tRR))BB> (t> (tRR))AA..

MAR

MBR

A

B

t)t(

t)t(

'k

'k

Usato per confrontare le prestazioni di colonne diverse a parità di eluente

Fattore di separazione o

Ritenzione relativa

Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola separazione, N ha un significato puramente matematico.

Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna.

Parametri che descrivono quantitativamente Parametri che descrivono quantitativamente l’efficienzal’efficienza di una di una colonna (ampiezza dei picchi):colonna (ampiezza dei picchi):

1)1) Altezza equivalente di piatto teorico HAltezza equivalente di piatto teorico H2)2) Numero di piatti teorici N Numero di piatti teorici N

L = lunghezza colonnaL = lunghezza colonnaH

LN

Si può dimostrare che

W = larghezza del picco

2R

W

t16N

W

Separazione ottimaleSeparazione ottimale

a) separazione con scarsa risoluzione e basso N

b) migliora la risoluzione ma è sempre basso N

c) ottima risoluzione e buono N

1k

k1N

4

1R

IB

IB

Si può dimostrare che:Si può dimostrare che:

risoluzione scarsa per scarsa risoluzione scarsa per scarsa efficienza e scarsa selettivitàefficienza e scarsa selettività

buona risoluzione dovuta a buona risoluzione dovuta a buona efficienza e buona buona efficienza e buona selettivitàselettività

risoluzione scarsa dovuta ad risoluzione scarsa dovuta ad una basso selettività.una basso selettività.

buona risoluzione dovuta a buona risoluzione dovuta a buona selettività, ma efficienza buona selettività, ma efficienza non troppo elevatanon troppo elevata

Una Una buona risoluzionebuona risoluzione può derivare sia da una può derivare sia da una buona buona efficienzaefficienza (picchi molto stretti, elevato numero di piatti (picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una teorici) sia da una buonabuona differenziazione del differenziazione del comportamento dei soluti (comportamento dei soluti (selettivitàselettività).).

Interazione soluto-fasiInterazione soluto-fasiLe interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni:

• legami a idrogeno• interazioni dipolo-dipolo• interazioni dipolo-dipolo indotto• forze di Van der Waals• formazione di composti di

interazione•attrazione coulombiana• interazioni steriche

In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico

Meccanismi di separazione• ripartizione

• adsorbimento

• scambio ionico

• esclusione

• affinità

CromatografiaFase mobile: liquida Fase mobile: gassosa

CROMATOGRAFIA LIQUIDA (L.C.)

GAS-CROMATOGRAFIA (G.C.)

Fase fissa: liquida

CROMATOGRAFIA di RIPARTIZIONE (L.L.C.)

Colonna

Strato sottile

Carta

Fase fissa: solida

CROMATOGRAFIA di ASSORBIMENTO (L.S.C.)

Colonna/strato sottile

CROMATOGRAFIA a SCAMBIO IONICO (L.S.C.)

Colonna/strato sottile

GEL CROMATOGRAFIA

Colonna/strato sottile

CROMATOGRAFIA di AFFINITA’

Fase mobile: fluido supercritico

CROMATOGRAFIA LIQUIDA SUPERCRITICA (S.F.C.)

RIPARTIZIONERIPARTIZIONE

La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte (gel di silice) o è ad esso chimicamente legato; in questo liquido le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e la fase mobile devono invece essere immiscibili. Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi di cromatografia di ripartizione, che può essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda della natura della fase mobile.

≡Si-OH + R-SiCl3 + 2 H2O ≡Si-O-Si(OH)2-R + 3 HCl

La cromatografia di ripartizione è chiamata in fase normale se la fase stazionaria è più polare della fase mobile, mentre è chiamata fase inversa se la fase stazionaria è meno polare della fase mobile. Si tratta della tecnica più comunemente impiegata per la separazione di sostanze organiche

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI RIPARTIZIONEdi RIPARTIZIONE (L.L.C.)

In fase normale

Fase stazionaria polare

≡Si-O-Si(R)2-CN

≡Si-O-Si(R)2-NH2

Fase mobile a bassa polarità

Solventi organici

Soluzioni acquose

(zuccheri, steroidi, amminoacidi,

proteine e peptidi)

In fase inversa

Fase stazionaria apolare

≡Si-O-Si(CH3)2

≡Si-O-Si-CH2-(CH2)6-CH3

≡Si-O-Si-CH2-(CH2)16-CH3

Fase mobile molto polare

Soluzioni acquose o tamponate

Miscele acqua/metanolo/acetonitrile

(ammine, vitamine, idrocarburi, analgesici)

ADSORBIMENTOADSORBIMENTO

La fase stazionaria è un solido in polvere (gel di silice o allumina); sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi (-OH) che possono stabilire legami deboli (reversibilireversibili!) con le molecole della miscela da separare (ma anche con le molecole d’acqua, disattivandolo). Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento, che può essere gas-solido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile.

Per sostanze molto polari è preferibile usare gel disattivati, mentre per sostanze con bassa polarità si preferiscono le silici non modificate.

Le fasi mobili più usate in ordine di polarità crescente e quindi di potere eluente sono:

Esano, isottano, cloroformio, acetonitrile, metanolo, acqua.

SCAMBIO IONICOSCAMBIO IONICOLa fase stazionaria è costituita da un polimero inerte (resine sintetiche) contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili (gruppi funzionali acidi o basici), i cui contro-ioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico (IEC)

La cromatografia a scambio ionico è impiegata per la separazione di sostanze

ioniche o ionizzabili (amminoacidi, nucleosidi,

nucleotidi)

Resina a scambio cationico: -SO3H, -COOH

Resina a scambio anionico: -NH2, -N(CH3)2

La fase mobile è un tampone anionico (acetato) o cationico (tris) contenenti ioni della stessa carica di quella dei campioni (capacità di spostamento, pH, t °)

Fase stazionaria: scambiatore cationico forte polistirene solfonato Fase mobile: tampone citrato/acido citrico Eluizione con gradiente di pH e forza ionica, ad esempio citrato/acido citrico da pH 2 a pH 5 e di ioni Na+ da 0,2 a 0,4M.

Gli aminoacidi vengono eluiti sequenzialmente quando i valori del pH si avvicinano al loro punto isoelettrico:

a pH basso: acidi (es. Asp, Glu) a pH neutro: neutri (es. Gly, Val) a pH basico: basici (es. Lys, Arg)

Un analizzatore di amminoacidi contiene un sistema continuo di registrazione dell'eluato: nel cromatogramma ad ogni picco corrisponde un amminoacido.

ESCLUSIONE DIMENSIONALEESCLUSIONE DIMENSIONALE

La fase stazionaria è un solido poroso o un gel di granulometria definita (acrilammide o sephadex) per cui i campioni vengono separati in base alla dimensione delle loro molecole. Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi (la fase stazionaria si comporta da setaccio, intervallo di PM).

