IDENTIFICACION DE FACTORES DE VIRULENCIA :

MEDICIÓN DE LA INEFECTIVIDAD Y LA VIRULENCIA

módulo de prevención y control de la propagación microbiana

equipo 1

IDENTIFICACIÓN DEFACTORES DE VIRULENCIA:

MEDICIÓN DE INFECTIVIDADY VIRULENCIA

MODELOS ANIMALES DE INFECCIÓN: HUMANOS VOLUNTARIOS

Utilizadas en muchas enfermedades infecciosas.

Consideraciones éticas (fácilmente tratables o vacunas).

Transmisión del VIH madre-hijo (AZT). Estudios de ética.

MODELOS ANIMALES NO HUMANOS

Para la mayor parte de estudios de enfermedades infecciosas, los animales son los modelos de opción. Desde el tiempo de Koch y Pasteur, roedores de laboratorio han sido los modelos el más extensamente usados para la investigación de enfermedad infección porque ellos son pequeños y así más fácilmente son almacenados.

Por ejemplo, la Salmonella entérica serovar Typhimurium causa diarrea en humanos, causa enfermedades sistémicas en el ratón causada por S.enterica serovar Thyphi.

Los ejemplos son hurones como un modelo para úlceras gástricas causadas por Helicobacter, conejillos de Indias como modelos para la tuberculosis, armadillos para la lepra, chichillas la otitis .

Los ratones son genéticamente defectuosos en la habolidad para producir células B. Y las células T, por lo que los ratones son más susceptibles un infección.

Otros modelos útiles de animal tienen recientemente importancia para estudiar procesos de infección y respuesta inmune.

Animales Gnotobioticos son criados en entornos estériles y no tienen bacterias. Por consiguiente, ellos tienen el tejido mucoso subdesarrollado y ninguna inmunidad parcial debido a la exposición previa. Desafortunadamente, ellos son muy caros de comprar y mantener. Los animales "patógeno libre” son los animales que son criados en un entorno sin un patógeno particular, pero de otra manera son expuestos a otros microbios.

Consideraciones Éticas

Los experimentos que implican animales también implican numerosas publicaciones éticas. Deben haber motivos realmente convincentes para realizar estos experimentos. Los animales de experimentacion deben ser diseñados para probar las hipótesis críticas que pueden proporcionar la información útil de una enfermedad bacteriana estudiada, incluso si resultados obtenidos son negativos.

PROTOCOLO

El protocolo debe contener la información extensa sobre la opción del modelo de animal para ser usado,el numero de animales que se requirieron y los resultados estadísticamente significativos. Finalmente, estos protocolos deben ser repasados y renovados cada año.

VALORES DE LD50 E ID50

LD50 es una medida mas haya de la infección que conducirá a la muerte del hospedero (dosis letal) al 50%

ID50 valor de dosis infecciosa , # de bacterias necesarias para infectar el 50% de los animales expuestos.

Número de animales infectados (o que se convierten en moribundos) en comparación con el número de bacterias en el inóculo (dosis) se sigmoidal, no lineal

Los valores de DL50 y DI50 han probado ser medidas útiles de letalidad y inefectividad, pero tienen algunas limitaciones importantes. Estos parámetros reflejan el efecto acumulativo de los muchos pasos implicados en la colonización y en la producción de los síntomas. por lo tanto, carecen de un cierto nivel de sensibilidad, y el fracaso de una mutación en un gen bacteriano para aumentar el valor de DL50 o ID50 no siempre significara que esta no afecte a algunos determinantes de la virulencia

Limitaciones

Se usa un gran numero de animales Cuando se quiere determinar un factor de

virulencia en particular es necesario eliminar los otros

Se inyecta gran cant. de bacterias 109 para el estudio de patógenos atenuados (dificil ver la virulencia)

Medidas que serán determinadas en un estudio

Numero de días Modelo animal Dosis administrada Animales utilizados Animales moribundos transcurridos los días Si ocurre o no la infección Establecer medidas en relación a la virulencia

MODELOS DE CULTIVOSon estándar de la

búsqueda de la virulencia bacteriana pero forman un sistema complejo difícil de

controlar

El cultivo de células se utilizan para controlar la interacción huésped –bacteriana.

