CONIUGAZIONE BATTERICA

Come si coltivano batteri in laboratorio

Terreno minimo: acqua, sali inorganici, fonte di carbonio Batteri prototrofici: crescono in terreno minimo Batteri auxotrofici: Incapaci di crescere in terreno minimo, se non complementato da altre sostanze

Cosa si vede

Genoma batterico: -  Non delimitato da membrana -  Singolo cromosoma circolare -  Quasi totale assenza di sequenze non

codificanti -  Non avviene la meiosi

Le cellule figlie sono sempre uguali alle cellule madri? Esiste un qualche tipo di “unione sessuale”?

Lederberg e Tatum: la scoperta della coniugazione

Evento simile alla riproduzione sessuata

Coniugazione richiede il contatto fisico Attraverso il poro passano solo i soluti e non I batteri

Pilo di coniugazione: ponte e poro con cui le cel lule si scambiano materiale genetico

Per caso Hayes (‘53) scopre un altro tipo di passaggio di informazione: una variante del ceppo originale che non produce ricombinanti quando incrociata al ricevente. La coniugazione e’ diseguale: Una cellula e’ donatore (di una parte del materiale genetico), l’altra (mutante) e’ solo ricevente, esiste una sorta di asimmetria sessuale. In contatto con ceppi wild-type, il difetto era recuperato: Fattore di fertilita’ (F) era trasmissibile.

F e’ un plasmide, che esprime geni per la generazione del pilo. Si duplica con replicazione rotante, in cui trasferisce un singolo filamento e una copia rimane in donatore

Il fattore F è un PLASMIDE Molecola di DNA a doppia elica, circolare Circa 100 kbp Replica in modo autonomo dal cromosoma - origine di replicazione “vegetativa” Contiene geni - per la propria replicazione - per costruire il “pilus sessuale” - per “coniugare”

I ceppi Hfr

Luigi Luca Cavalli Sforza scopre un ceppo F+ con delle particolarità: 1.  Incrociato con F- produce un numero di

ricombinanti 1000 volte superiore ad un F+ normale (da qui il nome High Frequency of Recombination)

2.  Negli incroci Hfr x F- nessun F- era convertito in F+ o Hfr (diversamente dagli incroci F+ x F-)

F+: met+ x F-: met- = 1/10-7 ricombinanti (ma tutta la popolazione diventa F+) Hfr: met- x F-: met- = 1/10-4 ricombinanti (ma tutta la popolazione rimane F-)

Il ceppo Hfr deriva dall’integrazione del fattore F nel cromosoma batterico à durante la coniugazione il fattore F promuove il trasferimento di materiale cromosomico con alta efficienza à trasforma il cromosoma batterico in un maxiplasmide

I geni del donatore possono essere trasferiti in tutto o in parte nel ricevente; questi possono essere incorporati nel ricevente mediante crossing over (doppio) e quindi ricombinare (creazione di ricombinanti).

DIPLOIDE PARZIALE (ricorda questo nella genetica dell'operatore)

Perché in un incrocio F+ x F si ottengono ricombinanti per i marcatori cromosomici? • In una popolazione di batteri F+ può succedere che il plasmide F si integri nel cromosoma batterico. Questi eventi sono (quasi) casuali e rari (frequenza circa 10-6) • Si producono così cloni indipendenti di cellule “Hfr” mescolate alla stragrande maggioranza di cellule F+. • Solo questa sottopopolazione di batteri “Hfr” è responsabile del trasferimento del cromosoma negli incroci F+x F e quindi della ricombinazione (a bassa frequenza) di marcatori cromosomici.

Coniugazione interrotta (da una agitazione meccanica): gli alleli entravano nel ricevente F- secondo un ordine preciso = si formano meno ricombinanti contenenti i geni più tardivi

nella coniugazione il trasferimento del DNA a singolo filamento inizia da un punto fisso del cromosoma: la ORIGINE, che e’ il punto in cui e’ inserito F. F e’ trasferito per ultimo

Hfr azir tonr gal+ strs X F- azis tons lac- gal- str+

Mappa genetica a tempo (unità di misura: minuti)

Alle volte il ceppo F fuoriesce con meccanismi simili (ma in ordine inverso) alla sua entrata: alle volte il meccanismo e’ imperfetto che include frammenti di genoma batterico. • Questi plasmidi (F’) sono usati per creare diploidi parziali (per studi di dominanza ed epistasi di un certo gene o gruppo di geni) •  I plasmidi sono il modo con cui si trasporta, amplifica e manipola il DNA. ESSENZIALI IN BIOLOGIA MOLECOLARE

Trasformazione