Si parla di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC)

oGel permeazione (GPC)Gel permeazione (GPC) per la separazione di sostanze insolubili in acqua

oGel filtrazione (GFC)Gel filtrazione (GFC) per la separazione di sostanze solubili in acquaLa tecnica è impiegata per la separazione di molecole di grandi dimensioni (peptidi, proteine, polimeri)

AFFINITA’AFFINITA’

In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifichereversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria a cui è chimicamente legato un ligando specifico così da ottenere l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Si parla di cromatografia di affinità (AFC).Ligandi tipici sono substrati di reazioni enzimatiche, inibitori, cofattori, recettori, basi di sequenza complementari, ormoni, anticorpi, ecc…Le matrici più utilizzate sono l’agarosio, la poliacrilammide, il destrano, la cellulosa; scarse interazioni aspecifiche, buone proprietà di flusso, gruppi chimici modificabili, stabilità a variazioni di pH e di temperatura.

La cromatografia di affinità è impiegata nella separazione di molecole di interesse prevalentemente biochimico

Cromatografia classica su colonnaCromatografia classica su colonna

Le colonne impiegate sono generalmente in vetro e possono essere di varie dimensioni secondo le esigenze.

Il riempimento della colonna può essere costituito da materiale solido adsorbente, finemente suddiviso, asciutto e scelto opportunamente in base alla separazione da effettuare (per LSC) oppure la colonna viene riempita con supporto granulare inerte, generalmente gel di silice, che viene impregnato con solvente opportuno e che costituirà la fase fissa (per LLC) o ancora una resina a scambio ionico per cromatografia ionica.

Il solvente scelto, contenente la miscela da separare, viene fatto fluire attraverso la colonna.

Il metodo strumentale della cromatografia liquida ad alta pressione è frutto dell’evoluzione tecnologica delle tecniche di cromatografia su colonna.

I principi sono sempre quelli dell’adsorbimento e della ripartizione, ma le fasi stazionarie sono impaccate in colonne chiuse, con materiali di granulometria molto fine (3-10 m) e controllata: in tal modo viene aumentata la superficie di contatto fra fase mobile e fase stazionaria e l’impaccamento diviene più omogeneo.

Utilizzando queste colonne è necessario che la fase mobile venga fatta fluire ad alta pressione perché, attraverso colonne con impaccamento a granulometria così fine, il flusso dell’eluente diventa molto lento.

Con l’impiego di pompe particolari, capaci di applicare pressioni di 50-150 atm, diventa possibile ottenere flussi di alcuni ml/min, sufficienti ad ottenere l’eluizione in tempi ragionevolmente brevi.

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

HPLC - Vantaggi rispetto alla LC classica: velocità, risoluzione e sensibilità superiori

A BC

A.A. crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d = 100 = 100 m, D = 20-50 mm, L = 200-100 cm)m, D = 20-50 mm, L = 200-100 cm)

B.B. HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 m, D = 1-3 mm, L = 50-m, D = 1-3 mm, L = 50-100 cm)100 cm)

C.C. HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 m, D = 2-6 mm, L m, D = 2-6 mm, L = 10-50 cm)= 10-50 cm)

d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna

LC classica: LC classica: 1) dimensione delle particelle e 1) dimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto diametro interno della colonna molto maggiori che nella HPLCmaggiori che nella HPLC2) velocità di flusso molto basse2) velocità di flusso molto basse3) tempi di analisi lunghi3) tempi di analisi lunghi

HPLC: HPLC: 1) impaccamento di dimensioni 1) impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in molto inferiori, compresso in colonne sottilicolonne sottili2) contropressioni maggiori2) contropressioni maggiori3) tempi d’ analisi contenuti3) tempi d’ analisi contenuti

Cercando di aumentare la velocità del Cercando di aumentare la velocità del

solvente, diminuiscono efficienza e solvente, diminuiscono efficienza e

risoluzione a causa del limitato risoluzione a causa del limitato

trasporto di massa nei pori profondi e trasporto di massa nei pori profondi e

nei lunghi canali interparticellari.nei lunghi canali interparticellari.

Per favorire il flusso della fase mobile è Per favorire il flusso della fase mobile è

quindi necessario l’uso di pompe ad quindi necessario l’uso di pompe ad

alta pressione. Efficienza aumentata di alta pressione. Efficienza aumentata di

10-100 e tempi di separazione 10-100 e tempi di separazione

diminuiti (miglioramento nei termini di diminuiti (miglioramento nei termini di

trasporto di massa della fase trasporto di massa della fase

stazionaria e della fase mobile).stazionaria e della fase mobile).

La pressione dipende da diversi paramentri:

η = viscosità del solvente

V = velocità lineare di flusso

L = lunghezza della colonna

K = costante legata alle caratteristiche fisiche del

riempimento della colonna

d = diametro della colonna

1 pascal = 1 newton/m2 = 1x105 bar

1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm2

Le colonne per HPLC sono in acciaio o in plastica, lunghe 5-30 cm e con diametro interno di 1-5 mm.

Le colonne sono costose e vengono facilmente danneggiate da polvere o da particelle o impurezze presenti nel campione e nel solvente. È per questo che è necessario proteggere l’ingresso della colonna principale con una pre-colonna che contiene la stessa fase stazionaria della colonna principale, ma è più corta e può venire periodicamente sostituita.

La fase stazionaria più comune è costituita da particelle microporose di silice ad elevata purezza, permeabili al solvente e con elevata area superficiale (alcune centinaia di m2/g). Questa fase stazionaria viene generalmente impiegata per cromatografia di adsorbimento. Più comunemente, si realizza la cromatografia di ripartizione impiegando fasi stazionarie legate, ossia fissate covalentemente alla superficie della silice.

Fasi polari comuni Fasi non polari comuni

R = (CH2)3NH2 ammino R = (CH2)17CH3 ottadecile

R = (CH2)3CN ciano R = (CH2)7CH3 ottile

La C18 (anche indicata con ODS) è la fase stazionaria di gran lunga più

utilizzata in HPLC

• riserva di solventi: uno o più solventi che possono essere utilizzati singolarmente o in miscela

• pompa con pressione fino a 400 Atm, flusso stabile tra 0.1 e 10 ml/min

• sistema di iniezione costituito da una valvola a più vie e da un circuito a volume fisso, o loop, nel quale si mette il campione

• colonna cromatografica ed eventuale precolonna

• rivelatore per monitorare gli eluati

• PC per gestire il sistema e i dati

Eluizione isocratica e a gradiente

Con 1 solo solvente o con una miscela di solventi di composizione costante.

Variazione continua della composizione del solvente per aumentare la forza eluente. Una forza eluente crescente è necessaria per eluire i soluti più fortemente trattenuti e per migliorare le separazioni.

SOLVENTESOLVENTEDEBOLEDEBOLE

SOLVENTESOLVENTEFORTEFORTE

FORZAFORZAINTERMEDIAINTERMEDIA

GRADIENTEGRADIENTEDI SOLVENTEDI SOLVENTE

Sistemi di rivelazione

• Sensibilità adeguata al problema

• Buona stabilità e riproducibilità

• Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza

• Tempi di risposta rapidi

• Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti

Rivelatore LOD (ng) Selettività

Utilizzabile in gradiente?

