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CROMATOGRAFÍA

Cátedra de Química Orgánica

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Objetivos

Incorporar los conceptos teóricos en los que se fundamenta la cromatografía en sus

distintos tipos. Ejemplificar la utilidad de las técnicas

cromatográficas como método de separación y

como criterio de pureza e identificación. Aplicar las técnicas de capa delgada y columna

para la separación de pigmentosvegetales (adsorción) y papel para la separación de colorantes alimentarios (partición).

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Origen

A principios del siglo XX, el botánico ruso Tswett separó pigmentos vegetales pasando soluciones de estos pigmentos por una columna de vidrio empaquetada con CaCO3. Las especies separadas aparecían como bandas de colores, lo que dio origen al nombre del método

chroma = color graphé = escribir

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CROMATOGRAFIA

Sistema Cromatográfico:

Fase Móvil

Fase Estacionaria

solutos

Uno o más

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Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración entre los componentes de la muestra, debidas a interacciones con las fases,, una estacionaria y otra móvil

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Clasificación de las técnicas cromatográficas:

1) Clasificación de acuerdo al mecanismo de separación

2) Clasificación de acuerdo al estado físico de las fases

3) Clasificación de acuerdo al lecho cromatográfico

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Proceso físico - químico que rige la separación:

Adsorción:

El soluto se adsorbe en la superficie de las partículassólidas de la fase estacionaria. Es un fenómeno superficial, aumentado con la formación de puentesde hidrógeno.

Partición o Reparto:

El soluto se equilibra entre el líquido de la fase estacionaria y la fase móvil, por diferencia de solubilidad. Hasta llegar a un equilibrio

1)Clasificación de acuerdo al mecanismo de separación

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- Intercambio Iónico:

Los aniones o cationes se unen a la fase estacionaria sólida por fuerzas iónicas

- Exclusión Molecular, Filtración o Permeación en Gel:

No existen interacciones entre la fase estacionaria y el soluto. Se separa por tamaño de partícula.

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2) Clasificación de acuerdo al estado físico de las fases:

Tipo de fase estacionaria

• Sólido: finamente dividido en un tubo de vidrio o metal

• líquido inmiscible con la fase móvil. Se emplean distintos procedimientos para fijar la fase estacionaria líquida.

Tipo de fase móvil

• Gas• líquido

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Tanto el soluto como el solvente son atraídos por los sitios polares de la fase estacionaria, pero la separación es posible por las distintas fuerzas de atracción.

Adsorción

Fase estacionaria: sólido (sílica o alúmina)

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ParticiónLa separación se basa en la solubilidad relativa del soluto entre dos fases líquidas. Se utiliza gel de sílice que absorbe agua fuertemente. La fase estacionaria es el agua.

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Coeficiente de Partición

K = Cs fase estacionaria / Cs fase móvil Cs: concentración de soluto

A > K, el soluto tarda más tiempo en pasar por la columna

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Intercambio iónico

La fase estacionaria (resina) tiene su superficie con carga opuesta a la del soluto que se quiere retener.

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Exclusión por tamaño (gel permeation)

La separación se basa en el tamaño molecular. La fase estacionaria es un material de tamaño de poro controlado.

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Afinidad

Sólo es retenida la molécula afín a las unidas covalentemente a la fase estacionaria.

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Fase Estacionaria :

Partición: La fase estacionaria es líquida, sobre un soporte sólido inerte.

1 - Común (Agua)

2 - Reversa o Inversa (parafina)

El papel contiene un 20 % de agua retenido aunquenosotros lo notemos seco, esa es la fase estacionaria.

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Exclusión molecular: Tierras de DiatomeaSephedex (geles)

Adsorción:

Silica Gel (Oxido de Silicio).Alumina (Oxido de Aluminio).Celulosa.Fluorisil (Silicato de Magnesio).Sulfato de Calcio.

Fase Estacionaria :

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Intercambio Iónico:

Resinas

Catiónicas

Aniónicas

Acido sulfónico

RSO2- H+

Acido carbóxilico

Ión amonio cuaternario

Grupo amina

RCO2- H+

R3NR+ OH-

R3NH3+ OH-

Fase Estacionaria :

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3)Clasificación de acuerdo al lecho cromatográfico:

-Cromatografía plana: en papel capa fina

-Cromatografia en columna

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Fase

estacionaria

Fase

móvil

Proceso

cromatográfico

Capa fina

Columna

Adsorción

I. Iónico

Esc. Molecular AdsorciónColumna

Papel

Capa fina

Columna

Partición

ParticiónColumna

Líquida

LíquidaLíquida

Sólida

Gas

Gas

Técnica

cromatográfica

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Cromatografía en Papel y Capa Fina (TLC)

Sembrado:

Puntiforme Banda

Forma de sembrado: Manual (capilares jeringas)

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Cualitativa

xx

Identificación

x x

Pureza

x x

Ausencia

Cuantitativa

x x x x

Preparativa

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Desarrollo

Simple

Múltiple

DescendenteAscendente

Circular

Horizontal

ComúnBidimensional

Continuo

x

ba Rf

a - distancia recorrida por el analito.

