Cromatografia em Camada Delgada

Discentes: Daniely de Godoy Silva

Germano Blaquez Junior

Gislaine Ap. da Cunha

Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira

Profª Amanda Coelho Danuello

Histórico da Cromatografia em Camada Delgada

BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgânicos.

Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a Cromatografia em Camada Delgada, para análise de produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os sólidos ao suporte.

Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL.

Cromatografia :Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.

Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes.

Cromatografia

Planar Coluna

Líquido LíquidoGás

Líquido Fase ligada

Sólido Líquido LíquidoSólido Fase ligada

CP CCD CCD CGL CGS CGFL CLL

Sólido

CLS CE

Fase ligada

CLFLCTI CB

Critério de classificação

Técnica

Fase Móvel

Fase Estacionária

Tipo de cromatografia

Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa (CG): (aplicada a compostos orgânicos voláteis).

•A fase móvel é um gás

•A fase estacionária é frequentemente um líquidode alto p.e. sobre um suporte sólido ou um adsorvente sólido

Métodos cromatográficos

Cromatografia Líquida em Coluna Clássica

Cromatografia Líquida em coluna clássica (CCC) (utilizada para separar analitos em solução, incluindoíons) metálicos e compostos orgânicos).

•A fase móvel é um solvente

•A fase estacionária é um líquido sobre um suportesólido, um sólido ou uma resina de troca iônica, etc.

Algodão

Disco de papel filtro

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Cromatografia Líquida de Alta EficiênciaCLAE)

(uma variação da cromatografia líquida queutiliza bombas de alta pressão para aumentar

a eficiência das separações) . SOLVENTES

BOMBA

INJETOR COLUNA

DETETOR COLETOR

DESCARTE

Outra Classificação

Fase Normal

Polaridade: FE > FM

FE utilizada : Sílica G

Fase Reversa

Polaridade: FE < FM

FE utilizada: Sílica C18

CromatografiaCromatografia emem CamadaCamadaDelgadaDelgada

Consiste na separação de uma mistura atravésda migração de seus componentes sobre umacamada delgada de adsorvente (faseestacionária) retido sobre uma superfície plana, geralmente placas de vidro. Isso acontece devidoa processos de adsorção. Após ocorrido o processo, a placa passa a se chamarcromatograma.

Fase Estacionária (FE): Contém o adsorvente

Fase Móvel (FM): Contém o solvente

MecanismosAdsorção Partição Exclusão

Líquido/gás sólido

Líquido sólido

+

+

+ -

-

Líquido/gás líquido Líquido/gás gel/sólido

INTERAÇÕES INTERMOLECULARESIônicasPonte de Hidrogêniovan der Waals Keeson (dipolo/dipolo)

Debye (dipolo/dipolo induzido)London (dipolo induzido/dipolo

induzido)

Troca Iônica

Aplicações:

Identificação de compostos orgânicos com pontos de fusão próximos;

Estudos preliminares da complexidade dos componentes de um extrato orgânico;

Investigação de: Casos de envenenamento; ingestão de estimulantes por atletas;

Estudos de reações : presença de intermediários estáveis;

Análise da pureza de compostos;

Análise da eficiência de: destilação e cristalização

Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada

a. Maior rapidez;

b. Menor trajeto da fase móvel ;

c. Boa resolução;

d. Alta sensibilidade;

e. Manchas em geral menos difusas;

f. Possibilidade, quase sempre, de emprego de reagentes de detecção corrosivos;

g. Baixo custo;

h. Facilidade de raspar a camada, com espátula fina ou com uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição o conteúdo de uma mancha ou de uma banda;

ADSORVENTES UTILIZADOS EM CCD

Adsorvente: termo geral para Fase EstacionáriaAtividade dos adsorventes varia em função da quantidade de água presentes no mesmos. Quanto menor o teor de água, maior será a sua atividade, isto é, maior sua afinidade para com as substâncias a separar. A atividade depende, pois, da temperatura e do tempo de aquecimento a que é submetido o adsorvente.

Na prática, as cromatoplacas, após sua ativação, devem ser utilizadas logo a seguir, ou então conservadas em dessecadores de dimensões apropriadas, para que não tenham seu grau de atividade diminuído, por adsorção de água do ambiente.

Exemplos de adsorventes:

Sílica-Gel ou àcido Silícico;

Óxido de alumínio ou alumina;

Celulose;

Kieselgur;

Poliamida;

Sílica gel ou Ácido silícico

Mecanismo de adsorção:-Si-OH: Interações polares por ponte de hidrogênio, como doador ou aceptor de H.-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo ou dipolo/dipolo induzido

SiO O Si

O

O O

O

OH

Mais usada na CCD

Substância porosa e amorfa.

