cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de … · • quando o íon molecular não é...

CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE

MASSAS – GC‐MSPrincípios e Aplicaçõesp p ç

Elias Paulo TessaroElias Paulo [email protected]

[email protected]

1

1. Introdução

Instrumentação

Direto EI B Multiplicador e‐GCHPLC

CIAPCIAPPI

QTofIT

MCP

APPIESIMALDI

ITLITICRMALDI ICROrbitrap

2

1. Introdução

O que é cromatografia??

• 1906 – Botânico russo Mikhail Tswett

3

1. Introdução

4

2.Cromatografia Gasosa

O principal mecanismo de separação da Cromatografia Gasosa (CG) está baseadona partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a faseestacionária (líquida ou sólida)estacionária (líquida ou sólida).

• Alto poder de resolução;• Alto poder de resolução;• Alta sensibilidade;

•A amostra e/ou seus componentes devem ser voláteis e termicamenteestáveis!!! (temperaturas até 300 °C);• Tempos razoavelmente longos de analise.

5

2.Cromatografia Gasosa

Sinal Registrado

Introduçãode amostra

Conversor de sinal

Gás de ArrasteColuna Cromatográfica DetectorColuna Cromatográfica

e FornoDetector

6

Instrumentação

Instrumentação

DiretoGCHPLC

EICIAPCIAPPI

BQTofIT

Multiplicador e‐MCP

Sinal Registrado


ESIMALDI

LITICROrbitrap

Conversor de sinal

Gás de ArrasteColuna Cromatográfica

e FornoDetector

7

3. Ionização por Elétrons

8


Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorção térmica), a uma

pressão típica de 10‐5 torr, são bombardeadas por elétrons, com

i í i d 70 V O i i l i denergia típica de 70 eV. Ocorre principalmente a retirada ou captura

de um elétron formando íons M+. ou M‐.. Íons positivos são

predominantes. M‐. se tornam importantes para moléculas com alta

EAEA.

M + e‐ (70 eV) → M+. (~ 5‐10 eV) + 2e‐ (~60‐65 eV)

9


Fonte de EI

10


I i ãIonização70 eV

• Os espectros de massas

70 eV

são reprodutíveis emequipamentos similares

• Existem uma variedadesde bibliotecas deespectros de massas:Wil Ni t t tWiley, Nist, entre outras

11


Energia x Fragmentação

12


E lExemplos

C7H16 m=10013


Características• Processo unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídos da fonte deionização pelo eletrodo de repulsão ("repeller“).

Í• Íons moleculares são formados com excesso de energia interna e se fragmentamtotal ou parcialmente.

• EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como também• EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como tambémfragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas de espectros de EI a70 eV; estável; fácil de operar; alta sensibilidade.

• Aplica‐se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular(~500u), voláteis e termo‐estáveis: moléculas orgânicas relativamente pequenas.

• Quando o íon molecular não é observado (devido a dissociação excessiva),existe um processo dissociativo exotérmico e portanto M+. é uma espécie instável.

EI ~10‐16 U d 103 105 lé l t f t d• EI ocorre em ~10‐16 s. Uma em cada 103‐105 moléculas que entram na fonte deEI é ionizada.

14

4. Ionização QuímicaMunson and Field ‐ 1966

• EI:

– SimplesSimples

– Produz extensa fragmentação

– Muitas vezes tem M+.

– Quando não tem M+. ???

15

4. Ionização Química

Fonte de CI

16

I i ã4. Ionização Química

Ionização

• Pressão ~ 10‐3 mbar;• Método de ionização indireta e branda;• Transferência de um próton do gás reagente à molécula ‐p g gíon molecular protonado [M‐H]+;• Fragmentação leve ou quase ausente, ideal para obter oFragmentação leve ou quase ausente, ideal para obter oíon molecular

17

4. Ionização Química

CH44

ExemplosExemplos Iso‐C4H10

NH3

18

EI vs CI

E t d M C ã t EI CIEspectro de Massas: Comparação entre EI e CI

I i ã El t ô i• Fragmentação intensa – maisinformações sobre a molécula;

Ionização Eletrônica

• Muitas vezes não é encontrado oíon molecular.

• Fragmentação branda espectroIonização Química

• Fragmentação branda – espectromais limpo;

• Sempre é encontrado o íonmolecular;

• Necessário a utilização de um gásreagentereagente.

