conteo de celulas de purkinje

VISUALIZACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ESPINAS DENDRÍTICAS EN IMÁGENES POR MICROSCOPÍA DE LUZ

UNIVERSIDAD DE LOS ANDESFACULTAD DE INGENIERÍA

DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADOMAESTRÍA EN INGENIERÍA BIOMÉDICA

VISUALIZACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ESPINAS DENDRÍTICAS DE

CÉLULAS DE PURKINJE EN IMÁGENES POR MICROSCOPÍA DE LUZ

Tesis de Maestría

presentada ante la Universidad de Los Andes

por

Francisco Javier Durán Montilla

como requisito parcial para optar al Grado de

Magister Scientiae en Ingeniería Biomédica

Realizada bajo la Tutoría del Profesor

Dr. Rubén de Jesús Medina

1


AGRADECIMIENTOS

Agradezco ante todo a Dios por permitirnos plantear y lograr los objetivos, a mis Padres

María Faustina Montilla† y Benito Ramón Durán por esmerarse en mis inicios y logro de mi

formación profesional.

A mis hijas María José Durán, María Fernanda Durán y a mi esposa Yane Margarita Durán,

por apoyarme en la obtención del objetivo planteado en esta nueva etapa de mi formación.

Al Dr. Ernesto Palacios Prü†, por su dedicación a la formación de personal en el área de

investigación, como textualmente lo decía “Las instituciones nunca mejoran ni son más

productivas, sino mejoran y aumentan la producción de todos y cada uno de los individuos

que las integran”

Al Personal del Centro de Microscopía Electrónica “Dr. Ernesto Palacios Prü” por la

colaboración en el desarrollo de los experimentos para adquirir las imágenes, en especial a la

Dra. Rosa Virginia Mendoza Briceño, por la asesoría brindada y permitir desarrollar en mi

ambiente de trabajo actividades para el mejoramiento de mi nivel académico.

También agradezco a la Planta Profesoral del Grupo de Ingeniería Biomédica en especial al

Profesor Rubén de Jesús Medina, quien me permitió adquirir herramientas esenciales para el

procesamiento de imágenes.

A los compañeros de estudio, por el apoyo incondicional en las horas nocturnas dedicadas a la

búsqueda del entendimiento del conocimiento y su aplicación.

...de que el tiempo pase y no hagamos nada es mejor que pase haciendo algo….

...y a Dios por permitir hacer.

2


Introducción XI

1. CAPÍTULO I 17

1. HERRAMIENTAS PARA EL PROCESAMIENTO DE LAS CP 17

1.1. Introducción. 17

1.2. Motivación y Planteamiento del Problema 19

1.3. Bases Teóricas 22

1.3.1. El Microscopio de luz 22

1.3.2. Microscopía digital de alta resolución basada en luz 23

1.3.3. Aberraciones ópticas en MLARD 28

1.3.4. Ruido aleatorio en las imágenes MLARD 29

1.3.5. Función de distorsión puntual 30

1.4. Imágenes Digitales 31

1.4.1. Técnicas básicas de procesamiento 33

2. CAPÍTULO II 40

2. UTILIZACIÓN DE FILTROS DE MEDIANA Y TRANSFORMADA WAVELET EN EL ANÁLISIS DIGITAL DE IMÁGENES

NEURALES 40

2.1. Introducción 40

2.2. Materiales y Métodos 42

2.2.1. Filtro de mediana 42

2.2.2. Filtro de mediana ponderado 43

2.2.3. Filtro de mediana ponderado óptimo 44

2.2.4. Transformada Wavelet 45

2.3. Resultado 45

2.3.1 Filtro de mediana 46

2.3.2 Filtro de mediana ponderado 46

2.3.3 Filtro de mediana ponderado óptimo 47

2.3.4 Transformada Wavelet 49

2.4. Conclusiones 52

3


3. CAPÍTULO III 53

3. PREPROCESAMIENTO DE IMÁGENES DE CÉLULAS DE PURKINJE UTILIZANDO DECONVOLUCIÓN 53



3.2.1 Convolución 55

3.2.2 Deconvolución 57

3.2.3 Relación Señal a Ruido de Pico 63

3.3. Resultados 64

3.3.1 Validación de los algoritmos de restauración 64

3.3.2 Restauración de Imágenes de Células de Purkinje 68

3.4. Conclusiones 72

4. CAPÍTULO IV 74

4. HERRAMIENTA DE CLASIFICACIÓN APLICADA A IMÁGENES DE CÉLULAS DE PURKINJE 74



4.2.1 Máquina de soporte vectorial (SVM) 77

4.2.2 Máquina de soporte vectorial de mínimos cuadrados (LSSVM) aplicados a imágenes de CP 80

4.2.2.1 Selección de Marcadores 81

4.2.2.2 Selección de No Marcadores 82

4.2.2.3 Entrenamiento de la LSSVM 83

4.2.2.4 Validación de la LSSVM 86

4.2.2.5 Prueba de desempeño de la LSSVM en imágenes de CP 87

.4.2.3 Resultados 88

.4.2.3.1. Máquina de soporte vectorial de mínimos cuadrados aplicados a imágenes sintéticas 89

4.2.3.1.1 Primer Ensayo 91

4.2.3.1.2 Segundo Ensayo 93

4.2.3.1.3 Tercer Ensayo 95

4.2.3.1.3.1 Resultado de la prueba de desempeño 100

Máquina de soporte vectorial de mínimos cuadrados aplicados a imágenes de CP 103

4.2.3.2.1 Análisis de resultados de la LSSVM aplicados a imágenes de CP 109

4.2.3.2.2 Discusión acerca de los resultados de la LSSVM aplicados a imágenes de CP 114

4


5. CONCLUSIONES GENERALES 118

6. REFERENCIAS 121

5


Índice de Figuras

FIGURA 1-1. ORGANIZACIÓN CELULAR DE LA CORTEZA CEREBELOSA

(TOMADA DE [6]) 18

FIGURA 1-2. MODELO DETALLADO DE CP, DONDE SE RESALTAN LAS ESPINAS

DENDRITICAS. (FUENTE: CENTRO DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA “DR.

ERNESTO PALACIOS PRÜ”) 21

FIGURA 1-3. IMAGEN DE UN SEGMENTO DEL ÁRBOL DENDRÍTICO DE CP

OBTENIDA CON MLARD, SIN SER SOMETIDA A PREPROCESAMIENTO. 22

FIGURA 1-4. MICROSCOPIO DE LUZ CONVENCIONAL (TOMADO DE [11]) 23

FIGURA 1-5. SISTEMA ÓPTICO DEL POLYVAR REICHERT-JUNG (OJO: MANUAL

REFERENCIARLO) 24

FIGURA 1-6. ADQUISICIÓN DE IMÁGENES DE CP CON MLARD (FUENTE: EL

AUTOR). 25

FIGURA 1-7. MICRÓTOMO. (FUENTE: CENTRO DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

“DR. ERNESTO PALACIOS PRÜ”) 26

FIGURA 1-8. ESQUEMA QUE ILUSTRA EL PROCESO DE TRANSILUMINACIÓN.

LA FLECHA AMARILLA REPRESENTA EL HAZ DE LUZ INCIDENTE SOBRE LA

MUESTRA, QUE ATRAVIESA LA MISMA. (TOMADO DE [12]) 26

FIGURA 1-9. ESQUEMA DE LA POSICIÓN DE LOS LENTES OBJETIVO Y OCULAR,

EN RELACIÓN CON EL ESPÉCIMEN Y EL OBSERVADOR. (TOMADO DE [12]) 27

6


FIGURA 1-10. DIFRACCIÓN DE UN HAZ DE LUZ AL PASAR A TRAVÉS DE UN

ORIFICIO. (TOMADO DE [11]) 28

FIGURA 1-11. DISCOS DE AIRY. (TOMADO DE [11]) 29

FIGURA 1-12. ABERRACIÓN ESFÉRICA. LOS RAYOS QUE INCIDEN

PARALELAMENTE AL EJE PRINCIPAL NO CONVERGEN TODOS EN UN MISMO

PUNTO. (TOMADO DE [11]) 29

FIGURA 1-13. MICROSCOPIO POLYVAR REICHERT-JUNG. (FUENTE: CENTRO DE

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA “DR. ERNESTO PALACIOS PRÜ”) 32

FIGURA 1-14. IMAGEN DE LA ARBORIZACIÓN DENDRÍTICA DE UNA CP, A UNA

RESOLUCIÓN DE 4096X5120X3 Y 8 BITS DE PROFUNDIDAD 32

FIGURA 1-15. SEGMENTO DEL ÁRBOL DENDRÍTICO DE UNA CP, IMPREGNADA

CON EL MÉTODO DE GOLGI Y SIN NINGÚN PREPROCESAMIENTO. 33

FIGURA 1-16. (A) IMAGEN DE CP, SIN PROCESAR (B) IMAGEN DE CP,

PREPROCESADA UTILIZANDO TRANSFORMACION PUNTUAL 35

FIGURA 1-17. (A) IMAGEN DE CP, SIN PROCESAR (B) IMAGEN DE CP,

PROCESADA CON UN FILTRO DE MEDIANA 36

FIGURA 1-18. (A) IMAGEN SIN PROCESAR DE CP. (B) IMAGEN DE CP

PROCESADA CON UN FILTRO DE MEDIA 37

FIGURA 1-19. (A) IMAGEN DE CP, SIN PROCESAR. (B) IMAGEN DE CP

PROCESADA CON UN FILTRO GAUSSIANO 38

7


FIGURA 1-20. (A) IMAGEN DE CP, SIN PROCESAR. (B) IMAGEN DE CP

PROCESADA CON UN REALCE LOGARÍTMICO 39

FIGURA 2-21. (A) DENDRITAS DE CP, SIN NINGÚN PREPROCESAMIENTO. (B)

DENDRITAS DE CP DESPUÉS DE UTILIZAR FILTRO DE MEDIANA, CON UNA

VECINDAD 5X 5. 46


DENDRITAS DE CP DESPUÉS DE UTILIZAR EL FILTRO DE MEDIANA

PONDERADO, CON UNA VECINDAD 5X5 47


DENDRITAS DE CP DESPUÉS DE UTILIZAR FILTRO DE MEDIANA PONDERADO

ÓPTIMO, CON UNA VECINDAD 5X5. 48


DENDRITAS DE CP DESEADA 49

FIGURA 2-25. CURVA DE ERROR 49

FIGURA 2-26. DESCOMPOSICIÓN DE LA TW DE CP, CON LA WAVELET DB1 50

FIGURA 2-27. (A) IMAGEN AUMENTADA DE LAS DENDRITAS DE CP,

CORRESPONDIENTE A UNA SECCIÓN DE LA IMAGEN. (B) APLICACIÓN DE LA

TWI 51

FIGURA 3-28. EJEMPLO DE LA OPERACIÓN DE CONVOLUCIÓN 56

FIGURA 3-29. FUNCIÓN DE PROPAGACIÓN DE PUNTOS () 57

FIGURA 3-30. EJEMPLO DE LA OPERACIÓN DE DECONVOLUCIÓN 58

8


FIGURA 3-31. MODELO DE RESTAURACIÓN 60

FIGURA 3-32. DEGRADACIÓN ESPACIAL DE UNA IMAGEN 62

FIGURA 3-33. DIAGRAMA DEL TEST DE DECONVOLUCIÓN 65

FIGURA 3-34. (A) IMAGEN DE LENA (B) IMAGEN CONVOLUCIONADA CON

UNA GAUSSIANA (C) CÁLCULO DEL PSNR ÓPTIMO APLICANDO EL FILTRO DE

REGULARIZACIÓN (D) IMAGEN RESTAURADA CON EL FILTRO DE

REGULARIZACIÓN 66

FIGURA 3-35. (A) IMAGEN DE LENA. (B) IMAGEN CONVOLUCIONADA CON


WIENER (D) IMAGEN RESTAURADA CON EL FILTRO DE WIENER 67

FIGURA 3-36. (A) IMAGEN DE LENA. (B) IMAGEN CONVOLUCIONADA CON


LUCY-RICHARDSON (D) IMAGEN RESTAURADA CON EL FILTRO DE LUCY-

RICHARDSON. 68

FIGURA 3-37. (A) IMAGEN CP SIN PREPROCESAMIENTO (B) IMAGEN CP

APLICANDO EL ALGORITMO DE REGULACIÓN CON UNA VENTANA DE 15X15 Y

VARIANZA 2,5 (C) IMAGEN ORIGINAL APLICANDO REALCE LOGARÍTMICO (D)

IMAGEN DE CP OBTENIDA POR REGULACIÓN E INMEDIATAMENTE SE LE

APLICA UN REALCE LOGARÍTMICO 70

FIGURA 3-38. (A) IMAGEN CP SIN PREPROCESAMIENTO. (B) IMAGEN CP

APLICANDO EL ALGORITMO DE WIENER CON UNA VENTANA DE 17X17 Y

VARIANZA 0,5 (C) IMAGEN ORIGINAL DE CP APLICANDO REALCE

LOGARÍTMICO (D) IMAGEN DE CP OBTENIDA POR WIENER Y SE LE APLICA UN

REALCE LOGARÍTMICO 71

9


FIGURA 3-39. (A) IMAGEN CP SIN PREPROCESAMIENTO. (B) IMAGEN CP

APLICANDO EL ALGORITMO DE LUCY-RICHARDSON, CON UNA VENTANA DE

17X17 Y VARIANZA 5 (C) IMAGEN ORIGINAL DE CP APLICANDO REALCE

LOGARÍTMICO (D) IMAGEN DE CP OBTENIDA POR LUCY-RICHARDSON Y SE LE

APLICA UN REALCE LOGARÍTMICO 72

FIGURA 4-40. HIPERPLANO DE SEPARACIÓN OPTIMO W.X+B 78

FIGURA 4-41. LA IDEA DE LA SVM ES ESTABLECER UNA CORRESPONDENCIA

DE LOS DATOS DE ENTRENAMIENTO EN UN ESPACIO CARACTERÍSTICO DE

DIMENSIÓN SUPERIOR UTILIZANDO Y ASÍ, PODER CONSTRUIR UN

HIPERPLANO QUE SEPARE LAS CLASES CON UN MARGEN MÁXIMO 80

FIGURA 4-42. IMAGEN DE CP SELECCIÓN DE MARCADORES 82

FIGURA 4-43. IMAGEN DE CP UTILIZADA PARA LA SELECCIÓN DE NO

MARCADORES 82

FIGURA 4-44. MUESTRA LA ORGANIZACIÓN DE LOS PATRONES DE

ENTRENAMIENTO DE ENTRADA DE LA LSSVM DONDE X ES UNA MATRIZ DE

13200X317 E Y ES UNA MATRIZ DE TAMAÑO 13200X1 84

FIGURA 4-45. ESTIMACIÓN DE LOS VALORES ÓPTIMOS DE LOS

HIPERPARÁMETROS SIGMA Y GAMMA 85

FIGURA 4-46. UBICACIÓN DE LOS MARCADORES SOBRE LA IMAGEN 87

FIGURA 4-47. DIAGRAMA DEL ALGORITMO DE LAS LSSVM 90

10


FIGURA 4-48. IMAGEN SINTÉTICA DE ENTRENAMIENTO 256X256 PIXELES Y 8

BIT DE PROFUNDIDAD (A) IMAGEN CON LOS MARCADORES (B) SE

SELECCIONAN LOS MARCADORES 91

FIGURA 4-49. IMAGEN SINTÉTICA SIN MARCADORES UTILIZADA PARA

EXTRAER LOS NO MARCADORES 92

FIGURA 4-50. IMÁGENES SINTÉTICAS DE VALIDACIÓN DEL CLASIFICADOR

LSSVM, (A) SE ENCONTRARON 10 MARCADORES (B) SE ENCONTRARON 14

MARCADORES 93

FIGURA 4-51 (A) IMAGEN DE ENTRENAMIENTO ( B) IMAGEN DE VALIDACIÓN 94

FIGURA 4-52. REPRESENTACIÓN DEL NIVEL DE GRIS UTILIZADO EN LOS

MARCADORES, NO MARCADORES Y FONDO DE LA IMAGEN 95

FIGURA 4-53. (A) IMAGEN SINTÉTICA SIN RUIDO (B) UNA DE LAS IMÁGENES

SINTÉTICA CON RUIDO (SNR=37,63 DB), UTILIZADAS EN LA PRUEBA DE

DESEMPEÑO DE LA LSSVM 96

FIGURA 4-54. (A) IMAGEN SIN RUIDO, LA LSSVM SELECCIONÓ LOS

MARCADORES EN EL TEST DE ENTRENAMIENTO (B) IMAGEN CON RUIDO

DONDE LA LSSVM SELECCIONÓ LOS MARCADORES, TEST DE VALIDACIÓN

(IMAGEN1, SNR=49,76 DB) 97

FIGURA 4-55. (A) IMAGEN SIN RUIDO, LA LSSVM SELECCIONÓ LOS

MARCADORES EN EL TEST DE ENTRENAMIENTO (B) IMAGEN CON RUIDO

DONDE LA LSSVM SELECCIONÓ LOS MARCADORES, TEST DE VALIDACIÓN

(IMAGEN8, SNR=23,74 DB) 97

FIGURA 4-56 CURVA ROC 100

11


FIGURA 4-57. RELACIÓN SEÑAL RUIDO 101

FIGURA 4-58. GRÁFICA DE SENSIBILIDAD VS SNR (DB) 102

FIGURA 4-59. GRÁFICA DE ESPECIFICIDAD VS SNR (DB) 102

FIGURA 4-60. GRAFICA DE ROC, CON ÁREA BAJO LA CURVA DE 0,71 103

FIGURA 4-61. IMÁGENES DE CP DE ENTRENAMIENTO (A) CONTEO MANUAL (B)

CONTEO AUTOMÁTICO 106

FIGURA 4-62. IMÁGENES DE CP DE ENTRENAMIENTO (A) CONTEO MANUAL (B)


FIGURA 4-63. IMÁGENES DE CP DE VALIDACIÓN (A) CONTEO MANUAL (B)


FIGURA 4-64. IMÁGENES DE CP DE VALIDACIÓN (A) CONTEO MANUAL (B)


12


Índice de Tablas

TABLA 4-1. RESULTADOS APLICANDO LA LSSVM A LAS IMÁGENES DE

ENTRENAMIENTO 94

TABLA 4-2. RESULTADOS APLICANDO LA LSSVM A LAS IMÁGENES DE

VALIDACIÓN 94

TABLA 4-3. PRUEBA DE DESEMPEÑO 98

TABLA 4-4. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE DESEMPEÑO EN LAS IMÁGENES

SINTÉTICAS 101

TABLA 4-5. IMÁGENES DE CP, PARA EL ENTRENAMIENTO DE LA LSVM 110

TABLA 4-6. IMÁGENES DE CP, PARA LA VALIDACIÓN DE LA LSVM 112

TABLA 4-7. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE DIAGNÓSTICO EN LAS IMÁGENES

DE CP DEL GRUPO DE ENTRENAMIENTO 113

TABLA 4-8. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE DIAGNÓSTICO EN LAS IMÁGENES

DE CP DEL GRUPO DE VALIDACIÓN 114

13


Introducción

En el desarrollo de esta investigación se utilizaron diferentes herramientas para el

procesamiento de imágenes que contienen células de Purkinje (CP). En tal sentido, en cada

uno de los capítulos se desarrolló una breve exposición de las herramientas utilizadas,

presentando al final de cada capítulo la conclusión respectiva.

Las neuronas de los diferentes centros de integración del sistema nervioso central se

caracterizan por presentar una estructura morfológica determinada conocida como fenotipia, la

cual depende de la función que debe cumplir y que hace posible distinguir un tipo de neurona

de otra. El propósito de este trabajo es proponer un esquema de procesamiento de imágenes

neurales, que permita la cuantificación y el análisis preciso del contorno neural

correspondiente a las células de Purkinje de la corteza cerebelosa de ratón.

En el capítulo I, se presentan diversos aspectos de CP, tales como su ubicación anatómica,

sus características morfológicas definitivas y la importancia funcional dentro de todo el

contexto del sistema nervioso central. Además, se describen las características básicas del

sistema óptico, utilizado en microscopía de luz de alta resolución digitalizada (MLARD), para

la adquisición de las imágenes de CP.

