http://www.ebah.com.br/content/ABAAABu48AL/trabalho-cromatografia

I. INTRODUÇÃO

A Cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na

migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes

interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade

de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil

e de grande aplicação.

O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é atribuída a um

botânico russo ao descrever suas experiências na separação dos componentes de extratos de

folhas. Nesse estudo, a passagem de éter de petróleo (fase móvel) através de uma coluna de

vidro preenchida com carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se adicionou o extrato,

levou à separação dos componentes em faixas coloridas. Este é provavelmente o motivo pelo

qual a técnica é conhecida como cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo

levar à errônea idéia de que o processo seja dependente da cor.

Apesar deste estudo e de outros anteriores, que também poderiam ser considerados

precursores do uso dessa técnica, a cromatografia foi praticamente ignorada até a década de

30, quando foi redescoberta. A partir daí, diversos trabalhos na área possibilitaram seu

aperfeiçoamento e, em conjunto com os avanços tecnológicos, levaram-na a um elevado grau

de sofisticação, o qual resultou no seu grande potencial de aplicação em muitas áreas.

A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com

padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as

substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura. As diferentes

formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos critérios, sendo

alguns deles listados abaixo:

1. Classificação pela forma física do sistema cromatográfico

Em relação à forma física do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia

em coluna e cromatografia planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se à cromatografia

em papel (CP), à cromatografia por centrifugação (Chromatotron) e à cromatografia em

camada delgada (CCD), são diversos os tipos de cromatografia em coluna, os quais serão mais

bem compreendidos quando classificados por outro critério.

2. Classificação pela fase móvel empregada

Em se tratando da fase móvel, são três os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa, a

cromatografia líquida e a cromatografia supercrítica (CSC), usando-se na última um vapor

pressurizado, acima de sua temperatura crítica. A cromatografia líquida apresenta uma

importante subdivisão: a cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel é arrastada

através da coluna apenas pela força da gravidade, e a cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE), na qual se utilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso

de uma bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel. A CLAE foi inicialmente

denominada cromatografia líquida de alta pressão, mas sua atual designação mostra-se mais

adequada. No caso de fases móveis gasosas, separações podem ser obtidas por cromatografia

gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A diferença entre os dois

tipos está na coluna. Enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase

estacionária é um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior diâmetro

empacotadas com a fase estacionária.

3. Classificação pela fase estacionária utilizada

Quanto à fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas, líquidas e

quimicamente ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por um líquido, este pode

estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele. Suportes

modificados são considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por

normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separação.

4. Classificação pelo modo de separação

Por este critério, separações cromatográficas se devem à adsorção, partição, troca iônica,

exclusão ou misturas desses mecanismos. Dentre os vários tipos de cromatografia, especial

ênfase será dada à cromatografia em camada delgada (CCD), à cromatografia líquida clássica

e de alta eficiência (CLAE) e à cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR).

II. CROMATOGRAFIA PLANA

Na cromatografia plana, a fase estacionária é suportada sobre uma placa plana ou nos poros

de um papel. Nesse caso, a fase móvel desloca-se através da fase estacionária por ação da

capilaridade ou sob a influência da gravidade. Útil em separação de compostos polares.

Encontra-se bastante difundida devido à sua facilidade experimental e ao seu baixo custo.

1. Cromatografia em Papel

Esta técnica é assim chamada porque utiliza para a separação e identificação das substâncias

ou componentes da mistura a migração diferencial sobre a superfície de um papel de filtro de

qualidade especial (fase estacionária). A fase móvel pode ser um solvente puro ou uma mistura

de solventes. Este método é muito útil para separar substâncias muito polares, como açúcares

e aminoácidos. Possui o inconveniente de poder-se cromatografar poucas quantidades de

substância de cada vez.

Manipula-se o papel com cuidado e pelas pontas, e cortam-se tiras em tamanhos que possam

ser contidos nas cubas. É importante cortar o papel seguindo o eixo das fibras, pois a celulose

está orientada neste sentido, o que facilitará a passagem da fase móvel. Os líquidos polares

terão grande afinidade pelas hidroxilas da molécula de celulose, formando pontes de

hidrogênio, ficando retido e funcionando como fase estacionária, e os líquidos menos polares

serão repelidos por esta estrutura, funcionado como fase móvel.

As cubas deverão ser perfeitamente fechadas para permitir a saturação interna. A

cromatografia pode ser ascendente ou descendente, sendo que esta última é mais rápida e

consome menos eluente. 2cm de altura de eluente na cuba é suficiente para a cromatografia

ascendente.

