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  • Quim. Nova, Vol. 39, No. 2, 210-220, 2016Re

    vis

    ohttp://dx.doi.org/10.5935/0100-4042.20160003

    *e-mail: carlag@live.com

    CROMATOGRAFIA POR INTERAES HIDROFILICAS (HILIC): ESTADO DA ARTE E APLICAES

    Carla Grazieli Azevedo da Silva,* Carla Beatriz Grespan Bottoli e Carol H. CollinsInstituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, 13083-970 Campinas SP, Brasil

    Recebido em 09/06/2015; aceito em 22/09/2015; publicado na web em 14/01/2016

    HYDROPHILIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY (HILIC): STATE OF THE ART AND APPLICATIONS. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) has been gaining increased attention for its effective separation of highly polar compounds, which include carbohydrates, amino acids, pharmaceutical compounds, proteins, glycoproteins, nucleosides, etc. Polar compounds are usually poorly retained on reverse-phase liquid chromatography (RP-HPLC) columns or have poor solubility in the apolar mobile phase of normal-phase high performance liquid chromatography (NP-HPLC). Since HILIC uses organic solvents such as ACN or MeOH ( > 70%), also used in RP-HPLC and polar stationary phases similar to NP-HPLC (bare silica, diol, amino, amide, saccharide, zwitterionic stationary phases, etc.), it represents a hybrid of the two separation modes. The high organic content in the MP leads to good compatibility with mass spectrometry (MS), increasing the detectivity. This review describes the fundamentals of HILIC and highlights some interesting applications.

    Keywords: hydrophilic interaction chromatography; separation of polar compounds; HILIC separations; high performance liquid chromatography; polar stationary phases.

    INTRODUO

    A cromatografia lquida no modo fase reversa (RP-HPLC, do ingls reversed phase high performance liquid chromatography), onde se emprega uma fase estacionria (SP, do ingls stationary phase) mais apolar que a fase mvel (MP, do ingls mobile phase) a tcnica analtica de separao mais utilizada.1 Porm, uma das limitaes do uso da fase reversa a baixa reteno de molculas polares ou inicas. O uso da cromatografia lquida no modo de fase normal (NP-HPLC, do ingls normal phase high performance liquid chromatography), na qual se emprega SP mais polares que as fases mveis, pode solucionar essa limitao. No entanto, a solubilidade de molculas polares em MP apolares no aquosas limitada, restringindo a aplicabilidade desta. E em alguns casos, a cromatografia de ons no pode ser apli-cada devido a ausncia de cargas dos solutos. Para minimizar esses problemas, na dcada de 90, Alpert2 introduziu a cromatografia por interaes hidroflicas (HILIC, do ingles hydrophilic interaction chromatography). A HILIC uma modalidade de separao na qual empregada uma SP mais polar do que em RP-HPLC e MP com pouca concentrao de gua ou tampo, sendo normalmente > 70% em solvente orgnico, tipicamente acetonitrila.3

    Dessa forma, HILIC apresenta modo de separao ortogonal ao modo em RP-HPLC, pois os mecanismos de separao do modo HILIC e do modo RP so independentes entre si. Com isso h a possi-bilidade de se explorar diferentes perfis de seletividade, o que permite a sua aplicao em cromatografia lquida bidimensional abrangente (LC LC), com a vantagem de apresentar menor incompatibilidade do eluente da primeira dimenso (1D) com o eluente da segunda dimenso (2D), quando comparado a um sistema ortogonal com NP-HPLC, podendo ser utilizada no modo de duas dimenses para separao de amostras complexas na qual a amostra submetida a dois mecanismos de separao diferentes e complementares com a finalidade de fornecer um maior poder de separao e distribuio dos analitos nas duas dimenses, aumentando o poder de resoluo.4

    Alm disso, seu uso com detectores de espectrometria de mas-sas, devido alta proporo de solvente orgnico na MP,5-9 vem

    possibilitando um incremento anual de trabalhos utilizando essa modalidade de cromatografia (Figura 1), principalmente devido necessidade crescente de separao de compostos altamente polares (com valores negativos de log P: coeficiente de partio octanol--gua) em anlises clnicas e de compostos farmacuticos, nas reas da metabolmica, protemica, glicmica, etc. (Figura 2).

    As SP utilizadas em HILIC10 so fases polares tradicionalmente conhecidas como a slica pura,11,12 slica modificada13 com grupos triazis, cianos, aminos,14,15 amidas, cidos sulfnicos, carboxilatos, diols,16 poliidroxietilaspartamida,2 e SP base de ciclodextrinas,16,17 ou polmeros,3 alm de novos materiais como compostos zwiterinicos, os quais apresentam cargas positivas e negativas em sua estrutura.18-20 Mais recentemente SPs base de lquidos inicos21,22 vm sendo utilizadas, alm de SP com diversas funcionalidades preparadas por reaes do tipo click chemistry.23,24

    A utilizao do modo de separao HILIC, tambm denominada na poca de seu surgimento de cromatografia lquida de fase reversa--reversa ou cromatografia aquosa de fase normal, propicia algumas vantagens quando comparada a outros modos de separao como a fase normal ou fase reversa:25-28

