게놈 편집이 펼치는 과학 원더 랜드

만화로 만나는 게놈 편집의 원리

Cover title Subhead

GeneArt® CRISPR

GeneArt® Precision TALENs

2 Life Technologies | Gene Editing

siRNA 실험은 잘됐는데... 그러면 이제 유전자의 기능을 완전히 억제하고 싶은데....

CRISPR에게 맡겨봐!내게 염기서열만 알려주면 knock out을 시켜버릴게!

Gene editing(게놈 편집)을 이용하면 특정 유전자의 기능을 완전히 knock-out이 가능합

니다. 이 방법은 세포나 동물 등에 모두 손쉽

게 사용할 수 있습니다.

1화 : CRISPR은 손쉽다

3Life Technologies | Gene Editing

CRISPR이란?정식 명칭은 CRISPR/CAS9 시스템으로 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 RNA(gRNA)와 특정한 염기서열을 자르는 가위 역할인 Cas9 nuclease로 구성되어 있다(그림 1). 세포나 동물에 plasmid DNA를 도입하여 특정 유전자의 기능을 완전히 억제할 수 있는 knock-out이 가능하다.CRISPR이란?Genomic DNA가 절단된 경우 세포내 에서는 이를 회복하기 위해 재조합 및 다양한 기작들이 발생하게 된다. 이때 한번 절단된 부위의 염기서열 중에서 몇몇 염기서열이 소실되는 현상이 발생하게 되며 이를 통해 돌연변이가 발생하게 된다. 그 결과로 DNA 코딩 부위의 프레임 변화(Frame Shift)가 발생하게 되고 발현되는 단백질의 아미노산 염기서열에 영향을 미치게된다. 이렇게 아미노산의 염기서열이 변하게 되면 단백질의 기능을 하지 못하고 이것을 Knock-out이라고 부른다(그림 2).만일 single-stranded DNA외 CRISPR plasmid vector를 함께 세포 내에 도입하게 되면 homologous recombination이 일어나게 되고 새로운 염기서열이 도입된다(그림 2).

손쉽게 CRISPR을 이용해 볼 수 있습니다.GeneArt® CRISPR Nuclease Vector Kit는 모든 것들이 하나에 들어 있는 시스템이다. 디자인한 gRNA를 목표로 하는 염기서열에 상보적이며 이를 세포 내에 도입만 하면 된다. Orange Fluorescent Protein(ORF) 혹은 CD4 유전자를 report gene으로 사용하고 있으며(그림 3) 이는 도입 효율을 확인하고 발현 여부를 확인하기 쉽게 되어 있다. CD4의 경우 magnetic anti-CD4 항체를 이용하여 손쉽게 분리해낼 수 있다. ORF를 발현하는 경우 FACs를 이용하여 발현되는 세포를 쉽게 분리해내어 원하는 clone을 얻는데 많은 도움을 줄 수 있다(그림 4).

lifetechnologies.com/crispr에서 확인해 보세요.

CRISPR

PAM

그림 1. CRIPR은 크게 2가지로 구성되어 있다. 염기서열을 인식하는 gRNA와 실제로 유전자를 절단하는 Cas9 Nuclease로 구성되어 있다.

그림 2. 절단된 염기서열은 크게 2가지 형태로 나타낼 수 있다. 잘린 염기서열

은 NHEJ(non-homologous end joining)을 통해 복구되는 과정에서 frame shift가 일어나 Knock-out이 가능하며 혹은 donor DNA를 함께 도입하여 homologous recombination을 이용하여 새로운 염기서열을 도입할 수 있다.

그림 3. GeneArt® CRISPR Nuclease Vector map. 잘린 염기서열은 NHEJ(non-homologous end joining)을 통해 복구되는 과정에서 frame shift가 일어나 Knock-out이 가능하며 혹은 donor DNA를 함께 도입하여 homologous recombination을 이용하여 새로운 염기서열을 도입할 수 있다

그림 4. GeneArt® CRISPR Nuclease Vector map. GeneArt ® CRISPR / Cas9 플라스미드를 도입하게 되면 세포는 gene editing이 일어나게 되며 이러

한 세포들은 OFP 혹은 CD4를 발현하게 된다. 이를 Enrichment하여 세포의 선별이 더욱 쉽게 할 수 있다.

CRISPR은 염기서열을 인식하는 gDNA와 실제 절단을 수행하는

Cas9으로 이루어져 있어요.

혹은

PAMTarget sequence

gRNA

Genomic DNA

Cas9

절단

NHEJ (non-homologous end joining)

GeneArt® CRISPR / Cas9 플라

스미드가 도입된 세포

CD4 혹은 OFP를 발현한다

CD4 혹은 OFP enrichment

HT(Homologous recombination)

Donor DNA

4 Life Technologies | Gene Editing

Genome editing이 재미 있는 거구나. 근데 CRISPR과 TALENs는 뭐가 다른 거야?

