cromatografia em camada delgada (ccd) (1)
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIAS
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA QUÍMICA
DISCIPLINA: QUÍMICA ANALÍTICA III
PROFa: DJAVÂNIA
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
LAUANDICE SÁ MENESES NOGUEIRA QM06114- 46
MANOEL DE JESUS DE A. LIMA QM09110-54
MARCOS LEITE S. JUNIOR QM06111- 43
ROMES SILVA QM06102-42
TAYANE AGUIAR FREITAS QB09104-45
SÃO LUÍS – MA
2010
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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
LAUANDICE SÁ MENESES NOGUEIRA QM06114- 46
MANOEL DE JESUS DE A. LIMA QM09110-54
MARCOS LEITE S. JUNIOR QM06111- 43
ROMES SILVA QM06102-42
TAYANE AGUIAR FREITAS QB09104-45
SÃO LUÍS – MA
2010
Trabalho Apresentada ao
Curso de Química da
Universidade Federal do
Maranhão Para Obtenção da
Terceira Nota da Disciplina
de Química Analítica III
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Placa de camada fina ..................................................................... 16
Figura 2: Desenvolvimento da placa de cromatografia ............................. 17
Figura 3: Cromatografia ascendente ............................................................ 18
Figura 4: Desenvolvimento da placa ............................................................ 18
Figura 5: Cromatografia horizontal ............................................................... 21
Figura 6: Esquema de um equipamento para desenvolvimento circular .. 22
Figura 7: Esquematização de um cromatograma obtido por CCD ............ 23
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Comparação entre (CDD) e (CCDAE) ......................................... 26
Sumário
1.0- INTRODUÇÃO......................................................................................................6
2.0- CCD UMA VISÃO GERAL....................................................................................6
3.0- ADSORVENTES...................................................................................................8
4.0- ADSORVENTES UTILIZADOS EM CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA...........8
4.1- SÍLICA (SIO2)........................................................................................................8
4.2- ALUMINA (AL2O3).................................................................................................9
4.3- TERRA DIATOMÁCEA.........................................................................................9
4.4- CELULOSE...........................................................................................................9
4.5- POLIAMIDA........................................................................................................10
5.0- TÉCNICAS GERAIS...............................................................................................11
5.1- Preparação das Placas.......................................................................................11
5.1.1- Preparação por Espalhamento....................................................................11
5.1.2 Placas Pré – Fabricadas...............................................................................13
5.2 Ativação das Placas.............................................................................................14
5.3- Seleção da Fase Móvel......................................................................................14
5.4- Aplicação da Amostras nas Cromatoplacas.......................................................15
5.5- Desenvolvimento das placas..............................................................................17
5.6- Revelação dos cromatogramas..........................................................................22
5.7- Documentação....................................................................................................22
6.0- ANÁLISES QUANTITATIVAS................................................................................23
7.0- CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA EFICIÊNCIA.................25
8.0- APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA.........................27
9.0- CONCLUSÃO.........................................................................................................28
10- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................29
1.0- INTRODUÇÃO
A química analítica possui diversos métodos de análise, dentre eles um método
moderno que ocupa um lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar
separação, identificação e quantificação das espécies químicas é a
cromatografia em camada delgada.
A CCD é um processo físico-químico de separação que está fundamentada na
migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a
diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase
estacionária.
Essa técnica teve início como ferramenta de análise em química e bioquímica
com os trabalhos de Izmailov e Sharaiber, em 1938, e somente a partir da
década de 1960 passou a ser largamente utilizada em qualquer laboratório que
envolva análise de substâncias orgânicas e organometálicas.
O grande desenvolvimento dessa técnica é conseqüência natural das múltiplas
vantagens que mesma oferece, como fácil compreensão e execução,
separação em breve espaço de tempo.
Neste trabalho estudaremos a fundo as técnicas de uma CCD, suas
aplicações, características, seus desenvolvimentos e outros assuntos que
caracterizam esta técnica.
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2.0- CCD UMA VISÃO GERAL
A cromatografia é uma técnica da química analítica utilizada para a separação
de misturas e substâncias. De maneira mais completa, a técnica baseia-se no
princípio da adsorção seletiva (que não deve ser confundida com absorção),
um tipo de adesão. A técnica foi descoberta em 1906 pelo botânico italiano
naturalizado russo Mikahail Tswett, mas não foi largamente utilizada até os
anos 30. Tswett separou pigmentos de plantas (clorofilas) adicionando um
extrato de folhas verdes em éter de petróleo sobre uma coluna com carbonato
de cálcio em pó em um tubo de vidro vertical. Enquanto a solução percolou
através da coluna os componentes individuais da mistura migraram para baixo
em taxas diferentes de velocidades e então a coluna apresentou-se marcada
com gradientes horizontais de cores. A esse gradiente deu-se o nome de
cromatograma.