Coloca-se a amostra a ser analisada um pouco acima da extremidade inferior do papel seco,

que após ter esta extremidade inferior mergulhada numa mistura de solventes, terão os seus

constituintes arrastados, juntamente com esta mistura que tende a subir por capilaridade. Os

diferentes constituintes apresentarão variação na velocidade de deslocamento, de acordo com

os seus coeficientes de partição. Os componentes menos solúveis na fase estacionária (água)

terão uma movimentação mais rápida. Pode ser utilizado para análise de mistura de

aminoácidos ou misturas de açúcares. A cromatografia em papel pode ser também no sentido

descendente e bidimensional, este último realizado em duas etapas com solventes

apresentando diferentes propriedades.

2. Cromatografia em Camada Delgada

A cromatografia em camada fina (ou delgada) é uma técnica simples, barata e muito importante

para a separação rápida e análise quantitativa de pequenas quantidades de material. Ela é

usada para determinar a pureza do composto, identificar componentes em uma mistura

comparando-os com padrões; acompanhar o curso de uma reação pelo aparecimento dos

produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma

mistura.

Na cromatografia de camada delgada a fase líquida ascende por uma camada fina do

adsorvente estendida sobre um suporte. O suporte mais típico é uma placa de vidro (outros

materiais podem ser usados).

Sobre a placa espalha-se uma camada fina de adsorvente suspenso em água (ou outro

solvente) e deixa-se secar. A placa coberta e seca chama-se "placa de camada fina". Quando a

placa de camada fina é colocada verticalmente em um recipiente fechado (cuba

cromatográfica) que contém uma pequena quantidade de solvente, este eluirá pela camada do

adsorvente por ação capilar.

Cromatografia em camada delgada.

A amostra é colocada na parte inferior da placa, através de aplicações sucessivas de uma

solução da amostra com um pequeno capilar. Deve-se formar uma pequena mancha circular. À

medida que o solvente sobe pela placa, a amostra é compartilhada entre a fase líquida móvel e

a fase sólida estacionária. Durante este processo, os diversos componentes da mistura são

separados. Como na cromatografia de coluna, as substâncias menos polares avançam mais

rapidamente que as substâncias mais polares. Esta diferença na velocidade resultará em uma

separação dos componentes da amostra. Quando estiverem presentes várias substâncias,

cada uma se comportará segundo suas propriedades de solubilidade e adsorção, dependendo

dos grupos funcionais presentes na sua estrutura.

Depois que o solvente ascendeu pela placa, esta é retirada da cuba e seca até que esteja livre

do solvente. Cada mancha corresponde a um componente separado na mistura original. Se os

componentes são substâncias coloridas, as diversas manchas serão claramente visíveis.

Contudo, é bastante comum que as manchas sejam invisíveis porque correspondem a

compostos incolores. Para a visualização deve-se "revelar a placa". Um método bastante

comum é o uso de vapores de iodo, que reage com muitos compostos orgânicos formando

complexos de cor café ou amarela. Outros reagentes para visualização são: nitrato de prata

(para derivados halogenados), 2,4-dinitrofenilidrazina (para cetonas e aldeídos), verde de

bromocresol (para ácidos), ninhidrina (para aminoácidos), etc.

3. Cromatografia Centrífuga

A cromatografia centrifugaé uma cromatografia em camada delgada preparativa e acelerada

centrifugamente. Baseia-se no principio da operação onde a amostra a ser separada é aplicada

como uma solução no centro do disco giratório umedecido com o solvente.

A eluição com solvente gera bandas circulares de separação dos componentes que são

removidos juntamente com o solvente para um tubo de recepção.

É compatível com todos os solventes comumente usados nas outras técnicas cromatográficas,

inclusive ácido acético, não é apropriada para uso com ácidos minerais.

Tem como vantagens, a não aplicação de “spot” ou raspagem de bandas, as separações são

rápidas, cerca de 20 min, permite a observação direta por UV ou de compostos coloridos

durante a eluição, suas camadas finas de 1, a 4 mm apresentam alta capacidade,permite a

utilização de pouco solvente e a eluição por gradiente é fácil, o solvente é regenerado in situ,

podendo ser re-utilizado, a atmosfera de nitrogênio previne oxidação das amostras, é compacta

(facilmente removida de um laboratório para outro), poucos controles e não necessita altas

pressões, possui baixo preço e assim a Chromatotrons custa menos que um simples HPLC

preparativo.

III. CROMATOGRAFIA EM COLUNA

A cromatografia em coluna costuma ser citada como o mais antigo procedimento

cromatográfico. Foi utilizada primeiramente para o isolamento dos pigmentos existentes nas

folhas verdes dos vegetais.

Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico, preenchida com um

adsorvente adequado. É uma técnica de partição entre duas fases, sólida e líquida, baseada na

capacidade de adsorção e solubilidade. O sólido deve ser um material insolúvel na fase líquida

associada, sendo que os mais utilizados são a sílica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente

na forma de pó.

A mistura a ser separada é colocada na coluna com um eluente (fase móvel; solvente) menos

polar e vai-se aumentando gradativamente a polaridade do eluente e consequentemente o seu

poder de arraste de substâncias mais polares. Uma seqüência de eluentes normalmente

utilizada é a seguinte: éter de petróleo, hexano, éter etílico, tetracloreto de carbono, acetato de

etila, etanol, metanol, água e ácido acético.

Colunas cromatográficas. (a) Solvente adicionado à coluna; (b) suporte sólido sendo

introduzido na coluna.

O fluxo de solvente deve ser contínuo. Os diferentes componentes da mistura mover-se-ão

com velocidade distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente (grupos polares

interagem melhor com o adsorvente) e também pelo eluente. Assim, a capacidade de um

determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase

diretamente da polaridade do solvente com relação ao composto.

À medida que os compostos da mistura são separados, bandas ou zonas móveis começam a

ser formadas, sendo que cada banda contem somente um composto. Em geral, os compostos

apolares passam através da coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares,

porque os primeiros têm menor afinidade com a fase estacionária. Se o adsorvente escolhido

interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela não se moverá. Por outro lado, se

for escolhido um solvente muito polar, todos os solutos podem ser eluídos sem serem

separados. Por uma escolha cuidadosa das condições, praticamente qualquer mistura pode ser

separada.

Coluna cromatográfica acoplada a um funil de separação

para manter o nível do solvente na superfície superior.

O êxito de uma coluna dependerá então da escolha de um suporte e solvente adequados para

a sua realização. Em alguns casos é possível visualizar a separação dos componentes de uma

mistura observando o desenvolvimento de manchas diferentes na coluna ou acompanhando

cm uma luz ultravioleta. Entretanto, na maioria das vezes, torna-se necessário o

acompanhamento da separação dos componentes pela técnica de cromatografia em camada

delgada (ccd).

IV. CROMATOGRAFIA GASOSA

Cromatografia data de 1903 no trabalho do cientista russoMikhail Semenovich Tswett. O

estudante graduado alemãoFritz Prior desenvolveu a cromatografia gasosa de estado sólido

em 1947. Archer John Porter Martin, quem foi vencedor do Prêmio Nobel por seu trabalho no

desenvolvimento das cromatografias líquido-líquido (1941) e em papel (1944), estabeleceu os

fundamentos para o desenvolvimento da cromatografia gasosa e posteriormente produziu a

cromatografia gás-líquido (1950). Técnica de separação e análise de misturas por interação

dos seus componentes entre uma fase estacionária e uma fase móvel.

Técnica utilizada na Cromatografia Gasosa:

Uma cromatografia gasosa é uma técnica que se baseia na análise química instrumental por

separação de compostos químicos e uma amostra complexa. Uma cromatografia gasosa usa

um tubo estreito através do qual se dá o fluxo conhecido como coluna, através do qual

diferentes constituintes de uma amostra passam em uma corrente de gás (gás condutor, ou

transportador, a fase móvel) em diferentes taxas dependendo de várias propriedades físicas e

químicas e suas interações com um específico recheio da coluna, chamada fase estacionária.

Como os composto químicos saem no final da coluna, são detectados e identificados

eletronicamente.

A função da fase estacionária na coluna é seperar componentes diferentes, causando a cada

um saída da coluna em um tempo diferente (tempo de retenção). Outros parâmetros que

podem ser usados para alterar a ordem ou tempo de retenção são a taxa de fluxo do gás

condutor e a temperatura.

Em uma análise CG, um volume conhecido de analito gasoso ou líquido é injetado na entrada

da coluna, geralmente com o uso de uma microseringa (ou com fibras de microextração de fase

sólida, ou ). Conforme o gás carreador leva as moléculas do analito através da coluna, essa

movimentação é inibida pela adsorção das moléculas do analito nas paredes da coluna ou no

material do empacotamento da mesma.

A taxa com que as moléculas progridem ao longo da coluna depende da força da adsorção

que, por sua vez, depende do tipo de molécula e do material da fase estacionária. Uma vez que

cada tipo de molécula tem uma taxa de progressão diferente, os vários componentes da

mistura de analito são separados conforme progridem ao longo da coluna, chegado ao fim dela

em momentos diferentes (tempos de retenção). Um detector é empregado para monitorar o

fluxo de saída da coluna.

