Cromatografia em camada delgada

Parte Experimental

Camila Sangaleti RepissoMichelle dos Santos de Oliveira

É uma técnica utilizada para analisar, identificar ou separar os componentes de uma mistura. A cromatografia é definida como a separação de dois ou mais compostos diferentes por distribuição entre fases, sendo que uma selocomove através de uma outra. Assim, a fase que se move denomina-se fase móvel, e a que não se locomove denomina-se fase estacionária ou suporte.

A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) éuma técnica simples, sendo desenvolvida sobre uma placa de vidro, que contém uma fina camadade adsorvente. É um tipo de cromatografia líquido-sólido

Como os componente são retidos?O processo de separação desta técnica estáfundamentado principalmente no fenômeno de adsorsão de substância na fase estacionária ou adsorventeOs componentes da mistura adsorvem-se com as partículas de sólido devido a interação de diversas forças intermoleculares. O composto terá uma maior ou menor adsorção, dependendo das forças de interação, que variam na seguinte ordem: formação de sais > coordenação > pontes de hidrogênio > dipolo-dipolo > Van der Waals.

Aplicações da CCD em Química Orgânica

A CCD pode ser usada em Química Orgânica para:•estabelecer a identidade de dois compostos;•determinar o número de componentes de uma mistura;•determinar o solvente apropriado para uma separação por cromatografia em coluna;•monitorar uma separação realizada por cromatografia em coluna;•verificar a eficiência de uma separação;•monitorar o andamento de uma reação.Em todas estas aplicações, a CCD tem a vantagem de utilizar pequenas quantidades de amostras.

A placa é imersa em uma cuba cromatográfica, que contém uma pequena quantidade de solvente(eluente). Este eluirápela camada do adsorvente por ação capilar. As amostras devem ser colocadas, na placa, acima da linha do eluente.

Preparação da suspensão do adsorvente

No preparo das suspensões emprega-se geralmente água, que pode conter ácidos , base, sais ou agentes complexantes, sendo que a parte sólida é o adsorvente.Como adsorvente usa-se geralmente sílica gel G, terra diatomácea, celulose, poliamida e outros

O maior problema do preparo da suspensão é a obtenção da viscosidade adequada para o espalhamento

• Se a suspensão for muito fina (pouco viscosa), obtém-se camadas finas demais

• Se for muito viscosa, ela não escoa adequadamente, podendo formar camadas sem uniformidade de espessura

Preparação da suspensão do adsorvente

CeluloseCelulose

SSíílicalica GelGel

→

→

AluminaAlumina →

AplicaAplicaççãoão: Utilizada para separa: Utilizada para separaçção de ão de compostos hidrofcompostos hidrofíílicos (alicos (açúçúcares, cares, aminoaminoáácidos, cidos, ííons inorgânicos, ons inorgânicos, áácidos cidos nuclnuclééicos). icos).

PreparaPreparaççãoão: 20g de celulose : 20g de celulose microcristalinamicrocristalina + + 60 60 mLmL de Hde H22O. Rendimento: 5 placas 20 x O. Rendimento: 5 placas 20 x 20 cm, 300 um. 20 cm, 300 um.

AtivaAtivaççãoão: 105: 105ººC, 10 min.C, 10 min.

CeluloseCelulose

SSíílica Gellica GelÁcido Silício amorfo, altamente poroso. É o

adsorvente mais utilizado em cromatografia. Aplicação: Utilizada para separação de

compostos hidrofílicos (açúcares, aldeídos, cetonas, fenóis, aminoácidos, íons inorgânicos, etc).

Preparação: 20g de sílica + 60-70 mL de H2O. Rendimento: 5 placas 20 x 20 cm, 300 um.

Ativação: 105ºC- 110ºC, 30 min.

Depois da Sílica, é o adsorvente mais utilizado. Assim como a sílica é empregado na separação de compostos lipofílicos.