b - distancia recorrida por el frente

ab

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Fase Móvil

COOH OH NH2

SH CHO CO COOR OCH3

Hidrocarburos No SaturadosHidrocarburos Saturados

Acidos carboxílicosAlcoholesAminasTiolesAldehidosCetonasEsteresEteres

Alta

Baja

Polaridad

Saturación de la Cámara

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Cromatografía en capa delgada

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Cromatografía de capa fina

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Revelado Difiere de acuerdo al objetivo planteado

Clasificación de reveladores

H2SO4

I2

Lámpara ultravioleta

No Destructivo

Destructivo

Técnica de bañadoAplicación

Técnica de pulverización

Revelado

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H2SO4

Lámpara ultravioleta

I2

Ftalato de anilina (azúcares)

Ninhidrina (Amino-ácidos) Resorcina (Cetosas)Difenilamina + U.V. 254 (Clorados)

Generales

Selectivo

Específico

Revelado

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Estimación del área de la mancha (por medida, pesada)

Determinación indirecta (raspado y valoración)

Determinación directa (Densitómetro)

Detector Fuente de luz

Placa cromatográfica

Cromatografía Cuantitativa

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Cromatografía en Columnas

Son de acero inoxidable o vidrio, tienen un diámetro de 0,5 a 6 cm y una longitud de cm a más de 1 m. Se rellenan con la fase estacionaria sólida o un soporte inerte recubierto con la fase estacionaria

Una columna más larga aumenta el grado de separación

Se usan con fines analíticos y preparativos

column.mov

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Elución: el soluto es lavado de la columna por agregado de solvente

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Volumen de retención V RVolumen de la fase móvil requerido para eluir el soluto de la columna

Tiempo de retención t RTiempo requerido para para eluir el soluto de la columna. t R es característico de una sustancia. Debe ser comparado con un standard.

V R = t R . V flujo

Tiempo de retención t m Es el tiempo que tarda un soluto que no es retenido en pasar por la columna.

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Cromatografía gaseosa

-Fue el primer método cromatográfico instrumental que se desarrolló comercialmente

-Sólo se necesita un cilindro de gas comprimido y un regulador de presión para mantener un fluído estable

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Cromatografía gaseosa

Compuestos orgánicos volátiles

Carrier: He, Ar, H2

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Gases Portadores

La elección de la fase móvil influye en el funcionamiento de la columna y el detector. Los gases más utilizados son: H2, He y N2. Los tres producen una A.E.P.T. = 0.3, pero con gastos distintos, mientras que el N2 10 cm/s, el H2 y el He pueden utilizarse a un gasto mayor.

Por lo tanto se debe mantener el el flujo del gas portador a una velocidad constante.

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Inyección de la muestra

La muestra se inyecta con un jeringa a través de un septo de goma y se vaporiza. Generalmente 0.1 a 10 L.Controlar la temperatura del horno de inyección.Para columnas tubulares se tienen que manejar con puertos de inyección más elaborados pues no pueden manejarse muestras tan grande.

La inyección dividida: Sólo el 0.1 a 10 % del volumen de 0.1 a 2 L de muestra inyectada llega a la columna; el resto se elimina.

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CROMATOGAFIA LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCE (H.P.L.C.)

Desgasificador

de solventes

Abastecimiento

de solvente

Filtro

Bomba

Válvula de seguridad y purga

Columna analítica

Espacio térmico

Lectura

Amplificador

Recoleccióno descarga

Descarga

Gases disueltos

Jeringa o válvula para la muestra

Introducción de la muestraPreco-

lumna

Medidor de presión

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Fase estacionaria

Todos los tipos de cromatografía pueden realizarse en el modo de alta resolución.

Un soporte común es el partículas microporosas de sílice con diámetro de 5 a 10 m.

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Solventes

Los solventes utilizados deben ser muy puros.

Se puede utilizar un solo solvente (elección isocrática).

Se puede cambiar un solo solvente por otro luego de un tiempo apropiado.

Se puede cambiar continuamente de composición del solvente (elección por gradiente).

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Extracción Pigmentos 20 g de hojas verdes (espinaca, acelga, etc.) se cortan en finos trozos con tijera yse colocan en el mortero.

Se agregan 20 mL de acetato de etilo y se maceran por 5 minutos realizando un movimiento giratorio con el pilón. La solución debe quedar de color verde intenso.

Una vez pasado los 5 minutos se exprime el sólido (utilizar guantes) para extraer la mayor

cantidad de pigmentos posibles.

La solución obtenida se filtra por gravedad (utilizando un embudo con papel de filtro o algodón), recogiéndose en una ampolla de decantación.

A la ampolla se le adicionan 10 mL de solución de cloruro de sodio al 0,1%, se extrae, seseparan las fases y se reserva la fase orgánica.

El extracto de color verde intenso se seca con una punta de espátula de sulfato de sodioanhidro.

Finalmente se comprueba la cantidad de componentes por CCD.

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Parte experimental

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Parte experimental

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Parte experimental