A cromatografia funciona graças ao fato das moléculas possuírem uma
propriedade chamada polaridade em comum e tenderem a se atrair
mutuamente. Uma molécula polar é simplesmente aquela que possui uma
região rica em elétrons e uma outra região que é pobre em elétrons. Estas
regiões às vezes são representadas como sendo negativamente e
positivamente carregadas, respectivamente. Moléculas polares são unidas por
forças de atração entre cargas opostas de moléculas diferentes. Moléculas de
água têm regiões ricas em elétrons nos átomos de oxigênio e regiões pobres
em elétrons nos átomos de hidrogênio. Assim, as moléculas de água são
polares e por conseguinte organizam-se de maneira que a região de carga
positiva de uma molécula é atraída pela região de carga negativa de outra.
Estas interações provêem uma explicação para o elevado ponto de ebulição da
água. A água (H20) é uma molécula muito mais simples que o etanol (H2C-H2C-
OH), mas tem um ponto de ebulição muito mais alto - etanol = 46ºC; água
=100ºC, 1atm.
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3.0- ADSORVENTES
O mercado dispõe de uma grande variedade de adsorventes para fins
cromatográficos, os quais podem ser adquiridos para a confecção de placas no
próprio laboratório ou como placas pré-fabricadas, nas quais esses
adsorventes são espalhados em camadas de diferentes espessuras. Alguns
dos principais fornecedores desses produtos são: Merck, Macherey-Nagel,
entre outros. Entre os adsorventes mais utilizados em CCD estão a sílica, a
alumina, a celulosa.
4.0- ADSORVENTES UTILIZADOS EM CROMATOGRAFIA EM
CAMADA DELGADA
4.1- SÍLICA (SIO2)
Á silício amorfo, altamente poroso, é seguramente um dos adsorventes mais
utilizados em cromatografia por adsorção. Apresenta caráter fracamente ácido,
que pode ser aumentado pela presença de impurezas ácidas, podendo ocorrer
como conseqüência, fenômenos de quimiossorção de bases ou reações ácido-
catalisadas das amostras.Existem vários tipos de sílicas disponíveis no
comércio, de acordo com certas características adicionais de cada produto.
Em geral, a sílica é empregada na separação de compostos lipofílicos como
aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos graxos, aminoácidos, alcalóides, terpenóides
e esteróides, usando mecanismo de adsorção. Entretanto, quando for
propositalmente desativada com vapor de água, retém água suficiente para que
as separações ocorram por mecanismo semelhante à cromatografia em papel.
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Na preparação de placas, misturam-se cerca de 30g de sílica com 60-70 ml de
água destilada. Essa quantidade de suspensão é suficiente para preparar cinco
placas de 20 por 20cm, com uma espessura da camada ao redor de 0,3mm.
4.2- ALUMINA (AL2O3)
A alumina é depois da sílica o adsorvente mais utilizado. Tem características
alcalinas, embora possa também ser preparada para apresentar característica
neutra ou ácida.
Deve-se sempre considerar a possibilidade de a alumina catalisar diversas
reações orgânicas, como as condensações de compostos carbonílicos .
A alumina é geralmente empregada na separação de compostos lipofílicos e,
pelo fato de poder ser preparada com características ácida, neutra ou alcalina,
é bastante útil na separação de substâncias que apresentem variações dessas
características . Ela separa bem hidrocarbonetos policíclicos, alcalóides,
aminas e vitaminas lipossolúveis.
Para preparar cinco placas de 20 por 20cm e espessura de 0,3mm,
recomenda-se a utilização de uma suspensão de 30g de alumina em 40ml de
água destilada.
4.3- TERRA DIATOMÁCEA
É um adsorvente neutro amplamente empregado como suportes nas
separações por partição. Quando comparada com a sílica e alumina, é menos
adsorvente e com menor poder de resolução. Algumas vezes é adicionada à
sílica para diminuir seu poder adsorvente. Pode ser encontrada
comercialmente com seu aglutinante. Na preparação de placas, utilizam-se as
mesmas proporções citadas para a sílica, ou seja, uma parte de adsorvente
para duas partes de água destilada.
4.4- CELULOSE
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Tem sido empregado como suporte da fase estacionária líquida em
cromatografia por partição ou troca iônica. Assim, tem-se a celulose
impregnada com polietilenoimina (PEI-celulose),empregada na separação de
nucleotídeos e nucleosídeos;a carboximetil-celulose (CM-celulose)para
separaão de proteínas; a dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose) e uma
mistura de celulose alcalina,trietanolamina e epicloridrina (ECTEOLA-celulose),
para separação de proteínas e ácidos nucléicos. A celulose microcristalina
pode ser empregada em todos os tipos de separações realizáveis por
cromatografia em papel, uma vez que exerce as mesmas funções, com a
vantagem de fornecer manchas mais compactas, devido à uniformidade das
partículas.Também por isso é de desenvolvimento mais rápido, e o limite de
detectabilidade do método é mais baixo.As diferentes celuloses têm sido
empregadas na separação de ácidos carboxílicos, aminoácidos,
carboidratos,cátions inorgânicos e fosfatos, entre outros.