Assorbimento UV 0.1-1 selettivo SI

Indice di rifrazione 100-1000 generale NO

Fluorescenza 0.001-0.01

selettivo SI

Elettrochimico 0.01-1 selettivo NO

Conduttimetrico 0.5-1 selettivo NO

Assorbimento IR 1000 selettivo SI

Spettrometro di massa

0.1-1 generale SI

GAS-CROMATOGRAFIA

In gascromatografia (Martin e Synge 1941 e poi James e Martin 1952) la fase mobile è un gas che fluisce in una colonna in cui è posta la fase stazionaria.

I meccanismi di separazione dei componenti la miscela sono determinati dalla fase stazionaria, poiché quella mobile funziona solamente da gas di trasporto(carrier).

Condizione indispensabile per operare un’analisi gascromatografica su una miscela è che essa sia in grado di passare in fase vapore alla temperatura di lavoro.

VANTAGGI DELLA GCVANTAGGI DELLA GC

•Poco costosaPoco costosa

•Altamente sensibile (10Altamente sensibile (10-9 -9 - 10- 10-13-13 g/mL)g/mL)

•Robusta Robusta

•RiproducibileRiproducibile

•RapidaRapida

•Separazione di mix complesse Separazione di mix complesse (100 analiti in GC-capillare)(100 analiti in GC-capillare)

SVANTAGGI DELLA GCSVANTAGGI DELLA GC

Non applicabile all’analisi di Non applicabile all’analisi di macromolecole, sostanze termolabili, macromolecole, sostanze termolabili, altamente polari o idrofilealtamente polari o idrofile

Cromatografia di adsorbimento gas-solidoCromatografia di adsorbimento gas-solido (fase stazionaria = (fase stazionaria = solido adsorbente)solido adsorbente) Cromatografia di ripartizione gas-liquidoCromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria = (fase stazionaria = liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti della colonna)sulle pareti della colonna)A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: il il gas di trasporto o CARRIER serve solo per trascinare i gas di trasporto o CARRIER serve solo per trascinare i componenti lungo la colonna.componenti lungo la colonna.

Trattamento del campione

Derivatizzazione: usata per sostanze altobollenti

• Reagenti sililantiHMDS esametildisilazano (zuccheri)TMCS trimetilclorosilano (acidi carbossilici)BSA bistrimetilsililacetamide (alcoli, ammine, acidi carbossilici,

fenoli, steroidi, alcaloidi)BSTFA bistrimetilsililtrifluoroacetamide (come BSA froma deivati poù

volatili)

• Reagenti acilantiTFAA anidride trifluorometansolfonica (alcoli, fenoli, ammine)PFPA anidride pentafluoropropionica (alcoli, fenoli, ammine)HFBA anidride eptafluorobutirrica (tioli)

• Reagenti alchilantiTMPAH idrossido di trimetilanilinio (COOH, NH2, OH, barbiturici, sedativi,

basi xantiniche, alcaloidi fenolici)BF3 in etanolo (acidi grassi dei trigliceridi)PFBBr pentafluorobenzilbromuro (acidi, fenoli, tioli e solfonammidi)

He, Ar, N2

SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO

SISTEMA DI INIEZIONEFUNZIONI:

- Introduzione del campione

- Evaporazione del campione

- Ingresso del gas di trasporto

- Collegamento alla colonna

L’entrata deve essere ad una temperatura sufficientemente elevata da permettere l’evaporazione istantanea del campione e abbastanza grande da permettere al vapore di espandersi senza essere spinto indietro.

Nelle colonne impaccateNelle colonne impaccate, il campione (max 0,5 mL) viene introdotto direttamente nel flusso del , il campione (max 0,5 mL) viene introdotto direttamente nel flusso del

gas-carier atttarverso una camera di iniezione che assicura la immediata vaporizzazione della gas-carier atttarverso una camera di iniezione che assicura la immediata vaporizzazione della

miscela (T° 50-100°C).miscela (T° 50-100°C).

Nelle colonne capillariNelle colonne capillari, la quantità che arriva in colonna è invece notevolmente inferiore (fino a , la quantità che arriva in colonna è invece notevolmente inferiore (fino a

100 volte) e questo può essere realizzato con vari tipi di valvole. 100 volte) e questo può essere realizzato con vari tipi di valvole.

COLONNE Per gas-cromatografia

Le Le impaccateimpaccate (acciaio, vetro o (acciaio, vetro o

rame) contengono particelle rame) contengono particelle

solide inerti di appropriata solide inerti di appropriata

granulometria, eventualmente granulometria, eventualmente

imbevute della fase stazionaria imbevute della fase stazionaria

liquida (diametro = 0.75 - 4 liquida (diametro = 0.75 - 4

mm; lunghezza = 6 m)mm; lunghezza = 6 m) ..

Le Le capillaricapillari sono tubi molto più sono tubi molto più

sottili e lunghi (diametro = 0.1 - sottili e lunghi (diametro = 0.1 -

0.75 mm; lunghezza = 15-300 0.75 mm; lunghezza = 15-300

m) in cui la fase stazionaria è m) in cui la fase stazionaria è

depositata sulle pareti interne. depositata sulle pareti interne.

Queste ultime hanno un elevato Queste ultime hanno un elevato

numero di piatti teorici (anche numero di piatti teorici (anche

300.000) grazie alla loro elevata 300.000) grazie alla loro elevata

lunghezza.lunghezza.

“canalicoli” dell’impaccata

unico “canalone” della capillare

WCOT= wall-coated-open-tubular

SCOT= support-coated-open-tubular

Le fasi stazionarie più usate in Le fasi stazionarie più usate in

GC di adsorbimento sono: GC di adsorbimento sono:

Gel di siliceGel di silice

AlluminaAllumina

Carbone attivoCarbone attivo

Carbone grafitizzatoCarbone grafitizzato

Microparticelle sferiche di carboneMicroparticelle sferiche di carbone

ZeolitiZeoliti

Sali inorganiciSali inorganici

I supporti inerti più usati in GC di I supporti inerti più usati in GC di

ripartizione sono: ripartizione sono:

Terra di DiatomeeTerra di Diatomee

TeflonTeflon

Microsfere di vetroMicrosfere di vetro

Le fasi stazionarie più usate Le fasi stazionarie più usate

(ancorate, legate) sono:(ancorate, legate) sono:

IdrocarburiIdrocarburi

Esteri e poliesteriEsteri e poliesteri

PolieteriPolieteri

Ammidi, ecc….Ammidi, ecc….

Influenza della temperatura sulla corsa cromatografica

• Normalmente la temperatura della colonna è regolata sul valore corrispondente alla media dei punti di ebollizione dei componenti della miscela.

• Per miscele particolarmente complesse con punti di ebollizione troppo distanti tra di loro la scelta della temperatura è problematica.

• Per tali miscele un temperatura troppo alta consentirebbe una buona separazione dei componenti altobollenti ma ammasserebbe quelli più bassobollenti.