Assim, o momento em que cada componente sai da coluna, e a quantidade deles, pode ser

determinada. Geralmente, as substâncias são identificadas (qualitativamente) pela ordem com

que emerger (eluem) da coluna e pelo tempo de retenção do analito na coluna.

Aplicações práticas da Cromatografia Gasosa:

Química:

1. Determinação de antioxidantes, nutrientes ou contaminantes em alimentos.

Indústria:

1. Monotorização de processos industriais.

Saúde:

- Análises dos constituintes do sangue.

- Análise forense.

Ambiente:

- Determinação de resíduos de pesticidas em produtos alimentares, águas ou esgotos.

- Determinação de gases e solventes orgânicos na atmosfera, solos ou rios.

As partes de um Cromatógrafo Gasoso:

A cromatografia é um método físico de separação, no qual componentes a serem separados

são distribuídos entre duas fases: a fase estacionária, e a fase móvel. A amostra é transportada

por uma corrente de gás através de uma coluna empacotada com um sólido recoberta com

uma película de um líquido. Devido a sua simplicidade, sensibilidade e efetividade para separar

os componentes de misturas, a cromatografia de gás é uma das ferramentas mais importantes

em química. É amplamente usada para análises quantitativos e qualitativos de espécies

químicas e para a determinar constantes termoquímicas tais como calores de solução e

vaporização, pressão de vapor e coeficientes de atividade. A cromatografia de gás é também

usada para monitorar os processos industriais de forma automática: analisam-se as correntes

de gás periodicamente e realizam-se reações de forma manual ou automática para compensar

variações não desejadas.

Muitas análises de rotina são realizadas rapidamente no campo medicinal e outros. Por

exemplo, por meio do uso de apenas 0.1 centímetros cúbicos (0.003 onças) de sangue, pode-

se determinar as porcentagens de oxigênio dissolvido, nitrogênio, dióxido de carbono e

monóxido de carbono. A cromatografia de gás é útil também na análise de contaminantes do

ar, álcool no sangue, óleos essenciais e produtos alimentícios.

O método consiste primeiramente na introdução da mistura de prova ou amostra em uma

corrente de gás inerte, normalmente hidrogênio, hélio, nitrogênio ou argônio, que atuarão como

gás de arrastre. As amostras líquidas vaporizam-se antes da injeção no gás de arrastre. O fluxo

de gás passa pela coluna empacotada através da qual os componentes da amostra se

deslocam a velocidades influenciadas pelo grau de interação de cada componente com a fase

estacionária não volátil. As substâncias que têm a maior interação com a fase estacionária são

retidas por mais tempo e, por tanto, separadas daquelas de menor interação. À medida que as

substâncias eluem da coluna, podem ser quantificadas por um detector e/ou tomadas para

outra análise.

Existem dois tipos de cromatografia de gás: cromatografia Gás - Sólido (CGS) e cromatografia

Gás - Líquida (CGL). A cromatografia Gás - Sólida se baseia na base sólida estacionária, na

qual a retenção das substâncias analisáveis é a consequência da absorção física. A

cromatografia Gas -Líquida é útil para separar íons ou moléculas dissolvidas em um solvente.

Se a solução de amostra estiver em contato com um segundo sólido ou fase líquida, os

diferentes solutos interagem com a outra fase em diferentes graus, devido a diferenças de

adsorção, intercâmbio de íons, partição, ou tamanho. Estas diferenças permitem que os

componentes da mistura se separem usando estas diferenças para determinar o tempo de

retenção dos solutos através da coluna.

V. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

A cromatografia líquida (HPLC) é um processo de análise de separação físico cuja aplicação

permite a análise qualitativa mais comumente e quantitativa de uma amostra. Esse método

analítico vem sendo amplamente empregado graças ao rápido tempo de análise. Permite

separar constituintes de uma mistura através de sua distribuição em duas fases: fase móvel é

um líquido e a fase estacionária é um sólido.

A cromatografia liquida é utilizada em várias áreas da ciência, no acompanhamento de

sínteses, em análises de pesticidas, feromônios, no isolamento de produtos naturais e

sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras

aplicações.

A cromatografia a líquido permite, entre outras, a análise das seguintes classes dos principais

compostos: proteínas, ácidos nucléicos, aminoácidos, corantes, polissacarídeos, pigmentos de

plantas, compostos iônicos, íons metálicos, cátions, lipídeos polares, explosivos, polímeros

sintéticos, surfatantes, farmacêuticos, metabólicos de plantas, ânions, complexos de metais

pesados, etc.