Para preparação de cinco placas de 20 por 20cm,misturam-se 25g de celulose
a 90ml de água destilada, levando-se ao agitador por dois minutos antes de
colocar na placa de vidro.
4.5- POLIAMIDA
A utilização de poliamidas vem crescendo nos últimos anos. A poliamida pode
ser de dois tipos, de acordo com sua preparação. A poliamida 11 é preparada a
partir do ácido poliaminoundecanóico (nylon 11), enquanto a poliamida 6 vem
da aminopolicaprolactama ( perlon ).em geral, as separações dos solutos
ocorrem através da competição, pela formação de ligações de hidrogênio, com
adsorvente e fase móvel.Tem sido empregada, com maior freqüência, na
separação de fenóis e ácidos carboxílicos. Sua maior utilização é
comprometida pela dificuldade de separação das cromatoplacas no laboratório
no laboratório, em função de sua baixa aderência ao vidro.
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Para a preparação das placas, recomenda-se fazer a suspensão de 15g de pó
em 60ml de metanol, previamente purificado.Essas quantidades são suficientes
para cinco placas de 20 por 20c e 0,3mm de espessura.
5.0- TÉCNICAS GERAIS
5.1- Preparação das Placas
5.1.1- Preparação por Espalhamento
Existem diversas formas de se separar uma placa cromatográfica, quer
manualmente quer com emprego de espalhadores. Independentemente do
método escolhido, a preparação sempre se inicia com a limpeza da placa de
vidro, procurando-se eliminar toda a gordura de sua superfície. Para tanto,
recomenda-se que a placa seja lavada com detergente, solução sulfocromica e
água corrente, evitando-se ao final enxaguar com solvente orgânico que
possam dificultar a aderência do adsorvente, e, finalmente, secando-se em
estufa.
O tamanho da placa de vidro deve ser observado, pois os espalhadores em
geral são construídos com vistas à utilização de placas com 20 cm de
comprimento e largura variável. Quando a preparação for manual, esse
cuidado pode ser ignorado.
Quando não se dispõe de um aplicador, existem outras formas bastante
simples de preparar uma placa. Uma delas consiste em preparar a suspensão
do adsorvente no solvente adequado e, mantendo-se a placa de vidro na
posição horizontal, transferir a suspensão para superfície da placa,
espalhando-a com de maneira uniforme com o auxilio de um bastão de vidro e
fazendo-a oscilar, para facilitar a uniformização da camada. Repousa-se a
placa em uma superfície plana horizontal e deixa-se secar ao ar. A dificuldade
encontrada nesse processo é a obtenção de superfícies uniformes.
Outro processo bastante simples, mais indicado para placas de pequenas
dimensões, consiste na imersão da placa em uma pequena suspensão de
adsorvente, mantido em um frasco de boca larga. Nesses casos, a suspensão
12
é feita em um solvente orgânico volátil, como o clorofórmio, na proporção de 40
g de adsorvente para 100 ml de solvente. Tomam-se duas placas com as faces
justapostas, mergulhando-as na suspensão, segurando-as com uma pinça e, a
seguir, retirando-as lentamente. As placas são separadas, o solvente é
evaporado, e a camada de adsorvente é exposta ao vapor d’água. Nesse
processo obtem-se superfícies bem mais delgadas e uniformes, o que permite
a utilização de menores quantidades de amostras e o desenvolvimento mais
rápido dos cromatogramas. Placas assim preparadas tem seu uso restrito a
escala analítica.
Uma vez aplicada à camada do adsorvente sobre a placa de vidro, ela é seca
ao ar livre. Quando sua superfície torna-se opaca, isso significa que ela está
seca e, conseqüentemente, o adsorvente encontra-se fixado ao vidro. O tempo
necessário para isso é variável. A titulo de exemplo, as placas de PEI –
celulose necessitam de 12 horas para secar, antes de ficarem prontas para
uso, enquanto as de poliamida ficam prontas em 30 min.
Quando se pretende preparar placas bem uniformes e com espessuras
definidas, para uso analítico ou preparativo, faz-se necessária a utilização de
espalhadores. Eles são encontrados no mercado em tipos e marcas diferentes,
sendo os mais comuns fundamentalmente em manter as placas fixas em um
suporte e, sobre elas, fazer deslizar um recipiente contendo a suspensão,
através a suspensão do adsorvente. Enquanto o recipiente desliza, deixando
escoar a suspensão, através de uma fenda regulável existente ao longo de sua
base. A abertura da fenda varia segundo a origem do equipamento; entretanto,
em geral, estão dentro dos limites de 0 a 2,0 mm. Existem ainda espalhadores
que mantém o recipiente com adsorvente fixo e, sob ele, fazem deslizar as
placas fixadas em um suporte móvel. Esses modelos são de uso menos
freqüente.