El capítulo II, se refiere al procesamiento de imágenes de CP con Transformada Wavelet

(TW) y diversos Filtros de Mediana. Estas técnicas permiten obtener un mejor realce de las

espinas dendríticas, eliminando parte del ruido generado durante el proceso de adquisición de

la imagen, sin degradar las características más importantes de la imagen de CP.

En el capítulo III, para procesar imágenes de las CP adquiridas con MLARD, se propone

una técnica de restauración basada en el algoritmo iterativo de deconvolución de Lucy-

Richardson, utilizando la función de dispersión puntual (PSF: point spread function), que

representa las imperfecciones ópticas del sistema de adquisición de imágenes de CP. El

realce de las CP, utilizando deconvolución, es necesario debido a que es difícil la total

visualización de su estructura, ya que las imágenes se adquieren a diferentes planos focales,

dando como resultado imágenes con segmentos que presentan borrosidad. El algoritmo de

deconvolución de Lucy-Richarson corrige estas aberraciones y a la vez logra un realce

14


adecuado de las dendritas y espinas de CP. Este realce permitirá utilizar una técnica

automática para la cuantificación de las espinas dendríticas empleando reconocimiento de

patrones.

En el capítulo IV, se utilizan las máquinas de Soporte Vectorial (SVM) para identificar y

clasificar espinas dendríticas de CP, las cuales fueron previamente procesadas con técnicas de

deconvolución iterativas.

Este proyecto ha dado lugar a las siguientes publicaciones:

• Durán F, Medina R, Mendoza L, Mendoza R, Peña Z, Davila D. UTILIZACIÓN DE FILTROS DE MEDIANA Y TRANSFORMADA WAVELET EN EL ANÁLISIS DIGITAL DE IMÁGENES NEURONALES. Modelos Computacionales en Ingeniería Desarrollos Novedosos y Aplicaciones. CIMENICS 2010. p PS25-PS29. 2010.

• Duran F, Medina R, Vera M, Mendoza R, Peña Z, Dávila D, Balza J, Mora N. PREPROCESAMIENTO DE CÉLULAS DE PURKINJE UTILIZANDO EL ALGORITMO DE DECONVOLUCIÓN DE LUCY-RICHARSON. LX CONVENCIÓN ANUAL DE AsoVAC CIUDAD BOLÍVAR. 2010.

• Duran F, Medina R, Vera M, Mendoza R, Peña Z, Dávila D Vera.VISUALIZACION Y CUANTIFICACION DE ESPINAS DENDRITICAS DE CÉLULAS DE PURKINJE EN IMÁGENES OBTENIDAS POR MICROSCOPÍA DE LUZ VISIBLE. III Jornadas Científico Técnica del Postgrado Ingeniería Biomédica. Mérida-Venezuela. 2010.

• Durán F, Medina R, Mendoza R, Mendoza L, Peña Z, Balza J, García N, Dávila D, Labarca E, Colmenares M. TRANSFORMADA WAVELET APLICADA AL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMAGÉNES DE CELULAS DE PURKINJE. XIII Congreso Venezolano de Microscopía y Microanálisis Cumaná. p 66-69. 2008

• Durán F, Medina R, Mendoza L, Mendoza R, Peña Z, Davila D. PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMAGÉNES NEURONALES APLICANDO TRANSFORMADA WAVELET Y FILTROS NO LINEALES. I Jornadas de Ingeniería Biomédica. Pamplona-Colombia.2009.

• Castellanos R, Duran F, Mendoza L, Mendoza R, Peña Z, Davila D. OPTIMIZACION MEDIANTE SEGMENTACION Y BINARIZACION DE IMÁGENES POR MICROSCOPÍA DE LUZ DIGITAL DE CELULAS DE PURKINJE, UTILIZANDO FILTRO DE MEDIANA Y TRANSFORMADA WAVELET. Desarrollo y avances en

15


métodos numéricos para ingeniería y ciencias aplicadas. CIMENICS 2008. p OP2-OP6. 2008.

• Duran F, Medina R, Mendoza R, Peña Z. ANALISIS Y PROCESAMIENTO DE IMAGENAS DE LA CELULA DE PURKINJE. II Jornadas Científico Técnica del Postgrado Ingeniería Biomédica. Mérida-Venezuela.2007.

16


1. Capítulo I

1. HERRAMIENTAS PARA EL PROCESAMIENTO DE LAS

CP

1.1. Introducción.

Las CP son neuronas altamente diferenciadas, con una morfología muy específica, que se

encuentran ubicadas en la corteza cerebelosa de los vertebrados. Cuando se observan en

sección transversal de una laminilla cerebelosa, sus globosos cuerpos celulares tienen forma

piriforme y el árbol dendrítico se extiende semejando una palma; mientras que en secciones

longitudinales, el cuerpo se observa alargado y las ramificaciones dendríticas se visualizan

como una estrecha franja o lámina vertical. Las CP están dispuestas en un estrato o lámina

simple, localizada inmediatamente por debajo de la capa molecular o plexiforme y por encima

de la capa granulosa de la corteza del cerebelo (Figura 1-1). Las CP están separadas por

espacios de aproximadamente 50 µm en dirección trasversal y de 50 a 100 µm

longitudinalmente y tienen un diámetro transversal de 30 a 35 µm. Del cuerpo o soma neural

de cada CP, orientada hacia la periferia de la laminilla cerebelosa, emerge una dendrita

primaria que se ramifica casi inmediatamente, en dos grandes troncos lisos que se alejan el

uno del otro formando, en el plano trasversal de la laminilla, un ángulo cercano a los 45°,

desde esta ramificación surge una extraordinaria arborización de segundo, tercero y

subsiguientes órdenes de ramas, que se dirigen a la superficie pial de la corteza cerebelosa. La

dendrita primaria y las ramas de primer orden tienen superficies lisas, a pesar que se pueden

observar algunas espinas dendríticas aisladas; mientras que las ramas de segundo, tercer y

subsiguientes ordenes están cubiertas por múltiples espinas dendríticas, que establecen

contactos sinápticos con los axones de las células granulosas, denominados fibras

paralelas [6,6].

17


Las CP envían proyecciones inhibidoras hacia los núcleos cerebelosos, constituyendo la

única salida de toda la coordinación motriz de la corteza cerebelosa. El interés en este estudio

está enfocado hacia la identificación y cuantificación de las espinas dendríticas de CP,

utilizando técnicas de procesamiento digital de imágenes, que permitan obtener información

confiable, cercana a la realidad y con un mínimo de error.

Figura 1-1. Organización celular de la corteza cerebelosa (Tomada de [6])

Hasta ahora, en el mencionado Centro de Microscopía Electrónica, la cuantificación de

espinas dendríticas se realizaba de forma manual y subjetiva, a través de un simple análisis

visual de las imágenes obtenidas con MLARD, lo cual se traduce en una mayor probabilidad

de error.

Existen diferentes paquetes de programas comerciales tales como Neurolúcida, Imaris o

Methamorph [6], los cuales proporcionan interfaces que permiten, por ejemplo, reconstruir

secciones del árbol dendrítico de CP; sin embargo, estos tipos de programas presentan algunos

inconvenientes ya que son semiautomáticos y su adquisición es costosa.

Debido a estos inconvenientes se hace necesario el desarrollo de un algoritmo

computacional robusto, que utilice diferentes herramientas especializadas tanto para el

preprocesamiento de este tipo de imágenes como para la posterior detección y cuantificación

de las referidas espinas dendríticas de CP.

18


Las imágenes a procesar en este estudio han sido obtenidas en el Centro de Microscopía

Electrónica “Dr. Ernesto Palacios Prü” de la Universidad de Los Andes, Mérida-Venezuela.

Dichas imágenes se adquieren a diferentes planos focales y en ellas es común observar

segmentos borrosos o carentes de nitidez, originada por los diferentes planos de foco que

presenta la sección tisular a observar y por un proceso de degradación asociado al sistema

óptico del microscopio. Las imágenes obtenidas se utilizan, posteriormente, para aplicarles un

realce del árbol dendrítico y así determinar el número de espinas dendríticas presentes en las

dendritas de CP.

Se propone un conjunto de técnicas de realce para realizar el preprocesamiento, entre ellas

Filtro de Mediana, Filtro de Mediana Ponderado, Filtro de Mediana Ponderado Optimo,

Transformada Wavelet (TW), Transformación Logarítmica y Técnicas de Deconvolución

[6,6]. Algunas de estas técnicas permitirán realzar las características esenciales de CP, tales

como su árbol dendrítico y sus espinas, reduciendo el ruido y la borrosidad. Posteriormente,

se utilizarán técnicas de aprendizaje supervisado, como las Máquinas de Soporte Vectorial

(SVM) [6] que permitirán cuantificar, de forma automática, el número de espinas dendríticas

en las ramas de CP.

1.2. Motivación y Planteamiento del Problema

Mediante técnicas de microscopía de luz, como el método cromo-argéntico de Golgi [6], es

posible obtener imágenes que ofrecen importante información relativa a la morfología de las

células neurales las cuales, a diferencia de las células de otros tejidos animales, tienen

morfologías muy diferentes dependiendo de la región donde estén ubicadas y de las funciones

que deben cumplir. Así se tienen neuronas piramidales en la corteza cerebral, neuronas

mitrales en el bulbo olfatorio, neuronas de Purkinje en la corteza cerebelosa, motoneuronas en

la médula espinal, por citar algunas. Entre toda esta diversidad neural se escogió la célula de

Purkinje (CP) del cerebelo como modelo para realizar el análisis, por ser una neurona que

posee una arborización dendrítica muy compleja pero a la vez única y muy característica y

que ha sido motivo de estudio en nuestro laboratorio, desde el punto de vista histológico y

19


ultraestructural, tanto ontogénica como filogenéticamente, por lo cual su estudio reviste gran

importancia en el desarrollo de diversos proyectos de investigación [6,6,6].

Las CP, funcionalmente, intervienen de manera integrada en importantes actividades

corporales sincronizadas, como son la modulación del equilibrio y de la postura corporal;

además, participa en el control de la ejecución de movimientos, en la regulación del tono

muscular y en el procesamiento de información visual indispensable para la orientación

corporal en relación a la fuerza de gravedad [6,6].

Para poder ejecutar todas sus funciones, las células neurales necesitan recibir, procesar y

enviar información a otras neuronas y a otras células efectoras como las células musculares.

Esta actividad se denomina Sinapsis y se realiza a través de complejas estructuras anátomo-

funcionales. En las sinapsis intervienen dos elementos celulares: el componente pre-sináptico

que transmite la información, y el componente post-sináptico, que recibe la información.

En el caso de la corteza cerebelosa, le corresponde a las CP ser el receptor directo, a través

de las fibras trepadoras, e indirecto vía fibras musgo-célulo-granulosas cerebelosas. De toda

la información de entrada emerge, a través del axón de las CP, una única vía de salida de

información desde la corteza cerebelosa. Para que esta función se cumpla, las CP disponen del

citoplasma neural y de numerosas evaginaciones de la membrana, distribuidas

tridimensionalmente, en toda la extensión del árbol dendrítico y que reciben el nombre de

espinas dendríticas (Figura 1-2).

20


Figura 1-2. Modelo detallado de CP, donde se resaltan las espinas dendriticas. (Fuente: Centro de Microscopía Electrónica “Dr. Ernesto Palacios Prü”)

Las dendritas de cada una de las CP se extienden hacia la superficie de la laminilla

cerebelosa, atravesando toda la capa plexiforme o molecular, la cual tiene un espesor

promedio de 400 µm y cada árbol dendrítico, que se orienta, perpendicularmente, a la

dirección transversal de la laminilla cerebelosa, se extiende unas 200 µm lateralmente y ocupa

una profundidad aproximada de 6 µm [6]. El número de espinas dendríticas en CP repercute

en la parte funcional, ya que a través de ellas se activa el control y la coordinación de

actividades musculares y de otras complejas funciones cognitivas relacionadas.

En el procesamiento de las imágenes de CP se debe realizar el realce y la cuantificación de

las espinas dendríticas. Los problemas que origina este procesamiento no son fáciles de

resolver, debido a que estas imágenes son capturadas a diferentes planos focales utilizando

técnicas de MLARD, presentando variación tanto en su centro focal como en el contraste, lo

cual hace poco probable la superposición de diferentes imágenes sin un previo pre-

acondicionamiento de las mismas.

Generalmente, la identificación y cuantificación de las espinas dendríticas neurales se

realiza manualmente por medio de un simple análisis visual de las imágenes obtenidas con

MLARD (Figura 1-3) y es, por tanto, un proceso tedioso, subjetivo y con una mayor

probabilidad de error.

21


500 1000 1500 2000 2500 3000

500

1000

1500

2000

2500

3000

Figura 1-3. Imagen de un segmento del árbol dendrítico de CP obtenida con MLARD, sin ser sometida a preprocesamiento.

Debido a estos inconvenientes para la cuantificación de espinas dendríticas, se hace

necesario el desarrollo de un algoritmo computacional robusto que utilice diferentes

herramientas especializadas tanto para el preprocesamiento de este tipo de imágenes como

para la posterior detección y cuantificación de las referidas espinas.

1.3. Bases Teóricas

1.3.1. El Microscopio de luz

El funcionamiento de un microscopio de luz se basa en propiedades derivadas del empleo

de lentes ópticos, correctamente acoplados a otros componentes, que en conjunto constituyen

cuatro grupos de dispositivos [6,6], que garantizan un funcionamiento óptimo (Figura 1-4),

los cuales se describen a continuación:

• Sistema mecánico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y demás

elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo).

22


• Sistema óptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolución

(objetivos y oculares).

• Sistema de Iluminación: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o no) y

transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van a

incidir sobre el espécimen (lámpara o fuente de iluminación, espejo, condensador y

diafragma).

• Accesorios: Son componentes que permiten extender las capacidades del instrumento

(cámaras fotográficas, de video, computadoras, accesorios para dibujo, entre otros).

Figura 1-4. Microscopio de luz convencional (Tomado de [11])

1.3.2. Microscopía digital de alta resolución basada en luz

Es importante disponer de un microscopio de luz de alta calidad, para garantizar la

optimización de la alineación de las trayectorias lumínicas y un excelente enfoque de la

imagen a analizar, tomando en consideración que el haz de luz al incidir sobre un objeto es

dispersado por este, teniendo el sistema óptico la función de hacer converger nuevamente el

haz de luz hasta conseguir lo que se denomina el enfoque de la imagen. Un sistema óptico

ideal es aquel que permite que cada punto del objeto sea representado en un punto específico

en la imagen, condiciones a las que tiene un alto grado de aproximación el microscopio óptico

Polyvar Reichert-Jung. (Figura 1-5)

23


Figura 1-5. Sistema óptico del Polyvar Reichert-Jung (OJO: Manual referenciarlo)

Por otra parte, se debe tener presente que el sistema captador y procesador de imágenes más

eficiente que existe está constituido por el ojo y el cerebro humano. Todas las aplicaciones

ofrecidas por la tecnología no son equiparables con ese sistema, en lo que concierne a

velocidad y resolución. La estructura del ojo puede ser comparada con la de una cámara

fotográfica. En el caso del ojo, el cristalino conjuntamente con la superficie curva de la córnea

proyecta una imagen óptica sobre la retina, la cantidad de brillo de la luz incidente es

controlada por el diámetro variable del iris y la longitud focal es cambiada por los músculos

ciliares, de manera tal que el enfoque de cualquier punto del objeto sea posible y pueda ser

obtenida una imagen nítida. Un microscopio, basado en MLARD, es un instrumento óptico

que permite observar objetos que por su pequeño tamaño son invisibles a simple vista y

además, permite obtener una imagen digitalizada y considerablemente aumentada o

magnificada, El efecto de magnificación permite ampliar la imagen, de forma directa, 2,5,

10, 25, 40 y 100 veces (2.5X, 10X, 25X, 40X y 100X, respectivamente). Este tipo de

microscopio magnifica en dos pasos como consecuencia de los dos sistemas de lentes que

posee. El primer sistema, denominado objetivo, que funciona como un proyector de imágenes,

produce una imagen aumentada del objeto y el segundo, denominado ocular, magnifica la

imagen producida por el objetivo, de la misma manera que lo haría una lupa. La digitalización

consiste en poder visualizar en un computador una imagen en determinado formato. El

procedimiento de adquisición de imágenes descrito se esquematiza en la Figura 1-6 . Todo lo

24


anterior, permite confirmar que para utilizar la microscopía como una técnica para la

observación y análisis de objetos se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:

• El objeto a estudiar

• La fuente de iluminación

• El sistema óptico

Figura 1-6. Adquisición de imágenes de CP con MLARD (Fuente: El autor).

Cuando se plantea el estudio de una muestra con microscopía de luz, previamente, se

deben realizar cortes o secciones de la muestra biológica, los cuales pueden ser de espesor

variable, entre 1 μm hasta 200 μm; estas secciones se obtienen utilizando un instrumento

especializado denominado micrótomo (Figura 1-7), que es un instrumento mecánico que

permite la obtención de cortes de muestras para observación al microscopio. En el caso de

tejidos a los que se les ha aplicado el método cromo-argéntico de Golgi, el espesor de los

cortes debe estar en el rango entre 90 a 150 μm.

25


Figura 1-7. Micrótomo. (Fuente: Centro de Microscopía Electrónica “Dr. Ernesto Palacios Prü”)

Posteriormente, se debe definir cuáles aspectos morfológicos se desean analizar en la

muestra, en base a esto se selecciona la técnica de visualización, el tipo de instrumento óptico

(selección de objetivos) y se debe considerar la intensidad de iluminación que incide en la

muestra para obtener un buen contraste en la imagen. Para la iluminación de la muestra se

puede utilizar la Transiluminación [6], que consiste en el paso de un haz de luz a través de un

objeto, en este caso una sección de tejido (Figura 1-8).

Para mejorar la transparencia del tejido y facilitar la transmisión del haz de luz, se emplean

ciertas sustancias químicas como el xilol, el toluol y/o el benzol, así como medios de montaje

como el bálsamo de Canadá.

Figura 1-8. Esquema que ilustra el proceso de transiluminación. La flecha amarilla representa el haz de luz incidente sobre la muestra, que atraviesa la misma. (Tomado de [12])

26


Para el análisis de una muestra con microscopía de luz se deben considerar los términos

aumento y resolución [6], que deben ser bien conocidos por todo usuario del microscopio. El

aumento de una lente está determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia

focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la curvatura, menor será la distancia focal y

mayor será el aumento. Como se indicó anteriormente, el microscopio cumple el proceso de

magnificación en dos etapas y para ello es necesario colocar en serie dos tipos diferentes de

lentes. El primero, que debe estar situado cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y

el segundo, que debe permitir la cercanía del ojo del observador se denomina ocular (Figura 1-

9). Cada tipo de lentes es capaz de producir una imagen aumentada cuyo valor se enuncia con

la letra X, así que 10X significa que la imagen está aumentada 10 veces.

Figura 1-9. Esquema de la posición de los lentes objetivo y ocular, en relación con el espécimen y el observador. (Tomado de [12])

El poder de aumento de un sistema óptico tiene sus límites y el magnificar las imágenes

acarrea pérdida de información o detalles del objeto estudiado, esto puede ser resuelto

mediante otro principio, la resolución, que es la capacidad que tiene el objetivo del

microscopio de separar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se

puedan ver individualizados uno del otro, lo cual permite observar detalles de la imagen en el

microscopio. Mientras más corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, más precisos

serán los detalles. Esto se puede comparar con algunos aspectos de la informática como por

27


ejemplo, el tamaño del píxel; mientras más pequeño sea el tamaño mayor será la cantidad de

detalles de la imagen digital.

1.3.3. Aberraciones ópticas en MLARD

Existen factores que limitan la resolución en los sistemas ópticos de un microscopio,

presentándose como errores que distorsionan las imágenes, ya sea por el comportamiento de la

luz al incidir sobre el objeto en estudio o por defectos propios de las lentes. Estos defectos son

conocidos como aberraciones. Algunos resultan de la esfericidad de la superficie de la lente y

son reproducidos al interaccionar la luz con dicha superficie, produciendo alteraciones de los

detalles en las imágenes. Esto es debido a la difracción (del latín diffractus: quebrado). La

difracción es el fenómeno que se observa cuando la luz, al pasar por el extremo de una

superficie se curva desviándose del trayecto y no sigue su propagación en línea recta (Figura

1-10). En la transiluminación, las ondas luminosas encuentran obstáculos en su trayecto, lo

que produce una expansión de la luz por difracción y se obtiene una imagen borrosa que limita

la capacidad de aumento útil de un microscopio. Cuando se observa un objeto transparente en

el microscopio, cada detalle iluminado de este, crea un patrón de difracción denominado disco

de Airy (Figura 1-11), también llamado función de dispersión untual (PSF: point spread

function) y que representa las imperfecciones ópticas del sistema, Este patrón está formado

por un punto central brillante y varios anillos brillantes separados por anillos oscuros.