Hoje a cromatografia líquida de alta eficiência tem as seguintes características:

1. alto poder de resolução;

2. separações rápidas;

3. monitoramento contínuo do eluente;

4. medidas quantitativas acuradas;

5. análises repetitivas e reprodutíveis com a mesma coluna;

6. automação do procedimento analítico e do manuseio dos dados

Sob alguns aspectos, a cromatografia líquida de alta eficiência é mais versátil que a

cromatografia com fase gasosa porque ela não está limitada a amostras voláteis e

termicamente estáveis e porque a escolha de fases estacionárias e móveis é mais ampla

(Mendham et al, 2002).

O emprego da cromatografia a líquido para solucionar problemas analíticos ou preparativos

necessita, além da instrumentação adequada, da combinação correta das condições

experimentais tais como:

1. tipo de coluna (fase estacionária);

2. fase móvel, sua composição e vazão;

3. temperatura;

4. quantidade de amostra injetada, etc.

A seleção correta dessas variáveis necessita do conhecimento básico dos fatores que

controlam a separação na cromatografia a líquido (Ciola,1998).

Cromatografia a líquido de alto desempenho (HPLC)

A cromatografia a líquido de alto desempenho é um tipo de cromatografia que emprega uma

fase móvel líquida e uma fase estacionária finamente dividida e que, para ter um fluxo razoável,

opera a pressões elevadas. Originalmente chamava-se cromatografia líquida de alta pressão e

esta terminologia foi abandonada quando se constatou que o diferencial de comportamento

desta para as demais cromatografias líquidas não era a maior pressão, mas sim o melhor

desempenho cromatográfico. Dentre as principais características e vantagens do método HPLC

estão:

1. coluna recheada com partículas de pequeno tamanho ( 3 - 10 mm);

2. alta resolução;

3. análise não destrutiva;

4. velocidade de separação;

5. monitoração contínua do efluente da coluna;

6. medição quantitativa exata;

7. análises repetitivas e reprodutivas com a mesma coluna;

8. automação do procedimento analítico e do tratamento dos dados.

Os componentes essenciais da HPLC são:

1. Bomba de alta pressão: dispositivo importante pois está relacionado ao tempo de retenção, a

reprodutibilidade e a sensibilidade do detector. Este sistema é composto por bomba e

controladores de pressão e vazão. De uma maneira geral, a bomba deve ter a capacidade de

impulsionar a fase móvel. Existem dois tipos de bomba, com pressão constante e com volume

constante.

2. Sistema de injeção da amostra: a introdução da amostra pode ser realizada por meio de uma

válvula de amostragem ou por meio de uma seringa de injeção. O efluente desses dispositivos

preenche uma serpentina de volume conhecido e o acionamento da válvula transfere,

integralmente, esse volume para a corrente de fase móvel.

3. Coluna: são feitas de aço inoxidável polido, com comprimentos de 10 a 30 cm, com calibre de

precisão. Diâmetros internos típicos variam de menor ou igual a 1 mm para colunas capilares;

2, 3, 4, 5 e 6 mm para colunas analíticas recheadas e maior ou igual a 10 mm para colunas

preparativas. Os recheios usados são constituídos por partículas pequenas, rígidas comum a

distribuição granulométrica estreita. Os tipos de recheio podem ser divididos em três

categorias:

4. 1- grânulos porosos, poliméricos, baseados em copolímeros de estireno-divinilbenzeno e são

utilizados na troca de íons e na cromatografia por permeação em gel;

2- grânulos de camada porosa , constituídos por uma camada delgada de sílica modificada,

estes recheios peculiares são usados em alguma aplicações de troca de íons e muito usados

em cromatografia de fase reversa para análise de compostos orgânicos;

3- partículas de sílica totalmente porosas que proporcionam considerável melhoria da eficiência

da coluna, da capacidade de analisar as amostras e da velocidade de análise.

1. Detector: monitora a fase móvel à medida que elui da coluna. São duas principais classes em

que podem ser divididos: detectores de propriedades macroscópicas e detectores de

propriedades de soluto, que medem a diferença entre uma propriedade física do soluto na fase

móvel e a mesma propriedade na fase móvel pura. Esse monitoramento é efetuado pela

detecção propriamente dita, associada a uma transdução para um sinal elétrico que pode ser

registrado ou arquivado eletronicamente na fase móvel pura. Esse monitoramento é efetuado

pela detecção propriamente dita, associada a uma transdução para um sinal elétrico que pode

ser registrado ou arquivado eletronicamente.

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CIOLA, R. Fundamentos da cromatografia a líquido de alto desempenho: HPLC. São Paulo,

SP, 1998.

MENDHAM, J.; DENNEY, R. C.; BARNES, J. D.; THOMAS, M.T. Vogel, Análise Química

Quantitativa. 6ª ed. Londres, 2002.