É possível que as laminas de vidro não tenham a mesma espessura, o que
provoca oscilação durante o deslizamento do recipiente, ao passar de uma
placa para outra. Para evitar esse tipo de problema, alguns modelos de
espalhadores permitem o nivelamento das placas, através de guias laterais que
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comprime-nas contra um fundi provido de espuma de náilon, o que permite
colocar todas as faces superiores das placas no mesmo nível.
Além dos espalhadores existentes no mercado, é mencionada na literatura a
existência de diversos espalhadores adaptados ou construídos pelos
pesquisadores em seus laboratórios.
5.1.2 Placas Pré – Fabricadas
Placas cromatográficas, pré-fabricadas, dos adsorventes mais utilizados estão
disponíveis no mercado há algum tempo. Apesar de terem custo bem mais
elevado, dispensam a fase de preparação e são bem mais uniformes e
homogêneos os que, sem duvida, melhora a separação e torna os valores mais
reprodutíveis. A camada de adsorvente está depositada sobre uma lamina de
material plástico, de alumínio ou de vidro. São pré-cortadas geralmente nos
tamanhos 5 x 20 cm e 20 x 20 cm, e com a espessura da camada de
adsorvente variando entre 0,1 a 2,0 mm. Também podem ser encontradas
placas de 20 x 40 cm, com 2,0 mm de espessura, para fins preparativos.
Um dos cuidados a serem observados na realização de um experimento de
cromatografia é a colocação das amostras exatamente na mesma linha de
partida, para não ocorrem variações nos valores. Isso pode ser contornado
com o uso de cromatoplacas com zona de concentração. São preparadas com
dois componentes diferentes em camadas adjacentes que apresentam uma
bem definida linha divisória, que não oferece resistência ao fluxo da fase
móvel. A zona de concentração ocupa toda a extremidade inferior da placa, até
uma altura de 2,5 cm no sentido do desenvolvimento do cromatograma, tem
um comportamento inativo e apresenta boa velocidade de fluxo. O restante da
placa é constituído do adsorvente propriamente dito. Em produtos disponíveis
comercialmente, essa zona de concentração pode ser de dióxido de silício
(SiO2) ou terra diatomácea.
14
5.2 Ativação das Placas
Para muitas separações, as placas preparadas ou pré-fabricadas, secas ao ar
livre, são usadas diretamente, enquanto outras separações exigem sua
ativação.
O tempo e a temperatura utilizados para a ativação estão na dependência do
adsorvente utilizado e da atividade desejada. Temperatura mais elevadas, por
tempos prolongados, tornam a maioria dos adsorventes mais ativos. Sílica,
alumínio e terra diatomácea são ativados a 105 – 110 °C por 30 a 60 min. A
celulose não deve ser aquecida por mais de 10 min. a 105°C. As placas podem
ser conservadas, prontas para uso, em ambientes secos como dissecadores ou
caixas semelhantes a estantes fechadas.
5.3- Seleção da Fase Móvel
O solvente ou mistura de solvente a serem utilizados como fase móvel deve ser
escolhida cuidadosamente, pois terão papel fundamental na separação da
mistura. Entende-se que existe uma competição entre as moléculas da fase
móvel e da amostra, pela superfície do adsorvente. Portanto, na escolha da
fase móvel, devem-se considerar a natureza química das substancias a serem
separadas e a polaridade da fase móvel.
Nessa seleção, toma-se como base a ‘serie cluotropica’ dos solventes, na qual
eles são ordenados segundo suas polaridades, as quais estão diretamente
relacionadas com o poder de eluição. Essa serie auxilia muito, porem deve-se
ter em mente que não é raro encontrarem-se nela alterações, em função do
tipo de adsorvente ou da natureza das sustâncias.
Quando uma fase móvel pura não separa bem os componentes de uma
amostra, pode-se utilizar uma mistura. Existem diferentes misturas que
promovem igual separação das amostras/ em geral, observa-se que pequenas
15
variações na composição da fase móvel levam a grandes alterações no
deslocamento das manchas.
Uma maneira bastante pratica de se ter uma idéia do poder eluente da fase
móvel consiste em colocar manchas da amostra sobre uma cromatoplaca e
gotejar sobre cada uma delas, com auxilio de uma micropipeta, diferentes
solvente. Serão observados deslocamentos concêntricos das substancias, o
que permite que, em poucos minutos, se tenha informação a respeito da
capacidade de deslocamento de diferentes solventes.
5.4- Aplicação da Amostras nas Cromatoplacas
As amostras são aplicadas nas cromatoplacas na foram de soluções, em
solventes bastante voláteis, que possa,, ser facilmente eliminados após a
aplicação. Em geral são empregados soluções de 0,1% a 1,0%, devendo-se
sempre ter em mente o limite de detectabilidade do revelador, pois, se ele não
detectar a amostra, deve ser aumentar sua concentração na placa. Soluções
muito diluídas podem exigir a aplicação de um volume grande de amostra e,
conseqüentemente, aumentar muito o diâmetro da mancha.