Figura 1-10. Difracción de un haz de luz al pasar a través de un orificio. (Tomado de [11])

28


Figura 1-11. Discos de Airy. (Tomado de [11])

Otro de los factores importantes que limitan la resolución, es la aberración, principalmente

la aberración esférica [6], fenómeno que está relacionado con la forma de la lente y se

produce por falta de convergencia de las ondas luminosas que pasan por la periferia de la lente

cuando no son enfocadas en el mismo punto que aquellas ondas que pasan por el centro, las

cuales son refractadas ligeramente; mientras que las que inciden en la periferia son refractadas

en mayor grado y convergen en diferentes puntos focales (Figura 1-12). Esta es una de las

principales causas por las que una imagen aparece dispersa y borrosa, en lugar de enfocada y

nítida. Además de la lente, la lámina cubre-objeto empleada en la preparación histológica,

puede producir este tipo de aberración.

Figura 1-12. Aberración esférica. Los rayos que inciden paralelamente al eje principal no convergen todos en un mismo punto. (Tomado de [11])

1.3.4. Ruido aleatorio en las imágenes MLARD

El proceso de adquisición de las imágenes puede verse entorpecido por la presencia de los

denominados ruidos, que corresponden a los píxeles aleatorios que se entremezclan entre los

píxeles aceptables que componen la imagen. Esos píxeles aleatorios pueden ser generados por

fluctuaciones provenientes de la fuente de alimentación eléctrica del equipo, cambios de

temperatura en el área de trabajo y aun por imperceptibles movimientos del microscopio al

29


momento de adquirir la imagen. El valor radiométrico de un píxel sobre la imagen que procesa

un sensor es la representación de la radiancia captada por el sensor a nivel del campo visual,

que es la superficie abarcada por el IFOV (Instantaneous Field of Vision) a lo largo del tiempo

de integración. Como se indicó, anteriormente, la imagen adquirida está determinada por

diferentes factores como la óptica del instrumento, la electrónica involucrada, los efectos

atmosféricos y el proceso de re-muestreo del sensor, que casi siempre presenta cierto

solapamiento entre píxeles contiguos.

1.3.5. Función de distorsión puntual

Todas las aberraciones ópticas y ruidos presentados previamente están descritos a través de

la PSF (Point Spread Function, traducida al castellano como Función de Dispersión Puntual).

De acuerdo a todo lo anterior, se puede decir que si todos los factores involucrados en el

funcionamiento del sistema sensor, son englobados bajo la función de transformación S, en la

ecuación 1.1, se encuentra que:

)],([),( yxpuntoSyxPSF = (1.1)

El significado de la PSF es que el sensor no sólo responde a la radiancia procedente del

píxel que se considera en la resolución espacial, sino que también procede de los píxeles que

se encuentran alrededor. Por ello, resulta de gran interés en estudios relacionados con la

discriminación de facetas de imagen y en la detección de bordes. En este caso, se define la

función de dispersión lineal (LSF: Line Spread Function), como la respuesta dada por el

sistema de captación a una línea procedente del campo visual. La LSF se representa,

matemáticamente, mediante la ecuación 1.2.

dyyxPSFyxLSF ∫∞

∞−

= ),(),(

(1.2)

30


La PSF puede ser expresada como una función que depende de las coordenadas del campo

focal ( qp, ) y de las coordenadas de la imagen ( yx, ), de la forma ),,,( yxqpPSF ; así, la

radiancia ),( yxR de un píxel de la imagen, que procede de un objeto espacial en el campo

focal ),( qpg , se expresa mediante una convolución ecuación 1.3.

dpdqqpgpypxPSFyxR ),(),(),( ∫∫ −−= (1.3)

La determinación experimental de PSF de la ecuación 1.3 es una tarea complicada y en

pocos casos se aporta una representación o función que la define a tal efecto, resulta

instructivo el trabajo de Mannstein and Gesell [6] en el que presentan una aproximación del

PSF. En cualquier caso, se puede imaginar que esta función es muy cercana a una gaussiana

2D, cuyo eje vertical representa la sensibilidad del sensor para ponderar la radiancia

proveniente de cada punto del campo focal. En este caso la función PSF vendría dada por una

expresión del tipo:

−−−−=2

22

2

)()(exp),,,(

σuyux

vuyxPSF (1.4)

Donde: x e y son las coordenadas cross-track y along-track del píxel en la imagen,

u y v son las coordenadas en el espacio imagen y

σ determina la dispersión el tamaño del píxel del sensor.

1.4. Imágenes Digitales

Una imagen digital es un arreglo bi-dimensional de datos obtenidos al muestrear y

cuantificar una imagen continúa generada por medios ópticos. El muestreo se realiza con una

red rectangular de sensores igualmente espaciada. En el Centro de Microscopía Electrónica

“Ernesto Palacios Pru”, se utiliza un microscopio de luz de alta resolución Polyvar Reichert-

Jung (Figura 1-13). Las imágenes de las arborizaciones dendríticas de las CP provenientes de

31


secciones de corteza cerebelosa de ratones adultos jóvenes, se adquieren a una resolución de

4096x5120x3 y 8 bits de profundidad (Figura 1-14).

Figura 1-13. Microscopio Polyvar Reichert-Jung. (Fuente: Centro de Microscopía Electrónica “Dr. Ernesto Palacios Prü”)

Figura 1-14. Imagen de la arborización dendrítica de una CP, a una resolución de 4096x5120x3 y 8 bits de profundidad

Teniendo en consideración el espesor del corte (90 a 150 μm) y la distribución

tridimensional de las células neurales (Figura 1-15), se presentan algunas dificultades para la

cuantificación de las espinas dendríticas, debido a que las imágenes son capturadas a

diferentes planos focales, presentando variación en su centro focal y variación en el contraste,

lo cual dificulta la superposición de diferentes imágenes sin un previo pre-acondicionamiento.

32


Figura 1-15. Segmento del árbol dendrítico de una CP, impregnada con el método de Golgi y sin ningún

preprocesamiento.

1.4.1. Técnicas básicas de procesamiento

A las imágenes de CP, se les aplicaró un realce, que es una de las principales técnicas

básicas de procesamiento digital de imágenes. Las operaciones que componen esta técnica se

dividen en operaciones de procesamiento píxel por píxel [6] donde el valor de la imagen

realzada en un píxel está en función del valor de su píxel correspondiente en la imagen

original, y filtrado espacial que es una operación de procesamiento por grupo de pixeles o

vecindades.

a) Filtraje por convolución: Para aplicar un filtro espacial a una imagen ),( yxf es

necesario definir una matriz que contendrá los coeficientes del filtro, lo que a su vez define los

píxeles del entorno que serán utilizados como argumento del filtro que alterará el valor del

píxel; a esta matriz se le denomina máscara ),( tsw y tiene una dimensión [ ]nm, . Se

utilizaron máscaras impares ya que dan un único punto central, en la aplicación del filtro

espacial se utilizó la ecuación 1.5.

),(),(),( tysxftswyxga

as

b

bt

++= ∑ ∑−= −=

(1.5)

33


En la ecuación 1.5, se cumple que: 12 += am y 12 += bn . Siendo a y b las

coordenadas del centro de la máscara y ),( tsw representa los términos de la matriz de la

máscara de cuyo tamaño es [ ]nm, y ),( tysxf ++ el valor de los píxeles de la vecindad

definida por la máscara.

Por otra parte, las operaciones espaciales, engloban las técnicas de tipo convolutivo [6]. Un

filtro de convolución para una imagen digital, en el espacio real ),( yx , puede representarse

como una matriz cuadrada o rectangular (matriz de convolución), de dimensiones [ ]nm,

mucho más pequeñas que la de la imagen. La matriz de convolución se desplaza sobre la

imagen de tal forma que el elemento central de la matriz de convolución coincida con cada

uno de los píxeles de la imagen. En cada posición, se multiplica el valor de cada píxel de la

imagen que coincida en posición con un elemento de la matriz de convolución, por el valor de

éste. El píxel de la imagen, que coincide con el elemento central de la matriz de convolución,

es sustituido por la suma de los productos. La convolución es una operación matemática que

tiende a conferir a una función ),( yxf la forma de otra función ),( yxg , como lo muestra

la ecuación 1.6.

∑∑= =

−−==M

k

N

l

lykxhlkfyxhyxfyxg1 1

),(),(),(*),(),( (1.6)

Donde: ],[ NM es el tamaño de la imagen ),( yxf y ),( yxh es la repuesta al impulso

del sistema.

Por tanto, al aplicar a una imagen ),( yxf una convolución con una función gaussiana

),( yxh lo que se hace es forzar a que las variaciones de brillo existentes en la imagen se

parezcan más a la forma de una gaussiana, haciendo suave el cambio de colores, lo cual

produce un efecto de desenfoque gaussiano.

b) Transformaciones por puntos: Al aplicar a la imagen de la Figura 1-15 una

transformación puntual, que ajusta los tonos de gris del rango [0 255], utilizando la ecuación

1.7 de la recta.

34

http://www.ayc.unavarra.es/miguel.pagola/convolucion.htm


[ ]( ]0 60

( )255 60 255

∈= =∈

aX si XY T X

si X

(1.7)

Así, se obtiene la imagen mostrada en la Figura 1-16 observándose que el filtro puntual

realza la estructura de CP, pero no se destacan claramente las espinas dendríticas de CP.

c) Filtro de mediana: es un filtro espacial (Figura 1-17) que corresponde a una técnica no

lineal, y en este caso para una secuencia impar de k números, se define como el número que

cumpla que es mayor que 1

2

−k números, y menor que los otros

1

2

−k. Se utiliza en la

reducción del ruido, sin difuminar la imagen.

Se puede observar en la Figura 1-17 contrastando la imagen original y la filtrada con el

filtro de mediana que la imagen sufre un suavizado y realce del árbol dendrítico de CP, pero

no se destacan las características fundamentales como lo son las espinas dendríticas de CP.

Figura 1-16. (a) Imagen de CP, sin procesar (b) Imagen de CP, preprocesada utilizando transformacion

puntual

35


Figura 1-17. (a) Imagen de CP, sin procesar (b) Imagen de CP, procesada con un filtro de mediana

d) Filtro media: es un filtro espacial que sustituye la intensidad de cada pixel de la imagen

por el promedio de los pixeles vecinos, es decir, sea una imagen ),( yxf el procedimiento

consiste en generar una nueva imagen ),( yxg , cuya intensidad para cada píxel se obtiene

promediando los valores de intensidad de los píxeles ),( yxf incluidos en un entorno de

vecindad predefinido de tamaño ],[ nm , ver ecuación 1.8. Se caracteriza por difuminar el

ruido en la imagen.

∑ ∑−= −=

++=

=

a

as

b

bt

tysxftswyxg

mxntsw

),(),(),(

1),(

(1.8)

x, y: varían dependiendo del tamaño de la imagen

En la Figura 1-18 se observa un suavizado en la imagen y un aumento de densidad en la

estructura del árbol dendrítico de CP, también se produjo un realce del árbol dendrítico pero

no se destacan claramente las espinas dendríticas de CP.

36


Figura 1-18. (a) Imagen sin procesar de CP. (b) Imagen de CP procesada con un filtro de media

e) Filtro gaussiano: presentado en la ecuación 1.9, permite que el valor de cada punto

sea el resultado de realizar la promediación ponderada con distintos pesos representados por

una función gaussiana. El valor máximo aparece en el pixel central y disminuye hacia los

extremos tanto más rápido cuanto menor sea el parámetro de desviación (σ ).

),(),(),(

2),(

2

4

)(2

22

tysxftswyxg

etsw

a

as

b

bt

ts

++=

=

∑ ∑−= −=

+−

πσ

σ

(1.9)

ts, : Varían dependiendo del tamaño de la ventana o vecindad

yx, : Varían dependiendo del tamaño de la imagen

σ : Varianza

Se observa en la Figura 1-19, la imagen del árbol dendrítico de CP, realzada pero no se

resaltan los detalles como lo son las espinas dendríticas.

37


Figura 1-19. (a) Imagen de CP, sin procesar. (b) Imagen de CP procesada con un filtro gaussiano

f) Realce logarítmico: según la ecuación 1.10 es una transformación puntual donde se

ajusta la información de la imagen hacia una curva logarítmica, se utiliza para mejorar

imágenes demasiado oscuras.

)1),((log),( += yxfNyxg (1.10)

N : Factor de escala que fija el máximo nivel de salida

En la Figura 1-20, se observa que el filtro de realce logarítmico realizó en la imagen de

CP, un realce extraordinario del árbol dendrítico de CP con respecto a los filtros anteriores,

este realce es mucho mejor pero de igual manera no realzó las espinas dendríticas de CP.

38


Figura 1-20. (a) Imagen de CP, sin procesar. (b) Imagen de CP procesada con un realce logarítmico

Se puede observar que en las técnicas utilizadas no se visualizan cambios en el realce de

las espinas dendríticas de CP, que posibilite el conteo manual de dichas espinas.

39


2. Capítulo II

2. UTILIZACIÓN DE FILTROS DE MEDIANA Y

TRANSFORMADA WAVELET EN EL ANÁLISIS DIGITAL

DE IMÁGENES NEURALES

2.1. Introducción

El procesamiento de imágenes de espinas dendríticas neurales para la cuantificación

presenta algunas dificultades, debido a que estas imágenes son capturadas a diferentes planos

focales, presentando variación en su centro focal y variación en el contraste, lo cual dificulta la

superposición de diferentes imágenes sin un previo pre-acondicionamiento. Algunos autores

delimitan el procesamiento a una región de la imagen, con el fin de disminuir el grado de

dificultad en el procesamiento de la imagen.

Fleuret y otros [6], utilizaron técnicas estadísticas donde describen los resultados

preliminares respecto al seguimiento de las dendritas expandidas de una neurona en

imágenes de microscopía confocal. Sobre un número pequeño de imágenes, ellos obtienen

buenos resultados usando un algoritmo basado en la técnica de Expectación-Maximización (E-

M), para la estimación de la probabilidad de que un píxel pertenezca al árbol dendrítico de

una neurona, para ello utilizan las propiedades globales del árbol del conjunto completo de

dendritas. El algoritmo EM se usa en estadística para encontrar estimadores de máxima

verosimilitud de parámetros en modelos probabilístico que dependen de variables no

observables.

40

http://diccionario.sensagent.com/Modelo_probabil%C3%ADstico/es-es/

http://diccionario.sensagent.com/Estimador/es-es/

http://diccionario.sensagent.com/Estad%C3%ADstica/es-es/


Young y otros [6], realizaron análisis de imágenes celulares en tres dimensiones y

demuestran con resultados experimentales la viabilidad del seguimiento automatizado del

árbol dendrítico de las neuronas, con datos adquiridos por microscopía de fluorescencia

confocal. La salida del sistema es una representación gráfica etiquetada de la topología neural

y esta espacialmente alineada con la data de la imagen en 3D. Una variedad de análisis

topológicos y métricos se puede realizar usando esta representación, como por ejemplo

mediciones precisas de volúmenes longitudes, diámetros y tortuosidades. Se hace sobre

fracciones específicas de la neurona.

Bai y otros [6] realiza estudios en las espinas dendríticas ya que juegan un papel muy

importante en el sistema nervioso central y la técnica de proteínas fluorescente facilita la

búsqueda de espinas. Para analizar, cuantitativamente, las espinas dendríticas en las imágenes

adquiridas en microscopía de fluorescencia, se propone un método para el análisis

automático de las espinas dendríticas. Debido al límite de la resolución axial, el método se

diseñó para procesar la imagen de la proyección a lo largo del eje de z y analizar las espinas

dendríticas laterales. El método puede extraer, automáticamente, las líneas centrales de las

dendritas y el segmento de las espinas a lo largo de la dendrita de acuerdo a criterios basados

en el ancho. El criterio es utilizar características morfológicas comunes de las espinas. Puede

detectar algunas formas de espinas perdidas no detectadas por otros métodos. Para validar el

método desarrollado el número de espinas, longitudes y densidades se analizaron de manera

manual y automática.

Estos trabajos muestran resultados que tuvieron gran impacto, pero su desventaja es que

para su buen funcionamiento necesitan mucha intervención manual por parte del especialista,

lo cual hace que el estudio sea lento y muy laborioso. Las imágenes de CP han sido poco

estudiadas desde el punto de vista de la ingeniería biomédica y el presente estudio se enfoca

hacia la búsqueda de una herramienta que atenué el ruido y a su vez realce la morfología de las

imágenes de CP, especialmente en áreas pequeñas de las ramificaciones dendríticas, más que

en el árbol dendrítico completo. Adicionalmente, que se considera que este estudio es

importante ya que permite realizar medidas comparativas del número de espinas durante las

diferentes etapas del desarrollo de las CP, aspecto importante en caso de enfermedades

neurales durante la infancia.

41


Tratando de conseguir un mejor realce morfológico celular de CP, se utilizan filtros de

Mediana [6,6,6] y la transformada wavelet [6,6] que son herramientas que muestran buenos

resultados para el preprocesamiento de datos en las referidas imágenes.

2.2. Materiales y Métodos

Para este estudio, se generó una base de datos que consta de 35 imágenes (4096x5120 y 8

bits de profundidad) de CP del cerebelo de ratones adultos jóvenes, adquiridas utilizando un

microscopio Polyvar Reichert-Jung. A los cerebelos se les aplicó la técnica de impregnación

cromo-argéntica o método de Golgi, modificada por Palacios-Prü [6]. Las imágenes fueron

obtenidas en el Centro de Microscopía Electrónica “Dr. Ernesto Palacios Prü” de la

Universidad de Los Andes (Mérida, Venezuela), visualizando los cortes con microscopía de

luz de alta resolución digital (MLARD). Las diferentes técnicas que se utilizaron para procesar

las imágenes de CP fueron: filtro de mediana, filtro de mediana ponderado, filtro de mediana

ponderado óptimo y transformada wavelet (TW). Estas técnicas se usaron con el fin de

mantener las características relevantes de la imagen original. Se procesó con estos filtros una

sección de una imagen de CP de tamaño 1024x1024 y 8 bit, en los filtros de mediana las

ventanas fueron de tamaño impar y vecindad cuadrada, el tamaño de la ventana se seleccionó

de forma heurística hasta encontrar un tamaño optimo.

2.2.1. Filtro de mediana

Una de las técnicas no lineales más utilizadas para el procesamiento de imágenes, en cuanto

a la eliminación de ruido, es el filtro de mediana. La mediana (operador median(.) ) de una

secuencia impar de k números se define como el número que cumpla que es mayor que 2

)1( −k

números, y menor que los otros 2

)1( −k. Diversos autores [6] han demostrado las ventajas de

utilizar esta técnica en el preprocesamiento de imágenes. La ecuación 2.1, define

matemáticamente este tipo de filtro.

42


))(),...(),...(()( RL NnxnxNnxmedianny +−=

(2.1)

Donde:

LR NNN += : Tamaño de la ventana de observación

)(nx : Elementos de la ventana de observación

)(ny : Salida del filtro.

2.2.2. Filtro de mediana ponderado

Los Filtros de mediana sin ponderaciones son temporalmente ciegos todas las muestras en

la ventana de observación son tratadas iguales sin importar su localización pero las

ponderaciones permiten realzar y/o despreciar la importancia de las muestras en la ventana de

observación. El funcionamiento del filtro de mediana ponderado, cuya expresión matemática

se presenta en la ecuación 2.2, es similar al filtro de mediana ya descrito, pero se le asigna a

cada elemento de la matriz de coeficientes, una ponderación que indica cuantas veces se repite

el valor del píxel [6].