Cromatografia de Coluna. Disponível em:

http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/COLUNA.htm. Acesso

em: 04 de maio de 2010.

Cromatografia. Disponível em:

http://ube-167.pop.com.br/repositorio/4488/meusite/qorganicaexperimental/cromatografia.htm.

Acesso em: 04 de maio de 2010.

Experimento 5: Introdução a Métodos Cromatográficos. Cromatografia em Camada Delgada e

em Coluna. Disponível em:

http://vsites.unb.br/iq/litmo/disciplinas/tecnica_pesquisa_I/Cromatografia.DOC. Acesso em: 04

de maio de 2010.

Cromatografia em Papel. Disponível em:

http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/CROMA_PAPEL.htm.

Acesso em: 03 de maio de 2010.

Cromatografia em Papel. Disponível em:

http://www.setor1.com.br/analises/cromatografia/cro_pa.htm. Acesso em: 03 de maio de 2010.

Cromatografia Gasosa. Disponível em: http://www.ebah.com.br/cromatografia-gasosa-nivel-

tecnico-ppt-a24620.html. Acesso em: 28 de abril de 2010.

PENTEADO, José Carlos, et. al. Experimento didático sobre cromatografia gasosa: uma

abordagem analítica e ambiental. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-

40422008000800047&script=sci_arttext. Acesso em: 28 de abril de 2010.

http://www.engenhariaearquitetura.com.br/blog/ciencias-da-vida/?p=378

A importância da cromatografia

A cromatografia é uma poderosa ferramenta analítica para o controle de qualidade de ativos e formas farmacêuticas. Apresenta elevada exatidão nos resultados, permitindo a identificação e/ou a quantificação dos compostos presentes com confiabilidade. “A cromatografia atua em várias áreas de atribuição do controle, como na determinação da porcentagem do princípio ativo, na quantificação das impurezas de um produto, na determinação da composição ou formulação de um produto, e também no estudo de estabilidade e degradação de um produto. Desta forma, o controle de qualidade se beneficia ao usar uma técnica que permite obter resultados em curto espaço de tempo (em geral, 1 a 20 minutos) e com alta precisão e exatidão”, resume Romão Batista Beserra Jr., especialista em cromatografia da Agilent. “Outro ponto importante a se destacar é a praticidade de execução dessas análises, ajudadas também pelo avanço dos softwares que são utilizados nesses equipamentos”, acrescenta José Lamartine Soares Sobrinho, diretor do Núcleo de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal do Piauí (UFPI).

Entre as técnicas mais utilizadas estão a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) e a Cromatografia em Fase Gasosa (GC). A CLAE é uma técnica físico-química de separação de compostos em que a amostra é introduzida no equipamento através de um injetor. Os compostos dessa amostra são arrastados por uma fase móvel (solventes como metanol, acetonitrila, água e outros) e passam por uma fase chamada estacionária (colunas cromatográficas conhecidas como C18, C8 e outras). “O objetivo é que os compostos de interesse sejam separados na coluna cromatográfica e cheguem a um detector que mede o sinal fornecido por cada composto. Este sinal é registrado em um gráfico (chamado cromatograma), em que as informações registradas podem revelar qual é o composto e a sua quantidade”, esclarece Beserra Jr. Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba, injetor, forno, coluna e todo o processo é realizado à alta pressão (1000- 18000 psi).

A Cromatografia em Fase Gasosa (CG), explica o especialista da Agilent, é uma técnica físico-química de separação de compostos. O processo é semelhante à CLAE, porém, a fase móvel que arrasta os compostos da amostra é um gás (H2, He, N2 e outros). “Os compostos também passam por uma coluna cromatográfica (empacotada ou capilar) e o objetivo é que haja a separação desses compostos para que o detector possa reconhecer o sinal de cada composto”, acrescenta. Nesse processo também é produzido um cromatograma, e as informações revelam o composto e sua quantidade. O equipamento CG é composto de um compartimento de injetor, forno para coluna e detector.

Beserra Jr. destaca que em ambas as técnicas o sistema pode ser automatizado com amostradores automáticos que trariam maior produtividade e eficiência dos resultados.

A CLAE tem sido usada para determinação da porcentagem do produto ativo, na quantificação das impurezas de um produto, na determinação da composição ou formulação de um produto, e também no estudo de estabilidade e degradação de um produto. “Em alguns casos, tem sido usada também para purificação de princípio ativo, área conhecida como cromatografia líquida preparativa. Outro campo de aplicação é quando usada como ferramenta analítica para descoberta de novos medicamentos ou estudos de bioequivalência”, afirma.