Apresenta caráter ácido.

Possui característica polar, devido à presença de grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve apresentar número de hidroxilas razoável para ser seletivo na separação de substâncias de diferentes polaridades

Tratamento térmico → eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de 105 a 110ºC)

Caracterização do tipo básico de sílica gel :G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante);H: indica ausência de aglutinante;F: indica adição de substâncias fluorescentes;P: indica adsorvente para uso preparativo;R: indica adsorvente de alto grau de pureza;

Preparação: 30g de sílica com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3 mm

CUIDADO! A aspiração da sílica causa silicose, um tipo de inflamação pulmonar crônica!

Alumina ou Óxido de AlumínioSegundo adsorvente mais empregado em CCD;

Há três grupos deste adsorvente:

A ativação da alumina faz-se,após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min.

A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos.

Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m2. g-1.

Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m2. g-1.

Preparação: 5 placas de 20x20 cm e espessura de 0,3 mm, recomenda-se a utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 mL de água destilada.

O Al

AlO

ClAlCH3

Cl

CH3

Cl

ÁCIDApH 4,0

O Al

AlO

ONaAlCH3

ONa

CH3

ONa

BÁSICApH 9,0

O Al2+

AlO

AlCH3 O NEUTRApH 7,0

Mecanismo de adsorção:Al3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados)O2-: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+

CeluloseExistem dois tipos de celulose empregadas em CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose microcristalina.

Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas aplicadas na CCD:

Tipos:

CM-celulose ( carboximetilcelulose) → trocador iônico fraco;

DEAE-celulose (dietilaminoetilcelulose) → trocador aniônico básico forte;

ECTEOLA-celulose (mistura alcalina, trietanolamina e epicloridrina → trocador aniônico básico fraco;

PEI-celulose (polietilenimina) → trocador iônico básico forte;

Celulose fosforilada → trocador catiônico forte;

Celulose microcristalina constitui-se em excelente material para separação de substâncias orgânicas hidrofílicas.

Mecanismo: Partição ou troca iônica.

Preparação: 5 placas de 20 x 20 cm, mistura-se 25 g de celulose com 90 mL de água destilada, agitando-se por 2 min, antes de colocar na placa de vidro.

Kieselgur ou terra de diatomáceas

É um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis.

Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder de resolução.

Pode ser adicionado à sílica para diminuir seu poder adsorvente.

Apresenta baixa atividade

Tipos:

Com aglutinantes;

Sem aglutinantes;

Mecanismo: Partição

Preparação: 30g do adsorvente com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3 mm

PoliamidaSeparação de fenóis e ácidos carboxílicos

A separação depende da intesindade das forças decorrentes das ligações de hidrogênio com o analito.

Baixa aderência ao vidro: dificuldade de preparação da placas

Tipos:

11 – ácido poliaminoundecanóico (Nylon 11)

6 – aminopolicaprolactama (Perlon)

6.6 – poli-hexametildiaminamonoadipato

Poliamida acetilada

Preparação:

15g em 60 mL de metanol = 5 placas (20 x 20 x 0,03 cm)

Técnica GeralEscolha da fase estacionária;

Preparação das placas cromatográficas;

Ativação das placas cromatográficas;

Seleção da fase móvel;

Aplicação das amostras nas cromatoplacas;

Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do cromatograma;

Revelação dos cromatogramas;

Documentação;

Calculo do fator de retenção Rf;

Escolha da fase estacionária

Liofilicidade e liofobicidadeInteração com os componentes (polaridade)

Necessidade de aditivos AglutinantesSubstâncias fluorescentes

Capacidade adsorvedora

Preparação da placasAs placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes àtemperatura e uniformes.

Procedimentos para a preparação das placas

Limpeza da placa de vidro → detergente e água corrente (eliminação de gordura);

Secagem → em estufa

Preparação das camadas finas dos adsorventes:

Utilização de espalhadores ( mais empregada);

Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.

Dificuldades: Obtenção de solução com viscosidade adequada.

Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.

Riscar as placas, determinando a altura

de ínicio e fim da cromatografia

Ativação das placas

Objetivo: retirar substâncias interferentes e eliminar água

Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro.Exemplo : Sílica e alumina ⇒ estufa 105 – 110 ºC por 30 –60 min;

Celulose ⇒ estufa 105ºC por 10 min;

Seleção da fase móvel Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase móvel.

Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto. Assim, para solutos muito polares deve-se utilizar um adsorvente de baixa atividade e uma fase móvel de grande poder eluente.Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: Realizada com os adsorventes celulose microcristalina e kieselgur, constitui um processo de separação que depende das diferenças de solubilidade dos componentes das amostras, nas fases estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.

Aplicação das amostras

A amostra A amostra éé aplicada na forma de soluaplicada na forma de soluçção 0,1 ão 0,1 –– 1%,dependendo 1%,dependendo da sensibilidade do revelador, usando solventes mais volda sensibilidade do revelador, usando solventes mais volááteis teis posspossííveis.veis.

AplicaAplica--se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos capilares.capilares.

As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato diretinferior da placa, afim de que essas não entrem em contato direto o com o solvente durante o desenvolvimento do com o solvente durante o desenvolvimento do cromatogramacromatograma..Alinhamento horizontal uniforme.Alinhamento horizontal uniforme.

Preparação da cuba A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar

evaporaevaporaçção) e verticalmente, apão) e verticalmente, apóós aplicadas as amostras, numa s aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase mcuba de vidro contendo a fase móóvel desejada. A cuba deve estar vel desejada. A cuba deve estar saturada com vapor de fase msaturada com vapor de fase móóvel para que o cromatograma se vel para que o cromatograma se desenvolva regularmente. Para isso, colocadesenvolva regularmente. Para isso, coloca--se papel de filtro na se papel de filtro na cuba, que ajuda na evaporacuba, que ajuda na evaporaçção e na conseqão e na conseqüüente saturaente saturaçção. A ão. A cuba deve ser dotada tampa esmeriladas de forma a vedcuba deve ser dotada tampa esmeriladas de forma a vedáá--la la hermeticamente, garantindo uma boa saturahermeticamente, garantindo uma boa saturaçção da atmosfera ão da atmosfera interna.interna.

Desenvolvimento de um cromatograma numa cuba

Procedimentos químicos, físicos, ou biológicosaplicados ao cromatograma para tornar visível as manchasdas substâncias separadas por cromatografia. AA-- ProcedimentosProcedimentos FFíísicossicos: Luz ultravioleta (aromáticos oudupla ligação conjugada).CC-- ProcedimentosProcedimentos BiolBiolóógicosgicos e e EnzimEnzimááticosticos: Antibióticos, Enzimas e Substratos. DD-- ProcedimentosProcedimentos QuQuíímicosmicos: Aplicação de um reativoquímico para formar um derivado colorido ou fluorescente.

Revelação dos cromatogramas

Reveladores Físicos

RadiaRadiaçção ultravioleta para compostos fluorescentes.ão ultravioleta para compostos fluorescentes.Ex: clorofila.Ex: clorofila.

Reveladores QuímicosConsiste em utilizar reveladores quConsiste em utilizar reveladores quíímicos que, em contato com micos que, em contato com

as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visas substâncias da amostra, as tornam coloridas e visííveis.veis.

Tipos de reveladores quTipos de reveladores quíímicos micos AlcalAlcalóóides:ides: DragendorffDragendorff, , iodoplatinatoiodoplatinatoFlavonFlavonóóidesides:: NPNP--PEGPEGAnti-oxidantes: ββ--carotenocarotenoSaponinasSaponinas, terpenos e , terpenos e esteresteróóidesides:: anisaldeanisaldeíídodo sulfsulfúúricoricoAntraquinonasAntraquinonas e e cumarinascumarinas:: vapor de amôniavapor de amôniaFenFenóólicos, licos, saponinassaponinas e e terpenterpenóóidesides:: vapor de iodo e soluvapor de iodo e soluçção de ão de CeSOCeSO44

Compostos fenCompostos fenóólicos:licos: FeClFeCl33

Reveladores BiológicosUtilizaUtiliza--se rease reaçções enzimões enzimááticas ou bacterianas para ticas ou bacterianas para tornar a mancha vistornar a mancha visíível.vel.Ex.: para testar se uma amostra contEx.: para testar se uma amostra contéém substância m substância antianti--ffúúngicangica, revela, revela--se o se o cromatogramacromatograma com esporos de com esporos de fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas substâncias.substâncias.

Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate factor)

Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase móvel.

Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a vírgula.

dr1

dm

dr2

Ws1

Linha de chegada da FM

Profundidade da FMPonto de partida da amostra

Ws2

•• FartorFartor de de RetenRetenççãoão ((RRff):):•

• Rf = dr / dm

••• ResoluResoluççãoão ((RRss):):

•• Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2) ••• EficiênciaEficiência::

•• n = 16 (dr – Ws)2

ParâmetrosParâmetros UtilizadosUtilizados nana CromatografiaCromatografia PlanarPlanar

Desvantagens da CCD

DifDifíícil reprodutibilidade:cil reprodutibilidade:quantidade de amostra aplicada quantidade de amostra aplicada obtenobtençção de ão de cromatoplacascromatoplacas com caractercom caracteríísticas idênticas.sticas idênticas.

Baixa sensibilidade:Baixa sensibilidade:detecdetecçção ão difusão da amostradifusão da amostra

DifDifíícil determinacil determinaçção exata do ão exata do RfRf..

Constantes Físicas

Bibliografia

••COLLINS, Carol H. COLLINS, Carol H. etet al, introdual, introduçção a mão a méétodos cromatogrtodos cromatográáficos, 6ficos, 6ªª eded, ed. , ed. Unicamp,Campinas,1995.Unicamp,Campinas,1995.

••NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, FunepFunep, Jaboticabal, 2005 , Jaboticabal, 2005

••THE MERCK INDEX, 13th, ed. THE MERCK INDEX, 13th, ed. MerckMerck & CO., Inc., Usa, 2001.& CO., Inc., Usa, 2001.

Tabela de constantes físicas e Toxicidade

Substância Densidade/ g.mL-1 p.f/ºC p.e./ºC M.M/

g.mol-1Fórmula

molecular Toxicidade

Etanol 0,789 -114,1 78,4 46,07 C2H5OH Causa náusea, vômito e depressão

Ácido acético 1,049 16,7 118 60,05 C2H4O2

Se ingerido causa vômito, diarréia e

colapso circulatório

Diclorometano 1,326 -25 39,75 84,93 CH2Cl2

Causa fadiga, náusea, irritação

nos olhos e cabeça

1,2 -dicloroetano 1,257 -40 83-84 98,96 C2H4Cl2

Depressão do sistema nervoso

central

Aspirina 1,40 135 - 180,16 C9H8O4Náusea, vomito e

irritação Acetaminofenol 1,293 170,5 - 151,16 C8H9NO2 [Anti-térmico]

Cafeína 1,23 238 - 194,19 C8H10N4O2

Estimulante do sistema nervoso

central

Acetato de Etila 0,902 -83 77 88,10 C4H8O2

Irritação nos olhos, pele, nariz e

garganta. Ácido

Acetilsalicílico - 152 - 300,26 C16H12O6 [Anti-térmico]

Metanol 0,7866 -97,8 64,7 32,04 CH4O Dermatite, dor de cabeça, náusea,

vômitos, anorexia

Fluxograma

Análise Cromatográfica em Camada Delgada Determinação dos Rf dos padrões:

- Transferir a solução para uma cuba cromatográfica até atingir 1,5 cm de altura - Colocar uma folha de papel de filtro da altura da cuba e deixar saturar até que toda a folha esteja umedecida com a fase móvel Aplicar cada solução no centro de cada coluna (a 2 cm da base)

- Colocar dentro da cuba e esperar a fase móvel atingir o limite traçado

- Revelar com UV - Revelar numa cuba com vapores de iodo

Solução de 1,2 dicloroetano e ácido acético 12:1

ó

Cuba Saturada

0,1g de cafeína 0,1g de ácido acetilsalicílico

0,1g de acetoaminofen

- Adicionar em cada tubo de ensaio 5,0 mL de etanol e diclorometano (1:1) - Aquecer rapidamente em banho-maria, evitando a perda de solvente

Soluções Padrão

Mistura de referência

- Num outro tubo de ensaio pipetar 1 mL de cada solução padrão - Agitar bem e homogeneizar a solução

Placa de vidro (com sílica)

Placa riscada

- Riscar a placa em 4 colunas

- Ativar a placa em estufa a 110ºC por 10

Placa ativada

Placa aplicada

Cromatograma padrão revelado

Cromatograma padrão

Cálculo dos fatores de retenção dos padrões

Análise de Analgésicos

- Triturar - Transferir para 3 béqueres de 10 mL

- Adicionar 5 mL de etanol/diclorometano 1:1 - Dissolver [banho-maria]

- Aplicar cada solução em cada coluna da placa juntamente com a MISTURA PADRÃO

- Eluir na cuba

- Revelar em UV e em iodo

- Medir Rf

3 comprimidos (Amostras)

Soluções das amostras

Placa aplicada

Cromatograma

Cromatograma revelado

Determinação das amostras