( ) ( ) ( )))sgn(,...)sgn(,)sgn(()( 222111 NNN xWWxWWxWWmedianny ◊◊◊=

(2.2)

Dónde:

NWWW ...2,1 : Son los coeficientes de ponderación

Nxxx ...2,1 : Representan el Nivel de Gris de cada píxel de la imagen

N : Tamaño de la vecindad

◊: Operador de repetición que indica el número de veces que se repite el píxel de la

imagen según la ponderación ( iW )

)(ny : salida del filtro

n : Valor en el tiempo

sgn: Extrae el signo de su argumento

43


2.2.3. Filtro de mediana ponderado óptimo

En la aplicación del filtro de mediana ponderado optimo se vectorizan las matrices de las

imágenes de igual tamaño, este filtro se fundamenta en un proceso de optimización del vector

de ponderación utilizando recursividad, donde la salida previa es usada para determinar la

salida actual. El número de iteraciones depende del número de componentes del vector

imagen. Durante este proceso se mide el error según la ecuación 2.3. Tal error es la

diferencia en valor absoluto del vector ideal )(nD y el vector con ruido procesada con el

filtro de mediana ponderado )(ˆ nD . La ecuación 2.4 presenta la definición matemática

utilizada para generar nuevos pesos [6]. Esto permitirá obtener la ponderación óptima la cual

será seleccionada a partir de la envolvente de la curva de error donde ésta alcance un mínimo.

)))(ˆ)((()( nDnDabsne −= (2.3)

))(ˆ)(sgn(*))(sgn())(ˆ)(()()1(1 nDnSnWnDnDnWnW jjjj −−+=++ µ

(2.4)

Donde:

)(ne : Error

jW : Coeficientes previos de ponderación

1+jW : Coeficientes actuales de ponderación

)(nD : Imagen deseada

)(ˆ nD : Imagen a procesar que se le aplico filtro de mediana ponderado

)()()( nXnWnS jjj =

)(nX j : Elementos de la ventana de observación

sgn: Extrae el signo de su argumento

n : Valor en el tiempo

µ: Coeficiente que determina la velocidad de convergencia del algoritmo

j: Componentes del vector de ponderación (j=1..N)

44


2.2.4. Transformada Wavelet

La Transformada Wavelet (TW) es una herramienta que se utiliza en el procesamiento

digital de imágenes, tiene diferentes planos de resolución espacio-escala [6]. El objetivo es

encontrar un estimado de una imagen ),( yxf que conserve las características más

relevantes, eliminando las componentes de ruido. La TW se considera como una herramienta

de análisis multi-resolución, que permite la representación de la imagen mediante coeficientes

que miden el grado de correlación o similitud entre la imagen original y las versiones escalada

y trasladada, en el espacio de la función básica ),( yxψ llamada wavelet madre.

Para ),( yxf , las funciones wavelet y la transformada wavelet en el dominio continuo

bidimensional, están dadas por la ecuación 2.5

( ) ( )( ) ( ) ( ) ( )dxdyyxyxfyxfyxfW

kykxyx

kykxjkykxj

yj

xjj

kykxj

,*,,,,

2,22,

,,,,

,,

ψψ

ψψ

ψ ∫∫==

−−=

(2.5)

Donde xk y yk son respectivamente traslaciones en los ejes coordenadas x, y la TW

Inversa bidimensional. se representa mediante la ecuación 2.6

( )

( ) ( )dxdyyxyxfyxyxfC

donde

yxCyxf

kykxjkykxjkykxj

j kx ky kykxjkykxj

,*),(,),(

,),(ˆ

,,,,,,

,,,,

ψψ

ψ

∫∫

∑ ∑ ∑

==

=

(2.6)

El proceso de reconstrucción, también denominado síntesis, se encarga de la obtención de

la imagen a partir de los detalles y aproximaciones. Éste proceso se lleva a cabo con la

transformada wavelet inversa (TWI).

2.3.Resultado

45


Mediante la aplicación de las diferentes técnicas mencionadas se encontraron resultados

que demuestran su efectividad en cuanto al realce de la imagen, cuando se compara el

resultado con la imagen de CP original MLARD.

2.3.1 Filtro de mediana

Cuando se utilizó el filtro de mediana [6], con una vecindad 5x5, se observó la atenuación

de ruido impulsivo de alta frecuencia; mientras que los bordes de las CP se realzan (Figura 2-

21b), y se mantienen inalteradas algunas estructuras de la imagen, como son las espinas

dendríticas.

En la aplicación de este filtro se utilizaron máscaras o vecindades cuadradas de orden

impar y el tamaño de la máscara optima se encontró utilizando una metodología heurística, es

decir, se ensayo con máscaras de tamaño 3x3, 5x5, 7x7… 25x25 y se observó un mejor realce

en la imagen de CP con la máscara de 5x5.

Figura 2-21. (a) Dendritas de CP, sin ningún preprocesamiento. (b) Dendritas de CP después de utilizar filtro de mediana, con una vecindad 5x 5.

2.3.2 Filtro de mediana ponderado

Al aplicar el filtro de mediana ponderado [6] se puede observar que se mantienen las

características fenotípicas de CP (Figura 2-22b), sin embargo, se aprecia cambios en el

contraste y suavizado en la imagen de CP. El filtro de mediana ponderado se caracteriza

46


porque a cada elemento de la máscara o vecindad cuadrada de tamaño impar, se le asigna una

ponderación ( iW ). Los valores de ponderación se seleccionan en forma: aleatoria,

heurísticamente, considerando un Filtro de Repuesta Impulsiva Finita (FIR), entre otros. En

nuestro caso se utilizaron los coeficientes de un filtro FIR pasa banda normalizado con

respecto a la frecuencia de Nyquist, de orden 24=N (genera 25 coeficientes, para una

vecindad de 5x5 y frecuencia 7.01.0 ≤≤ nf ). En el desarrollo del presente estudio se

modificó heurísticamente el tamaño del filtro (N) y se modificaron los valores del intervalo en

nf , hasta observar mejoras en el realce de la imagen de CP.

Figura 2-22. (a) Dendritas de CP, sin ningún preprocesamiento. (b) Dendritas de CP después de utilizar el filtro de mediana ponderado, con una vecindad 5x5

2.3.3 Filtro de mediana ponderado óptimo

Se observa en la imagen obtenida por el filtro de mediana ponderado óptimo (Figura 2-

23b) que se obtiene una imagen con un mejor contraste y realce, que la imagen deseada

(Figura 2-24b), pero se observan algunos “artefactos” que distorsionan la imagen, estos se

muestran en el recuadro rojo donde se encierra unas franjas verticales que se originaron como

resultado al aplicar el filtro.

En la implementación del filtro de mediana ponderado óptimo, es necesario inicializar los

pesos ( iW ). Para ello se consideran los coeficientes del filtro FIR mencionado en la sección

47


2.3.2. También es necesaria una imagen de referencia )(nD y la imagen a procesar )(ˆ nD de

CP (Figura 2-24) ambas imágenes están vectorizadas. )(ˆ nD Se obtiene aplicándole a la

imagen, que se desea optimizar, un filtro de mediana ponderado y la imagen de referencia es

una imagen de CP restaurada mediante el algoritmo de Lucy-Richardson (ver capítulo III) [6].

La Figura 2-25 muestra una curva de aprendizaje de error que se obtiene restando en valor

absoluto )(ˆ nD y )(nD , generando una curva envolvente del error. Para cada valor del error

se genera un vector de ponderación de 25 componentes, utilizando la ecuación 2.4. La mejor

ponderación se obtiene cuando la curva envolvente del error se hace mínima (Figura 2-25) y

se logra en la iteración 16000.

Figura 2-23. (a) Dendritas de CP, sin ningún preprocesamiento. (b) Dendritas de CP después de utilizar filtro de mediana ponderado óptimo, con una vecindad 5x5.

48

ArtefactosArtefactos


Figura 2-24. (a) Dendritas de CP, sin ningún preprocesamiento. (b) Dendritas de CP deseada

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 160000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Numero de iteraciones

Error

Figura 2-25. Curva de error

2.3.4 Transformada Wavelet

En cuanto al procesamiento utilizando TW, inicialmente, se procedió a realizar la

descomposición y procesamiento, considerando un solo nivel de descomposición obteniéndose

49


cuatro coeficientes, conocidos como: aproximación, detalles horizontales, detalles verticales y

detalles diagonales (Figura 2-26). En la descomposición se utilizó la Daubechies (db1)

originando resultados aceptables en el realce de CP. En la selección de la wavelet no existe

una transformada wavelet única que resuelva los problemas a priori en la imagen tratada

(compresión, eliminación de ruido, segmentación de imagen,...), lo que se hace es busca la

familia de wavelets (Haar, Daubechies, Coiflets,...) que mejor realcen las características de la

imagen a estudiar generando mejores resultados en la imagen a procesar.

En la descomposición de la imagen utilizando TW, los coeficientes de aproximación

contiene la mayor parte de la energía de la imagen, mientras que los detalles (horizontal,

vertical y diagonal) tienen valores próximos a cero, la transformada wavelet permite aplicar

técnicas de procesamiento de imágenes a cada uno de sus coeficientes.

Figura 2-26. Descomposición de la TW de CP, con la wavelet db1

50


Los coeficientes fueron procesados utilizando técnicas de procesamiento de imágenes

procesamiento píxel por píxel o filtrado espacial. Obteniéndose mejores resultados aplicando

el filtro laplaciano de una gaussiana (matlab: fspecial('log',[17 17], 0 .07) ) a los coeficientes

de aproximación, seguidamente se le aplico la transformada wavelet inversa, obteniendo un

realce del árbol dendríticos y las espinas de CP, para lo cual se muestran secciones de las

imágenes de CP para observar en detalle el realce de espinas dendríticas. (Figura 2-27a y

Figura 2-27b).

Figura 2-27. (a) Imagen aumentada de las dendritas de CP, correspondiente a una sección de la imagen. (b) Aplicación de la TWI

51

a


2.4. Conclusiones

El procesamiento de imágenes de CP con filtros de mediana y TW es una metodología

novedosa, a la cual se le ha dedicado poca atención. Esto puede concluirse debido a la escasa

literatura encontrada al respecto. Los resultados obtenidos sugieren que las técnicas estudiadas

podrían ser una importante herramienta de procesamiento para este tipo de imágenes. En

cuanto a los resultados, el filtro de mediana ponderado es el que produce mejores resultados.

El filtro de mediana ponderado óptimo presenta como limitante el requerimiento de una

imagen de referencia, la cual en esta aplicación no siempre está disponible. Por su parte, la

TW resalta y ofrece información importante relativa a los bordes de las CP, permitiendo una

mejor definición de aquellos sitios donde las espinas dendríticas aparecen borrosas.

Las técnicas de procesamiento propuestas resultan útiles para producir un realce adecuado

de las CP, lo cual puede contribuir a mejorar el procedimiento de cuantificación de espinas

dendríticas que normalmente se realiza en forma manual.

52


3. Capítulo III

3. PREPROCESAMIENTO DE IMÁGENES DE CÉLULAS

DE PURKINJE UTILIZANDO DECONVOLUCIÓN

3.1. Introducción

Las imágenes obtenidas con microscopía de luz de alta resolución digitalizada (MLARD) a

partir de secciones de tejido de 90 a 150 µ de espesor son imágenes bastante nítidas; sin

embargo, algunas son borrosas debido a los diferentes planos focales existentes por el espesor

del corte, lo cual produce un proceso de degradación lineal e invariante espacial que afecta a

cada uno de los pixeles de la imagen en igual proporción. Esta degradación se modeló como

una convolución matemática bidimensional de una función ),( yxf representativa de la

imagen original [6], con otra función de propagación puntual (PSF), que modela el proceso de

degradación de cada punto ),( yxh , obteniéndose una imagen degradada ),( yxg . El

problema consiste en realizar la operación inversa que permita recuperar la imagen original

),( yxf a partir de la versión degradada ),( yxg y del conocimiento que se tenga del

sistema óptico de adquisición de imágenes representada por la función ),( yxh , esto se

conoce como deconvolución [6,6]. La deconvolución, en este caso, es la corrección de los

efectos instrumentales originada por las aberraciones de los sistemas ópticos.

Diversos autores han realizado trabajos utilizando la técnica de deconvolución en algunas

modalidades de imágenes. En este sentido, Poindexter (2008), realizó un estudio de

visualización y localización de los antimicrobios humanos beta 1, 2 y 3, alfa defensina

neutrófilos y LL-37, en piel [6]. Para ello, tomó muestras de tejido en el cual las células

fueron marcadas con anticuerpos secundarios. Estas muestras fueron observadas con

53


microscopía de fluorescencia, las imágenes obtenidas fueron restauradas por deconvolución

generando una secuencia adecuada para la posterior cuantificación de las células en estudio.

Por otra parte, Park y otros [6], aplicaron la referida técnica, conjuntamente con la PSF,

para ubicar con precisión la ubicación del baricentro de los anillos que generan unas

micropartículas al analizar un movimiento tridimensional.

De igual manera, Maierhofer y otros [6], aplicaron la técnica en la compresión de

enfermedades a nivel celular, analizando el ADN de manera eficiente en una celda a partir de

células de tejido en el contexto natural. Sin embargo, el análisis de ADN en las células es útil

para la comprensión del cáncer. En el estudio presenta una hibridación fluorescente in situ,

técnica basada en la deconvolución multicolor. Se utilizaron siete canales para la detección de

la sonda, que permite la localización simultánea en alta resolución en una muestra biológica

con un espesor de hasta 30 micras. También utilizó un etiquetado de los núcleos que ofrece

una segmentación simultánea.

En el proceso de deconvolución existen diversas formas de enfocar la técnica, entre ellas

se pueden mencionar los métodos basados en alcanzar una solución de máxima verosimilitud

(maximum likelihood), métodos basados en la probabilidad Bayesiana, y métodos de

deconvolución a ciegas (blind deconvolution) [6]. Entre los métodos de máxima verosimilitud

están los métodos iterativos para minimizar la diferencia entre la imagen distorsionada original

y la convolución de la imagen verdadera con el PSF. Con respecto a los métodos Bayesianos

destaca el algoritmo Pixon [6], este algoritmo permite la incorporación de información a

priori, tales como restricciones de suavidad, para así mejorar la calidad de la imagen. El

algoritmo iterativo de Lucy-Richardson, se basa en alcanzar una solución de máxima

probabilidad [6]. Los métodos de deconvolución a ciegas buscan extraer una PSF plausible a

partir de la información existente en la imagen y de cierto conocimiento a priori del contenido

de la misma. En nuestro caso, se implementarán los algoritmos iterativos [6] de los filtros de

regularización, filtro Winner y filtro de Lucy-Richardson. Dicha implementación permitirá

establecer comparaciones en cuanto al desempeño de tales algoritmos iterativos.

De lo descrito anteriormente, se puede intuir que los instrumentos ópticos producen

ligeras desviaciones en la trayectoria de los fotones, lo que se traduce en aberraciones en la

54


imagen, de modo que ésta nunca es una copia exacta del objeto real y será necesario recurrir a

técnicas de restauración, para optimizar el posterior proceso de cuantificación de la imagen.


En la presente investigación se adquirió una base de datos de 35 imágenes, con una

resolución de 4096x5120 píxeles y una profundidad de 8 bits. Las imágenes de CP son de un

corte del cerebelo de un ratón adulto joven, adquiridas utilizando un microscopio fotónico

Polyvar Reichert-Jung con un objetivo de 100X y una cámara fotográfica Infinity. Al cerebelo

se le aplicó el método de Golgi modificado por Palacios-Prü [6]. Se visualizaron cortes (90µ

de espesor) con MLARD a diferentes planos focales. La técnica utilizada para procesar las

imágenes de CP fue la deconvolución, la cual fue implementada para realzar las características

más importantes de las espinas de las ramificaciones dendríticas de CP.

3.2.1 Convolución

La convolución es una operación matemática que corresponde al filtraje de una función

),( yxf con un cierto núcleo funcional h(x,y) para producir la forma de otra función

),( yxg , como lo indica la ecuación 3.1.

∑∑= =

−−==M

k

N

l

lykxhlkfyxhyxfyxg1 1

),(),(),(*),(),(

(3.1)

Por tanto, al aplicar a una imagen una convolución (Figura 3-28) con una función

gaussiana (Figura 3-29), lo que se hace es forzar a que las variaciones de brillo existentes en la

imagen se parezcan más a la forma de una gaussiana, haciendo el cambio de colores suave, lo

cual produce un efecto de desenfoque gaussiano. En la formación de la imagen expresa que lo

obtenido, cuando se adquiere cualquier imagen de un objeto real, es básicamente el resultado

55


de una convolución, donde la PSF ( ),( yxh ) es una función que caracteriza las

imperfecciones de los dispositivos de adquisición (microscopio y cámara LCC). En otras

palabras la PSF es la función matemática que describe la distorsión que sufre un punto teórico

de luz al atravesar un medio de difracción (lente) como lo modela la ecuación 3.2

Ryxhyxfyxg += ),(*),(),(

(3.2)

),( yxg : Imagen observada

),( yxf : Imagen real

),( yxh : PSF

R : Ruido

*: Operador de convolución

En condiciones ideales de observación, en un microscopio con lentes con grado de

aberración igual a cero, la PSF sería una delta de Dirac (función impulso), función

consistente en un pico único cuya anchura tiende a cero y área a uno. En estas condiciones la

convolución sería una identidad, es decir, no modificaría el objeto en observación.

Figura 3-28. Ejemplo de la operación de convolución

56


Figura 3-29. Función de propagación de puntos ( ),( yxh )

3.2.2 Deconvolución

La deconvolución (Figura 3-30), es la inversa de la convolución con ausencia de ruido (

0=R ). Conocido el resultado de una convolución y sabiendo qué forma tiene la PSF, es

posible revertir el proceso para obtener la función original ),(/),(),( yxhyxgyxf = donde

el símbolo ‘/’ representa la deconvolución. Esto es cierto en teoría, pero no es tan sencillo en

la práctica. Trabajando con imágenes reales, no se puede llegar a un resultado razonable

aplicando una deconvolución de forma fácil y hay varias razones para ello. Una, muy

importante, es que las imágenes digitales son representaciones discretas. Todo proceso de

muestreo necesariamente se realiza con un rango finito de frecuencias, con lo cual una parte de

la información se pierde de forma irreversible. Otra razón, igualmente importante, es que en

realidad no se conoce la PSF, debido a las perturbaciones que intervienen durante la

adquisición de una imagen en microscopía, sólo se puede modelar de forma aproximada, por

lo tanto una pequeña variación en la PSF tiene efectos muy importantes en el resultado de la

deconvolución. También hay que tener en cuenta en la adquisición de imágenes, la presencia

del ruido ( R ), que es un componente aditivo que complica la solución del problema. Esto es

debido a que es muy difícil caracterizarlo correctamente, y además, porque es aún más difícil

separarlo de la imagen, ya que no se sabe de forma exacta que es el objeto y que es el ruido.

Otra causa es que PSF, posee valores igual a cero, y divisiones de ese tipo generan error. Por

todas estas razones, la deconvolución de imágenes reales es un problema bastante complejo,

57


debido a esto se recurre a la implementación de técnicas basadas en algoritmos de

deconvolución que se implementan mediante métodos numéricos.

Figura 3-30. Ejemplo de la operación de deconvolución

Los métodos numéricos que se utilizaron en la deconvolución fueron los algoritmos de

regulación, el de Wiener y el de Lucy-Richardson. Tales Algoritmos son procedimientos

iterativos que se utilizan para la restauración de una imagen, que ha sido distorsionada por

una PSF.

Antes de definir los filtros anteriores se hará referencia a los métodos iterativos. Un

método iterativo es un método que progresivamente va calculando aproximaciones a la

solución de un problema. Matemáticamente, en un método iterativo se repite un mismo

proceso de mejora sobre una solución aproximada: se espera que lo obtenido sea una solución

más aproximada que la inicial. El proceso se repite sobre esta nueva solución hasta que el

resultado más reciente satisfaga ciertos requisitos. A diferencia de los métodos analíticos, en

los cuales se debe terminar el proceso para obtener la respuesta, en los métodos iterativos se

puede suspender el proceso al término de una iteración y se obtiene una aproximación a la

solución. Por ejemplo un método iterativo será encontrar la raíz a una ecuación cuadrática,

donde se utiliza el método de Newton, pero un método directo consiste en aplicar la ecuación

solución por factorización, solución por completación de cuadrados o solución por la

58


ecuación general. La desventaja de los métodos iterativos respecto a los métodos directos es

que los iterativos calculan aproximaciones a la solución. Los métodos iterativos se usan

cuando no se conoce un método para obtener la solución en forma exacta.