• Al contrario, una temperatura troppo bassa, non consentirebbe di separare quelli altobollenti.

Nei moderni strumenti la programmazione è di tipo lineare, e prevede le seguenti tappe:

Isoterma iniziale: indica quanto tempo si rimane a una determinata temperatura.Fase di rampa: si stabilisce la temperatura da raggiungere e con quale velocità.Isoterma finale: indica il tempo che si deve restare alla temperatura più alta.Raffreddamento: si attua dopo la fine della registrazione del cromatogramma

45°

145°

programma di T

Sistemi di rivelazione

• Sensibilità adeguata al problema

• Buona stabilità e riproducibilità

• Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza

• Tempi di risposta rapidi

• Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti

Rivelatore Selettività

Termoconducibilità TCD Non selettivoInsostituibile per l’analisi dei gas

Ionizzazione di fiamma Poco selettivo

Azoto-fosforo (NPD) o a fiamma alcalina

selettivo

A Cattura di elettroni (ECD) SelettivoOrganofosforici, diossine,

benzodiazepine

Spettrometro di massa generale

Limite di linearitàè la concentrazione massima al di là della quale il segnale non è più proporzionale alla concentrazione (con una tolleranza del 5%).

Intervallo di linearità range di concentrazioni compresa tra il limite di rivelabilità e il limite di linearità. Intervallo di

risposta dinamico

intervallo di concentrazioni entro il quale il

rivelatore risponde, anche

se non in maniera lineare

Limite di rivelabilità

è la concentrazione

minima che dà una risposta doppia del

rumore di fondo

Limite intervallo di risposta dinamico; oltre questa concentrazione non si possono fare misure

Riassumendo

• analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici

Gascromatografia

• analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici, termicamente instabili

Cromatografia liquida

La Radiazione Elettromagnetica è costituita da un campo magnetico e da un campo elettrico oscillanti su due piani perpendicolari alla direzione di propagazione dell’onda.

Parametri che descrivono la natura ondulatoria dell’onda:

-Lunghezza d’onda : distanza tra i due massimi o tra i due minimi.

-Ampiezza d’onda: in valore assoluto la distanza tra la direzione di propagazione dell’onda e il punto di max o di min.

-Frequenza : numero di onde che passano un dato punto nell’unità di tempo.

La descrizione quantitativa delle interazioni tra la radiazione e la materia è possibile solo se si considera la radiazione come formata da quantità discrete, chiamate FOTONI. L’energia dei fotoni è proporzionale alla frequenza della radiazione.

SPETTROSCOPIA

E’ la disciplina che studia l’INTERAZIONE delle radiazioni elettromagnetiche con gli stadi quantici di energia della materia.

In virtù di questa interazione, si determina una variazione dell’energia che può interessare nuclei, elettroni, atomi o molecole.

assorbire la radiazione > il suo contenuto energetico (SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO)

emettere la radiazione < il suo contenuto energetico (SPETTROSCOPIA di EMISSIONE)

diffondere la radiazione (SPETTROSCOPIA RAMAN)

Tutti questi tipi d’interazione possono avvenire solo per determinate l della radiazione incidente e quindi solo per determinate . h = E’-E” differenza di energia tra i due stati del sistema.

SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTOProcesso mediante il quale una sostanza rimuove

selettivamente alcune frequenze dalla radiazione elettromagnetica.

Lo spettro non è altro che la rappresentazione grafica delle transizioni energetiche permesse (Regole di selezione) sotto forma di righe.

1. Transizioni elettroniche ETOT = Ee + Ev + Er + Et

2. Transizioni vibrazionali

3. Transizioni rotazionali

4. Transizioni traslazionali

Een

Ee1

Ee0

Evn

Ev2

Ev1

Er0

Ern

, E

Ev0

Infrarosso lontano,

microonde

TRANSIZIONI

Rotazionali VibrazionaliElettroniche

Infrarosso

Visibile, Ultravioletto, Raggi

X

Onde Radio

Variazioni di energia troppo

deboli per essere osservate se non sotto un intenso

campo magnetico

STATI di SPIN INDOTTI

MAGNETICAMENTE

EPR (elettroni)

NMR (nuclei)

La legge dell’assorbimento o Legge di Beer

E’ la legge sperimentale che descrive i fenomeni di assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche in generale e con particolare riferimento alle soluzioni.

A = . b . C

A = assorbanza o frazione di energia assorbita

b = cammino ottico (cm), spessore della soluzione attraversata dal raggio

c = concentrazione (mol/L) della specie in esame

= assorbività o coefficiente di estinzione molare o di assorbimento molecolare (IUPAC), cioè l’assorbanza a concentrazione e spessore unitari.

(, dal solvente, dalla natura chimica della specie che assorbe; non dipende in generale dalla temperatura)

Se è costante e b (cammino costante) allora l’equazione assume la forma A = kc e quindi del tipo y = mx.

Altro modo per descrivere il fenomeno dell’assorbimento consiste nell’usare la definizione di Trasmittanza

T =

T = trasmittanza

I0 = intensità della radiazione incidente

I = intensità della radiazione che esce dal campione

Questa grandezza è legata all’Assorbanza secondo la relazione:

A = log 1/T = log I0/I

Se T% = 100T

A = log 100/T% = 2-log T% oppure T% = 102-A

A varia tra 0 e infinito mentre T% varia tra 0 e 100.

Fattori che possono determinare deviazioni dalla linearità:

-Concentrazione della soluzione (10-2/10-7), se troppo concentrata si può avere una variazione dell’indice di rifrazione e quindi di , così come si possono formare coppie ioniche o complessi o aggregati.

-Variazioni di pH, perché influenza l’equilibrio tra due forme della stessa sostanza, aventi diverso ad una stessa .

-Temperatura, perché influenza sempre un eventuale equilibrio; tuttavia variazione nell’ordine di ±5 °C non comportano particolari problemi.

-Solvente, perché la polarità del solvente influisce sulla distribuzione elettronica nella molecola analizzata. Ad es solventi polari o con alta costante dielettrica esercitano un effetto batocromo.

-Co-presenza di fenomeni di fluorescenza (emissione) e diffusione della radiazione.

-Fattori strumentali (ampiezza della banda passante)

Spettri di assorbimento e scelta della lunghezza d’onda per la misura dell’assorbanza

Una sostanza assorbe in modo diverso le varie radiazioni, cioè a diverse corrispondono vari .

Lo spettro di assorbimento che si ottiene è uno spettro a bande caratterizzato dalla presenza di massimi (picchi di assorbimento) e minimi.

Ogni sostanza ha un suo spettro caratteristico ed è proprio individuando la posizione dei massimi caratteristici che si realizza l’analisi qualitativa.

L’analisi quantitativa viene invece fatta scegliendo un’opportuna , detta lunghezza d’onda analitica, scelta in modo che corrisponda ad un max o ad un min.

Transizioni elettroniche e cromofori

L’assorbimento nel campo UV-VIS è dovuto a transizioni elettroniche da orbitali di legame a orbitali di non-legame o di anti-legame a più alto contenuto energetico e questo è possibile solo se la radiazione possiede un’energia pari al E tra i due livelli.