19

Instrumentação

Instrumentação

DiretoGCHPLC

EICIAPCIAPPI

BQTofIT


Sinal Registrado


ESIMALDI

LITICROrbitrap

Conversor de sinal


e FornoDetector

20

5. Setor Magnético

S M é iSetor Magnético

21

S Elé i5. Setor Magnético

Setor Elétrico

Devido a problemas de focalização dos íons apósDevido a problemas de focalização dos íons apóspassar pelo Setor Magnético 22

D l F li ã5. Setor Magnético

Dupla Focalização

23

F i A

5. Setor Magnético

•1919

Francis Aston

•1919Francis Aston constrói o primeiro espectrógrafo demassa com focalização de velocidade com poder de

l ã d 130resolução de 130.

•1937Aston constrói um espectrógrafo de massa com poderde resolução de 2000

• Descobriu 212 dos 287 isótopos naturais 1922

•Nobel Prize in Chemistry "for his discovery, by means ofNobel Prize in Chemistry for his discovery, by means ofhis mass spectrograph, of isotopes, in a large number ofnon‐radioactive elements, and for his enunciation of thewhole number rulewhole‐number rule

24

F i A

5. Setor Magnético

Francis Aston

25

Mi ã Viki

5. Setor Magnético

Missão Viking

26

C l

5. Setor Magnético

Calutron

M i C lMain Calutron patents:U.S. Patent 2709222 Methods of and apparatus for separating materials (Ernest O. Lawrence)U.S. Patent 2719924 Magnetic shims (Robert Oppenheimer and Stanley Frankel)U S Patent 2847576 Calutron system (Ernest O Lawrence)U.S. Patent 2847576 Calutron system (Ernest O. Lawrence)

27

R ã I tó i6. Razão Isotópica

Razão Isotópica

28


Razão Isotópica

29


Razão Isotópica

30


Razão Isotópica

31

6. Razão Isotópica

32


33


34


Características

( )• Alta resolução (~50.000)

• Alta exatidão (~ 10 20 ppm)• Alta exatidão ( 10‐20 ppm)

• Analizador discriminativo Analizador discriminativo

• Feixe contínuo

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7. Quadrupolo

QuadrupoloQuadrupoloQuatro pólos acoplados diagonalmenteQuatro pólos acoplados diagonalmente

• Idealmente hiperbólicos

– Substitui‐se por circulares

• Voltagem RF e DC

Para Quadrupolos Circulares

D/d = 1.148

36

7. Quadrupolo

Dimensões

Quadrupolo sintonizado para m/z 200 e íon de m/z 200

Freqüência = 880 kHz

Comprimento = 20 cm

Potencial de aceleração = 10 VPotencial de aceleração = 10 V

Tempo de permanência aproximado = 64 s

37

C t í ti7. Quadrupolo

Características

• Resolução unitária (1 Da) ~ número de ciclos RFResolução unitária (1 Da) número de ciclos RF

• Paralelismo é muito importante !p

• Simples

• Varredura discriminatória

38

E t t i d M7. Quadrupolo

Espectrometria de Massas SequencialSequencial

39

Tipos de Experimentos MS/MS7. Quadrupolo

Tipos de Experimentos MS/MS

Experimentosp

– Varredura (MS)

– SIM (MS)SIM (MS)

– SRM / MRM (MS/MS)

Varredura de Íons Produtos (MS/MS)– Varredura de Íons Produtos (MS/MS)

– Varredura de Íons Precursores (MS/MS)

V d d P d N t (MS/MS)– Varredura de Perda Neutra (MS/MS)

40

7. Quadrupolo

41

8. Ion Trap

Ion Trap 3D

42

I T 3D8. Ion Trap

Ion Trap 3DArmadilha iônica desenvolvida porWolfgang Paul (Nobel de Física de 1989)g g ( )

43

I T 3D8. Ion Trap

Ion Trap 3D

• Consiste de um eletrodo em forma de Anel e dois eletrodos “tampa”• Consiste de um eletrodo em forma de Anel e dois eletrodos tampa

• Conectados à uma voltagem RF/AC

• Forma um potencial oscilante de aprisionamento• Forma um potencial oscilante de aprisionamento

• Segue a equação de Mathieu 44

8. Ion Trap

Sequência de Eventos (MS)

• Aprisionamentop

• Resfriamento

• Varredura

• Detecção (por instabilidade de órbita)

Sequências no Tempo !!! 45

8. Ion Trap

Desvantagens

Chemical Shift

• Interações entre os íons causam desvio de órbita dentro do trap;

• Provoca um erro de massa em alguns casos.