Filtro de regularización: El algoritmo de regularización [6], es la aproximación de un

problema mal condicionado, por medio de problemas bien condicionados similares. En

general la regularización conlleva a realizar ciertas suposiciones acerca de la solución con

respecto a su tamaño o suavidad de una imagen. Supóngase que se tiene una imagen borrosa

con la cual se forma un vector b , por otro lado se tiene la imagen x vectorizada que se

quiere recuperar y el aparato con el que se adquirió la imagen representado por una matriz A

(PSF), de nxn , en otra palabras, una imagen x se captura mediante el dispositivo A para

obtener una imagen b , esto es equivalente a aplicar una transformación lineal A a un vector

x .

bAx = (3.3)

El problema se reduce a encontrar x que resuelva la ecuación 3.3, desafortunadamente,

resolver el sistema de ecuaciones por cualquier método numérico, no resulta factible debido al

mal condicionamiento de la matriz A, conduciendo a la propagación de errores numéricos y

así generar una imagen de mala calidad, debido a eso se utilizan los filtros de regularización

que consisten en reemplazar el problema mal condicionado bAx = por la )x que minimiza el

funcional (3.4).

bAIAAxxbAx Tn

T 122)(0; −+=⇒>+− ααα (3.4)

α : Parámetro de regularización

nI : Matriz identidad nxn

Filtro de Wiener: El algoritmo de Wiener se diseñó para trabajar en los casos donde el

ruido ( ),( yxN ) es significativo, este filtro requiere que se conozca en detalle el tipo de

ruido presente en la imagen. Es un filtro lineal de mínimos cuadrados para reducir al mínimo

la distancia media entre la señal de salida y una señal deseada. Dicho algoritmo es usado para

la restauración de imágenes. Para diseñarlo se necesita tener un conocimiento previo

59


apropiado de las propiedades estadísticas de la imagen de entrada, el problema reside en que

este conocimiento no se puede obtener en forma precisa, en su lugar se usan filtros

adaptativos, que hacen uso de los datos de entrada para aprender los datos estadísticos

requeridos [6].

Figura 3-31. Modelo de restauración

El modelo de la Figura 3-31, se representa mediante la ecuación 3.5

[ ] ),(*),(),(*),(),(ˆ yxHyxNyxHyxFyxF RDII +=

(3.5)

Aplicando la transformada de Fourier, se tiene la ecuación 3.6

[ ] ),(*),(),(*),(),(ˆyxRyxyxDyxIyxI wwhwwnwwhwwfwwf +=

(3.6)

Donde

yx ww , : son la frecuencia correspondiente a cada uno de los ejes de la trasformada de Fourier

bidimensional

),(),,(),,(),,(),,(ˆyxRyxyxDyxIyxI wwhwwnwwhwwfwwf Son las transformadas de

Fourier de ),(),,(),,(),,(),,(ˆ yxHyxNyxHyxFyxF RDII

Aplicando mínimos cuadrados al error (3.7) que se obtiene entre la imagen deseada y la

imagen de salida

[ ]{ }2),(ˆ),( yxFyxFEE II −= (3.7)

60


La minimización de la ecuación 3.7 conduce a estimar el filtro de Wiener que está dado por la

ecuación 3.8.

),(

),(),(

yxFF

yxFF

yxR wwW

wwWwwH

OO

OI= (3.8)

Donde

),( yxFF wwWOI : es la correlación entre la señal de entrada y la repuesta deseada ( Figura 3-

31)

),( yxFF wwWOO : Autocorrelación de la entrada

En el caso de existir ruido de tipo aditivo ( Figura 3-31) entonces ),( yxFF wwWOI y

),( yxFF wwWOO se sustituyen por las ecuaciones 3.9 y la ecuación 3.10 respectivamente en la

ecuación 3.11.

),(),(),( *yxFyxDyxFF wwWwwHwwW

IOI= (3.9)

),(),(),(),(2

yxNyxFyxDyxFF wwWwwWwwHwwWIOO

+= (3.10)

),(),(),(

),(),(),( 2

*

yxNyxFyxD

yxFyxDyxR

wwWwwWwwH

wwWwwHwwH

I

I

+=

(3.11)

Filtro Lucy-Richardson: En el presente estudio se utilizó el algoritmo de Lucy-

Richardson, debido a que genera excelentes resultados en el procesamiento de CP. Ellos

reportan [6] reportan resultados que se adquieren aplicando métodos probabilísticos de

restauración de imágenes degradadas por altos niveles de ruido. En el desarrollo de la técnica

se asume que la degradación de una imagen H es de la forma SWH *= , donde W es la

61


imagen original, S es la función de dispersión puntual (PSF) y * denota la operación de

convolución (Figura 3-32). Se considera que W , S y H son una medida de la frecuencia

de ocurrencias de un evento en un punto dado.

Figura 3-32. Degradación espacial de una imagen

Dada la imagen degradada H, la función de dispersión de puntos S, y el requerimiento de

conseguir la imagen original W, se puede recurrir al teorema de Bayes. Dicho teorema

establece la probabilidad condicional del evento iW dado el evento kW y se puede estimar

de acuerdo a la ecuación 3.12.

KkJjIiWPW

HP

WPWHP

WiP

ji

i

k

ii

k

..1,..1,..1)()(

)()()( ====

∑

(3.12)

Donde:

iH : Es la i-esimo pixel de H

iW : Es la i-esimo pixel de W

Considerando todos los iH y su dependencia con respecto a iW según S , se puede

escribir.

∑ ∑==k

kk

ikii HPH

WPHWPWP )()()()(

(3.13)

62


Como se cumple P (W Hk) = P (WiHk)/1P (Hk). Es posible obtener

∑∑

=k

jj

j

k

kii

k

i

WPWHP

HPWPWHP

WP)()(

)()()()(

(3.14)

En la ecuación 3.14 )( iWP es considerada la solución, pero en muchas aplicaciones del

teorema de Bayes el término no es conocido, por eso es necesaria la utilización de iteraciones

para estimar el valor )( iWP .

{ },....1,0;)Pr()(

)()()()()(1 == ∑

∑+ r

WWHP

HPWPWHP

WPWPk

jj

j

k

kii

k

irir

(3.15)

La ecuación 3.15 es un procedimiento iterativo (r), inicializando )(0 iWP . La inicialización

se puede realizar considerando una distribución de probabilidad uniforme.

3.2.3 Relación Señal a Ruido de Pico

La Relación Señal a Ruido de Pico (PSNR: Peak Signal-to-Noise Ratio) es un término

utilizado en ingeniería para definir la relación entre la máxima energía posible de una señal y

el ruido que afecta a su representación fidedigna. Debido a que muchas señales tienen un gran

rango dinámico, el PSNR se expresa generalmente en escala logarítmica, utilizando como

unidad el decibelio (dB). Para definir PSNR se hace indispensable la formulación del error

cuadrático medio representado en la ecuación 3.16, que para dos imágenes ),( yxI y

),( yxK de tamaño ][ NM se define el PSNR de acuerdo a la ecuación 3.17.21

0

1

0

1 ),(),(∑∑−

=

−

=−=

M

i

N

jMN jiKjiIMSE

(3.16)

63

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Error_cuadr%C3%A1tico_medio&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Error_cuadr%C3%A1tico_medio&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Decibelio

http://es.wikipedia.org/wiki/Rango_din%C3%A1mico


El PSNR se define en la ecuación 3.17 como:

−=MSE

PSNRB 12

log*20 10 (3.17)

B : Número de bits de profundidad en la representación de la imagen

El uso del PSNR en este contexto es una medida cuantitativa de la calidad de una imagen

( ),( yxI ) que al aplicarle una convolución con una PSF, genera una nueva imagen (

),( yxg ). La PSF ( ),( yxh ) se representa por una gaussiana, con un tamaño de ventana

de vecindad y varianza conocidas.

A partir de la imagen ),( yxg se debe obtener una imagen ),(ˆ yxI muy aproximada a

),( yxI . Para lograr esto se realiza una deconvolución de ),( yxg con una PSF ( ),( yxh )

de tipo gaussiana. Por lo tanto al calcular los PSNR, se genera una gráfica modificando la

varianza y asumiendo una vecindad constante. En la gráfica el pico más alto, representa el

indicador del valor óptimo de varianza ya que es donde se logrará una mejor imagen ),(ˆ yxI

. El cálculo del PSNR, se aplicará a la imagen de referencia con las diferentes técnicas de

deconvolución.

3.3. Resultados

3.3.1 Validación de los algoritmos de restauración

Antes de analizar los resultados obtenidos correspondientes a la restauración de las

imágenes de CP por deconvolución se realizó una validación de la implementación de los

algoritmos, basada en la imagen de Lena (Figura 3-34a) distorsionada con un núcleo

gaussiano. El objetivo es procesar la imagen distorsionada de Lena (Figura 3-34b) (que

emularía la imagen adquirida en un microscopio), que al aplicarle los métodos numéricos de

deconvolución y luego estimar el PSNR permite estimar la imagen de Lena restaurada optima.

El procedimiento utilizado se muestra en la Figura 3-33, donde la imagen ),( yxf

convolucionada con la función gaussiana ),( yxh con una vecindad cuadrada NxN de

64


1515 x y varianza 5,2=σ permite generar la imagen ),( yxg , que representa la imagen

distorsionada. Dicha imagen es procesada mediante filtros de deconvolución que consideran

como información a priori diferentes núcleos PSF gausianos ),( yxhi , obtenidos al

considerar diferentes valores para la varianza iσ . El tamaño del PSF es de 1515 x . Luego de

aplicar el filtro de deconvolución se obtiene la imagen estimada ),(ˆ yxf i . Posteriormente

dicha imagen estimada se compara con la imagen original al calcular el valor de la relación

señal ruido PSNR de pico expresada en decibeles. El proceso se repite para otro valor iσ de

la PSNR considerada a priori para modelar la distorsión. De esta manera es posible generar

una grafica del PSNR en función de iσ , donde el máximo valor de la curva indicara el

),( yxf i más parecido a ),( yxf que debería ocurrir para 5,2=σ .

Figura 3-33. Diagrama del test de deconvolución

Aplicando el filtro de regularización a la imagen de Lena, se observa un desenfoque a

pesar de que se utilizó el valor óptimo de 5,2=iσ (Ver Figura 3-34d), que se muestra en el

65


cálculo del PSNR (Figura 3-34c), esto indica que cualquier otro valor de iσ presenta una

imagen con un desenfoque mayor.

Figura 3-34. (a) Imagen de Lena (b) Imagen convolucionada con una gaussiana 5,2=σ (c) Cálculo del PSNR óptimo aplicando el filtro de regularización (d) Imagen restaurada con el filtro de regularización

En la Figura 3-35 se muestran los resultados obtenidos al realizar la restauración usando el

filtro de Wiener. En este caso, (Figura 3-35b) la imagen restaurada muestra menos

desenfoque que el obtenido con el filtro de regularización. Es decir, se logra un mejor realce

de la imagen (Figura 3-35d). De la misma manera que en el caso anterior se logra un PSNR

óptimo, cuando el PSF a priori tiene 5,2=iσ .

66


Figura 3-35. (a) Imagen de Lena. (b) Imagen convolucionada con una gaussiana 5,2=σ (c) Cálculo del PSNR óptimo aplicando el filtro de Wiener (d) Imagen restaurada con el filtro de Wiener

Los resultados obtenidos al realizar la restauración de la imagen con el algoritmo de Lucy-

Richardson se muestran en la Figura 3-36b. En este caso se logran los mejores resultados en

cuanto a la restauración. Esto se deduce por el hecho que el PSNR máximo es más elevado

que para los filtros considerados previamente.

67


Figura 3-36. (a) Imagen de Lena. (b) Imagen convolucionada con una gaussiana 5,2=σ (c) Cálculo del PSNR óptimo aplicando el filtro de Lucy-Richardson (d) Imagen restaurada con el filtro de Lucy-Richardson.

3.3.2 Restauración de Imágenes de Células de Purkinje

En la restauración de imágenes de CP, se buscó una PSF utilizando la función gaussiana

ya que modela la distorsión en las imágenes de CP, donde los parámetros de la función son el

tamaño de la vecindad y la varianza, para encontrar el valor óptimo de los parámetros se

utilizó una vecindad de tamaño NxN y varianza (σ) . La PSF se utiliza en la deconvolución

de las imágenes de CP (Figura 3-37, Figura 3-38 ,Figura 3-39) para atenuar el ruido y realzar

68


los bordes de las espinas dendríticas de CP manteniéndose inalteradas algunas estructuras de

la imagen. Se emplearon vecindades cuadradas de orden impar utilizando una metodología

heurística, es decir, se ensayo con vecindades de tamaño 3x3, 5x5, 7x7… 25x25 y en cada

una de ellas se varió la varianza dentro del intervalo (0≤σ≤10, incrementando σ en 0,5),

permitiendo así observar el realce en la imagen de CP en cada ajuste de la vecindad e

intervalo. Estos ensayos permitieron encontrar el PSF adecuado. Inmediatamente se aplicó

un realce logarítmico ver ecuación 3.18, donde a las imágenes originales de CP, y las

imágenes de CP obtenidas en la deconvolución se ajustan los pixeles hacia una curva

logarítmica, permitiendo así mejorar imágenes demasiado oscuras.

)1),((log),( += yxfNyxg (3.18)

N : Factor de escala fija el máximo nivel de salida

En la Figura 3-37, se observan los resultados de la restauración de las CP utilizando el

filtro de regularización y una PSF con una ventana de 15x15 y σ=2,5. En la Figura 3-37b se

muestra que se produce un realce en el árbol dendrítico y se resaltan las espinas, también se

logra atenuar el ruido que contiene la imagen de CP original (Figura 3-37a), lo cual facilitaría

la cuantificación de las espinas dendríticas que se aprecian en la Figura 3.10b.

Se aplica realce logarítmico a las imagen de CP Figura 3-37a y Figura 3-37b generando su

respectivo resultado en las Figura 3-37c y Figura 3-37d, observándose en las imágenes que se

logra un realce de la estructura del árbol dendrítico de CP, pero no un realce de los bordes de

las espinas dendríticas.

Utilizando el filtro de Wiener, se observa en la imagen de CP (Figura 3-38a), que la imagen

resultante es suavizada (Figura 3-38b) y la restauración no es adecuada para realizar la

cuantificación de las espinas de CP, la distorsión en la imagen se modela utilizando una PSF

con una ventana de 15x15 y σ=2,5.

Como se observa en la Figura 3-37c y Figura 3-37d, obtenidas por un realce logarítmico de

las imágenes de las Figura 3-37a y Figura 3-37b donde se elimina gran cantidad de ruido pero

no se realzan las espinas dendríticas de CP.

69


Figura 3-37. (a) Imagen CP sin preprocesamiento (b) Imagen CP aplicando el algoritmo de regulación con una ventana de 15x15 y varianza 2,5 (c) Imagen original aplicando realce logarítmico (d) Imagen de CP

obtenida por regulación e inmediatamente se le aplica un realce logarítmico

70


Figura 3-38. (a) Imagen CP sin preprocesamiento. (b) Imagen CP aplicando el algoritmo de Wiener con una ventana de 17x17 y varianza 0,5 (c) Imagen original de CP aplicando realce logarítmico (d) Imagen de CP

obtenida por Wiener y se le aplica un realce logarítmico

En la Figura 3-39a se muestra la imagen de CP y en la Figura 3-39b el resultado del

proceso de restauración utilizando el algoritmo de Lucy-Richardson, observándose que se

logra una excelente restauración de las espinas dendríticas en la imagen de CP (ver Figura 3-

39b), lo cual facilitaría la cuantificación de las espinas dendríticas. En este caso la PSF que

modela la distorsión se considera como una función gaussiana de tamaño 17x17 y con una

varianza 5. Luego se aplica un realce logarítmico sobre las imágenes de CP Figura 3-39a y

Figura 3-39b presentándose los resultados en las Figura 3-39c y Figura 3-39d obteniéndose

un mejor realce en las imágenes de CP.

71


Figura 3-39. (a) Imagen CP sin preprocesamiento. (b) Imagen CP aplicando el algoritmo de Lucy-Richardson, con una ventana de 17x17 y varianza 5 (c) Imagen original de CP aplicando realce logarítmico (d)

Imagen de CP obtenida por Lucy-Richardson y se le aplica un realce logarítmico

3.4. Conclusiones

El método numérico iterativo de deconvolución, que genero mejores resultados fue el

algoritmo de Lucy-Richardson. De lo descrito anteriormente, se puede intuir que los

instrumentos ópticos, durante los procesos de adquisición (convolución) de la imagen,

producen ligeras desviaciones en la trayectoria de los fotones, lo que se traduce en

aberraciones de la imagen, de modo que ésta nunca es una copia exacta de lo real. Sin

72


embargo, mediante la utilización de algoritmos de restauración iterativos es posible lograr un

buen realce de la imagen, lo cual permitirá facilitar la cuantificación de las espinas dendríticas.

Las imágenes obtenidas se utilizarán en el siguiente capítulo para determinar el número de

espinas presentes en las dendritas de CP, utilizando para ello alguna técnica de aprendizaje

supervisado.

73


4. Capítulo IV

4. HERRAMIENTA DE CLASIFICACIÓN APLICADA A

IMÁGENES DE CÉLULAS DE PURKINJE

4.1. Introducción

El conteo de espinas en las células de Purkinje (CP) constituye un problema de gran

interés para el Centro de Microscopía Electrónica “Ernesto Palacios Prü”, justificado por la

diversidad de enfermedades que pueden afectar tanto la estructura como la funcionalidad del

cerebelo. Este órgano posee como neuronas principales las CP, que son estructuras

encargadas de recibir, modular y transmitir toda la información, que se procesa en la corteza

cerebelosa, a través de las sinapsis que establecen por medio de las espinas dendríticas. Este

tipo de espinas son estructuras especializadas a las cuales se les ha dedicado particular

atención debido a que su aspecto morfológico, su número y su distribución espacial,

representan la expresión anatómica del funcionamiento del cerebelo. Entre las manifestaciones

patológicas cerebelosas, más comunes, se encuentran la disimetría, la ataxia de la marcha, la

hipotonía muscular; mientras que las menos frecuentes son la degeneración cerebelosa,

neoplasias, atrofias del cerebelo, dificultades para el aprendizaje no verbal, degeneraciones

espinocerebelosas y el síndrome hidrocefálico, que es una anomalía congénita del cerebelo

debida a una expansión quística del cuarto ventrículo hacia el cerebelo. El número de espinas

y el crecimiento dendrítico son dos variables dinámicas, expresión de la plasticidad del

sistema nervioso, que van modificándose durante el proceso de desarrollo y maduración de los

vertebrados. De allí la importancia de conocer los patrones normales propios de cada una de

las etapas de desarrollo, para poder determinar cualquier alteración que en la práctica se

traduce en manifestaciones clínicas y patológicas [6]. En los estudios que se realizan en el

referido Centro, es importante disponer de la información relativa al número de espinas

74


dendríticas en CP, ya que dicha información permite expresar las condiciones funcionales del

cerebelo y, por tanto, del individuo.

El procesamiento de imágenes y el desarrollo de técnicas automatizadas de clasificación

son herramientas que podrían resultar útiles para la cuantificación de las imágenes de células

de Purkinje. Algunas de las investigaciones relacionadas con estas herramientas se presentan a

continuación.

Vera y otros [6], desarrollan una técnica para la detección automática del corazón a partir

de imágenes de Tomografía Multi-corte (MSCT), la técnica implementada consta de dos

etapas. En la primera se detectó automáticamente un conjunto de marcadores anatómicos

sobre el borde del corazón, empleando una máquina de soporte vectorial de mínimos

cuadrados entrenada usando patrones de tamaño 31x31, asociados tanto a los Marcadores

como a otras estructuras presentes en las imágenes de MSCT, denominadas No Marcadores.

Mediante el entrenamiento se construyó una superficie de decisión que permitió clasificar los

patrones de entrada como Marcadores y No Marcadores. Durante el proceso de detección se

obtiene un 95,84% de reconocimiento. Los marcadores detectados fueron ubicados mediante

sus respectivas coordenadas sobre la imagen. Tales coordenadas fueron utilizadas para obtener

mediante B-splines un conjunto de contornos que modelan el corazón. Durante la segunda

etapa, se implementó un algoritmo de triangulación, el cual permitió generar una superficie en

3-D a partir de los contornos proporcionados la cual es desplegada utilizando algoritmos de

rendering de superficie.

García y otros [6], presentan una herramienta de diagnóstico histológico en los tumores de

partes blandas el cual resulta útil como fase previa al abordaje terapéutico de estas lesiones.