Para a aplicação da amostra, podem-se utilizar micropipetas ou
microsseringas, que permitem determinar a quantidade de substancia colocada
na placa. Quando não é exigida a precisão na quantidade de amostra, podem
ser utilizados tubos capilares de vidro. A aplicação da amostra também pode
ser feita empregando-se aplicadores automáticos. Esses aplicadores são
sistemas que, movimentando o embolo de uma seringa, permitem tomar um
volume apropriado de amostra do recipiente que a contem e dispensar esse
volume na placa de maneira muito precisa e exata.
As gotas/manchas devem ser aplicadas 1,5 a 2,0 cm acima da borda inferior,
evitando-se que fiquem mergulhadas na fase móvel quando a placa for
colocada na cuba. A distancia entre cada gota/mancha é de aproximadamente
1,0 cm, evitando-se sempre que haja contato entre as gotas/manchas
adjacentes.
16
Em placas preparativas, uma solução concentrada da amostra é aplicada na
forma de faixa ou linha horizontal, cerca de 2 cm acima da borda inferior da
placa. A aplicação pode ser feita à mão, com auxilio de pipetas ou utilizando-se
aplicadores automáticos de amostras, porem sempre de maneira rápida e bem
uniforme. Se a amostra não estiver aplicada como uma faixa horizontal
uniforme, as bandas das substancias também não serão horizontais e o
trabalho estará perdido por má separação.
Nas placas preparativas, após o desenvolvimento e revelação do
cromatograma, a faixa correspondente a substancia desejada é retirada da
placa, com o auxilio de uma espátula ou aspirador apropriado, e a substancia é
extraída do adsorvente com um solvente adequado.
Figura 1: placa de camada fina
17
5.5- Desenvolvimento das placas
Uma cromatografia busca o melhor desenvolvimento possível para obter a
separação dos componentes na amostra. Dentre diferentes formas podemos
destacar o desenvolvimento ascendente, o desenvolvimento horizontal e o
desenvolvimento circular, todos serão descritos ainda neste item.
Na cromatografia ascendente o solvente é colocado no fundo da tinta de
cromatografia e tem um movimento ascendente através do papel
cromatográfico durante o desenvolvimento do cromatograma. Essa técnica
representada na figura (1.0) abaixo:
18
Este é o método mais utilizado e que pode ser como considerado a técnica
básica. O desenvolvimento pode ser unidimensional ascendente, bidimensional
ou ascendente unidimensional com múltiplo desenvolvimento.
Geralmente se inicia em trabalho com o movimento unidimensional
ascendente, com fase móvel e absorvente puro. Neste método, a fase móvel
(ou solvente) deve cobrir todo o fundo da cuba, até uma altura que seja inferior
uma altura àquela das manchas das placas (em geral 0,5-1,0 cm). Logo após
este procedimento, coloca-se a placa na cuba cromatográfica qual a posição
deve ser quase vertical, ou seja, apoiada no fundo da cuba e inclinada em
direção às paredes laterais. Colocam-se fitas de papel de filtro nas paredes da
cuba, mergulhadas no solvente (fase móvel), para garantir que a cuba fique
saturada com vapor de solvente (ilustrado na figura 2.0). Através de forças
capilares o solvente move-se para cima até a distância desejada (usualmente
10 a 15 cm), onde então a corrida é interrompida. Remove-se a placa e marca-
se a posição da frente de solvente com um objeto pontudo. Seca-se a placa em
capela ou em uma estufa. Na secagem, deve-se levar em consideração a
sensibilidade da amostra ao calor e a luz.
FIGURA 3
FIGURA 4
Desenvolvimento da placa
19
Pode-se colocar mais de uma placa em uma cuba; entretanto, deve-se ter
cuidado para que exista um espaçamento não muito estreito entre elas, na qual
a fase móvel não suba por capilaridade entre elas. Algumas cubas retangulares
possuem nas paredes laterais menores, sulcos de encaixe das placas, o que
permite vários desenvolvimentos ao mesmo tempo.
Durante o processo de desenvolvimento existem algumas considerações que
devem ser feitas, pois assim que a cuba é fechada iniciam-se os seguintes
processos:
i) O equilíbrio entre os componentes do solvente de desenvolvimento e
sua fase de vapor; dependendo da pressão de vapor dos componentes
individuais a composição da fase gasosa pode ser significativamente
diferente da composição do solvente de desenvolvimento.
ii) Enquanto a fase estacionária (placa) estiver seca adsorverá moléculas
da fase gasosa. Este processo é também um equilíbrio, chamado
saturação. Particularmente os componentes polares serão removidos da
fase gasosa e carregados para a superfície da fase estacionária.
iii) Simultaneamente, a parte da placa que ainda está úmida com a fase
móvel interage com a fase gasosa. Assim, especialmente o componente
menos polar do líquido é liberado para a fase gasosa.
iv) Durante a migração, os componentes da fase móvel podem ser
separados pela fase estacionária sob certas condições, causando a
formação de fronts secundários.