Se observan medio definidos, condiciones reproducibles, No. Limitado de células

Por lo tanto s mas fácil y más reproducible

Se observan por microscopia o fluorescencia

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

+ Los cultivos 1° son de células que no son derivados de tumores y se pueden obtener de tejidos de animales ejemplo: macrófagos.

+ Las células inmovilizadas proviene de tumores mediante fusión de células primarias con una célula tumoral.

+ Aquellas células que no están reguladas para el crecimiento en cultivo conduce a la acumulación de mutaciones, reordenamientos del gen, duplicaciones de genes.

Para llevar a cabo la transición de células diferenciadas no se dividen a una celda n la cual se dividirán rápidamente entonces las células del cultivo deben de ser despojados de muchas de sus propiedades que les hizo estar en el tipo de células 1°.

CONSECUENCIA

Bacterias y patógenos virales que son altamente específicos para un determinado factor que causa una infección en un animal intacto son con frecuencia capaces de invadir las células en cultivo derivadas a partir de tejido que normalmente no infectan.

Estas diferencias en la expresión génica puede sercorregido: 1.- medida por la adición de crecimiento, estimulantes u hormonas para el medio de cultivo.2.- Proporcionando una matriz artificial (también denominada sustrato) para que las células crezcan.

PROBLEMAS•Es que la mayoría de las células cultivadas pierden su forma normal y la distribución de la superficie antígenos.

• Las células de un animal intacto suelen ser polarizado, es decir las diferentes regiones de la membrana de la superficie celular están expuestos a diferentes ambientes.

• Las células de cultivo de tejidos que se cultivan como monocapas nonconfluent generalmente es necesario para proporcionar una sustituto de la matriz extracelular y proporcionar hormonas para obtener una monocapa polarizada en la cultura.

•Las superficies reales mucosa están cubiertas de moco y bañados en soluciones que son difíciles de imitar en un sistema in vitro.

GENTAMICINA Se utiliza con frecuencia para distinguir entre los mutantes que son defectuosas en el adjunto-desarrollo y son los que son defectuosos en la invasión de la gentamicina se realiza un ensayo de protección. 1.-Una monocapa de células de mamíferos, se incuban las células bacterianas a una multiplicidad de ciertas infecciones (MOI), que se define como el número de entradabacterias por células de mamíferos, en el pozo de una cultura placa. 2.-Después de la incubación por un período de tiempo para permiten la invasión vinculante y que se produzca.

Set

PRIMER SET.- proporciona el número total de bacterias (UFC) que unía a las células.

SEGUNDO SET.- se proporciona el número de bacterias adheridas (UFC), las células infectadas de mamíferos se lavan varias veces con solución tampón para eliminar cualquier microorganismo. La proporción de células UFC asociadas al total de UFC al final de laexperimento se define como la frecuencia de adherencia.

TERCER SET.- conjunto de pozos se lava como describio anteriormente para eliminar las bacterias no adherentes, ymedio de cultivo fresco que contiene el antibiótico gen-gentamicina se añade a cada pocillo.

USO

Ensayo de gentamicina ha demostrado que la invasión varía considerablemente dependiendo de la cepa de C. jejuni, así como las líneas celulares humanas, que se utiliza, el número de bacterias en el inóculo (MOI), y otras condiciones de ensayo.

Microscopia de fluorescencia Se utiliza para detectar proteínas u otras

moléculas específicas en una célula. Para lograrlo se puede acoplar la molécula fluorescente a otra molécula capaz de reconocer al componente que interesa visualizar, o emplear moléculas fluorescentes que directamente tengan afinidad con determinados componentes celulares. Se pueden combinar distintos compuestos fluorescentes para detectar distintas moléculas en la misma muestra. 

Microscopia de fluorescencia

Modelos de cultivos de órganos

Modelos de cultivos de órganos

• Preservar y mantener sus propiedades fisiológicas, metabólicas y genéticas.

• Aprovechar la maquinaria celular para estudios sobre metabolismo, regulación génica y fisiología.

Varios tipos de células presentes, incluyendo algunas del sistema inmune.

Desventajas del medio de cultivo de órganos: El cultivo de órganos puede empezar a

deteriorarse en cuestión de horas o días, por lo que es difícil hacer experimentos a largo plazo.

La oferta limitada de cultivos de órganos de donantes.