A CG em indústrias farmacêuticas, conclui Beserra Jr., tem sido usada fundamentalmente para monitoramento de matérias-primas, “avaliando o teor de impurezas orgânicas tóxicas e garantindo que os produtos finais estejam livres desses compostos.”

Vantagens e desvantagens

A grande vantagem das técnicas cromatográficas, segundo Daniela Daniel, especialista de produto HPLC/Biotech da Shimadzu do Brasil, está na capacidade de realizar separações e análises quantitativas de um grande número de compostos presentes em vários tipos de amostra, em uma escala de tempo relativamente pequena, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. “A única desvantagem da cromatografia gasosa é o fato de ser aplicável somente a amostras voláteis ou volatilizáveis. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência tem uma sensibilidade menor quando comparada à cromatografia gasosa”, diz Daniela.

Beserra Jr. destaca o fato de tais técnicas serem confiáveis e reprodutivas, possibilitarem ensaios de curto tempo e aumentarem a produtividade de um controle de qualidade. “Muito importante ressaltar que essas técnicas possibilitam realização de ensaios com resultados de alta confiabilidade, muitas vezes se constituindo em ensaios exclusivos que nenhuma outra técnica realiza”, afirma. “Por outro lado, o laboratório deve dispor de um investimento na aquisição, manutenção e treinamento dos usuários”, ressalva o profissional da Agilent.

José Lamartine Soares Sobrinho aponta a acessibilidade como um dos pontos importantes. “Com a evolução da técnica aliada à popularização, o custo, que antes era uma barreira, hoje é bem aceitável numa rotina dentro da indústria farmacêutica”, afirma. Lamartine reforça a necessidade de utilizar tais ferramentas de forma criteriosa com pessoal apto para executar esse trabalho, “pois por mais moderno que sejam os equipamentos e softwares, o fator operacional é primordial para realizações adequadas”.

Escolha da coluna cromatográfica

A escolha correta de colunas cromatográficas é etapa importante na montagem do sistema a ser utilizado. O conhecimento da matriz a ser analisada ou o analito a ser detectável/quantificável é ponto de partida para a seleção da fase estacionária (coluna cromatográfica). “Hoje, o mercado dispõe de um poderoso arsenal de colunas cromatográficas com eficiência e reprodutibilidade comprovadas. Porém, alguns outros aspectos devem ser levados em consideração como o tempo de análise ideal, o número de amostras e a resolução dos picos cromatográficos requeridos, sempre levando em consideração o custo de tais aparatos”, explica Lamartine.Beserra Jr. também acredita que a escolha da coluna cromatográfica se constitui em muitos casos na principal etapa de definição da metodologia. “Na área farmacêutica existem diretrizes a serem seguidas. A principal refere-se às metodologias encontradas nas farmacopéias, brasileira ou internacionais. Nestas encontram-se recomendações das colunas a serem usadas. Quando o ensaio não está previsto em uma farmacopéia, o usuário pode procurar na literatura (publicações, artigos, manuais e outros), ou então, a escolha pode depender de testes realizados com várias colunas no próprio laboratório. O objetivo sempre será de trabalhar com uma coluna que permita que o sinal obtido do composto de interesse seja exclusivo deste composto”, esclarece.

Para Daniela, a escolha da coluna cromatográfica deve se basear nas características da amostra (estrutura dos compostos presentes, solubilidade e pKa) e nas diferenças químicas entre os compostos de interesse. “Além disso, deve-se levar em consideração a estrutura química da fase estacionária, sua capacidade de retenção, o tamanho de partícula e as dimensões da coluna”, informa.Aprimoramento tecnológicoA cromatografia líquida tem sido beneficiada nos últimos anos por diversas inovações. Daniela Daniel afirma que o principal aprimoramento refere-se ao desenvolvimento de novas partículas de fases estacionárias, capazes de gerar colunas mais seletivas, eficientes e estáveis química e mecanicamente. “O emprego de partículas menores que 2 µm nas separações cromatográficas resulta em maior eficiência e possibilita a redução dos tempos de análise, todavia, há como consequência um aumento significativo na pressão do sistema. Estas novas colunas não são compatíveis com os sistemas cromatográficos convencionais e seu uso só se tornou possível recentemente, com o desenvolvimento da cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE) ou a U-HPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography)”, relata.

Começando pelo preparo de amostra, muitas vezes fundamental no cálculo do tempo total de um ensaio, novas técnicas de preparação como SPE, SPME e SBSE – que diminuem o uso de solvente – são seletivas ou específicas e rápidas. É o que afirma Beserra Jr. Novas técnicas como SFC (cromatografia com fluido super crítico) para análise de substâncias quirais de difícil separação, e UHPLC (cromatografia de ultra performance), que possibilita análises rápidas de 0,5 a 3 minutos, também são destacadas pelo especialista da Agilent. “Alguns métodos convencionais já estão sendo migrados para UHPLC, com ganho de tempo de 10 a 20 vezes”, afirma.