Las técnicas de reconocimiento de patrones pueden ser una herramienta muy útil tanto en el

diagnóstico como en la extracción de la información relevante, utilizando imágenes de RM

(Resonancia Magnética) y datos epidemiológicos. Se han obtenido muy buenos resultados, por

encima del 90% de acierto, al discriminar entre estirpes utilizando técnicas de clasificación,

tales como: clasificadores de distancia (los k vecinos), Clasificadores paramétricos (Bernoulli,

gaussiana y multinomial), Árboles de decisión y Funciones discriminantes lineales (máquinas

de soporte vectorial). La exactitud al diferenciar entre una estirpe y las demás ha sido también

75


muy elevada. Estos resultados, junto con información sobre benignidad/malignidad con

modelos previamente descritos, proporcionan clasificadores a integrar en una herramienta

médica de apoyo al diagnóstico de los tumores de partes blandas.

González y otros [6], proponen la utilización de descriptores de textura conocidos en la

clasificación de células espermáticas en función de la distribución intracelular que presentan.

Se emplean estadísticos de segundo orden derivados de la matriz de co-ocurrencia y se

comparan los resultados con los obtenidos utilizando características geométricas. El

clasificador utilizado es el de k vecinos más próximos. Los resultados indican que los

descriptores derivados de la matriz de co-ocurrencia clasifican este tipo de imágenes con un

error menor que los derivados de las características geométricas.

Huang y otros [6], presentan un método para la clasificación del carcinoma próstatico en

imágenes patológicas. Dado que la clasificación realizada en forma manual es subjetiva y

lenta, este trabajo presenta un sistema automatizado para clasificar imágenes patológicas

según el grado de acuerdo al sistema de clasificación de Gleason, que es el método más

utilizado para la clasificación histológica de los tejidos finos de próstata. Los autores proponen

dos métodos de extracción de características basadas en la dimensión fractal para analizar las

variaciones de la intensidad y la complejidad de la textura en las regiones de interés. Cada

imagen se puede clasificar en un grado apropiado de la escala de Gleason, utilizando Técnicas

bayesianas, redes neurales y máquinas soporte vectorial (SVM). Los resultados experimentales

demuestran que el 91,2%, 93,7%, y el 93,7% de Tasas Correctas de Clasificación (CCR) se

puede alcanzar por métodos Bayesiano, redes neurales y clasificadores SVM, respectivamente,

para un conjunto de 205 imágenes patológicas de la próstata. Si el sistema de base fractal de

características es optimizado la selección del CCR se puede mejorar hasta 94.6%, 94.2%, y

94.6%, respectivamente, usando cada uno de los tres clasificadores antes dichos. Los

resultados experimentales demuestran que el sistema de característica es mejor que los

sistemas de característica extraídos de multi-wavelets, filtro Gabor y los métodos de matriz de

la co-ocurrencia del nivel de gris.

En el procesamiento de las imágenes que contienen las CP, se utilizaron técnicas de

deconvolución, como se explicó en el capítulo III, obteniéndose así un realce de las espinas

dendríticas de las CP, que permitió implementar un modelo, basado en máquinas de soporte

76


vectorial de mínimos cuadrados [6], para la clasificación de las espinas dendríticas de CP.

Para ello, se realizó una revisión del estado del arte acerca de las Máquinas de Soporte

Vectorial de Mínimos Cuadrados, su idea original, sus extensiones propuestas, sus algoritmos

de entrenamiento y su aplicación a la clasificación de imágenes.


Para desarrollar el presente trabajo, se utilizó un procedimiento de clasificación automático

estructurado en dos etapas denominadas entrenamiento y detección. En primera instancia, se

implementó la etapa de entrenamiento. Durante esta etapa, a partir de características

especificas de datos etiquetados, obtenidos de un conjunto de imágenes de entrenamiento, se

generó una superficie de decisión que asigna etiquetas a la información contenida en cualquier

imagen de entrenamiento y por ende permite clasificar los objetos presentes en ella. Luego, se

implementó la etapa de detección, mediante la cual se asigna una etiqueta a cada uno de los

objetos presentes en imágenes no utilizadas durante la fase de entrenamiento.

La clasificación fue aplicada a una base de datos que consta de 25 imágenes (1024x1024

a 8 bits de profundidad en niveles de gris) de CP, que se pre-procesaron con el algoritmo de

deconvolución de Lucy-Richardson y realce logarítmico para realzar las espinas dendríticas y

así poder utilizar las herramientas de clasificación como lo son las máquinas de soporte

vectorial. Los resultados se presentan en la sección 4.2.3.2. Antes de aplicar las herramientas

de clasificación en CP, se realizaron validaciones de la técnica de reconocimiento con un

conjunto de imágenes sintéticas, que contienen formas conocidas para su identificación y

clasificación. Los resultados de esta validación se presentan en la sección 4.2.3.1.

4.2.1 Máquina de soporte vectorial (SVM)

Las SVM fueron desarrolladas por Vapnik [42] y constituyen un conjunto de algoritmos de

aprendizaje de tipo supervisado. Para resolver un problema de clasificación las SVM deben

77

http://es.wikipedia.org/wiki/Etiqueta_(metadato)


generar una superficie de decisión adecuada, basándose en el conjunto de datos de

entrenamiento. Para el caso especifico de máquinas de aprendizaje binarias, la superficie de

decisión es un hiperplano que separa los patrones de entrenamiento en dos clases. (Figura 4-

40).

Figura 4-40. Hiperplano de separación optimo W.x+b

En la Figura 4-40 se dispone de un conjunto de N datos de entrenamiento llamados

patrones, de la forma nNNN Rxyxyx ∈),,(...,),,( 11 , cada escalar iy (etiqueta) se

identifica con { }1± , llamándose así vector de etiquetas y ( )Nyyy ...,, 21= .

Problemas linealmente separables: existen muchos hiperplanos que pueden clasificar los

datos pero las máquinas no hallan uno cualquiera de estos hiperplanos, sino el único que

maximiza la distancia entre el hiperplano y el dato más cercano de cada clase, esta distancia

es llamada margen y el hiperplano que la maximiza se le llama el mejor hiperplano separador

(hiperplano de máximo margen). El hiperplano separador esta dado por la ecuación.

).( xW 0=+b ∈xW , RbR n ∈,

(4.1)

78


El trabajo consiste en hallar el vector W de pesos que contiene la ponderación de cada

atributo, indicando que tanto aporta en el proceso de clasificación, en tanto que b define el

umbral de decisión. Para encontrar el hiperplano optimo se utiliza una función (d)

discriminante de distancia

Wx+b

WW, = W.W

d b)=(x,W,

(4.2)

Donde W es la norma asociada al producto escalar en nR . Como se trata de patrones

linealmente separables, se puede re-escalar W y b , resultando la ecuación

d b)=(x,W,1

WWx +i b =1

(4.3)

Así se obtiene el hiperplano de máximo margen canónico en el cual los patrones de

entrenamiento más cercanos al plano tienen distancia normalizada (d ,,Wx 1) =b y los

demás patrones distancia (d ,,Wx 1) ≥b . Hallar el mejor hiperplano separador es un

clásico problema de maximización con restricciones de la ecuación 4.3, el cual se puede

transformar en un problema más sencillo utilizando el principio de dualidad, quedando como

W

2min (4.4)

Sujeto a:

y Wx +i i b >1, i=1...N

Clasificadores no lineales mediante kernel: se utilizan cuando no existe una superficie

lineal de decisión que separe los datos, en el espacio de entrada, se considera la

correspondencia del vector de entrada W a un espacio de mayor dimensión cR llamado

espacio característico φ, que este dotado de producto escalar (Figura 4-41). Eligiendo el

espacio φ apropiado, se realiza la correspondencia y se busca el hiperplano separador

optimo siguiendo la mecánica expuesta en la clasificación lineal, ya que será lineal en cR ,

pero representa un hiperplano no lineal en el espacio de entrada nR

79


Figura 4-41. La idea de la SVM es establecer una correspondencia de los datos de entrenamiento en un espacio característico de dimensión superior utilizando φ y así, poder construir un hiperplano que separe las clases con

un margen máximo

Existe una variante de las SVM, denominada máquina de soporte vectorial de mínimos

cuadrados (LSSVM). Las SVM han sido ampliamente utilizadas en la clasificación y la

estimación de la función no lineal. Sin embargo, el principal inconveniente de la SVM es su

mayor carga de cálculo para la programación de optimización con restricciones. La razón

principal para elegir trabajar con LSSVM en lugar de SVM es que las SVM abordan el

problema de clasificación resolviendo un sistema de inecuaciones; mientras que las LSSVM

resuelven un sistema equivalente de ecuaciones pero en un tiempo, considerablemente, menor

comparado con el empleado por las SVM.

4.2.2 Máquina de soporte vectorial de mínimos cuadrados

(LSSVM) aplicados a imágenes de CP

Con el propósito de realizar la detección automática de las espinas dendríticas de CP en

imágenes obtenidas por MLRD bajo igual condición y luego preprocesadas con una técnica

iterativa de deconvolución (ver capítulo III), se construyó un clasificador LSSVM con kernel

gaussiano de base radial, utilizando un toolbox en MatLab (LS-SVMlab v1.7) [6]. Debido

a la capacidad de generalización que poseen las LSSVM y a fin de minimizar el

80

http://www.esat.kuleuven.be/sista/lssvmlab/toolbox.html


preprocesamiento de las imágenes de entrada, el clasificador solo utilizó, como atributo,

información de la densitometría (niveles de gris), de las espinas dendríticas de CP.

En el estudio se consideraron un total de 25 imágenes (512x512 y 8 bits de profundidad) de

CP, que se dividieron en dos grupos. El primer grupo se constituyó por 15 imágenes,

denominado conjunto de entrenamiento, del cual se seleccionan los Marcadores y de una de

las imágenes se seleccionan los No Marcadores. Un segundo grupo de 10 imágenes,

denominado conjunto de validación, se utilizó para realizar la identificación de espinas

dendríticas, de las cuales la máquina no tiene una información exacta, solo que provienen de

la misma base de datos.

4.2.2.1 Selección de Marcadores

En este sentido, para detectar los marcadores, se utilizó un conjunto de vecindades

circulares de radio 10 pixeles, contentivos de los niveles de gris de las estructuras que

representan espinas dendríticas (Marcadores), esta vecindad permite incluir dentro del

circulo una espina dendrítica de CP (Figura 4-42). Los Marcadores fueron eliminados de

las imágenes (Figura 4-43) de CP, generando así nuevas imágenes donde no están incluidos

los Marcadores, y una de estas nuevas imágenes será utilizada en la selección de los No

Marcadores.

El número de Marcadores es de 825 vecindades que contienen las espinas dendríticas,

siendo el número total de espinas dendríticas que el experto estableció, de forma manual, en

las 15 imágenes de CP que son las imágenes que corresponden al grupo de entrenamiento.

81


Figura 4-42. Imagen de CP selección de Marcadores

4.2.2.2 Selección de No Marcadores

Para seleccionar los No Marcadores, se utilizó un conjunto de vecindades de igual

tamaño que las vecindades de los Marcadores. La imagen que se utilizó en la selección de

los No Marcadores fue una de las que se generaron en la extracción de los Marcadores, es

decir, los No Marcadores son vecindades del fondo de la imagen y todo aquello que no se

detecte como una espina dendrítica. Al desplazar una vecindad de radio 10 pixeles, sobre la

imagen, se obtiene un total de 242064 vecindades de No Marcadores en la imagen de CP.

Figura 4-43. Imagen de CP utilizada para la selección de No Marcadores

82


4.2.2.3 Entrenamiento de la LSSVM

Para el entrenamiento de las LSSVM, se cuenta con dos conjuntos de vecindades formados

por Marcadores (825 vecindades) y No Marcadores (242064 vecindades), ahora se debe

vectorizar las vecindades para lo cual se recorre el área de la vecindad pixel a pixel y se

almacena en un vector, generando para cada vecindad un vector de 317 componentes.

Obteniéndose para los Marcadores 825 vectores o patrones con 317 componentes cada uno y

para los No Marcadores se obtienen 242064 vectores o patrones con 317 componentes. Cada

uno de los vectores, tanto Marcadores como No marcadores, se deben normalizar para ser

procesados en la LSSVM, la normalización consiste en dividir cada vector por el valor de

profundidad del nivel de bits en la imagen, en este caso de dividió por 255 debido que las

imágenes tienen 8 bits de profundidad. A continuación se define una relación numérica de

proporción entre Marcadores y No Marcadores, considerándose que entre más grande sea la

proporción mejores resultados se obtiene en la LSSVM pero el costo computacional es muy

elevado. En este estudio se consideró una relación de 1:15, esto quiere decir que por cada

Marcador se debe seleccionar 15 No Marcadores. Como se puede observar el conjunto de

vectores Marcadores se utilizan todos, pero en el caso de los No Marcadores se debe

seleccionar un grupo (825*15=12375) de 12375 vectores No Marcadores de un total de

242064 vectores No Marcadores. La selección de los No Marcadores, se realizó en forma

aleatoria, extrayendo cada vector No Marcador sin remplazo para así evitar que se repitieran

los vectores hasta obtener 12375 vectores. Seguidamente se asigna a los vectores Marcadores

la clase -1 y a los vectores No Marcadores la Clase +1 y se ordenan según se muestra en la

Figura 4-44.

83


Figura 4-44. Muestra la organización de los patrones de entrenamiento de entrada de la LSSVM donde X es una matriz de 13200x317 e Y es una matriz de tamaño 13200x1

El proceso de entrenamiento de la LSVM tiene como objetivo construir una superficie de

decisión que permite la clasificación de los patrones de entrada como lo son los Marcadores

y No Marcadores, utilizando un kernel gaussiano y los hiperparametros sigma y gamma que

son asignados de forma heurística hasta lograr un entrenamiento adecuado que clasifica los

patrones. Donde sigma es la varianza del kernel gaussiano y gamma es un parámetro de

regularización. En este caso, un gamma pequeño minimiza la complejidad del modelo de lo

contrario aumenta la complejidad. En la estimación de los valores óptimos de los

hiperparametros sigma y gamma de la LSSVM, se utiliza un método heurístico, que consiste

en definir un conjunto de valores para gamma y sigma (Figura 4-45), donde cada valor de

gamma se combina con cada uno de los valores de sigma y se procesa en el test de

entrenamiento de la LSSVM. Para verificar la efectividad de la máquina, las salidas de los

Marcadores (-1) debe ser tal que su posiciones deben coincidir con las posiciones en la

imagen de entrenamiento, en donde se han seleccionado los marcadores. La forma visual que

se utiliza es imprimiendo sobre la imagen los resultados de la LSSVM, que deben coincidir

84


con los marcadores seleccionados manualmente. En caso de no coincidir, se debe seleccionar

un nuevo valor de gamma y combinarlo con los valores de sigma hasta lograr hacer coincidir

la selección de los marcadores en el test de entrenamiento con las etiquetas que produce la

máquina.

Figura 4-45. Estimación de los valores óptimos de los hiperparámetros sigma y gamma

En el test de entrenamiento de la LSSVM se utilizó una instrucción de Matlab con sus

respectivos parámetros para entrenar la máquina

[W, ]= ({X,Y,` })b trainlssvm classification`,gamma,sigma,`RBF_kernel` donde X son datos

de entrada, Y las clases, ‘classification’ es el procedimiento a aplicar a los patrones, gamma

es el valor de regularización, sigma es la varianza, 'RBF_kernel' permite procesar la data en

otro espacio, W vectores soporte, b umbral.

Después del entrenamiento se realiza una simulación colocando como datos de entrada los

mismos datos que se utilizaron en el entrenamiento en la instrucción de Matlab simlssvm que

permite realizar la simulación.

Ytest= ({X,Y,` })simlssvm classif ication`,gamma,sigma,`RBF_kernel`, `preprocess`, { ,b},W X luego se

85


verifican las posiciones de los índices de las clases -1 en el vector Ytest, con respecto a la

posición en el vector Y. Estas posiciones deben coincidir si la máquina opera con los

parámetros (gamma y sigma) correctos. En caso que no coincidan los vectores se deben variar

los parámetros sigma y gamma. Si al realizar el entrenamiento variando de forma heurística

sigma y gamma no se logran hacer coincidir los índices, se debe aplicar el procedimiento

denominado bootstrapping. Dicha procedimiento consiste en agregar la vecindad clasificada

erróneamente a su respectiva clase y entrenar nuevamente la LSSVM.

4.2.2.4 Validación de la LSSVM

Como se indicó al inicio de la sección 4.2.2 la data en estudio de imágenes de CP está

constituida por dos grupos uno de entrenamiento (15 imágenes de CP) y otro de validación

(10 Imágenes de CP) en esta sección se hará uso del grupo de validación. En la

implementación de la validación se emplea una instrucción de Matlab simlssvm. De acuerdo

con los datos de entrada, salida y los parámetros de la función de entrenamiento, se realiza la

validación, la función usada es

Y s im u = ( {X ,Y ,` } )s im ls s v m c la s s i f ic a t io n ` , g a m m a , s ig m a ,`R B F _ k e r n e l` , ` p r e p ro c e s s ` , { , b } ,W VA L donde

X son los patrones de entrenamiento, Y las clases, ‘classification’ es el procedimiento a

aplicar a los patrones, gamma es el valor de regularización, sigma es la varianza, kernel

permite procesar la data en otro espacio, W vectores soporte, b umbral, ’preprocess’ indica

que los datos han sido normalizados y VAL que es la imagen de validación vectorizada tal

como se explica a continuación

Vectorización de la imagen: La vectorización de las imágenes de validación de CP

implica realizar el siguiente procedimiento. Sobre la imagen se debe pasar una vecindad de

igual tamaño como la utilizada en la etapa de entrenamiento de radio 10 pixeles, generando

un total de 242064 vecindades. Cada una de estas vecindades debe ser vectorizada

recorriendo la imagen pixel a pixel y almacenando cada pixel perteneciente a la vecindad

como una componente de un vector, es decir, cada vecindad genera un vector de 317

componentes. De igual modo, se almacenan las coordenadas del centro de cada vecindad en

un vector de dos componentes a objeto de establecer la ubicación espacial de cada vector. Por

86


lo tanto, la VAL estará definida como una matriz de 242064x317, representando una imagen

vectorizada donde las filas serán identificadas por la máquina como un Marcador o un No

Marcador permitiendo la validación de la LSSVM. Los resultados que genera la LSSVM es

un vector de 242064 x1 donde aquellas componentes igual a -1, se consideran Marcadores y

se podrán ubicar sobre la imagen original porque se tienen los valores de las coordenadas del

centro de cada vecindad tal como se muestra en la Figura 4-46.

Figura 4-46. Ubicación de los marcadores sobre la imagen

4.2.2.5 Prueba de desempeño de la LSSVM en imágenes de CP

Para valorizar el desempeño del proceso de detección realizado por la LSSVM, se llevó a

cabo la prueba de la estimación de la sensibilidad. Cuando se analiza, en una imagen de CP, la

presencia de espinas dendríticas, se hace uso de una prueba de desempeño para determinar si

una imagen de CP presenta espinas dendríticas (positivos) o no la poseen (negativos), sin

87

http://www.monografias.com/trabajos/explodemo/explodemo.shtml


embargo, es muy poco probable que la prueba funcione de manera perfecta en todas las

circunstancias, por ello existe la posibilidad de que en algunas imágenes de CP se detecten

estructuras que no son espinas dendríticas y se clasifiquen como positivo, ellas serán

consideradas como falsos positivos (FP), otra posibilidad es que algunas imágenes de CP

tengan espinas dendríticas y las mismas no sean detectadas como tales. En ese caso, se

denominan falsos negativos (FN) y por último se tiene el caso en que se detecte la estructura

de una espina dendrítica de CP que es verdaderamente una espina dendrítica esto se define

como verdadero positivo (VP) . Para cuantificar el desempeño de la máquina se definen los

siguientes índices:

Sensibilidad: Es la probabilidad de clasificar correctamente espinas en cada imagen de

validación que procese la LSSVM. La sensibilidad se calcula de acuerdo a la siguiente

ecuación.