π π*

n π*

Le prime sono caratteristiche dei sistemi insaturi e le seconde di eteroatomi con doppietti liberi; sistemi di questo tipo sono indicati come cromofori.

C=C, C≡C, C=O, C≡N, C=S, N=O, N=N, polieni, aromatici, ecc…

Effetto dei sostituenti

Effetto Batocromo: diminuisce il E della transizione, alzando il contenuto energetico dell’orbitale legante o diminuendo quella dell’orbitale anti-legante o non-legante. Il picco (l’assorbimento) viene spostato a maggiori (sostituenti e- ricchi o donatori).

Effetto Ipsocromo: effetto opposto al precedente; aumenta il E e quindi diminuisce la dell’assorbimento (sostituenti e- poveri o elettronegativi).

Effetto Ipercromico: risulta aumentato o per aumento della probabilità che avvenga quella data transizione o per aumento della superficie del cromoforo; aumenta l’assorbanza ma rimane costante la a cui il composto assorbe.

Effetto Ipocromico: effetto opposto al precedente; diminuzione di e quindi dell’assorbanza.

Rivelatore UV a fissaVantaggi e svantaggi

Il principale vantaggio è il basso costo. Inoltre l’elevata intensità della radiazione della lampada a Hg permette di ottenere elevata sensibilità per composti che assorbono a 254 nm.

Il principale svantaggio è determinato dalla scarsa selettività dovuta alla necessità di lavorare a fissa.

Rivelatore UV a variabile

Vantaggi

- Versatilità: possibilità di selezionare da 190 a 800 nm.

- Elevata sensibilità: potendo scegliere la ottimale (max assorbanza) per un analita.

- Selettività: quando si hanno sovrapposizioni di picchi si può variare la in modo tale da minimizzare l’assorbimento degli interferenti.

- Possibilità di utilizzare gradiente di eluizione, scegliendo una alla quale la miscela solvente non assorbe.

Dopo un’ora

Separazione di una tossina proteica, della tossina coniugata con la biotina e dell’avidina (fattore antinutrizionale)

Avidina

Glicoproteina dell’albume che impedisce l’assorbimento della biotina

Biotina (IUPAC)

Vitamina H o I (tedesca)

Vitamina B7 (anglosassone)

Vitamina B8 (francese)

Lo spettrometro di massa può fornire informazioni qualitative e quantitative sui componenti della miscela analizzata mediante HPLC. Per ottenere uno spettro di massa, le molecole portate in fase gassosa, vengono ionizzate. Gli ioni sono quindi accelerati per mezzo di un campo elettrico e vengono poi separati in base al loro rapporto massa/carica (m/z).

L’accoppiamento HPLC-MS è una tecnica relativamente “giovane” e sempre più utilizzata.

Lo MS in un sistema integrato HPLC-MS può servire come rivelatore universale (o comunque come un rivelatore che risponde ad un’estesa gamma di soluti) e sensibile.

L’accoppiamento HPLC/MS è stato tentato già molti anni fa (fine anni ’60), ma soltanto dalla metà degli anni ’70 appaiono le prime pubblicazioni scientifiche.

Le difficoltà di tutti i metodi HPLC-MS derivano dal fatto che in HPLC si utilizzano solventi molto diversi, in funzione del tipo di analisi, (es. acqua, solventi organici, tamponi); inoltre i flussi in LC sono molto elevati rispetto a quelli richiesti per lo spettrometro di massa. Per accoppiare le 2 tecniche sono pertanto necessarie opportune interfacce che oltre a ridurre i flussi dovranno consentire anche la vaporizzazione degli analiti mediante riscaldamento.

Spettrometro di Massa

analita

Camera di ionizazione

fascio ionico

Campo elettrico acceleratore

Campo magnetico analizzatore

1) il sistema di entrata

2) la sorgente ionica, il cuore dello spettrometro, in cui le molecole neutre vengono trasformate in ioni e si frammentano

3) l’analizzatore, in cui gli ioni vengono separati in funzione del rapporto massa/carica (m/z)

4) il rivelatore, in cui gli ioni vengono raccolti ed i segnali inviati, dopo amplificazione, al registratore che converte le informazioni contenute nei segnali in uno spettro.

Spettrometro di Massa a Quadrupolo Iperbolico

1) M + e- M+ + 2e-

M1+ M3

+

2) M+ M2

+ M4+

, etc.

50 100 150 200 massa relativa

Abb

onda

nza

rela

tiva

Ogni molecola ha una frammentazione unica e caratteristica che, come una vera e propria impronta digitale, ci permette di identificare e di risalire alla molecola madre.

Normalizzazione dei picchi

1) Formazione ione molecolare (parente)2) Formazione ioni di frammantazione

3) Formazione di ioni di riarrangiamento (trasposizione)

AB + e- [AB]+. + 2e-

PM

[AB]+. [A]+ + [B].

catione radicale

[A]+ [C]+ + [D] catione molecola neutra

[AB]+. [EF]+. + [D] ione radicale molecola neutra

Informazioni sulla struttura

(identificazione dei composti)

La presenza di picchi isotopici, aventi quindi rapporto

m/z = M+ + 1 (o 2, 3, 4, ecc…)

con intensità proporzionale all’abbondanza isotopica naturale

Tre requisiti (necessari, ma non sufficienti) perché un picco sia effettivamente lo ione molecolare:

- Picco a massa più alta- Ione ad elettrone dispari (ione radicalico)- Spiegare tutti gli ioni più importanti nella zona delle

masse alte dello spettro in base a perdite logiche di specie neutre.

Grado di insaturazione (n° di anelli + n° di = legami) = X – ½ Y + ½ Z + 1

CxHyNzOn

C6H6 6 - 3 + 1 = 4 (1 anello + 3 = legami)

C7H5O 7 – ½ 5 + 1 = 5,5

CO

Regola dell’azotoIone molecolare pari = 0, 2, 4, …. n° di N

Ione molecolare dispari = 1, 3, 5, ….n° di N(azoto ha massa pari ma valenza dispari)

Analisi dei picchi isotopici- M+2: stessa intensità di M 1 atomo di Br- M+2: 33% intensità di M 1 atomo di Cl- M+2: 4% intensità di M 1 atomo di S- M+2, M+4, M+6,….. 2, 3,….atomi di Br,

Cl,..

Frammentazione

Ioni neutri non vengono rivelati ma possono essere individuati indirettamente dalla differenza di massa tra

lo ione molecolare e lo ione frammento vicino.Es.- Perdite di 1, 2, 3 sono plausibili- Perdite tra 4-14 no

- Perdita di 15 palusibile (CH3)

- Perdite tra 21-25 no

Tipi di ionizzazioneElettronica (E.I.)Chimica (C.I.)I. di campo (F.I.)Disassorbimento di campo (F.D.)

1) E.I.Gli ioni vengono generati per interazione con e- ad alta energia emessi da un filamento di tungsteno o renio portato all’incandescenza per riscaldamento elettrico.