• Aplicação: A atividade depende dos átomos “O” e “Al”: Ácida- (pH = 4) Pigmentos sintéticos e naturais, aminoácidos, ácidos carboxílicos. Neutra-(pH = 6,9-7,1)- Aldeidos, cetonas, substâncias instáveis em meio alcalino. Alcalina- (pH = 9,5-10,5)-Hidrocarbonetos aromáticos e insaturados, corantes sintéticos, alcalóides.

• Preparação: 30g + 60 mL de H2O. • Ativação: 105ºC, 10 min.

AluminaAlumina

Seleção da fase móvel

• Tem papel fundamental na separação de misturas• Para sua escolha devemos levar em consideração a

natureza química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase móvel

• Pequenas variações na composição da fase móvel leva a grandes alterações no deslocamento das manchas.

Escolha da Fase MóvelSérie de eluentes - polaridade e poder de eluição aumenta

de cima para baixoSSéérie 1rie 1 SSéérie 2rie 2n-pentano Éter de petróleo (p.e. 30-50ºC) Éter de petróleo Éter de petróleo (p.e. 50-70ºC) n-hexano Éter de petróleo (p.e. 70-100ºC) n-heptano Tetracloreto de carbono Ciclohexano CiclohexanoTetracloreto de carbono Sulfeto de carbono Triclorotileno Éter dietílicoBenzeno AcetonaDiclorometano BenzenoClorofórmio – livre de álcool Tolueno

Sobre uma cromatoplaca, colocar algumas gotas da amostra. Sobre cada uma delas, gotejar diferentes tipos de solventes. Em poucos minutos, serão observados deslocamentos concêntricos das manchas, o que permitirá a identificação da melhor.

As cubas cromatográficas, em geral de vidro com fundo plano, devem ter junto às paredes um pedaço de papel de filtro que permita a subida da fase móvel,saturando rapidamente o interior das mesmas.

Ativação das placas• A ativação consiste em aquecer as placas em temperaturas

relativamente elevadas, por tempo prolongado. Isto aumenta o seu poder de adsorsão.

• Este processo promove a remoção de vapor d’água e outros resíduos possivelmente adsorvidos na placa.

• Sílica, alumina e terra diatomácea são ativadas a 105-110ºC por 30 a 60 minutos. A celulose não deve ser aquecida por mais de 10 minutos a 105°C

• O tempo e a temperatura são fatores importante nesse processo, dependem do adsorvente utilizado e da utilidade que elas terão para com os testes.

Após estarem asplacas todas

ativadas, costuma-se riscar as placasde formas a fazer

com que uma amostra, na sua ascenção, não interfira na da outra amostra.

Aplicações das amostras nas cromatoplacas

• São aplicadas na forma de soluções, em solventes bastante voláteis

• Aplica-se através de micropipetas, o microseringas ou tubo capilar

• As amostras devem ser aplicadas 1,5 a 2,0 cm acima do bordo inferior

• Grandes quantidades de amostras geram manchas muito grandes, o que não é desejado

• Costuma-se riscar as placas de forma a fazer com que uma amostra, na sua ascensão, não interfira na da outra amostra

• Pode ser aplicada na forma de ponto (análise qualitativa), ou na forma de faixa (análise quantitativa e preparativa)

A amostra é colocada na parte inferior da placa, através de aplicações sucessivas de uma solução da amostra com um pequeno capilar. Deve-se formar uma pequena mancha circular. À medida que o solvente sobe pela placa, a amostra é compartilhada entre a fase líquida móvel e a fase sólida estacionária. Durante este processo, os diversos componentes da mistura são separados.

DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIA

As placas são colocadas numa cuba cromatográfica quase na posição vertical, apoiadas no fundo da cuba e inclinadas para as paredes laterais. Quando a fase móvel atinge uma determinada posição nas placas (2 cm do topo), estas devem ser retiradas e éimportante marcar imediatamente a distância percorrida pela fase móvel, possibilitando o cálculo dos valores de Rf

Cálculo do RfRf = dr / dm

onde dr é a distância percorrida pela amostra e dm é a distância percorrida pela fase móvel

Revelação dos cromatogramas

Após a eluição, as cromatoplacas são secas e reveladas, tornando visível as substâncias incolores existentes na amostra. Os métodos podem ser:

