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  • Cromatografia Scrittura del colore Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo Le tecniche sono molto utilizzate, permettendo lanalisi di miscele complesse come sono la maggior parte dei campioni di natura organica
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  • Cenni storici 1903-1906: nascita Cromatografia grazie a un botanico russo (M. Tswett) 1938: introduzione della T.L.C. e della cromatografia a scambio ionico 1941: cromatografia di ripartizione liquido- liquido 1944: cromatografia su carta 1950: cromatografia a fase inversa 1951: gas-cromatografia 1959: cromatografia a permeazione di gel 1965: cromatografia liquida ad alte prestazioni
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  • Principi della cromatografia -la differente velocit di migrazione dei componenti costituenti una miscela (equilibrio dinamico) -Fase mobile (MP), liquida o gassosa -Fase stazionaria (SP), solida o liquida, stratificata su vetro o alluminio o impaccata in una colonna Fase fissa A Fase mobile Fase fissa B Fase mobile Fase fissa C Fase mobile -Spostamento della fase mobile determina lavanzamento del soluto in essa contenuto mentre le molecole che sono distribuite nella fase stazionaria resteranno momentaneamente ferme
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  • X M X s Soluto X migrer con una velocit proporzionale a K x o coefficiente di distribuzione tra le due fasi (dipendente dal tempo che X spende nelle due fasi) Il coefficiente di distribuzione del componente X definito come: Quale componente ha K maggiore ? A: il campione viene iniettato allentrata della colonna B D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria ABCD Flusso del solvente K A K B K C
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  • V A = 1 V M + V S K A [A] S = 0 A non ha alcuna affinit per la fase fissa e si muove con il fronte della fase mobile [A] M = 0 A non ha alcuna affinit per la fase mobile per cui si distribuisce completamente nella fase fissa senza spostarsi Riportando il segnale in funzione del tempo si ottiene il cromatogramma
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  • Se [X] f =0 allora V x max e uguale alla V eluente e il Volume delleluente necessario a eluire X pari al volume dello spazio interstiziale non occupato dalla fase fissa detto volume interstiziale o V m. Se [X] f 0 allora V x < di V eluente e il Volume delleluente necessario a eluire X volume di ritenzione V R sar maggiore del V m. Allora V R -V m = V R o volume netto di ritenzione
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  • Tempo di ritenzione t M = t 0 = tempo morto t R = t R - t 0 = tempo netto di ritenzione, tempo trascorso da un dato soluto nella fase stazionaria Il tempo di ritenzione t R il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector.
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  • Relazioni che quantificano linterazione di un dato soluto con la fase stazionaria V R = t R. F V m = t 0. F F (velocit di flusso) FATTORE di CAPACITA V = velocit lineare media di migrazione di un soluto = L/t R U = velocit lineare media di flusso della fase mobile = L/t 0 V = u. (frazione di tempo che il soluto passa nella fase mobile) V = u. [C M.V M /C M V M +C S V S ] 1 1 + C S V S /C M V M V = u. L/t R = L/t 0. 1 1 + K V S /V M t R = t 0 (1 + K V S /V M ) = t 0 (1 + K) Fattore di ritenzione o rapporto di distribuzione di massa
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  • k dipende: dalla T dalla natura delle fasi dalle caratteristiche dellimpaccamento dalla granulometria e dallo spessore della fase stazionaria k non dipende: dalla lunghezza della colonna dal flusso La selettivit quantifica lentit della separazione fra due specie: riguarda la capacit di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (t R ) B > (t R ) A. Usato per confrontare le prestazioni di colonne diverse a parit di eluente Fattore di separazione o Ritenzione relativa
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  • Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poich in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi possibilit di realizzare una singola separazione, N ha un significato puramente matematico. Pi elevato il numero di piatti teorici, pi grande la probabilit di una separazione (migliore la capacit di separazione della colonna). N proporzionale alla lunghezza della colonna. Parametri che descrivono quantitativamente lefficienza di una colonna (ampiezza dei picchi): 1)Altezza equivalente di piatto teorico H 2)Numero di piatti teorici N L = lunghezza colonna Si pu dimostrare che W = larghezza del picco W
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  • Separazione ottimale a)separazione con scarsa risoluzione e basso N b)migliora la risoluzione ma sempre basso N c)ottima risoluzione e buono N Si pu dimostrare che:
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  • risoluzione scarsa per scarsa efficienza e scarsa selettivit buona risoluzione dovuta a buona efficienza e buona selettivit risoluzione scarsa dovuta ad una basso selettivit. buona risoluzione dovuta a buona selettivit, ma efficienza non troppo elevata Una buona risoluzione pu derivare sia da una buona efficienza (picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una buona differenziazione del comportamento dei soluti (selettivit).