100*FNVP

VPadSensibilid

+=

(4.11)

Donde:

VP: Verdaderos positivos

FN: Falsos negativos

.4.2.3 Resultados

88


.4.2.3.1. Máquina de soporte vectorial de mínimos cuadrados aplicados

a imágenes sintéticas

En la validación de la técnica de la LSSVM se utilizó un conjunto de imágenes sintéticas

de 256x256 y 8 bits de profundidad. En el desarrollo de los ensayos con las imágenes

sintéticas se siguió el diagrama de la Figura 4-47, en el diagrama se inicia con un conjunto de

imágenes que permiten construir un grupo de imágenes de entrenamiento y un grupo de

imágenes de validación. Del grupo de imágenes de entrenamiento se seleccionarán los

Marcadores considerando una vecindad circular con 15 pixeles de radio. Adicionalmente

una de estas imágenes se utiliza para seleccionar los No Marcadores con una vecindad de

radio 15 pixeles. La cantidad de No Marcadores depende de la relación de trabajo elegida

entre los Marcadores y los No Marcadores. Es decir, por cada Marcador se tendrán 30 No

Marcadores. Continuando con el diagrama mostrado en la Figura 4-47, se construyen los

vectores de atributos vectorizando las vecindades de los Marcadores y No Marcadores, esta

vectorización consiste en recorrer cada pixel de la imagen con la vecindad de 15 pixeles de

radio e irlos agregando como componentes en un vector. En este caso, las componentes de los

vectores están definidas por la intensidad del gris de los elementos de la vecindad. Los

vectores de atributos serán los datos de entrada en la LSSVM, conjuntamente, con el valor de

las etiquetas -1 o +1 según sea un Marcador (-1) o No Marcador (+1) y unos hiperparámetros

denominados sigma y gamma, tal como se explicó anteriormente. Seguidamente se realiza el

proceso de test de entrenamiento o prueba, utilizando imágenes del grupo de entrenamiento,

de esta manera se puede determinar si existen falsos positivos o negativos. En caso de existir

falsos positivos o falsos negativos se deben variar los hiperparámetros para realizar un nuevo

entrenamiento de las LSSVM. Por último, se realiza el test de validación que consiste en

presentar una imagen vectorizada, a la entrada de la máquina para que realice la clasificación

y detectar marcadores en el caso de las imágenes sintéticas serian los signos (- ó +).

89


Figura 4-47. Diagrama del algoritmo de las LSSVM

90


4.2.3.1.1 Primer Ensayo

Se definió un conjunto de 9 imágenes sintéticas, que contienen distribuido la simbología

del signo (- ó + definidos como los Marcadores y los signos incompletos conjuntamente con

el fondo se definen como los No Marcadores). El ensayo tiene como objetivo clasificar

aquello que sea un signo (+ ó -) que serian los Marcadores de aquello que no es un signo

definiéndose como un No Marcadores. Del conjunto de imágenes sintéticas, se seleccionaron

cinco imágenes para el entrenamiento y el resto de imágenes se asignaron para la validación.

Entrenamiento: se seleccionaron los marcadores con una vecindad circular (Figura 4-48.b)

de radio 15 pixeles y luego de extraídos de la imagen, los espacios es rellenaron con un nivel

de gris (Figura 4-49), estas imágenes, posteriormente, se utilizarán para extraer los No

Marcadores de una de ellas, con una vecindad circular de radio 15 pixeles, para obtener un

total de 51076 vecindades. Para hacer la vectorización de los Marcadores como los No

Marcadores se recorre cada vecindad de radio 15 pixeles, y se coloca cada elemento de la

vecindad como una componente de un vector generando un vector de 709 componentes.

Figura 4-48. Imagen sintética de entrenamiento 256x256 pixeles y 8 bit de profundidad (a) imagen con los marcadores (b) se seleccionan los marcadores

91


Figura 4-49. Imagen sintética sin marcadores utilizada para extraer los No Marcadores

En el entrenamiento de la LSSVM se utilizó una relación de 1:30, los No Marcadores se

seleccionaron en forma aleatoria, sin reemplazo.

Este tipo de entrenamiento es supervisado por lo cual se tienen dos clases: clase -1 se

asigna a los patrones correspondientes a los Marcadores y la clase +1 a los No Marcadores.

Además, se utilizaron como valores de los hiperparámetros (gamma = 5 y sigma=0,01)

seleccionados heurísticamente como aquellos que permiten optimizar la capacidad de

reconocimiento.

Validación: Luego de entrenar las LSSVM, se realiza un test de validación, para lo cual,

se introducen imágenes del grupo de validación para realizar la clasificación, como se puede

observar en la Figura 4-50, estas imágenes tienen que ser vectorizadas para introducir a la

máquina, para ello se utiliza una vecindad de igual tamaño que la utilizada en los Marcadores

y No Marcadores que es desplazada sobre toda la imagen. Luego estas vecindades son

vectorizadas. Al realizar el test se observa qua la LSSVM, clasificó correctamente los signos

que se utilizaron como Marcadores.

92


Figura 4-50. Imágenes sintéticas de validación del clasificador LSSVM, (a) se encontraron 10 marcadores (b) se encontraron 14 marcadores

4.2.3.1.2 Segundo Ensayo

Se construyó un conjunto de 10 imágenes sintéticas que contienen letras distribuidas,

aleatoriamente, y a cada imagen se les agregó ruido gaussiano (sigma=0,04). Los Marcadores

se definen por las primeras cuatro letras (A, B, C, D) y el resto de las letras conjuntamente

con el fondo se consideraron como No Marcadores. Del conjunto de las 10 imágenes se realizó

una selección según su posición, par para el grupo de entrenamiento e impar grupo de

validación.

Entrenamiento: se seleccionan los Marcadores (A, B, C, D) en las diferentes posiciones de

las 5 imágenes y de una de ellas se seleccionan los No Marcadores, para así, realizar el

entrenamiento de la máquina hasta encontrar los valores óptimos de los hiperparámetros de la

LSSVM .

Validación: Son imágenes utilizadas para el test de validación de la LSSVM, dicha

validación consiste en encontrar los Marcadores en imágenes que provienen de la misma base

de datos y que no se han usado en el entrenamiento de la LSSVM.

93


a b

Figura 4-51 (a) Imagen de entrenamiento ( b) Imagen de validación

Tabla 4-1. Resultados aplicando la LSSVM a las imágenes de Entrenamiento

Imagen Marcadores Marcadores LSSVM

1 9 93 8 85 7 77 7 79 8 8

Tabla 4-2. Resultados aplicando la LSSVM a las imágenes de validación

Imagen Marcadores Marcadores LSSVM

2 8 64 11 116 8 88 6 610 3 3

Se puede observar, según los resultados obtenidos en las Tabla 4-1 y Tabla 4-2, que la

LSSVM reconoció los marcadores tanto en el grupo de imágenes de entrenamiento como en

el grupo de validación.

94


4.2.3.1.3 Tercer Ensayo

Consiste en generar una imagen asignándole niveles de grises diferentes al fondo de la

imagen (FI=128), elementos Marcadores (A=150, C=190, G=90, I=50, K=10) y elementos No

Marcadores (J=30, H=70, F=110, B=170, D=210) (ver Figura 4-52) para generar la imagen

sintética que se muestra en la Figura 4-53.

Figura 4-52. Representación del nivel de gris utilizado en los Marcadores, No Marcadores y fondo de la imagen

95


Figura 4-53. (a) Imagen sintética sin ruido (b) una de las imágenes sintética con ruido (SNR=37,63 dB), utilizadas en la prueba de desempeño de la LSSVM

Se tomo la Figura 4-53a, y se generaron 25 imágenes agregándole ruido de tipo gaussiano

(Figura 4-53b) con varianza igual a 0,0001 (SNR =37,63dB) e incrementándola para cada

nueva imagen en 0,0001, y se aplica en la imagen original, luego se definieron dos grupos uno

de entrenamiento y otro de validación. Del conjunto de las 25 imágenes se realizó una

selección según su posición, par para el grupo de entrenamiento e impar grupo de

validación.

Entrenamiento: el grupo está formado por 13 imágenes que se generaron y son utilizadas

para seleccionar los Marcadores de igual manera se empleó una de ellas para seleccionar los

No Marcadores. En la Figura 4-55a se muestra una imagen que pertenece al grupo de

entrenamiento y se utilizó para realizar el test de entrenamiento de la LSSVM y se observó

que la máquina seleccionó solo los Marcadores.

Validación: las 12 imágenes restantes se utilizan para la detección de los Marcadores

realizando el test de validación de la LSSVM, en la Figura 4-55b se observa que la máquina

selecciona tanto Marcadores como No Marcadores en esta imagen se tiene una relación señal

ruido alta (SNR=49,76 dB) observándose en la imagen que la LSSVM selecciona tanto

Marcadores como No Marcadores, también se utilizó otra imagen la cual contienen una

relación señal ruido más bajo (SNR=23,74 dB) y se observa en la imagen que la máquina

96


selecciona tanto Marcadores como No Marcadores. Los resultados obtenidos en las imágenes

nos conducen a realizar una prueba de desempeño.

Figura 4-54. (a) Imagen sin ruido, la LSSVM seleccionó los Marcadores en el test de entrenamiento (b) Imagen con ruido donde la LSSVM seleccionó los Marcadores, test de validación (imagen1, SNR=49,76 dB)

Figura 4-55. (a) Imagen sin ruido, la LSSVM seleccionó los Marcadores en el test de entrenamiento (b) Imagen con ruido donde la LSSVM seleccionó los Marcadores, test de validación (imagen8, SNR=23,74 dB)

Prueba de desempeño: consiste en determinar la capacidad de la LSVM para clasificar

correctamente los elementos en el test de validación, con las imágenes sintéticas ubicando los

elementos en el grupo Marcadores o No Marcadores. Se trata de determinar cómo se ajustan a

97


la realidad los resultados de clasificación en la imagen sintética obtenidos, con la prueba, es

preciso conocer esa realidad mediante algún método alternativo y completamente fiable, lo

que en ocasiones con imágenes de casos reales como las de CP no es posible. Antes de aplicar

la prueba de desempeño se definirán algunas variables tales como:

• Verdadero positivo (VP): el Marcador está en la imagen y se selecciona como

Marcador.

• Falso Positivo (FP): los No Marcadores son seleccionados como Marcadores.

• Verdaderos negativos (VN): Los No Marcadores son seleccionados como No

Marcadores.

• Falso negativo (FN): los Marcadores son seleccionados como No Marcadores

Estas variables se visualizan mediante la Tabla 4-3, permitiendo hacer la identificación del

elemento seleccionado en la imagen sintética por la LSSVM de forma más sencilla.

Tabla 4-3. Prueba de desempeño

Marcadores No MarcadoresPositivo (Marcador) VP FPNegativo (No Marcador) FN VN

• Sensibilidad: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un Marcador en una

imagen.

100*FNVP

VPadSensibilid

+=

(4.13)

• Especificidad: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un marcador, es

decir, la probabilidad de clasificar un Marcador como un No marcador.

*100=+

VNEspecificidad

VN FP (4.14)

98


Relación señal ruido: es la diferencia en dB entre el nivel de gris en la imagen que se

seleccionó del grupo de validación ( I ) y la imagen con ruido ( I ). La relación señal ruido se

calcula con la siguiente ecuación.

−=

∑∑

∑∑

= =

= =M

i

M

j

M

i

M

j

II

I

SNR

1 1

2

1 1

2

)(

)(

log20

(4.15)

Curva ROC (Receiver Operating Characteristic, o Característica Operativa del Receptor):

Recorriendo todo el rango de valores posibles de los puntos de corte (puntos de la prueba de

desempeño) se obtendrá una serie de pares Sensibilidad y Especificidad, que definirán cada

prueba desempeño, definiéndose como el punto óptimo de desempeño como el que tiene el

mejor par Sensibilidad, Especificidad. La representación gráfica de todos estos puntos define

la curva ROC y se utiliza el par Sensibilidad – (1-Especificidad) para su representación

gráfica. La línea de puntos expresa la capacidad nula de discriminación. Cuanto más se

acerque la curva al extremo superior izquierdo de la cuadrícula la prueba de desempeño tendrá

más capacidad de discriminación. La curva ROC es la representación grafica de la

discriminación (Figura 4-56). Se entiende como el área bajo la curva ROC y se calcula

utilizando métodos numéricos, en este caso se utilizo la regla del trapecio. El área indica la

probabilidad de clasificar correctamente un par de individuos positivo y negativo

seleccionados al azar. Los valores del área bajo la curva ROC van entre 0.5 y el máximo que

es 1. Se suele aceptar como valor aceptable de discriminación cuando supera el 0.7.

99


Figura 4-56 Curva ROC

4.2.3.1.3.1 Resultado de la prueba de desempeño

. A continuación se presentan los resultados de la prueba de desempeño obtenidos con las

imágenes sintéticas, los cuales son mostrados en la Tabla 4-4, acompañadas de la graficas y

un breve análisis de estas.

La relación señal ruido (SNR) se muestra en la Figura 4-57, observándose en la curva, que a

medida que se varia en la imagen el nivel de ruido, la SNR disminuye, por lo tanto esto

implica que las imágenes se van haciendo muy diferentes con respecto a la imagen original, es

decir, el margen que hay entre la potencia de la imagen original y la potencia del ruido en la

imagen la va corrompiendo haciéndolas muy diferentes.

En la Figura 4-58, se puede observar la evolución de la sensibilidad respecto a SNR y se

aprecia en la curva variaciones bruscas debido a que la información que se manipula es

reducida y discreta. A medida que la SNR aumente se puede inferir que la sensibilidad también

aumenta indicando que las imágenes a medida que tienen menor ruido o mayor SNR la

SVM detecta mayor cantidad de marcadores.

Pero en la Figura 4-59, se mide la especificidad, se observan en la curva cambios bruscos

que va en aumentado a medida que crece SNR, esto indica que a medida que la máquina

continúe seleccionando marcadores en nuevas imágenes va a tender a equivocarse,

seleccionando no marcadores como marcadores.

100


La curva ROC en la Figura 4-60, indica que el mejor par Sensibilidad-Especificidad tiene

una probabilidad de 0,71 de poder diferenciar un Marcador de un No Marcador.

Tabla 4-4. Resultados de la prueba de desempeño en las imágenes sintéticas

.

.

0 5 1 0 1 5 2 0 2 52 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0R e la c io n S e ñ a l R u id o (S N R )

V a ria n z a

SN

R (d

B)

Figura 4-57. Relación señal ruido

101

Imagen No

Patrones detectados

VP FP V N F N SNR

Sensibilidad Especificidad(M->M) (NM->M) (NM->NM) (M->NM)

1 51 10 41 16 0 49,76 1,00 0,282 52 10 42 15 0 37,63 1,00 0,263 51 9 42 15 1 32,72 0,90 0,264 50 9 41 16 1 29,78 0,90 0,285 42 7 35 22 3 27,89 0,70 0,396 39 7 32 25 3 26,26 0,70 0,447 22 4 18 39 6 24,84 0,40 0,688 11 3 8 49 7 23,78 0,30 0,869 5 1 4 53 9 22,78 0,10 0,9310 3 0 3 54 10 21,96 0,00 0,9511 2 0 2 55 10 21,16 0,00 0,9612 1 0 1 56 10 20,42 0,00 0,98


. Figura 4-58. Gráfica de Sensibilidad vs SNR (dB)

. Figura 4-59. Gráfica de Especificidad vs SNR (dB)

102


Figura 4-60. Grafica de ROC, con área bajo la curva de 0,71

4.2.3.2 Máquina de soporte vectorial de mínimos cuadrados aplicados a

imágenes de CP

En el Centro de Microscopía Electrónica “Ernesto Palacios Pru”, se sigue un

procedimiento manual subjetivo en el que se invierte mucho tiempo para realizar el conteo de

espinas dendríticas de CP. En la identificación de espinas dendríticas en imágenes de CP el

investigador debe tener experticia para identificar las espinas dendríticas, debido que están

presentes en la imagen con diferente densitometría o nivel de grises. El conteo de espinas

dendríticas permite estudiar los efectos de sustancias nocivas en los individuos, midiendo el

grado en que se afecta la estructura del árbol dendrítico y a su vez el número de espinas

dendríticas. Para mejorar el conteo de espinas de CP, se implementó una herramienta

automática la cual permitirá mejorar el tiempo de conteo, el cual fue utilizado previamente en

un conjunto de imágenes sintéticas. Después de haber explicado el procedimiento de

clasificación utilizando las LSSVM en imágenes sintéticas, se aplicó la técnica de

clasificación a 25 imágenes de CP, dividiéndolas en dos grupos, 15 de entrenamiento y 10 de

validación.

103


Se les pidió a expertos que identificara las espinas en el grupo de imágenes de CP de

entrenamiento y validación. Las espinas identificadas en el grupo de entrenamiento son las

espinas que serán seleccionadas como Marcadores y las espinas identificadas en el grupo de

validación permitirá contrastar los resultados de la LSSVM con los del experto.

Se debe hacer notar que la identificación de espinas dendríticas por parte de los expertos es

un proceso subjetivo y por lo tanto el resultado varía, debido a la experticia de cada persona

para realizar la identificación de espinas dendríticas en CP. Por lo general se considera el

promedio del conteo de espinas realizado por diferentes expertos. En la presente investigación,

como el objetivo es mostrar las potencialidades del uso de máquinas de soporte vectorial en la

identificación de espinas, se consideraron las imágenes con las espinas dendríticas marcadas

por un experto (Experto 2 indicado en la Tabla 4-5 y Tabla 4-6, que se muestran a

continuación en la sección 1), tanto para el grupo de entrenamiento y el de validación.

Entrenamiento: En las imágenes se seleccionaron los Marcadores y No Marcadores

utilizando una vecindad con un radio de 10 píxeles, generando vectores de 317 componentes

y los valores de hiperparámetros sigma igual a 0,7 y gamma igual a 9, obtenidos de forma

heurística tal como se explico en la sección 4.2.2. Los resultados que se obtienen al realizar

el test de la etapa de entrenamiento son mostrados en la Figura 4-22b y Figura 4-23b. La

Figura 4-22 y Figura 4-23 muestra las imágenes 13, 14, 15 y 16 de CP del grupo de

entrenamiento, donde las espinas dendríticas de CP fueron señaladas por un experto (Figura

4-22a y Figura 4-23a). Las espinas seleccionadas por el experto son consideradas como

Marcadores e introducidas a la LSSVM para entrenarla e inmediatamente se realiza un test de

entrenamiento que permitirá cotejar la posición de las espinas en las imágenes de CP. Los

resultados de tal test son mostrados en la Figura 4-22b y Figura 4-23b. Se puede observar que

la máquina puede identificar 49, 59, 47 y 48 espinas de las 45, 58, 32 y 30 marcadas por el

experto. Tales resultados confirman la potencialidad de las máquinas de soporte vectorial para

realizar la identificación automática de las espinas dendríticas en CP.

Validación: Después de obtener resultados satisfactorios en el test de entrenamiento de la

LSSVM, se utilizaron imágenes de CP del grupo de validación para realizar el conteo

104


automático de espinas dendríticas utilizando la LSSVM. Dicha validación permite demostrar

la efectividad de tal técnica para realizar el conteo automático de espinas dendríticas en CP.

En la Figura 4-63 y Figura 4-64, se muestra el conteo manual realizado por un experto (Figura

4-63a. y Figura 4-64a) y el resultado del test de validación con la LSSVM (Figura 4-63b y

Figura 4-64b) en imágenes de CP del grupo de validación, permitiendo estos resultados cotejar

resultados del conteo manual con el conteo automático. En dicha imagen se observa que la

máquina de soporte vectorial detecta un número más grande de espinas dendríticas que las

marcadas por los expertos. Sin embargo es importante recordar que el conteo es un proceso

subjetivo.

105


Figura 4-61. Imágenes de CP de entrenamiento (a) Conteo manual (b) Conteo automático

.

106


.

.

.

Figura 4-62. Imágenes de CP de entrenamiento (a) Conteo manual (b) Conteo automático

.

.

.

107


.

.

Figura 4-63. Imágenes de CP de validación (a) Conteo manual (b) Conteo automático

108


Figura 4-64. Imágenes de CP de validación (a) Conteo manual (b) Conteo automático

4.2.3.2.1 Análisis de resultados de la LSSVM aplicados a imágenes de CP

Después de aplicar las LSSVM, a imágenes de CP, del grupo de entrenamiento y

validación se obtuvieron los resultados del conteo automático. Para poder realizar un análisis

de los resultados del conteo automático, tres expertos realizaron, de manera independiente, un

conteo manual de espinas dendríticas en cada una de las imágenes de CP. Los resultados

obtenidos por ellos, para las imágenes de entrenamiento se presentan en la btener un

109


acotamiento superior y así poder cotejar adecuadamente con los valores obtenidos de forma

automática.; mientras que los obtenidos para la imágenes de validación aparecen en la Tabla

4-6.