(Alta frammentazione, bassa intensità dello ione molecolare)

2)C.I.Gli ioni vengono generati per interazione con ioni derivanti dalla ionizzazione elettronica di un gas reagente (metodo soft di ionizzazione); metano, isobutano, ammoniaca.(Oltre alla ionizzazione si ha il trasferimento di un protone per cui si formerà [MH]+; minore frammentazione)

3)F.I. e F.D.in entrambi i metodi gli ioni sono generati da un forte campo elettrico che si instaura a causa della forte differenza di potenziale tra due elettrodi (metodo soft di ionizzazione); cambia il sistema di introduzione del campione che nell’F.D. è deposto direttamente in soluzione sull’anodo (miglioramento dell’efficienza, picco [M]+ o [MH]+ intensi)

E.S.I. Electro spray ionization

E’ il metodo di ionizzazione che più di frequente si trovaaccoppiato all’LC, potendo utilizzare campioni liquidi osolidi, scarsamente volatili o termolabili (soft ionization).Molecole con PM relativamente altoPresenza di legami deboli e labili Elevata sensibilità

Il campione liquido viene spruzzato sotto pressione e le goccioline caricate dal potenziale applicato al capillare.

Nella camera di evaporazione, il gas e il riscaldamento fanno evaporare e desolvatare le goccioline cariche. Aumenta la densità di carica fino all’esplosione in goccioline più piccole caricate positivamente o negativamente.

Quattro barre cilindriche parallele due caricate positivamente e due negativamente collegate a due a due ad un generatore di potenziale elettrostatico e a un generatore di radiofrequenze (variabile nel tempo).

Gli ioni subiscono l’azione combinata dei due campi. Per un certo valore del rapporto Potenziale elettrostatico/radiofrequenza solo ioni aventi un determinato rapporto m/z riescono a passare oltre al quadrupolo e arrivare al rivelatore. Occorre fare una scansione, cioè far variare il potenziale elettrostatico e la radiofrequenza ma mentenere costante il loro rapporto.

Semplicità costruttiva range di masse più stretto

Minor costo minore risoluzione

Tollera pressioni maggiori (LC, GC)

Maggiore velocità di scansione

O OO

O O

H3CO

H3CO

O OHO

O OO

7-idrossicumarina (Umbelliferone)

Attività: chemoprevenzione del cancro6,7-dimetossicumarina (Scoparone)

Attività: antiossidante, vasorilassante, antiasmatico

Psoralene (furanocumarina lineare)

Attività: cura di eczemi e psoriasi

Angelicina (furanocumarina angolare)

Attività: antiinfiammatoria

O O

CUMARINA(1,2-BENZOPIRONE)

Warfarin (Cumadin®)

Attività: anticoagulanteInterferisce con le funzioni della vitamina K, coinvolta nell’attivazione Dei fattori della coagulazione del sangue

Analisi GC-MS della 5,7-dimetossicumarina standard

M+ - CH3 = 191

M+ - CO = 178

M+ - CH3CO = 163

M+ - CH3CO – CH3 = 148

M+ - CH3CO – CO = 135

M+ - CH3CO – CH3CO = 120

O O

OCH3

H3CO

Identificazione della 5,7-dimetossicumarina nell’ESTRATTO in METANOLO

O O

OCH3

H3CO

5,7-dimetossicumarina

Cromatografia

Cromatogramma

Analisi qualitativa Analisi quantitativa

tempo di ritenzione(spettro di massa)

area del picco

-tr sostanza X e tr sostanza nota (standard)

-Iniettare una certa quantità (10-20%) della sostanza presunta, pura, nel campione in esame: se il picco di X risulta aumentato vi è buona probabilità di aver individuato l’identità dell’incognito.

-Stessa cosa viene ripetuta usando condizioni sperimentali diverse; se anche in questo caso l’arricchimento fa aumentare il picco allora siamo quasi certi dell’identità della sostanza.-Se ho accoppiato uno spettrometro di massa si può evitare questa procedura macchinosa.

ANALISI QUALITATIVA

ANALISI QUANTITATIVA L’analisi quantitativa cromatografica è basata sulla misura delle aree dei picchi, dal momento che esiste proporzionalità diretta tra la misura effettuata e la concentrazione che la determina (almeno in certi range).

Sono metodi comparativi cioè basati sulla relazione matematica tra il parametro misurato (risposta o segnale) e la concentrazione dell’analita.

Quindi richiedono la calibrazione mediante soluzioni standard.

Dopo opportuna elaborazione delle aree, si risale alla concentrazione percentuale dei componenti.

Il calcolo dell’area del picco viene fatta direttamente dal computer e viene stampata sul cromatogramma.

Alla base comunque ci sono delle regole per mezzo delle quali è possibile risalire alle aree dei picchi.

Necessità di determinare quantitativamente tutti i componenti di una miscela o solo alcuni o al limite uno solo (necessità quindi di avere risolti tutti i picchi, solo alcuni, uno solo).

massa picco

massa 1 cm2

area picco

Ritagliare il picco e pesarlo, confrontandolo con il peso di 1 cm2 della stessa carta.

-Metodo laborioso

-Precisione

Metodi geometrici

-Gaussiana

-Triangolazioni

Importante è la

pulizia del picco

(simmetria e

mancanza di

sovrapposizioni)

Si applica il metodo della gaussiana calcolando l’ampiezza del picco a metà altezza e considerando i due picchi come separati.

In questo caso l’ampiezza a metà altezza è ricavabile dalle semi-ampiezze.

L’integrazione elettronica ricostruisce la funzione matematica del picco maggiore, ne calcola l’area e la sottrae all’area totale (area del picco minore)

I metodi per la calibrazione possono essere divisi in due gruppi:

Uso di Standard Esterni (analizzati separatamente dal campione).

Uso di Standard Addizionati ad ogni campione (Standard Interni o aggiunti).

Standard esterni

Una serie di standard di questo tipo è costituita da unità che contengono quantità note e differenti di analita.

Si inietta un volume noto e preciso del campione e si registra il cromatogramma; poi, si prepara una soluzione a concentrazione nota del componente da determinare e si inietta lo stesso volume, registrando il cromatogramma.

S(A)c/S(A)s = Cc/Cs Cc = Cs . S(A)c/S(A)s

-E’ importante fare in modo che le concentrazioni comparate (campione e standard) non differiscano troppo tra loro.

-Occorre una grande accuratezza e riproducibilità nel misurare il volume da iniettare.

-Iniezioni ripetute, sia del campione che dello standard, e poi fare una media delle aree

-Le iniezioni vanno effettuate in un intervallo di tempo piuttosto breve per evitare le deviazioni dovute a variazioni ambientali o strumentali.

Costruzione di rette di taratura o calibrazione

Si preparano diverse soluzioni (da 3 a 5) a concentrazioni note e crescenti dell’analita e si riportano su un grafico A/[] i valori letti sul cromatogramma; si dovrebbe ottenere una retta passante per lo zero (se ci sono deviazioni significative allora si aumenta il numero delle soluzioni standard).

