¿CÓMO SE ESTUDIAN LAS INMUNOGLOBULINAS?

Prof. Carlos Ambrocio Ordóñez Sánchez.

¿CÓMO SE ESTUDIAN LAS INMUNOGLOBULINAS?

Existen varios métodos para estudiar las inmunoglobulinas de membrana de los linfocitos B que forman el receptor BcR. Los dos mas utilizadas son:El estudio mediante conjugados monoclonales o policlonales frente a los diferentes isotipos de inmunoglobulinas, marcados con isocianato de fluoresceína y observados al microscopio de fluorescencia.El análisis por citometría de flujo, utilizando anticuerpos monoclonales frente a cada isotipo de inmunoglobulina. 

¿CÓMO SE ESTUDIAN LAS INMUNOGLOBULINAS?

Las inmunoglobulinas libres en suero, calostro, leche, fluidos, etc. pueden ser estudiadas como inmunoglobulinas totales, sin considerar frente a que antígeno reaccionan, o como anticuerpos específicos frente a distintos antígenos de interés. Para este último tipo de estudios, que sin duda es el más interesante, se disponen de un gran número de técnicas que van desde las clásicas de precipitación, fijación de complemento, etc; a las más modernas y cada día mas utilizadas técnicas inmunoenzimaticas.

Las diferencias de sensibilidad, especificidad, capacidad de utilización a gran escala, etc. son algunos de los conceptos más importantes a la hora de seleccionar una u otra técnica. Así,  respecto a la sensibilidad podemos observar que hay técnicas con niveles bajos como las de precipitación, de sensibilidad media como las aglutinación bacteriana, fijación de complemento y otras de sensibilidad mayor como el ELISA, la seroneutralización o la actividad bactericida.

¿Qué diferencia hay entre las técnicas de laboratorio?

Como hemos reflejado al principio de este capítulo, hoy día existen multitud de técnicas de laboratorio disponibles para llevar a cabo un estudio serológico. La capacidad diagnóstica de un método, viene determinada por el cálculo de la sensibilidad y especificidad de ese determinado método, frente a la técnica considerada de referencia. Hay algunos conceptos que convienen recordar para saber valorar cada una de las técnicas disponibles. Estos conceptos son:

Sensibilidad: Es la capacidad de un método para detectar sueros positivos frente a una determinada enfermedad. La sensibilidad permite que todos los positivos sean detectados.Especificidad: Es la capacidad de un método para diferenciar sueros positivos de los sueros negativos en una determinada enfermedad. La especificidad evita dar resultados falsos positivos. Ningún negativo debe ser considerado por la técnica como positivo.

¿Qué diferencia hay entre las técnicas de laboratorio?

Valor predictivo: Es la capacidad de una técnica para distinguir entre animales que están padeciendo una determinada enfermedad de los que no la están padeciendo. En definitiva, predecir la sensibilidad y especificidad para un caso negativo o para un caso positivo. El valor predictivo puede ser:Positivo: Es la frecuencia de la enfermedad entre los animales con resultado positivo.

Negativo: Es la frecuencia de ausencia de la enfermedad en los animales con resultado negativo.Eficacia: Porcentaje de animales clasificados correctamente con un método determinado.Positivo verdadero: Animal enfermo correctamente clasificado por la técnica.Positivo falso: Animal incorrectamente clasificado por la técnica empleada.

Sensibilidad de las diferentes técnicas para la detección de anticuerpos (mg/ml)

MÉTODO SENSIBILIDAD (g/ml)Precipitación en gel   30

Precipitación en anillo 18Aglutinación bacteriana 0,05

Fijación de complemento 0,05Hemaglutinación pasiva 0,01

Inhibición de la hemaglutinación 0,005

Inmunofluorescencia 0,005ELISA 0,0005

Neutralización bacteriana 0,00005

ELISA, anticuerpos marcados con una enzima

El ELISA, se basa en el uso de anticuerpos marcados con una enzima (generalmente la peroxidasa), de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno ó anticuerpo) insolubilizados sobre la placa, la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y por tanto, podrán fácilmente ser revelada mediante la adición del sustrato, que al actuar sobre la enzima, producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante un colorímetro.Existen bastantes KITS comerciales disponibles y por tanto pueden realizarse estudios serológicos sin necesidad de grandes medios.

ELISA INDIRECTO

Es el método más utilizado para la determinación de anticuerpos. Básicamente, consiste en la inmovilización a la placa de ELISA del antígeno (en los Kits ya viene fijado) del que queremos conocer si en el suero problema existen anticuerpos específicos. Se pueden utilizar como antígenos, proteínas virales o bacterianas e incluso virus completos.