• Físicos• Químicos• Biológicos

Muitos compostos se tornam fluorescentes quando excitados por luz UV, ou utiliza-se o adsorvente contendo uma substância fluorescente

Físicos

QuímicosUtiliza-se agentes cromogênicos que, em contato com as substâncias da amostra, tornam-nas coloridas e, portanto, visíveis. O mais utilizado é o iodo, que torna as manchas marrons

Aplicadores de vidro para revelador químico

Reagente Procedimento Tratamento NotasAdicionar 10mL de uma solução aquosa de KI40% a 10mL da solução (0,85 g de subnitratobásico de bismuto em 10mL de ácido acético)e adicionar 50 mL de água destilada.

Diluir a solução resultante com ácido acético eágua na proporção (1 : 2 : 10)

Cloreto férrico 5,0 % de cloreto férrico em 0,5 N HCl Geralmente não requeraquecimento, mas se necessárioaquecer moderadamente

Para determinação de fenólicos

Anisaldeído / H2SO4

Adicionar 1,0 mL de H2SO4 concentrado em50,0 mL de ácido acético contendo 0,5 mL deanisaldeído

Aquecer a 100 0 C até odesenvolvimento de cor

Determinação de várioscompostos, especialmenteterpenos, açúcares, fenóis eesteróides

Dragendorff’s Geralmente não requeraquecimento, mas se a reaçãonão for espontânea, aquecer atéa coloração aparecer. Oprocedimento pode ser maseficiente se descolorir a placacom vapor de amôniaconcentrado.

Ë um método tradicional paradeterminação de alcalóides,embora possa dar reação positiva para não alcalóides, irridóides ealguns flavanóides. Alcalóidesdesenvolvem uma coloraçãoescura (laranja – vermelho)

Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para tornar a mancha visível.

Placa de sílica, eluída com diclorometano:metanol (97:3). A placa foi borrifada com solução esporos de fungos e, onde apareceram manchas brancas porque houve inibição dos fungos pelas substâncias contidas nos extratos de uma planta.

Biológicos

REVELAÇÃO COM APLICADOR COMERCIAL

Revelando o cromatograma Modo de dirigir ojato ao longo da placa

cromatográfica

1,2 dicloroetano / ácido acético12 : 1

1. Colocar essa solução em uma cuba cromatográfica até atingir a altura de 1,5 cm.

2. Colocar na cuba uma folha de papel de filtro, afim de deixar saturar até que toda a folha fique umedecida.

Preparação da cuba:

0,1 g de cada padrão (cafeína, Ácido acetilsalicilico e

acetoaminofen)

1. Dissolver cada padrão em 5,0 mL da mistura etanol / diclorometano (1:1)

2. Se necessário, aquecer em banho-maria, evitando evaporar a mistura do solvente

3. Pipetar 1,0 mL de cada solução dos padrões em um tubo de ensaio

4. Agitar afim de homogeneizar, obtendo assim a mistura de referência.

Preparação das soluções padrão:

Placa de sílica 1. Riscar a placa, dividindo-a em quatro colunas para a aplicação das soluções padrão e a mistura de referência.

2. Ativar a placa em estufa a 110°C por 10 minutos

Preparação da placa:

Fase estacionária: Placa de sílica anteriormente

preparadaAplicar com o auxílio de um capilar cada solução (padrão e referência) no centro de cada coluna a cerca de 2 cm da base.

Cuba cromatográfica (fase móvel: 1,2 dicloroetano /

acído acético)

1. Esperar até toda fase móvel atingir o limite delimitado por um rico traçado anteriormente.2. Aguardar a evaporação do solvente.