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  • Interazione soluto-fasi Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se cos non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni: legami a idrogeno interazioni dipolo-dipolo interazioni dipolo-dipolo indotto forze di Van der Waals formazione di composti di interazione attrazione coulombiana interazioni steriche In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarit delle due fasi. Spesso possono essere presenti pi tipi di interazione nello stesso processo cromatografico Meccanismi di separazione ripartizione adsorbimento scambio ionico esclusione affinit
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  • Cromatografia Fase mobile: liquidaFase mobile: gassosa CROMATOGRAFIA LIQUIDA (L.C.) GAS-CROMATOGRAFIA (G.C.) Fase fissa: liquida CROMATOGRAFIA di RIPARTIZIONE (L.L.C.) Colonna Strato sottile Carta Fase fissa: solida CROMATOGRAFIA di ASSORBIMENTO (L.S.C.) Colonna/strato sottile CROMATOGRAFIA a SCAMBIO IONICO (L.S.C.) Colonna/strato sottile GEL CROMATOGRAFIA Colonna/strato sottile CROMATOGRAFIA di AFFINITA Fase mobile: fluido supercritico CROMATOGRAFIA LIQUIDA SUPERCRITICA (S.F.C.)
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  • RIPARTIZIONE La fase stazionaria un liquido che impregna un solido granulare inerte (gel di silice) o ad esso chimicamente legato; in questo liquido le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e la fase mobile devono invece essere immiscibili. Durante leluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilit di ognuna. Si parla quindi di cromatografia di ripartizione, che pu essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda della natura della fase mobile. Si-OH + R-SiCl 3 + 2 H 2 O Si-O-Si(OH) 2 -R + 3 HCl La cromatografia di ripartizione chiamata in fase normale se la fase stazionaria pi polare della fase mobile, mentre chiamata fase inversa se la fase stazionaria meno polare della fase mobile. Si tratta della tecnica pi comunemente impiegata per la separazione di sostanze organiche
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  • CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI RIPARTIZIONEdi RIPARTIZIONE (L.L.C.) In fase normale Fase stazionaria polare Si-O-Si(R) 2 -CN Si-O-Si(R) 2 -NH 2 Fase mobile a bassa polarit Solventi organici Soluzioni acquose (zuccheri, steroidi, amminoacidi, proteine e peptidi) In fase inversa Fase stazionaria apolare Si-O-Si(CH 3 ) 2 Si-O-Si-CH 2 -(CH 2 ) 6 -CH 3 Si-O-Si-CH 2 -(CH 2 ) 16 -CH 3 Fase mobile molto polare Soluzioni acquose o tamponate Miscele acqua/metanolo/acetonitrile (ammine, vitamine, idrocarburi, analgesici)
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  • ADSORBIMENTO reversibili La fase stazionaria un solido in polvere (gel di silice o allumina); sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi (-OH) che possono stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della miscela da separare (ma anche con le molecole dacqua, disattivandolo). Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento, che pu essere gas- solido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile. Per sostanze molto polari preferibile usare gel disattivati, mentre per sostanze con bassa polarit si preferiscono le silici non modificate. Le fasi mobili pi usate in ordine di polarit crescente e quindi di potere eluente sono: Esano, isottano, cloroformio, acetonitrile, metanolo, acqua.
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  • SCAMBIO IONICO La fase stazionaria costituita da un polimero inerte (resine sintetiche) contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili (gruppi funzionali acidi o basici), i cui contro-ioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il meccanismo di separazione basato sulla competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. Si parla di cromatog