FonteFonte

• Fonte de íons deve ficar afastada do trap; p;

• Possibilidade de reações Íon molécula (CI);

• Usa‐se um guia de íons para fazer a transferência de íons. 46

d l

8. Ion Trap

Espectrometria de Massas Sequencial no Tempo (IT)

/ /

Tempo (IT)

• Eventos de análise de m/z, dissociação e análise de m/z ocorrem

no IT;

• Eventos ocorrem no tempo;

Único anali adorm/ ários e perimentos• Único analizadorm/z, vários experimentos;

• Dissociação é realizada com He;

• Nova fonte de RF excita os íons axialmente, provocando o

aumento da energia interna Dissociaçãoaumento da energia interna Dissociação

47

8. Ion Trap

Desvantagens

Low Mass Cut‐Off (LMCO)Low Mass Cut Off (LMCO)

• Nas condições de CID;ç ;

• Íons de massa baixa não são estáveis nessas condições;

• Íons com massa < 1/3 do precursor são ejetados

48

ff ( )

8. Ion Trap

Low Mass Cut‐Off ‐ (LMCO)

49

8. Ion Trap

MSn

• Experimentos de MS sequencial com n > 2 são possíveissem custo;

B i i l d l ã f i• Basta repetir os ciclos de seleção, resfriamento,dissociação e varredura;

• Limitado pela sensibilidade (somente 1 acumulação !);

• Aplicações c/ n=3, demonstrado c/ n=12.

50

( )

8. Ion Trap

Ion Trap Linear (LIT)

• Outra forma de “Trap”;

• Consiste em um arranjo quadrupolar com lentes de entrada saída;• Consiste em um arranjo quadrupolar com lentes de entrada saída;

• Várias melhorias em relação ao 3D:

– Maior capacidade

– Menor LMCO

– Menor chemical shifts

• Dois tipos extração:

– Radial (Thermo)

– Axial (Applied Biosystems)51

f

8. Ion Trap

Configurações

hThermo52

f

8. Ion Trap

Configurações

AB Sciex

53

8. Ion Trap

54

9. Time‐of‐Flight

Time‐of‐Flight ‐ TOF

• Princípio mais simples dos analizadores; Princípio mais simples dos analizadores;

• Íons são acelerados por uma voltagem constante;

• As velocidades dos íons dependem da razão m/z;

• Mede‐se o tempo que o íon leva para percorrer

uma certa distância.

55


TOF Linear

• Analisador Pulsado (não‐contínuo)• Grande sensibilidade (Não faz varredura)• Sem limite teórico de massaB i C t• Baixo Custo

•Baixa resolução (100‐400) devido à dispersões56


TOF Refletor

• Alta resolução (10000‐20000)• Alta exatidão (~ 3‐10 ppm)• Limite de massa (até 8000 a 10000)• Menor sensibilidade 57

Instrumentação

Instrumentação

DiretoGCHPLC

EICIAPCIAPPI

BQTofIT


Sinal Registrado


ESIMALDI

LITICROrbitrap

Conversor de sinal


e FornoDetector

58

10. Detectores

DDetectores

O detector tem a função de detectar e amplificar o sinald t d í d li d t f ida corrente de íons que vem do analisador e transferir osinal para o sistema de processamento de dados.

Os principais tipos de detectores são:• Multiplicador de elétrons• MCP (micro‐channel plate)• MCP (micro‐channel plate)

59

10. Detectores

Multiplicador de Elétrons• Dinodo de conversão que é utilizado para converter íons positivosou negativos em elétrons.

• Potencias mais altos nos dinodos de conversão são utilizados paraacelerar íons de massa altas e assim melhorar a sensibilidade

60

M lti li d d Elét10. Detectores

Multiplicador de Elétrons

61

10. Detectores

MCPOMCP é lti li d d lét it á id• OMCP é um multiplicador de elétrons muito rápido

• Um único íon pode gerar 107 elétrons sendo produzidos em um• Um único íon pode gerar 107 elétrons sendo produzidos em umperíodo de 4‐5 ns

62

MCP10. Detectores

MCP

63

Instrumentação

Instrumentação

DiretoGCHPLC

EICIAPCIAPPI

BQTofIT


Sinal Registrado


ESIMALDI

LITICROrbitrap

Conversor de sinal


e FornoDetector

64

11. Acoplamentos

A l tAcoplamentos

65

11. Acoplamentos

GC/MS: The direct coupling of gas chromatography (GC)and TOF MS was achieved in the mid-1950s by Roland S.Gohlke and McLafferty of Dow Chemical Co., Midland, Mich., in

ll b ti ith Wil M L d D H i t tcollaboration with Wiley, McLaren, and Dan Harrington atBendix. At about the same time, GC was coupled to amagnetic sector instrument by Joseph C. Holmes and Frank A.Morrell of Phillip Morris, Richmond, Va., among others.Fred McLafferty