Em muitos casos, mesmo usando diversas etapas de separação com solventes
diferentes, a separação de misturas por TCL com o desenvolvimento em uma
só direção não permite uma boa resolução dos componentes. Este problema
pode ser superado com o uso da cromatografia em camada fina em duas
dimensões ou cromatografia bidimensional. A técnica pode ser aplicada até
mesmo para compostos estruturalmente muito relacionado. Neste
procedimento, a separação é feita usando-se uma placa de TLC quadrada. A
aplicação da amostra é feita perto de um dos vértices da placa e um primeiro
20
desenvolvimento é feito usando um sistema de solventes. Quando o
desenvolvimento se completa, a placa é retirada da cuba e seca. Gira-se a
placa de modo a fazer com que a coluna de manchas separadas passe a ser a
linha de partida. O cromatograma é desenvolvido novamente usando-se um
segundo sistema de solventes. O resultado é uma separação efetiva que cobre
uma boa área da placa de TLC. Uma das grandes vantagens da cromatografia
em camada fina em duas dimensões é o que é possível se obter separações
semelhantes com placas quadradas de apenas 10 cm X 10 cm. (VOGEL)
Pode-se utilizar ainda a cromatografia ascendente unidimensional com múltiplo
desenvolvimento. Uma vez desenvolvido o cromatograma, a placa é retirada da
cuba e seca, retornando para novo desenvolvimento. Utiliza-se em geral a
mesma fase móvel; uma placa pode sofrer sucessivos desenvolvimentos, até
que se consiga uma boa separação. Este procedimento pode ser encarado
como um aumento da camada de adsorvente, no sentido de desenvolvimento
do cromatograma. (COLINS)
Como mencionado no início deste item, o desenvolvimento horizontal e vertical
também podem ser utilizados na TLC. Essas técnicas também produzem um
bom resultado, porém são menos utilizadas. Nessas duas técnicas as placas
ficam apoiadas na posição horizontal, ilustrado na figura abaixo:
Para o desenvolvimento horizontal, as amostras destacam-se em linha reta em
placa retangular e a fase móvel é colocada em uma das extremidades. Para o
desenvolvimento circular, a amostra fica em um circulo ao redor do centro e,
neste, aplica-se a fase móvel. As manchas aparecem em círculos concêntricos.
O desenvolvimento de um equipamento relativamente simples, porém muito
eficiente, o chromatotron, que é uma cromatografia em camada delgada
FIGURA 5
21
preparativa e acelerada centrifugamente. Foi desenvolvida pelos autores do
Compendium of Organic Synthetic Methods. Trata-se de uma CCD
desenvolvimento circular, em um disco de 24 cm de diâmetro, com uma
camada de adsorvente de espessura variável entre 1 e 4 mm. O processo
cromatográfico desenvolve-se do centro para as bordas, estando o disco na
câmara cromatográfica submetido a um movimento circular de velocidade
controlada. Possui uma grande vantagem, pois há a possibilidade de rápidas
separações preparativas com quantidades variáveis de amostra, que varia de
0,1 a 1,0 g. Além disso, o sistema permite que a separação se processe até
que as manchas separadas atinjam as bordas da placa e possam ser
coletadas, juntamente com a fase móvel, em frascos coletores (representado
na figura 4,0). (COLINS)
Outro equipamento que ser feito o desenvolvimento horizontal são nas
câmaras de desenvolvimento especiais, onde são utilizadas poucas
quantidades de fase móvel.
5.6- Revelação dos cromatogramas
FIGURA 6
Esquema de um equipamento para desenvolvimento circular
22
Os diversos solutos separados no desenvolvimento podem ser detectados por
diferentes métodos. Substâncias coloridas podem ser vistas diretamente sobre
a fase estacionaria e substancias incolores podem torna-se visíveis por meio
de métodos físicos ou químicos. Se tratar de utilização de reações enzimáticas
ou bactericidas, o processo poderá ser biológico.
Substancias incolores podem ser detectadas borrifando-se (uniformemente) a
placa com um reagente apropriado que colore as regiões ocupadas pelas
manchas. Os reagentes de revelação devem ser manipulados em capela. Este
é o método químico.
O método físico consiste na detecção de alguns compostos pela luz
ultravioleta, sem a necessidade de revelação, se esses compostos forem
fluorescentes. Quando as substâncias não são fluorescentes, podem-se utilizar
adsorventes impregnados com reagentes fluorescentes; nesse caso,
observam-se manchas escuras contra um fundo claro. As manchas que foram
deter minadas podem ser marcadas com uma agulha.Os olhos devem ser
protegidos com óculos especiais quando este método for utilizado.
5.7- Documentação
Terminada a migração, os resultados serão observados utilizando diferentes
métodos de revelação, seja desenhado em placas, seja delineando a placa
sobre o papel de seda transparente colocado sobre o adsorvente, ou através
de processos mais sofisticados.