    I) Alta concentrao de solvente orgnico na MP, o que diminui a presso do sistema visto que a viscosidade da MP tambm dimimui. A alta concentrao de solvente tambm aumenta a detectabilidade quando se utiliza o detector de espectrometria de massas, uma vez que o processo de ionizao dos analitos favorecido;

    II) Maiores retenes e eficincias de separao de analitos po-lares com baixa reteno no modo em fase reversa, como peptdeos e cidos nucleicos, sem a necessidade de utilizao de aditivos tipo par-inico;

    III) Maior preservao da SP pelo uso de menores quantidades de gua na MP, evitando o colapso de sua superfcie, principalmente em fases estacionrias com carter mais hidrofbico;

    IV) Compatibilidade com tcnicas de extrao que utilizam altas concentraes de solvente orgnico, como a extrao em fase slida (SPE, do ingls solid phase extraction) ou extrao lquido-lquido, o que facilita e simplifica a etapa de preparao de amostra.

    HILIC tambm pode ser conhecida por cromatografia de fase normal aquosa uma vez que essa modalidade de separao envolve

  • Cromatografia por interaes hidrofilicas (HILIC): estado da arte e aplicaes 211Vol. 39, No. 2

    uma fase estacionria polar similar a algumas das SP utilizado em cromatografia com fase normal, e a poro aquosa na fase mvel atua como o solvente forte, de forma oposta ao que ocorre na cromatografia lquida em fase reversa.29 Por outro lado, HILIC pode ser relaciona-da ao modo de separao em fase normal de compostos altamente polares ou inicos, mas sob condies tpicas da fase reversa. Dessa forma, muitos autores descrevem essa modalidade como um eixo de conexo entre a fase normal (NP) e a fase reversa (RP) (Figura 3).

    BREVE HISTRICO

    Em 1951 Gregor et al.30 descreveram as interaes envolvendo a camada de gua presente em uma SP a base de resina trocadora de ons. Os trabalhos de Samuelson e Sjstrm31 e Rckert e Samuelson32 tambm relacionaram interaes entre os analitos e a camada de gua presente na SP trocadora de ons. Um pouco depois, Linden e Lawhead,33 em 1975, utilizaram colunas polares com SP trocadora de nions na separao de sacardeos com uma MP com elevada concentrao de solvente orgnico e Palmer,34 no mesmo ano, utilizou uma coluna base de carboidrato para separar aucares com uma MP com alta concentrao de acetonitrila (ACN).

    Sequencialmente, em 1982 e 1985, Verhaar e Kuster35 e Nikolov e Reilly,36 respectivamente, separaram misturas de aucares utilizando colunas polares com grupos amino baseadas em suporte de slica, utilizando uma mistura de gua/acetonitrila como MP.

    No entanto, a utilizao do termo e do acrnimo HILIC atribuda a Alpert2 no seu trabalho clssico de 1990 sobre essa modalidade de

    Figura 1. Nmero de publicaes cientficas obtidas atravs da busca do termo hydrophilic interaction chromatography no portal ISI/Web of Science de 1990 at 2014

    Figura 2. Exemplo de seleo do tipo de modalidade cromatogrfica em funo da polaridade dos analitos medida pelo log P

    Figura 3. Relao entre HILIC e as demais modalidades principais de cro-matografia lquida. Adaptado da ref. 6

  • da Silva et al.212 Quim. Nova

    separao em cromatografia lquida, no qual foram separados pept-deos, cidos nucleicos e outros compostos polares. Este autor props o termo como uma variao da cromatografia em fase normal quando utilizou MP com alta concentrao de solvente orgnico e mecanismo de reteno baseado na interao hidroflica entre os analitos polares e a camada de gua superficialmente imobilizada na SP tambm polar.

    MECANISMOS DE SEPARAO

    Em HILIC a MP utilizada similar utilizada no modo em RP, descrita como uma mistura de gua/solvente orgnico, tipicamente ACN, porm, diferentemente da RP, com alta concentrao de sol-vente orgnico e pouca concentrao de gua (ou tampo aquoso) (5-40%).3,6,26,29 Assim como o modo em NP, HILIC utiliza SP mais polares que facilmente apresentam uma camada de gua superfi-cialmente imobilizada ou adsorvida e que retm solutos igualmente polares por meio de interaes hidroflicas por meio de um equilbrio de partio. Da mesma forma, acredita-se que podem ocorrer tambm interaes do tipo ligao de hidrognio entre os grupos funcionais po-lares dos analitos e da SP29,37-40 e interaes eletrostticas entre a SP e grupos funcionais ionizados dos analitos (Figura 4). Adicionalmente, podem tambm ocorrer interaes do tipo foras de van der Waals entre a poro hidrofbica da SP e grupos no polares dos analitos,3 e adsoro dos analitos na superfcie do adsorvente.

    Como resultado desse mecanismo triplo de interao, na HILIC h a inverso na ordem de reteno dos compostos, em que os compostos mais polares so os mais retidos em comparao com a RP, na qual os compostos polares so os menos retidos (Figura 5).

    FASES ESTACIONRIAS

    Atualmente, o nmero de SP disponveis para HILIC signi-ficativo e vm crescen

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