TAL의 단백질은 가이드 역할만 하죠. 만일 TAL effector를 이용하며 다른 기능을 가진 단백질을 융합시켜 다양한 기능을 구현할 수 있답니다.

TALENs 등장!CRISPR과는 다르게 단백질이 특정 염기서열

을 인지하죠! Knock-out 할 때에 TALENs는 두 개의 단백질이 필요하답니다!

2화 : TALENs는 정확하다

5Life Technologies | Gene Editing

TALEN란?정식 명칭은 TAL effector nuclease라고 하며 FokI이라는 절단을 유도하는 nuclease와 그리고 특정 염기서열을 인지하는 단백질로 이루어진다. CRISPR과는 다르게 Reverse와 Foward, 2 개가 쌍으로 있어야지만 작동이 가능하다. TALENs는 DNA 절단 시 더 높은 특이성을 보여준다. 라이프 테크놀로지스에서는 entry vector 형태로 제공이 되며 이를 gateway cloning 시스템을 이용하여 손쉽게 클로닝이 가능하다.

손쉽게 TALENs를 디자인해 볼 수 있습니다

지금 lifetechnologies.com/geneart에 접속하시면 손쉽게 TALENs 디자인 하고 주문하실 수 있다.

다양한 기능들을 추가하여 사용할 수 있습니다

TAL effector nuclease와 같이FokI을 이용한 knock-out 뿐만 아니라 다양한 작용기를 융합시켜 다양한 기능을 구현할 수 있다.

lifetechnologies.com/tal에서 확인해 보세요.

TALENs TALENs는 특정 염기서열

을 인지하는 단백질에 절단을 수행하는 FokI과 결합한 단백질입

니다.

TALENs을 이용 시에는

2개 쌍의 염기서열을 인식하는 유전자가 필

요합니다.

그림 5. TALENs의 작용. TALENs는 유전체의 염기서열을 인식하는 도메인과 FokI이 쌍을 이루어 작동하게 된다.

그림 6. TALENs의 작용. TAL effoector는 다양한 기능을 부여하여 다양한 작용을 유도할 수 있다.

DNA binding domainFunctionaldomain

Fok1

Fok1

Genetic editing 관련 제품 및 서비스 소개

Product Cat. No.

GeneArt® CRISPR Nuclease Vector with CD4 Enrichment Kit (with competent cells) A21177

GeneArt® CRISPR Nuclease Vector with CD4 Enrichment Kit A21175

GeneArt® CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit A21174

GeneArt® CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit (with competent cells) A21178

Native TAL Fok1 서비스 문의

Truncated TAL Fok1 서비스 문의

Native TAL VP16 activator 서비스 문의

Native TAL VP64 activator 서비스 문의

TAL repressor 서비스 문의

Native TAL MCS 서비스 문의

Truncated TAL MCS 서비스 문의

(A) TALENs, FokI을 이용하여 특정 유전체 염기서열을 잘라내어 knock-out을 유도한다.

(B) TAL effector에는 VP64, VP16을 추가하여 유전자를 활성 시키거나 KRAB를 선택하여 유전자의 활성을 억제할 수 있다.

(C) TAL effector에 MCS(Multi cloning site)를 넣어 내가 원하는 유전자를 넣어 그 기능을 연구할 수 있다.

6 Life Technologies | Gene Editing

TALENs와 CRISPR은 어떻게 사용해야 할까요?TALENs의 경우 CRISPR보다는 off-target effcet가 낮으므로 특이적인 반응을 원하고자 하실 때 사용하는 게 좋습니다. 또한, TAL의 경우 융합 단백질의 기능에 따라 다양한 기능을 시도해 볼 수 있습니다. 하지만 하나가 아닌 다양한 유전자에 gene editing을 하거나 아니면 손쉬운 gene editing을 원하시고자 하면 간편하고 사용하기 쉬운 CRISPR을 이용하는 것이 좋습니다.

CIRSPR은 20bo의 RNA로 이루어졌으며 3' 말단의 NGG - "PAM site"를 가지고 있습니다. 이러한 RNA가 특정 염기서열을 인식하고 CRISPR의 기능을 유도하게 할 수 있습니다. 또한 CRISPR은 클로닝하기 쉽고 사용하기 쉬우면 다양한 실험에 적용할 수 있습니다. 그러나 TALENs보다 off-target effct라 불리는 비특이적 반응을 일으킬 위험이 높습니다. TALENs는 CRISPR보다는 좀 더 특이적 반응을 하는 것으로 알려져 있습니다. 그 이유는 TALENs가 작동하기 위해서는 쌍으로 작동하기 때문입니다. 또한 genome editing 이후에 다양한 기능을 가진 도메인을 이용하여 다양한 실험도 가능합니다. 여러분들은 GeneArt® Precision TALs의 무료 디자인 도구를 이용하여 이를 쉽게 디자인할 수 있습니다. 나머진 클로닝등의 일은 라이프 테크놀로지스가 해결해 드립니다.