Revelação da placa

3. Revelar as manchas com o auxilio da luz ultra violeta e posteriormente pela exposição a vapores de iodo4. Medir as distâncias dos centros de massas das manchas até a origem para a realização dos cálculos de Rf

Constantes Físicas das substâncias químicas envolvidas noSubstância Densidad

ep.e./º

Cp.f/º

CP.M Form.molecul

arToxidade Solubilidade

Etanol 0,789 78,4 -114,

1

46,07

C2H5OH Causa náusea, vômitoe depressão

Solúvel em água e em solventes orgânicos

Ácido acético 1,050 118 - 60,5 C2H4O2 Se ingerido causa vômito, diarréia e

colapso circulatório

Água, álcool,éter,te-tra cloreto de carbono

Diclorometano 1,325 39,75

- 84,94

Narcótico em altas concentrações

1,2Dicloroetano

1,280 55 - 96,95

Causa irritação enarcótico

Aspirina 1,40 - 135 180,16

C9H8O4

Acetaminofen 1,293 - 170.5

151,17

C8H9NO2

Cafeína 1,23 - 238 194,19

C8H10N4O2

Preparação da amostra:Comprimidos de

analgésico1. Triturar cada uma dos três comprimidos a

serem analisados.

2. Transferir para três béqueres de 10 mL

3. Adicionar 5,0 mL de etanol / diclorometano (1:1) a cada um dos béqueres

4. Se necessário aquecer rapidamente em banho-maria, evitando evaporar a mistura de solventes

Obs.: O procedimento para a preparação da cuba cromatográfica e da placa estão

descritos anteriormente.

Fase estacionária: Placa de sílica anteriormente preparada

Aplicar com o auxílio de um capilar cada solução (padrão e referência) no centro de cada coluna a cerca de 2 cm da base.

Cuba cromatográfica (fase móvel: 1,2 dicloroetano / acído acético)

1. Esperar até toda fase móvel atingir o limite delimitado por um risco traçado anteriormente.2. Aguardar a evaporação do solvente.

Revelação da placa

3. Revelar as manchas com o auxilio da luz ultra violeta e posteriormente pela exposição a vapores de iodo4. Medir as distâncias dos centros de massas das manchas até a origem para a realização dos cálculos de Rf5. Determinar a composição de cada analgésico

Aspirina (g) Acetominofen (g) Cafeína (g)

Aspirina 0,325 ------ ------

Anacin 0,400 ------ 0,032

Bufferin 0,324 ------ ------

Excedrin 0,250 0,250 0,065

Tylenol ------ 0,325 ------

Analgésico e cafeína em algumas preparações comuns

Método B0,1 g do comprimido Preparação da amostra:

1. Triturar um comprimido

2. Transferir esta quantidade para um tubo de ensaio e adicionar 0,5 mL de metanol.

3. Agitar vigorosamente por 01 minuto.

4. Centrifugar 05 minutos.

5. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo

acetato de etila / hidróxido de amônia / água (10 : 0,25 : 0,25)

Preparação da cuba cromatográfica:

1. Colocar essa solução em uma cuba cromatográfica atéatingir a altura de 1,5 cm.

2. Colocar na cuba uma folha de papel de filtro, afim de deixar saturar até que toda a folha fique umedecida.

Fase estacionária: Placa de sílica gel G

anteriormente preparada

Aplicar com o auxílio de um capilar cada solução (padrão e referência) no centro de cada coluna a cerca de 2 cm da base.

Cuba cromatográfica (fase móvel: acetato de etila / hidróxido de

amônia / água (10 : 0,25 : 0,25))

1. Esperar até toda fase móvel atingir o limite delimitado por um rico traçado anteriormente.2. Secar a placa com o auxilio de um secador de cabelo

Revelação da placa

3. Revelar a placa com o auxilio de uma solução de cloreto férrico4. Aquecer a placa a 110°C por 10 minutos5. Marcar as posições das manchas reveladas6. Revelar com solção de Dragendorff.7. Medir as distâncias dos centros de massas das manchas até a origem para a realização dos cálculos de Rf8. Com base nas cores das manhas identificar o fármaco.

A figura abaixo representa o resultado de um cromatograma deuma amostra contendo 3 compostos diferentes:PERGUNTA:Sabendo que o eluente era água, e que a amostra continha os 3 compostos abaixo, relacione o número da mancha com a estrutura dos compostos abaixo

Mancha 2 Mancha 1

Mancha 3

• Simulação CCD• Simulação Cálculo de Rf