Ele também destaca as Cromatografias Capilar e Nano, que utilizam fluxos de 0,1 a 10 ul/min, consomem muito pouco solvente e utilizam pouca quantidade de amostra. “Existem ainda as técnicas multidimensionais LC-LC e comprehensive LC x LC que permitem difíceis separações de compostos. Como extensão da Cromatografia Líquida, a técnica de espectrometria de massas acoplada à Cromatografia Líquida (LC-MS) tem sido cada vez mais usada para estudos de bioequivalência, controle de qualidade e determinação de concentrações jamais imaginadas de partes por quatrilhão”, afirma. José Lamartine Soares Sobrinho também

ressalta a utilização do espectrômetro de massas. “Tal ferramenta possui uma sensibilidade muitas vezes maior frente ao tradicional UV-vis”, conclui.

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Historia da Cromatografia

A Cromatografia que vem do grego (chroma, cor e grafein", grafia) Cromatografia é uma técnica de separação analítica muito difundido e utilizado hoje em dia, devido sua facilidade, confiabilidade e sua capacidade de separação de uma mistura, a técnica foi criando pelo botânico russo Mikhail S. Tswett no inicio do século XX. Ele estudava pigmentos de folhas extraído de plantas, seu primeiro trabalho de cromatografia foi em 1903 Sociedade de Cientistas Naturais de Varsóvia, ele ate então não tinha nenhum dado a apresentar.

Em 1910 ele lançou um livro no qual descrevia sua técnica de cromatografia, detalhando e a suas teorias e a técnicas de cromatografia, podemos dizer que esse foi o primeiro livro de cromatografia.

A muita discussão de quem foi realmente o pai da cromatografia, muitos defende que na mesma época em que Tswett publico seus estudos de cromatografia, existia outros cientistas que já realizavam estudos do fracionamento do petróleo, e outros que já separavam suas substancias mesmo usando outras técnicas, porem podemos dizer que Tswett realmente é o pai da cromatografia na qual conhecemos hoje.Depois de Tswett ter criado a cromatografia apenas alguns cientistas/pesquisadores seguiram com a técnica como exemplo: • Gottfried Kranzlin: foi o primeiro “seguidor” da técnica de Cromatografia, aplicando-a apenas algumas semanas do trabalho publicado de Tsvet;

• Charles Dhéré: foi o primeiro cientista europeu a reconhecer a importância da Cromatografia, desenvolvendo esta técnica no seu laboratório. Foi também o biógrafo da vida e pesquisa de Tsvet;

• Leroy S. Palmer: cientista americano que introduziu a Cromatografia nos EUA, realizando importantes pesquisas com compostos naturais utilizando esta técnica, antes de Edgar Lederer;

• Edgar Lederer: importante bioquímico austríaco que pode ser considerado como o primeiro cientista que utilizou a Cromatografia para separar compostos naturais a partir de 1930, juntamente com o austríaco Richard Kuhn;

• Katharine Hope Coward: cientista britânica, que otimizou a técnica e a utilizou em sua pesquisa;

• Theodor Lippmaa: cientista estoniano, que segundo Ettre, é um cientista esquecido, mas que tem papel importante no desenvolvimento da técnica cromatográfica; (http://cromatografiabrasil.blogspot.com)Muitos cientistas usaram a técnica de cromatografia antes de dar o Nobel de Química da Cromatografia de partição, na década de 50 quando apartir de então foi muito difundido. Depois a surgiu diversas formas de cromatografia, cromatografia Gás – Liquida, Solida-Solida. Porem a mais utilizada hoje em dia é a Líquido- Solido, porem com certa diferença da qual Tswett usava.A técnica nas últimas décadas evoluíram no sentido de otimização de tempo e consumo de solvente, empregando bombas de alto desempenho para bombear a fase móvel (na cromatografia Líquido- Solido), foi empregado diversos detectores para quantificação e analises qualitativas, utilizando de diversos princípios físicos, química e físico-químicos, as colunas de separação foram as que mais evoluíram em relação as que Tswett usava, empregando vários compostos diferentes para a separação de diversas matrizes.Hoje em dia a técnica de cromatografia é muito difundida e utilizada para analises, tanto qualitativas, quanto quantitativas, em diversas áreas tanto na indústria quanto em pesquisa.

http://quimicanahistoria.blogspot.com.br/2010/07/historia-da-cromatografia.html