Si inietta la soluzione campione e si registra il valore dell’area. Si interpola la concentrazione incognita del campione.

Le soluzioni standard devono simulare al meglio la matrice del campione, e quindi devono contenere tutti i reattivi (e nelle stesse concentrazioni) contenuti nella soluzione campione. Questo comporta ricontrollare le rette di taratura ogni volta che le soluzioni dei reattivi vengono preparate di fresco.-Conoscenza della matrice-I vari componenti la matrice non causino interferenza con il campione

Standard aggiunti

Anche in questo caso possiamo distinguere due metodiche:

Metodo delle aggiunte standard o multiple

Consiste nel preparare soluzioni dell’analita contenenti volumi noti e crescenti di soluzione standard della stessa specie da analizzare.

Vi sono diversi modi per attuare il metodo delle aggiunte:

a) Introdurre una certa quantità di soluzione incognita in più matracci (3-4), aggiungere in ogni matraccio volumi diversi di soluzione standard (a concentrazione da 10 a 100 volte maggiore) e poi portare a volume con la soluzione incognita. Quindi di riportano in un grafico A/[] i valori ottenuti dalle diverse soluzioni.

1 2 43

1 mL 4 mL3 mL2 mLSol. STANDARD

C agg

A

A0

A4

A3

A2

A1

C eff

C1 C4C2 C30

Cx0 C1+Cx C4+CxC3+CxC2+Cx

Y = mx

Y = mx + q

Cx sarà data dall’intercetta sull’asse delle x (differenza tra i due zeri) cambiata di segno e sarà inferiore rispetto alle concentrazioni degli standard.

In realtà il metodo, rapido e pratico, non è del tutto rigoroso, perché il contenuto di analita varia leggermente all’interno delle diverse soluzioni così come la concentrazione finale dello standard aggiunto.

Es. nel matraccio 1 abbiamo miscelato 99 mL a concentrazione Cx e 1 mL a concentrazione ad es 1000 ppm, mentre matraccio 4 abbiamo miscelato 96 mL a concentrazione Cx e 4 mL a concentrazione 1000 ppm. Quindi gli incrementi effettivi differiscono leggermente.

Infatti ammettendo cheCx = 20 ppm e che 1 ppm = 1 mg/L = 1 g/mL allora Cx = 20 g/mL

Quantità dell’analita X nei diversi matracci:

-20 g/mL . 99 mL = 1980 g = 1,98 mg-20 g/mL . 98 mL = 1960 g = 1,96 mg-20 g/mL . 97 mL = 1940 g = 1,94 mg-20 g/mL . 96 mL = 1920 g = 1,92 mg

Quantità dello standard aggiunto nei diversi matracci:

1000 g/mL . 1 mL = 1000 mg = 1,00 mg1000 g/mL . 2 mL = 2000 mg = 2,00 mg1000 g/mL . 3 mL = 3000 mg = 3,00 mg1000 g/mL . 4 mL = 4000 mg = 4,00 mg

Queste quantità si trovano alla fine nei matracci da 100 mL

L’incremento in termini di massa ad es per il matraccio 1 è pari a 1 mg, ma in termini di concentrazione sarà:

(1,98+1,00) (mg)

(100) (mL)(1000) (mL/L) = 29,8 (mg/L o ppm)

29,8-20,0 = 9,8 ppm e non 10 ppm (1,00) (mL) 1000 (mg/L)

(100) (mL)

= 10,0 (mg/L o ppm)

Lo stesso ragionamento può essere applicato ad es al matraccio 4, il cui incremento in termini di concentrazione sarà:

(1,92+4,00) (mg)

(100) (mL)(1000) (mL/L) = 59,2 (mg/L o ppm)

59,2-20,0 = 39,2 ppm e non 40 ppm

Possiamo però calcolare lo scarto % e vedere che per ogni matraccio rimane costante:

9,8-10

10100 = -2,0 % 39,2-40

40100 = -2,0 %

Matraccio 1 Matraccio 4

b) Per evitare l’approssimazione del metodo precedente, si può aggiungere in ogni matraccio un volume noto ed esatto Vx della soluzione dell’analita a concentrazione incognita Cx e aliquote (in mL) di soluzione standard crescenti indicate con n1, n2, n3, ecc…; alla fine si porta al volume finale Vt (ad es. 100 mL) con un solvente opportuno.

n1 + Vx n2 + Vx n4 + Vxn3 + VxA = K Cni con K = b

Cni = concentrazione data dal campione e da un’aggiunta iesima dello standard.

A = KVx Cx

Vt

ni Cs

Vt

+A

A0

A4

A3

A2

A1

n1 n4n2 n3

A = 0

A = KCs

Vt

+ ni

VxCx

Vt

K

Y = mx + q

0 = KCs

Vt

+VxCx

Vt

K nx

nX

Cx =Vx

Cs (-nx)

Metodo delle aggiunte standard Vantaggi e Svantaggi

Permette di effettuare l’analisi quantitativa in matrici complesse o incognite

Si può applicare a tutte le tecniche analitiche sia spettrofotometriche, elettrochimiche e cromatografiche

E’ necessario un a curva di calibrazione per ogni analita da determinare

E’ necessario un volume maggiore rispetto a quello impiegato con la retta di taratura con standard esterno

E’ un metodo per estrapolazione, teoricamente meno preciso rispetto al metodo di interpolazione della retta di taratura con standard esterno

N.B.

Prima di effettuare la curva di taratura o di applicare il metodo delle aggiunte è necessario analizzare il bianco.

Il bianco ideale è costituito dalla soluzione conteente tutti i componenti il campione ad eccezione dell’analita stesso.

In questo modo si può ottenere il segnale relativo ad una “concentrazione zero” dell’analita.

E’ un metodo per estrapolazione, teoricamente meno preciso rispetto al metodo di interpolazione della retta di taratura con standard esterno

Metodo dello standard internoQuesto metodo viene usato prevalentemente in cromatografia. Consiste nel preparare una serie di soluzioni standard contenenti concentrazioni note e variabili dell’analita e le stesse quantità di un’altra sostanza (standard interno). Si costruisce una curva di calibrazione riportando in ascisse il rapporto ponderale o di concentrazione dell’analita e dello standard (Pa/Pis o [X]/[IS]) e in ordinate il rapporto delle aree (Aa/AIS).Quindi si aggiunge la stessa quantità di standard interno alla soluzione a concentrazione incognita e si effettua la determinazione.Dal rapporto delle aree si risale quindi tramite l’equazione della retta al rapporto dei pesi o delleconcentrazioni.Conoscendo la quantitàdi standard interno aggiunto, è possibile risalire alla quantità dianalita.

0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 PA/PIS

0

0,5

1,0

1,5

2,0

AA/AIS

[a]/[IS]

PA/PIS si ricava per interpolazione dal grafico

QIS è la quantità di standard interno aggiunta (in peso)

Esempio

Se la quantità di standard interno aggiunta è 200 mg e il rapporto tra le aree ottenuto dal cromatogramma è 1 per interpolazione dal grafico precedente si ricava che il rapporto PA/PIS risulta essere 1,25.