Mutation이 되었다면 그걸 어떻게 확인할 수 있나요?돌연변이 효율을 확인하기 위해서는 double strand DNA mismatch를 확인하게 됩니다. 이 경우 mismatch된 DNA를 인직하여 제한하는 효소를 사용합니다.

이러한 방법은 대상 DNA 부의의 genome에 대한 PCR을 수행하게 됩니다. 만일 유전자의 염기서열이 추가되거나 혹은 제거 되었다면 annealing 과정에서 mismatched double-stranded heteroduplex가 형성됩니다. 이러한 mismatch가 얼마나 이루어 졌는가는 이러한 mismatch를 특이적으로 인지하여 제한하는 효소를 처리하여 이를 전기영동하여 확인해 볼 수 있습니다.여러분들은 GeneArt® Genomic Cleavage Detection kit를 이용하면 PCR 이후의 정제 과정을 줄이고 더 욱 쉽게 mutation 된 clone이나 혹은 효율을 확인해 보실 수 있습니다. 자세한 내용은 옆에서 박사님이 설명해 줄 거에요!

성공적인 Knock-out 혹은 Knock-in은 어떻게 확인할 수 있나요? 직접 모든 염기서열을 확인해 볼 수 있습니다.

다양한 돌연변이 형태나 염기서열 형태가 나타날 수 있습니다. 대상 genome 부위를 PCR을 이용하여 증폭하여 이를 cloning하여 직접 염기서열이 어떻게 바뀌었는지를 확인해 볼 수 있습니다. 또한 발현 패턴을 분석해 볼 수 도 있으며 최신 기술을 이용한다면 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)를 이용해볼 수도 있답니다. 라이프 테크놀로지스에서는 이러한 실험에 IonTorrent™ PGM™을 추천합니다.

Knock은 어떻게 할까요?유전자합성 서비스를 이용하면 donor DNA Plasmid를 만드는 건 어려운 일도 아니랍니다.일반적으로 Knock을 위해서는 500-600bp 정도의 상보적인 염기서열(arm)을 가진 donor plasmid DNA가 필요합니다. 이러한 double stranded DNA 절편은 GeneArt®의 유전자 합성 서비스를 이용할 수 있습니다. GeneArt® Strings DNA Fragment는 단순히 염기서열 정보만 알고 있으며 이를 합성하여 간편하게 이용할 수 있답니다.

연구자(직업 : 연구원, 27세?)Genetic editing이 제일 쉬웠어요~~

7Life Technologies | Gene Editing

Indel in genomic DNA

Transfected cells with GeneArt® Precision TAL or GeneArt® CRISPR nuclease vector

Indel

Mismatch

+ - + - + - + -

10.8 21.1 38.9

Target 1 Target 2Negativecontrol

Positivecontrol

Enzyme:

Genemodification (%)

+ - + - + - + -

10.8 21.1 38.9

Target 1 Target 2Negativecontrol

Positivecontrol

Enzyme:

Genemodification (%)

Cell lysis (no purification needed)

PCR amplification (no purification)

Denaturation and reannealing

Mismatch detection and cleavage

Agarose gel electrophoresis

그림 6.Mismatch를 이용한 mutation 탐색. GeneArt® Genomic Cleavage Detection Kit 워크플로우

주문 정보

Product Cat. No.

GeneArt® Genomic Cleavage Detection Kit A24372

Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent L3000015

Lipofectamine® 3000으로 향상된 결과를 만나보세요

Lipofectamine® 3000은 최근에 출시된 양이온 지질의 기반의 유전자 전달 방식

입니다. 기존 제품보다 더 높은 유전자 도입 효율을 보여 주며 유전자 도입이 어려운 세포에서도 높은 효율을 보여줍니다. CRISPR과 TALENs를 사용할 때에도 Lipofectamine® 3000을 이용하면 더 높은 knock-out 효율 및 gene editing 효과

를 얻을 수 있습니다.

1 세포 용해( 정제 과정이 필요 없다)

2 PCR 증폭(PCR 산물의 정제 불필요)

3 Denature 이후 reannealing

4 Mismatch 확인과 절단

5 아가로즈 전기영동으로 밴드 확인

세상 참 좋아졌어~

Genetic editing에서 일반적으로 transfection

과 clone 선별이 중요한데 mismatch PCR 방식은 아주 간단하

지. 옆에만 봐도 쉬워 보이잖아Transfection은 Lipofectamione™ 3000을 이용하면 높은 효율을 보여줄 수 있어.또한 모든 서비스는 맞춤형으로 디자인부터 transfection이 가능한 플라스미드 형태로도 구매도 가능해. CRISPR과 TALENs 모두 원하는 대로 제작도 가능하지.지금 한번 시작해 봐. 어렵지 않아!

lifetechnologies.com/geneeditingcomics 에서 확인해 보세요.

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Genome editing을 지금 시작해 보세요