O sucesso da cromatografia em camada delgada depende dos solventes de
desenvolvimento e das afinidades diferentes do soluto pelo adsorvente da
placa. A ordem de separação das substancias depende das combinações de
solventes usadas. Sob condições de constante temperatura, sistema de
solventes e adsorvente, qualquer soluto (uma droga, um corante, um esteróide,
etc.) move-se com uma razão constante em relação à frente de solvente. Esta
razão é conhecida como valor Rf (frente relativa ou fator de retardamento),
onde
23
Rf = dist ância docomposto à linh adeorigem
dist ância da frente de solvente à linhadeorigem
O cálculo produz resultados que são números decimais menores que um. Por
isso, costuma-se usar hRf, um numero inteiro obtido multiplicando-se Rf por
100. (VOGEL)
Este é considerado o parâmetro mais importante da cromatografia em camada
delgada. Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6.
6.0- ANÁLISES QUANTITATIVAS
A cromatografia em camada delgada pode ser utilizada como métodos
quantitativos de analises de solutos que pode ser dividido em duas categorias.
Nos métodos in situ, mais geralmente usados, a quantificação é baseada na
medida direta da densidade óptica das manchas na placa, de preferência com
o auxílio de um densitômetro. O densitômetro varre as manchas uma por uma,
medindo a reflexão ou a absorção de um feixe de luz. Usualmente, fez-se a
varredura ao longo da linha de desenvolvimento da placa. A diferença de
intensidade do feixe de luz refletindo (ou transmitido) entre o adsorvente e as
manchas de soluto é vista como uma série de picos em um registrador. As
FIGURA 7
Esquematização de um cromatograma obtido por CCD
24
áreas dos picos correspondem às quantidades das substâncias existentes nas
varias manchas. Este tipo de procedimento requer a comparação das manchas
da amostra com manchas obtidas com quantidades conhecidas de padrões
cromatografados na mesma placa. Desenhos melhores de densitômetros
fizeram com que aumentasse a confiança nas determinações quantitativas de
CCD.
Um dos procedimentos mais barato é remover os componentes separados por
raspagem da porção relevante do adsorvente após a visualização com uma
técnica não destrutiva. O componente é então convenientemente extraído
colocando-se o adsorvente em um tubo de centrifuga e adicionando um
solvente adequado para dissolver o soluto. O tubo é então centrifugado e o
líquido supernadante removido e analisado por uma técnica quantitativa
adequada, como a espectrometria no ultravioleta ou no visível, ou a
espectrometria de fluorescência ou, ainda, a cromatografia com fase gasosa.
Um outro procedimento é extrair o soluto por transferência do adsorvente para
uma coluna curta de sílica gel colocada sobre um filtro sintetizado e eluição
com o solvente utilizado no desenvolvimento. Logo depois, o extrato é
analisado por uma técnica quantitativa conveniente. Em cada caso é
necessário obter uma curva de calibração usando quantidades conhecidas do
soluto no solvente usado no desenvolvimento do cromatograma.
Para que os resultados obtidos por estes métodos quantitativos de CCD sejam
de melhor qualidade, as manchas devem ter Rf = 0,3-0,7. Manchas com Rf <
0,3 tendem a estar mito concentradas e manchas com Rf > 0,7 são muito
difusas.(VOGEL)
Outros métodos de emprego direto são a medida de fluorescência e de
radioatividade, para substâncias apresentarem essas características. As
dosagens são feitas através de comparação com padrões.
25
7.0- CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA
EFICIÊNCIA
A CCD, tradicionalmente, é uma técnica simples, rápida e econômica de
analise qualitativa, entretanto, nos últimos anos, vem adquirindo aplicações
mais definidas em análise quantitativa, em razão dos desenvolvimentos na
qualidade e tipos dos adsorventes, na forma de aplicação de amostra e no uso
de densitómetros que permitem a análise quantitativa in situ.
O uso de adsorventes com partículas menores que as convencionais (5 µm)
possibilita a obtenção de separações mais eficientes (manchas mais
compactas) e, conseqüentemente, com maior resolução, tomando a técnica
bem mais atrativa. Esse aumento na eficiência, em relação a CCD usual levou
ao aparecimento da cromatografia em camada delgada de alta eficiência
(CCDAE), denominação emanada da similaridade com a cromatografia liquida de
alta eficiência (CLAE), em razão de as duas técnicas serem muito semelhantes
quanto ao fenômeno físico que as reage, diferindo fundamentalmente no
aspecto pratico.
Na tabela (nº tabela) é apresentada uma comparação entre CCD e CCDAE. A
análise dessa tabela permite verificar que comparativamente, a CCDAE é uma
técnica mais rápida, eficiente, e resulta em menores limites de detecção que a
CCD convencional; pode-se dizer se trata de um seu aperfeiçoamento, com
aplicações indicada quando se pretende efetuar a análise quantitativa.