Quindi dalla relazione sopra citata ricaviamo che la quantità di analita sarà:

1,25 x 200 = 250 mg

Se poi vogliamo conoscere la concentrazione basta considerare il volume di campione a cui è stato aggiunto lo standard.

AC

ISIS

A

CV

Q•P

P

Lo standard interno deve soddisfare certi requisiti:

-Non essere presente nella miscela da analizzare

-Essere ben risolto dagli altri componenti

-Avere un tr diverso ma non troppo lontano da quello dell’analita

-Essere strutturalmente simile al composto da analizzare in modo che la risposta strumentale sia uguale o simile.

-Non contenere impurezze

-Non reagire con i vari componenti della miscela analizzata

Tipicamente i grafici dose/risposta approssimano una linea retta

Nella pratica, raramente tutti i dati sperimentali sono allineati perfettamente lungo una linea retta; per questo occorre trovare la retta migliore che interpola i punti sperimentali attraverso un’analisi di regressione lineare usando il metodo dei minimi quadrati.

Viene cioè calcolata l’equazione della retta che minimizza la somma dei quadrati delle distanze verticali tra i punti e la retta stessa.

L’equazione è chiamata equazione di regressione ed è del tipo y = mx + q dove m, il coefficiente angolare, è chiamato coefficiente di regressione.

Tale retta, considerata la migliore, passa anche per il centroide o centro di gravità che corrisponde al punto (Xmedio, Ymedio), valori corrispondenti ai valori medi di tutti i dati sperimentali xi e yi.

X

Y

.

.

.

.

Per stabilire fino a che punto la retta trovata possa essere usata al fine di prevedere un valore di Y conoscendo un determinato valore di X, e viceversa, cioè per stabilire se la retta è realmente la migliore, si calcola il coefficiente di determinazione o di correlazione lineare r2.r2 può assumere valori in valore assoluto compresi tra 0 e 1.Se r2 = 1 allora esiste una relazione lineare perfetta tra x e y, per cui ad ogni valore di x corrisponde uno e un solo valore di y.Se r2 = 0 allora non esiste alcuna relazione lineare tra x e y.Valori compresi tra 0 e 1 indicano la “bontà” dell’equazione di regressione calcolata.Difficilmente le rette di calibrazione hanno valori di r2 inferiori a 0,98 e in ogni caso mai al di sotto dello 0,95.

Determinazione quali-quantitativa

Resveratrolo

HO

OH

OH

OH

HO

OHFamiglia Fitoalexine

-Forma trans

-Forma cis

-Forma glicosilata (3)

Antiossidante naturale presente nell’uva, nel succo d’uva e nel vino rosso

-GC-MS: derivatizzazione con bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetammide

-HPLC: in fase normale con eluizione isocratica o in fase inversa con eluizione a gradiente

-Nel 1999 LC-MS (E.S.I.) in modalità di ione negativo (C18 – eluente: MeOH/CH3COONH4 (55/45 v/v) 20mM)

-LC-MS (C.I.) in modalità di ione positivo (C18 – eluente: MeOH/HCOOH) m/z=229 [M+H]+

Spettro di frammentazione del

resveratrolo derivatizzato ottenuto per C.I.

m/z = 444

(10 g/L)

Spettro di frammentazione del

resveratrolo ottenuto con electro spray ionization

m/z = 227

(200 pg/L)

Determinazione per HPLC-UV del trans e cis resveratrolo in preparazioni commerciali e sua stabilità alla luce e alla temperatura

-HPLC Gilson a due pompe con miscelatore

-Colonna C18 5 M, lunghezza 250 mm, ID 4,6 mm

-eluizione isocratica

-eluente miscela acqua/acetonitrile

-Flusso 1 mL/min

-Prove eseguite in triplicato

-Iniezione di 20 L

Scelta della analitica

-Trans: 306 nm e 320nm

-Cis: 295 nmOttimizzazione % Acetonitrile

Conc. %v/v

T(min) T(min) T(min) media d.s. K’ log K’

20 26,06 25,932 25,899 25,96 0,085 10,74 1,03

25 12,969 12,99 12,971 12,977 0,0116 4,87 0,69

30 7,915 7,926 7,924 7,922 0,00586 2,6 0,41

35 5,662 5,661 5,467 5,657 0,00839 1,56 0,19

40 4,528 4,493 4,501 4,507 0,0183 1,04 0,02

20 L in triplicato di una soluzione preparata

diluendo 100 L della soluzione Standard A in

matraccio da 100 mL (5,53 g/mL)

con metanolo

Soluz. Standard A

10,53 mg/10 mL

Retta di Calibrazione

Costruita da diluizione

Soluz. Standard A

25, 50, 75 e 100 L

Portati a 10 mL con metanolo

Area 1 Area 2 Area 3 Area 4 media µg/mL d.s. c.v.%

73473 78487 78508 77971 77448,2 2.63 2242.241 2.9

176717 165339 181583 171204 173912.8 5.26 6086.796 3.49

256045 264057 232595 256686 249043.4 7.90 13945.235 5.59

337036 347257 323089 325493 337031.8 10.53 12891.18 3.82

y = 32475x - 4165,8

R2 = 0,9985

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

0 2 4 6 8 10 12

conc (microg/mL)

me

dia

are

e

Stabilità del trans-resveratrolo esposto a lampada fluorescente

Area 1 Area 2 Area 3 MediaT

(h)µg/mL C%

169919 170317 185594 175276,7 0 5,53 100

152532 155695 155569 154598,7 2 5,14 93

144593 149506 154731 149610 4 4,95 89,5

167122 138376 133066 146188 6 4,88 88,4

134775 139712 132314 135600,3 8 4,5 81,4

123140 127316 132081 127512,3 12 4,24 76,7

104440 110505 108410 107785 24 3,6 65,1

77743 80766 73183 77230,67 36 2,45 44,4

0

2

4

6

8

10

0 50 100 150 200 250

Tempo (giorni)

Co

nc

. (m

icro

g/m

L)

Stabilità a -20 °C al buio

0

2

4

6

8

10

0 50 100 150 200 250

Tempo (giorni)

Co

nc

.(m

icro

g/m

L)

Stabilità a t.a. al buio

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72

T (h)

Co

nc

%

Stabilità a t.a. con lampada 40 Watt

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

T (h)

Co

nc%

Stabilità a t.a. con lampada 100 Watt

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

T (h)

Co

nc%

Stabilità a t.a. con lampada UV 254 nm

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200 250 300

T(min)

Co

nc

%

Stabilità a t.a. con lampada UV 365 nm

CONCLUSIONI

Il trans-resveratrolo è risultato stabile sia a -20 °C che a t.a. quando mantenuto al riparo dalla luce, unica causa di isomerizzazione.

Questa si verifica sempre quando la soluzione è esposta a radiazioni provenienti da fonti diverse.

Inoltre è proporzionale al tempo di esposizione, alla potenza e alla usata.