Finnigan 1968 – Hewlett‐|Packard 197166

11. Acoplamentos

The Perfect Couple !The Perfect Couple !67

Configurações

f dConfigurações de Equipamentos

68

Vantagens e Desvantagens

Vantagens• EI fornece fragmentos / Ion molecular• GC tem alta resolução

f f é d d í• Quantificação feita através de monitoramento de 1 ou mais íons• Maior a massa → Maior sele vidade

D tl l

Desvantagens• Tempos razoavelmente longos• Necessidade de derivatização em vários casos

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Hid b t li í li áti

Exemplos

Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

• Amostra – Matriz simples ou complexa? solo, águas, sedimentos, partículas no ar, entre outros

• Monitorados e regulamentados 16 HPAs (7 o to ados e egu a e tados 6 s (HPAs são classificados como carcinogênicos pela – IARC)g p )

• Otimização da separação cromatográfica Quantificação necessárioQuantificação ‐ necessário

• Limites de detecçãoIARC International Agency for Research on Cancer

HPA SeparaçãoExemplos

HPA – Separação

Espectros de massas PHAExemplos

Espectros de massas ‐ PHA

100128

100152

MW: 128 C10H8 (mainlib) Naphthalene20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

0

50

26 3951 64 77 85 89 97

102113

MW: 152 C12H8 (mainlib) Acenaphthylene10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

50

14 27 37 44 50 55 6376

78 84 89 98 109 120126

50

100

76

153

50

100166

MW: 154 C12H10 (mainlib) Acenaphthene10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

014 27 32 39 51

63

76

87 98 110 126 139

MW: 166 C13H10 (mainlib) Fluorene10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180

014 26 39 44 51 56

63 69 7482

87 97 115 122139

150

Espectros de massas PHAExemplos

Espectros de massas ‐ PHA

100178

100178

MW: 178 C14H10 (mainlib) Anthracene20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

0

50

27 38 50 63 6976 89

98 110 126 139152

163

MW: 178 C14H10 (mainlib) Phenanthrene20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

0

50

27 39 50 6376 89

98 110 126 139

152

163 184

50

100202

50

100228

(mainlib) Fluoranthene30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210

039 50 62 74 88

101110 122 150 162 174

MW: 228 C18H12 (mainlib) Benz[a]anthracene20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240

028 39 50 63 74 88

101114

122 150 163 174 187 200

Drogas de abusoExemplos

Drogas de abuso

b i• Substancias entorpecentes psicotrópicas, e seus metabólitos– Anfetaminas e Metanfetaminas

– Cocaína ‐Metabólitos

– Maconha ‐Canabinoides

Análise por CG/EMExemplos

Acidic/neutral drugs resolved to baseline Acidic / neutro drogas resolvidos com a base de referência

Análise por CG/EM

1.Methprylon2. Butalbital3. Amobarbital4 Meprobamate

5. Glutethimide6. Phenobarbital7. Methaqualone8 Primidone4. Meprobamate 8. Primidone

Figure 1a Analyze underivatized acidic drugs or basic drugs under the same conditions, using an Rxi™‐5ms column (http://www.restek.com/aoi_forensics_A002.asp)

Análise por CG/EMExemplos

Análise por CG/EM

Sensitive analysis for basic drugs in free base form

1. Amphetamine2. Methamphetamine3. Nicotine4 Cotinine

8. Phencyclidine9. Methadone10. Cocaine11 Scopolamine4. Cotinine

5. Caffeine6. Benzphetamine7. Ketamine

11. Scopolamine12. Codeine13. Alprazolam

Figure 1b Analyze underivatized acidic drugs or basic drugs under the same conditions, using an Rxi™‐5ms column (http://www.restek.com/aoi_forensics_A002.asp.)

Análise MS/MSExemplos

Análise MS/MS

Atividades:

• Entregar a Atividade 3;

• 28/09 (sexta) – Reservado para Atividade 4:“Encontrar e resumir em 2‐3 páginas um artigoEncontrar e resumir em 2‐3 páginas um artigo cientifico publicado na Quimica Nova sobre o Uso d GC/MS li â i ”de GC/MS em analises orgânicas”

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cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de … · • quando o íon molecular não é...

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