26
Ás fases estacionárias usadas em CCDAE são sílica e várias fazes que foram
originalmente desenvolvidas para CLAE. Essas fases consistem de sílica
quimicamente modificada com grupos de diferentes polaridades, resultando
fases apolares (por exemplo, C18, sílica quimicamente ligada a uma cadeia
com 18 átomos de carbono), ou de média polaridade ( por exemplo, CN, sílica
quimicamente ligada a um gripo cianopropil)
As fazes mais polares são usadas no modo faze normal com fases móveis de
baixa polaridade e apresentam comportamento semelhante a sílica, ou seja,
maior retenção de compostos polares. No entanto, a seletividade pode ser
diferente. As fases móveis constituídas de um solvente orgânico, por exemplo,
metanol ou acetonitrila, e água, adicionadas ou não de aditivos. Em tais
condições, compostos apolares são mais retidos.
(Nº tabela) Comparação entre cromatografia em camada delgada (CCD) e
cromatografia em camada delgada de alta eficiência (CCDAE)
Parâmetro CCD CCDAE
Tamanho usual da placa 20 x 20 cm 10 x 10 cm
Volume aplicado de cada amostra 1 - 5 µL 0,1 - 0,2 µL
Número de amostras por placa 7 – 10 10 – 20
Diâmetro da mancha 3 – 6 mm 1 mm
Distância de migração do solvente 10 – 15 cm 3 – 6 cm
Tempo de corrida 30 – 200 min 3 – 20 min
Diâmetro médio da partícula de sílica gel 20 µm 5 µm
Limites de detecção
por absorção de luz - 5 ng - 0,5 ng
por fluorescência - 0,1ng - 0,01 ng
Número de pratos até 600 até 5.000
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8.0- APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
A CCD é mais simples e mais econômica das técnicas cromatográficas,
quando se pretende a separação rápida e a identificação visível. Ela tem
demonstrado ser de valor extraordinário na análise se substancias orgânicas e
inorgânicas, acompanhamento de reações em sínteses e de processos de
purificações. Seria muito difícil relacionar todas as aplicações da CCD; mais
fácil seria mencionar que ela está presente em quase todos os laboratórios de
química ou biologia, em face de fatos como existência de diferentes fases
móveis e estacionárias diferentes técnicas de desenvolvimento e visualização
sua rápida execução, sua repetitividade e o curto não elevado.
Por ser um método simples, rápido, visual e econômico, a CCD é a técnica
predominantemente escolhida para o acompanhamento de reações orgânicas,
sendo também muito utilizada para a purificação de substâncias e para a
identificação de frações coletadas em cromatografia líquida clássica.
Pode ser de aplicação analítica ou preparativa, cuja escala está na
dependência da espessura da camada de adsorvente e da amostra em análise.
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9.0- CONCLUSÃO
Uma técnica que vem tornando-se indispensável na química analítica e
também em outras áreas é a cromatografia em camada delgada. Este método
vem apresentando ao longo do tempo, uma melhoria no desempenho dos
processos de extração e aprimorando técnicas adequadas para resolver
problemas de análise.
Como mencionado neste trabalho, a cromatografia em camada delgada- CCD
(ou em camada fina) consiste em um processo físico-químico, no qual há a
separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial
sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana,
existindo uma vasta e importante aplicação na química podendo ser em
laboratório de pesquisas ou em escala industrial.
No desenvolvimento do trabalho, notaram-se diversas vantagens adquiridas ao
utilizarmos este método. Dentre elas podemos destacar sua fácil manipulação,
acessível financeiramente, possui técnicas simples, além de ser de extrema
importância para a separação rápida e analise quantitativa para pequenas
quantidades de material.
Contudo, ao realizarmos essa pesquisa aprofundada sobre a CCD, conclui-se
que esta técnica é uma metodologia muito eficaz, desenvolvida para
determinação dos componentes em uma mistura no qual produz resultados
satisfatórios para essas análises, podendo ser determinados numericamente,
possuindo valores padrões que podem ser consultados em bibliografias
confiáveis.
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10- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Fundamentos de cromatografia/ organizadores: Carol H. Colins, Gilberto L.
Braga e Pierina S. Bonato. – capinas, Sp: editora da UNICAMP, 2006.
PARK, Y.K; KOO, M.H.; IKEGAKI, M.; CONTADO, J.L. Comparison of the
flavonoid aglycone contents of Apis mellifera propolis from various
regions of Brazil. Arq. Biol. Tecnol., v.40, p.97-106, 1997.
PRATT, D.E.; BIRAC, P.M. Source of antioxidant activity of soybeans and
soy products. J. Food Sci., v.44, p.1720-1722, 1979.
VOGEL, A.I., Química Analítica Quantitativa e Qualitativa, EDITORA Mestre
Jou, São Paulo, 1990 e 1991;
HARRIS, D.C., Análise Química quantitativa, 5ª edição, LTC EDITORA, RJ,
2001;
BACCAN, N.,ANDRADE, J.C.,GODINHO, .O.E.S., BARONE, J. S., Química
Analítica Quantitativa Elementar, 3ª edição, EDITORA Edgard Blücher Ltda,
2001;
Iler, R. K., The Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, New York, 1979.
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