En el estudio no se utilizaron formas diferentes de combinación entre los expertos para

crear grupos de resultados promedios, solo se consideró los expertos que tenían valores muy

parecidos donde no existieran gran variación entre los datos para tener un acotamiento inferior

y un grupo donde se consideraran el promedio de todos los expertos, para obtener un

acotamiento superior y así poder cotejar adecuadamente con los valores obtenidos de forma

automática.

Tabla 4-5. Imágenes de CP, para el entrenamiento de la LSVM

Imagen Nº

Experto 1

Experto 2

Experto 3

Promedio (Exp1, Exp2)

Promedio (Exp1, Exp2, Exp3) Automático

Error1 (Exp1, Exp2)

Error2 (Exp1, Exp2, Exp3)

11 45,00 50,00 124,00 47,50 73,00 56,00 8,50 17,0012 42,00 48,00 98,00 45,00 62,67 60,00 15,00 2,6713 40,00 50,00 112,00 45,00 67,33 49,00 4,00 18,3314 62,00 55,00 157,00 58,50 91,33 61,00 2,50 30,3315 35,00 30,00 117,00 32,50 60,67 47,00 14,50 13,6716 33,00 27,00 88,00 30,00 49,33 48,00 18,00 1,3317 36,00 40,00 83,00 38,00 53,00 47,00 9,00 6,0018 20,00 25,00 67,00 22,50 37,33 42,00 19,50 4,6719 19,00 20,00 65,00 19,50 34,67 40,00 20,50 5,3320 21,00 26,00 100,00 23,50 49,00 37,00 13,50 12,0021 24,00 20,00 95,00 22,00 46,33 38,00 16,00 8,3322 24,00 22,00 70,00 23,00 38,67 34,00 11,00 4,6723 20,00 18,00 108,00 19,00 48,67 25,00 6,00 23,6724 29,00 31,00 97,00 30,00 52,33 28,00 2,00 24,3325 18,00 23,00 62,00 20,50 34,33 21,00 0,50 13,33

Promedio 10,70 12,38Desv Est 6,64 8,84Min 0,50 1,33Max 20,50 30,33

110


En los resultados obtenidos en el test de entrenamiento (btener un acotamiento superior y

así poder cotejar adecuadamente con los valores obtenidos de forma automática.) los valores

del conteo manual por el Experto2 y el conteo automático de las espinas dendríticas de CP

con las maquinas, no coinciden exactamente, ello podría ser debido a un conjunto de factores,

tales como: la máquina trabaja con niveles de gris y las espinas dendrítica tienen niveles de

gris parecidos a los no marcadores, permitiendo que la LSSVM los clasifique erróneamente o

bien podría ser que se trate de espinas dendríticas que no fueron identificadas por el experto

debido a que el conteo del experto es subjetivo y está sujeto a errores.

Como continuación del análisis de la tabla en estudio se calculó el promedio entre las

columnas Experto1 y Experto2, dando como resultado la columna Promedio (Exp1, Exp2) .

En este caso se observa que los resultados no coinciden y son más dispersos unos de otros,

con respecto a la comparación con el conteo Automático y Experto1.

Igual mente, se calculó el promedio entre los Experto1, Experto2 y Experto3, dando como

resultado la columna Promedio (Exp1, Exp2, Exp3), donde se observa que los resultados del

conteo automático son mejores que los obtenidos mediante las comparaciones anteriores.

Para verificar cual de los resultados promedios presentan mejor resultado, se calculó el

error, es decir, Error1 (Exp1, Exp2), es la diferencia en valor absoluto de las columnas

Promedio (Exp1, Exp2) y Automático, y el Error2 (Exp1, Exp2, Exp3) que es la diferencia en

valor absoluto de las columnas Promedio (Exp1, Exp2, Exp3) y Automático. Para medir cual

de los resultados entre las columnas de errores es mejor, se utilizan los parámetros

estadísticos correspondientes al promedio, la desviación estándar y el valor mínimo y máximo.

Analizando los resultados estadísticos en la Tabla 4-5 que pertenece al grupo de

entrenamiento, se tiene que el Error1 (Exp1, Exp2) es mejor que el Error2 (Exp1, Exp2,

Exp3), debido a que tiene un promedio de error menor 10,70 y desviación estándar 6,64, con

un rango de variación del error de 0,5 a 20,50.

111


Tabla 4-6. Imágenes de CP, para la validación de la LSVM

Imagen Nº

Experto 1

Experto 2

Experto 3

Promedio (Exp1, Exp2)

Promedio (Exp1, Exp2,

Exp3)Automático

error (Exp1, Exp2)

error (Exp1, Exp2, Exp3)

1 20,00 25,00 35,00 22,50 26,67 20,00 2,50 6,672 27,00 30,00 44,00 28,50 33,67 22,00 6,50 11,673 30,00 39,00 83,00 34,50 50,67 26,00 8,50 24,674 43,00 50,00 93,00 46,50 62,00 27,00 19,50 35,005 39,00 30,00 117,00 34,50 62,00 70,00 35,50 8,006 34,00 35,00 133,00 34,50 67,33 65,00 30,50 2,337 39,00 57,00 102,00 48,00 66,00 70,00 22,00 4,008 43,00 50,00 121,00 46,50 71,33 98,00 51,50 26,679 31,00 35,00 116,00 33,00 60,67 70,00 37,00 9,3310 51,00 45,00 124,00 48,00 73,33 98,00 50,00 24,67

Promedio 26,35 15,30Desv Est 17,49 11,38Min 2,50 2,33Max 51,50 35,00

Además, en la Tabla 4-6 del test de validación se puede observar que no coinciden el

número de espinas obtenidas por conteo manual y el conteo automático. Como se indicó,

anteriormente, la máquina tiene una etapa de entrenamiento que consiste en darle una

configuración que no debe ser cambiada en los test de validación dándose las mismas

características indicadas en el entrenamiento.

Analizando los resultados estadísticos en la Tabla 4-5 que pertenece al grupo de validación,

se tiene que el Error2 (Exp1, Exp2, Exp3) es mejor que el Error1 (Exp1, Exp2) , debido a que

tiene un promedio de error menor 15,30 y desviación estándar 11,38, con un rango de

variación del error de 2,33 a 35,00.

De lo anterior se puede intuir que la máquina presenta una estimación del número de

espinas dendríticas de la CP, así como lo realizaría un experto pero con una mejor precisión

ya que su rendimiento en la búsqueda depende solo del entrenamiento para conseguir los

hiperparametros óptimos y no estaría sujeta a las limitaciones subjetiva humanas como en el

caso del expertos en la búsqueda de los marcadores.

Inmediatamente se realizó una prueba de diagnostico, que consiste en comparar en

número y posición las espinas dendríticas en imágenes de CP del conteo manual y conteo

112


automático en los grupos entrenamiento (Tabla 4-7) y validación (Tabla 4-8). La prueba

consistió en cotejar el conteo manual y automático para encontrar las espinas dendríticas que

coincidían según su posición. Adicionalmente, se cuenta el número de espinas dendríticas que

no coinciden según su posición en imágenes de CP. Las variables utilizadas fueron las

siguientes:

VP: verdaderos positivos esto indica el número de espinas dendríticas que coincidieron en

número y posición espacial en las imágenes del conteo manual versus automático.

FN: falsos negativos son el número de espinas dendríticas en el conteo manual que no

coincidieron espacialmente en las imágenes del conteo automático.

Calculando el promedio en la sensibilidad en el grupo de entrenamiento, se puede afirmar

que la capacidad de la LSSVM para detectar espinas dendríticas a medida que se utilicen

nuevas imágenes, tiene una probabilidad del 72% de detectarlas en cada imagen según el test

de sensibilidad.

Tabla 4-7. Resultados de la prueba de diagnóstico en las imágenes de CP del grupo de entrenamiento

113

Imagen Nº

Coincidieron VP Conteo manual No coincidieron FN

Sensibilidad(Según la fórmula de la ecuación 4-11)

1 24 21 0,532 33 9 0,793 23 17 0,584 41 21 0,665 29 6 0,836 23 10 0,707 25 11 0,698 16 4 0,809 16 3 0,8410 16 4 0,8011 18 6 0,7512 15 9 0,6313 13 7 0,6514 22 7 0,7615 14 4 0,78

Probabilidad 72%


Tabla 4-8. Resultados de la prueba de diagnóstico en las imágenes de CP del grupo de validación

Imagen Nº

Coincidieron VP Conteo manual No coincidieron FN

Sensibilidad(Según la fórmula de la ecuación 4-11)

1 10 10 0,502 16 11 0,593 24 6 0,804 25 18 0,585 27 12 0,696 23 11 0,687 31 8 0,798 35 8 0,819 27 4 0,8710 41 10 0,80

Promedio 79%

Calculando un promedio en la sensibilidad en el grupo de validación (Tabla 4-8), se puede

afirmar que la capacidad de la LSSVM para detectar espinas dendríticas a medida que se

utilizan nuevas imágenes, tiene una probabilidad del 79% de detectarlas en cada imagen

según el test de sensibilidad.

Para poder discernir si las probabilidades conseguidas en la sensibilidad son buenas o

malas, se compararon las sensibilidades del grupo de validación contra la del grupo de

entrenamiento, donde se observa, que la sensibilidad en el grupo de validación está por

encima de la sensibilidad del grupo de entrenamiento, esto podría ser un índice para

cuestionar los resultados ya que la maquina se entrena con el grupo de entrenamiento y la data

del grupo de validación es desconocida. Se selecciona el indicador de esta manera, ya que no

tenemos casos de datas de CP con algún otro sistema de clasificación automático.

4.2.3.2.2 Discusión acerca de los resultados de la LSSVM aplicados a

imágenes de CP

En el Centro de Microscopía Electrónica “Ernesto Palacios Pru”, se sigue un

procedimiento manual subjetivo en el que se invierte mucho tiempo para realizar el conteo de

espinas dendríticas de CP. En la identificación de espinas dendríticas en una imagen de CP el

investigador debe tener experticia para identificar las espinas dendríticas, debido que están

114


presentes en la imagen con diferente densitometría o nivel de grises, se citarán artículos

desarrollados en el Centro de Microscopía electrónica “Ernesto Palacios Pru”, donde se

realiza el conteo de espinas dendríticas, por ende vesículas sinápticas ya que estas se

concentran en las espinas dendríticas.

Palacios-Pru y otros [6] indican que largos periodos de ejercicios produce severos cambios

morfológicos en las uniones neuromusculares de los teleósteos, los cambios consisten en la

disminución progresiva de las vesículas sinápticas y ramificaciones laminares del las

terminaciones nerviosas. Se mantuvieron los peces nadando durante 1 hora, en contra de la

corriente de agua a un flujo de 3,5 lts/min se observa que el numero de vesículas se reduce en

un 70% después de 10 minutos de ejercicio. Esta observación indica que la formación de las

vesículas no puede restaurarse a su número original y por lo tanto, bajo tales circunstancias, el

lanzamiento del transmisor puede ocurrir por un diverso mecanismo.

Para realizar el conteo de las espinas dendríticas, se utiliza una lamina de plástico trasparente

(acetatos) que contiene cuadriculas de dimensión 1x1 cm, esta lámina se sobrepone a la

imagen para sectorizar la fotografía de CP, con un lápiz se van seleccionando las espinas

dendríticas según la experticia del investigador. Cuando en algunas imágenes el conteo de

espinas es realizado por más de un investigador independiente con respecto a la misma imagen

de CP, los resultados obtenidos corresponden al promedio de los conteos realizados por los

expertos. Inmediatamente al realizar el conteo de espinas dendríticas, es necesario encontrar

una relación de área en la imagen de CP con respecto al número de espinas cuantificado en la

imagen de CP. En el cálculo del área es necesario un factor de escala de aumento de las

imágenes, este es obtenido en la calibración del microscopio con una lámina graduada que

contiene una cierta cantidad de líneas separadas una de otra a una distancia dada en micras, la

imagen del factor de escala se imprime en papel para tomar de la imagen la medida

correspondiente en centímetros, la cual tiene su equivalente en micras con respecto a la

medida real (5 cm en la imagen de calibraciones es equivalente a 2 micras en la escala real de

calibración). Con esta información se puede medir el área de la imagen de CP y así encontrar

la relación de las espinas dendríticas por área. En este trabajo como el objetivo es evaluar el

funcionamiento de las máquinas de soporte vectorial en el conteo de espinas dendríticas y

115


adicionalmente trabajar con regiones de interés con un tamaño pre-establecido único, se está

ignorando dicho factor.

El conteo de espinas dendríticas permite estudiar los efectos de sustancias nocivas en los

individuos, midiendo el grado en que se afecta la estructura del árbol dendrítico y a su vez el

número de espinas dendríticas. Los estudios en el laboratorio son realizados con ratones en sus

diferentes etapas de desarrollo, tales como, prenatales, postnatal y adulto. Se estudian ratones

debido a que su estructura cerebral es muy parecida a la estructura del cerebro en el hombre.

Algunos autores escriben cómo realizar medidas en las estructuras nerviosas de imágenes

adquiridas por microscopía, entre ellos se tiene a Palay y otros [6]. El número de células

granulosas es grande y esta empaquetadas mostrándose como densidades en la corteza

cerebelosa de los vertebrados, estimando en el cerebelo humano una densidad de 3 a 67*10

celulares granulosas por 3mm , con una relación de una células granulosa con 1600 de CP.

Dichos autores, realizan la representación de histogramas donde muestran la distribución,

medida en intervalos de varices sinápticas de fibras paralelas. También muestran

distribuciones grandes y pequeñas varicosidades en las fibras paralelas, que se ubican de

acuerdo a su posición en la capa molecular y su relación con el área.

4.2.3.2 Conclusiones

El conteo de espinas dendríticas en imágenes de CP, utilizando modelos de aprendizaje,

como las LSSVM constituye un enfoque de muy reciente aplicación. Los resultados obtenidos

sugieren que la técnica estudiada podría ser una importante herramienta de clasificación para

este tipo de imágenes adquiridas por microscopía. En cuanto a los resultados, la LSSVM

pudo detectar mayor cantidad de espinas que las identificadas por el experto que realizó el

conteo manualmente, tanto para las imágenes de entrenamiento como para las imágenes de

validación. Según expertos la mayor cantidad de espinas dendríticas detectadas en el conteo

automático por la LSSVM son espinas dendríticas de la CP.

Las técnicas de clasificación propuestas resultan útiles para clasificar adecuadamente las

espinas en CP, lo cual contribuye a mejorar el procedimiento de clasificación de espinas

116


dendríticas que, normalmente, se realiza de forma manual en el referido Centro de

Microscopía Electrónica.

La clasificación de las espinas dendríticas utilizando las LSSVM, se constituye en una

herramienta muy importante en estudios de clasificación de espinas dendríticas, pero el tiempo

computacional para un ciclo en el test de entrenamiento para encontrar los hiperparámetros

óptimos es demasiado elevado, lo mismo pasa con el tiempo computacional en el test de

validación y vectorización de las imágenes, esto indica que se debe seguir trabajando para

optimizar dichos tiempos operativos en el computador utilizando una mejor parametrización

de los Marcadores, No Marcadores y vectorización de las imágenes.

117


5. Conclusiones generales

Las neuronas de los diferentes centros de integración del sistema nervioso central se

caracterizan por presentar una morfología determinada, conocida como fenotípia, la cual

depende de la función que debe cumplir la neurona y permite distinguir un tipo de neurona de

otra. El objetivo de este trabajo fue proponer un esquema de procesamiento de imágenes

neurales, que permitió realzar, restaurar y cuantificar imágenes de microscopía de células

neurales, en este caso las células de Purkinje de la corteza cerebelosa de ratón. En este

estudio se utilizaron diversas técnicas de procesamiento de imágenes, tales como: técnicas de

restauración y un sistema de reconocimiento de patrones. Como resultado de la aplicación

sistemática de tales técnicas, se logró realzar la imagen, facilitando así el análisis en forma

más rápida, exhaustiva y precisa, en comparación con el simple conteo manual de este tipo de

imágenes.

En el procesamiento de imágenes de células de Purkinje, inicialmente, se les realizó un

realce, con técnicas básicas de procesamiento digital de imágenes, tales como las operaciones

de procesamiento píxel a píxel y filtrado espacial o por vecindades. Es importante señalar que

dichas técnicas no generaron cambios relevantes en las imágenes de células de Purkinje.

Debido a que los filtros anteriores no generaron resultados satisfactorios en las imágenes

de células de Purkinje, se utilizó el filtro de mediana con sus respectivas variaciones y la

transformada wavelet. En cuanto a los resultados del filtro de mediana el ponderado realizó

cambios en el realce de la imagen de células de Purkinje gerando un suavizado en la imagen,

presentando mejores resultados que los filtros anteriores y por su parte, la transformada

wavelet resaltó la imagen ofreciendo información importante relativa a los bordes de las

células de Purkinje, permitiendo una mejor definición de aquellos sitios donde las espinas

dendríticas aparecen borrosas, contribuyendo así a mejorar el procedimiento de cuantificación

de espinas dendríticas que, normalmente, se realiza en forma manual.

Se aplicaron también a las imágenes de las células de Purkinje métodos numéricos de

deconvolución (Regularización, Wiener y Lucy-Richardson) debido al desenfoque que se

118


produce en la adquisición de las imágenes mediante un microscopio, los métodos iterativos

generaron resultados muy novedosos en el realce de las imágenes, pero el que aporto un nivel

muy significativo en el realce de las mismas fue el algoritmo de Lucy-Richardson,

permitiendo el uso de herramientas de clasificación supervisada como las máquinas de soporte

vectorial para realizar el conteo de espinas dendríticas.

En el conteo de espinas dendríticas de células de Purkinje, se sigue un procedimiento

manual subjetivo, en el que se invierte mucho tiempo por parte de los expertos, por esa razón

se desarrolló un sistema de conteo automático, utilizando como herramienta las máquinas de

soporte vectorial. El sistema automático presentó resultados muy convincentes con respecto al

conteo manual, ya que estos resultados se pudieron cotejar entre cada una de las imágenes de

células de Purkinje procesadas. También, se realizó la prueba de desempeño, para lo cual se

utilizó la sensibilidad dando como resultado promedio de 75%, indicando una elevada

probabilidad de seleccionar en una imagen, de células de Purkinje, una espina dendrítica.

En la validación de la herramienta automática de clasificación, se utilizó un conjunto de

imágenes sintéticas de 8 bits de profundidad y los resultados obtenidos, al procesar las

imágenes con la herramienta de clasificación, fueron analizados a través de la prueba de

desempeño, en la cual se midió la sensibilidad, especificidad y se generó la curva ROC

obteniéndose resultados satisfactorios.

En la realización del trabajo se pudieron evaluar algunas técnicas y herramientas para

procesamiento de imágenes, como alternativas distintas a otras metodologías que implican

gran costo y esfuerzo computacional. Las técnicas elegidas son bastante sencillas y presentan

resultados satisfactorios.

• En particular con la deconvolución se apreciaron ciertas características de las imágenes

tratadas, especialmente, en sitios donde las espinas dendríticas aparecen borrosas en la

imagen, lo que permitió mejorar la visualización de bordes.

• El procesamiento de imágenes de CP con las diferentes técnicas propuestas,

proporcionó una ayuda útil para optimizar los análisis manuales de conteo de espinas

dendríticas, al permitir mejorar el realce de la imagen.

• La clasificación con las máquinas de vector soporte de mínimos cuadrados para

realizar el conteo automático de las espinas en la CP, dió resultados satisfactorios.

119


• Con los resultados obtenidos se puede afirmar que se cuenta con un procedimiento

adecuando para la clasificación de CP, y se puede plantear, como trabajo futuro, la

implementación en código C de la técnica desarrollada y adicionalmente se debe aplicar

técnicas de minería de datos para extraer atributos de las imágenes y así poder minimizar los

tiempos de computo empleados por las técnicas de clasificación, así como también se podría

emplear otras técnicas de clasificación como redes neurales, clasificadores bayesianos, entre

otros.

Este estudio indico la importancia de realizar estudios de investigación de procesamiento de

imágenes en el área del microanálisis de imágenes adquiridas por microscopía, en el Centro de

Microscopía Electrónica, permitiendo obtener en las imágenes información que sin un

procesamiento metódico, sería imposible de generar.

120


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