Cada día es más frecuente utilizar exclusivamente las proteínas de interés inmunológico y no todas las proteínas antigénicas. Los pasos siguientes serian la adición del suero problema, incubación y lavado, adición del conjugado, incubación y lavado, finalizando con la adición del sustrato, el frenado de la reacción y la lectura.

ELISA DE COMPETICIÓN

En este sistema también es muy utilizado para la detección de anticuerpos específicos. Se parte de un anticuerpo (monoclonal o policlonal), frente a un antígeno conocido, que previamente ha sido inmovilizado en la placa. Se denomina de competición ya que el suero problema es incubado previamente con el antígeno, antes de incubarlo con el antisuero fijado en la placa, y por tanto compite con él.Los pasos siguientes es la adición e incubación del conjugado, lavado y finalización con el sustrato y lectura. 

INMUNOELECTROTRANSFERENCIA O WESTERBLOT

La inmunoelectrotransferencia "westerblot" o "Immunoblotting" es una técnica inmunoenzimática que se utiliza para la detección de anticuerpos especificos. Se recomienda cuando no hay que estudiar un gran número de sueros o para analizar sueros dudosos por otras técnicas. Este método utiliza como soporte antigénico filtros de nitrocelulosa, donde las proteínas del antígeno han sido previamente transferidas, manteniendo total o parcialmente sus propiedades antigénicas. 

LA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA O INMUNOPEROXIDASA

La inmunofluorescencia indirecta o la inmunoperoxidasa, según se utilice el isocianato de fluoresceína o la peroxidasa, son técnicas que utilizan la especificidad de la histología (pueden ver la célula y comprobar que la reacción inmunológica se produce en un sitio especifico) con la sensibilidad de las técnicas inmunológicas.

Estas técnicas utilizan normalmente cultivos celulares (primarios o de líneas estables) infectados con el virus o la bacteria sobre la que se desea comprobar si hay o no anticuerpos en el suero problema. Tras la incubación con el suero problema; si hay anticuerpos se unirán a las células infectadas pero no a las no infectadas (especificidad histológica observable). La unión se visualiza tras la adición de un conjugado anti-inmunoglobulina marcado con isocianato o con peroxidasa y la posterior observación al microscopio de fluorescencia o convencional respectivamente.

SERONEUTRALIZACIÓN

Este método está considerado de referencia para cualquier estudio serológico pues es el que más se correlaciona entre la respuesta "in vitro" y la respuesta "in vivo". En esta prueba se puede valorar la capacidad que tienen los anticuerpos presentes en un suero problema para neutralizar la actividad biológica de un antígeno. Los métodos descritos hasta ahora permiten valorar  la capacidad que un suero determinado tiene para reconocer un antígeno concreto, en la seroneutralización se avanza un paso más y se indica la capacidad que tiene un suero para neutralizar la actividad biológica del antígeno. Estos métodos son ampliamente utilizados en los laboratorios para valorar la capacidad de un suero frente a toxinas bacterianas, bacteria y/o virus. Estas pruebas son más laboriosas, requieren de cultivos celulares, esterilidad, además de ser generalmente más lentas que todas las anteriores. Sin embargo son altamente especificas y sensibles, y se consideran las pruebas de referencia para cualquier valoración serológica.

Los seroperfilesLos seroperfiles se basan en la detección de los anticuerpos circulantes mediante cualquiera de las técnicas actualmente disponibles, con el fin de poder obtener información sobre la situación del animal en ese momento, o en estados previos. Estos estudios son cada día más utilizados para el control sanitario de las explotaciones porcinas, representando en muchos casos un importante medio para reducir costes y aumentar el nivel sanitario. Los análisis serológicos permiten, entre otras posibilidades: conocer la situación sanitaria, elegir el mejor momento para vacunar, controlar los programas vacunales y evitar la entrada de enfermedades en la explotación.

¿Qué deseo conocer de mi explotación? 

La serología nos puede ayudar para conocer algunas cosas, pero no para otras. Es importante conocer estas limitaciones. La dinámica de aparición de los anticuerpos, la dificultad para diferenciar anticuerpos vacunales de anticuerpos de enfermedad, el tiempo que tardan los anticuerpos en aparecer tras una infección, etc. son algunas consideraciones que debemos siempre recordar al planificar el estudio serológico.

¿A qué animales y en qué momento les debo preguntar?Esta es otra pregunta importante que debemos tener definida. Recordar que los animales de las distintas fases de producción pueden presentar diferentes seroperfiles; luego debemos preguntar a los animales que puedan contestar a nuestra pregunta. Como ejemplo, debe recordarse que las inmunoglobulinas no atraviesan la placenta, por lo que el lechón no presenta inmunoglobulinas hasta que tome el calostro materno. 

¿Qué número de muestras son necesarias para un estudio serológico?Esta es otra de las preguntas clave para que los resultados sean significativos de la situación. Además, de tomar muestras de las diferentes zonas de la explotación y de las diferentes áreas productivas, es también importante definir cuantas muestras necesitaré de cada zona. Dos aspectos son importantes a la hora de evaluar una explotación porcina: Aquellos encaminados a conocer si existe o no una determinada enfermedad en la explotación y los estudios que en caso afirmativo, pretenden conocer su prevalencia. En otras palabras las preguntas serían: ¿Existe tal o cual enfermedad en mi explotación? En caso afirmativo ¿Cuál es su prevalencia?. Para contestar a una u otra pregunta es vital determinar el tamaño de la muestra que debemos analizar. Este tamaño de muestra también dependerá del grado de precisión que deseemos obtener. Para estos estudios existen tablas (ver otras fuentes de información) que indican el número de muestras que necesitamos en función de la prevalencia esperada, la precisión y el nivel de confianza deseado. El número de muestras necesarias varía mucho dependiendo del nivel de confianza que deseemos obtener y la prevalencia que sospechemos.

En general, desde un punto de vista práctico y sencillo, se pueden aplicar las siguientes cifras para un muestreo serológico:

Para reproductoras:En explotaciones con menos de 25 animales: Se estudiaran todosEn explotaciones entre 25 y 100 reproductoras: Se tomaran 25 muestras que en las siguientes determinaciones irán rotando.En explotaciones con mas de 100 reproductoras: 30 muestras y se rotarán.En cebo:Al menos 30 muestras por cada área de cebo.La otra pregunta sería: ¿qué tipo de muestra necesito y como tomarla?. Los seroperfiles se llevan a cabo fundamentalmente a partir del suero de los animales, aunque a veces también interesa conocer la cantidad de inmunoglobulinas presentes en el calostro y/o en la leche materna. Las muestras de calostro se debe recoger durante las 24 horas después del parto. Si se va a remitir a laboratorio de forma inmediata conviene refrigerarlo y enviarlo con refrigerante. Si el envió se realizará en los días siguientes se debe congelar y enviar posteriormente bajo refrigeración.

¿Qué hago con la sangre una vez extraída?.

Por último, ¿Qué hago con la sangre una vez extraída?. La sangre debe quedar a temperatura ambiente (en una sombra, en zona fresca) hasta su coagulación (aproximadamente entre una y dos horas), después debe mantenerse a + 4º C (frigorífico) toda la noche. Posteriormente, es aconsejable centrifugarla o al menos separar el suero del coagulo antes de su envío al laboratorio. Los tubos deben ir claramente marcados y empaquetados. Si el estudio que se desee llevar a cabo implica la realización de dos determinaciones con un intervalo de 21 días (seroconversión) sería mejor congelar el suero una vez coagulado y separado del coagulo y esperar a la siguiente toma para hacer la misma operación y enviar ambos sueros a la vez. Un buen diagnóstico depende en gran medida de una buena muestra. Evitar contaminaciones o alteraciones del suero siempre es una garantía para el diagnóstico.

¿QUÉ APLICACIONES PRÁCTICAS PRESENTAN LOS SEROPERFILES?

Prevenir la entrada de enfermedades en los animales de reposición.El conocimiento serológico de la explotación origen es recomendado, así como la realización de un periodo de cuarentena entre 4 a 8 semanas, según la enfermedad que queramos controlar. Conviene recordar que cada enfermedad infecciosa tiene un periodo de incubación y otro de eliminación que varía considerablemente.

Elegir el momento de vacunación más adecuado en la explotación. Es fundamental conocer cuando los anticuerpos maternales presentan niveles bajos (no protectivos) para adelantarnos en la administración de la vacuna. 

Hacer seguimientos de los programas vacunales, así como conocer el estado sanitario de la explotación.

Hay que recordar que los perfiles serológicos sirven para conocer la situación sanitaria en las condiciones productivas del estudio. Si alguno de esos parámetros cambiara (distinta vacuna, edad de vacunación, diferentes animales, etc), también podría cambiar el resultado de los perfiles, por lo que habría que realizar los estudios serológicos cada vez que  se realicen cambios en la explotación.