C O L L E C T A N E A B O T Á N I C A V O L . I. F A S C . I II . 1947. N.o 15.

Los métodos para la investigación de las comunida­des acuáticas adnadas y especialmente las formadas por organismos microscópicos (perifiton, pecton)

por

R. M A R G A L E F

Esta nota se refiere a los métodos de estudio de las agru­paciones de organismos que se desarrollan sobre las superficies libres de los objetos sumergidos en el agua. Se trata de un tipo de comunidad que forma una capa o almohadilla continua sobre el substrato, que puede alcanzar un grueso considerable y precipita a menudo depósitos minerales en su espesor. Otras veces, la presencia de tal comunidad no puede apreciarse a simple vista, por su escasa altura y pequenez de los organismos que la constituyen. E l mismo tipo de comunidad puede des­arrollarse sobre substrato suelto o movedizo —limo, arcilla, gy t t j a—, en forma de lámina continua aplicada sobre el fondo.

E l concepto de perifiton fué introducido por B E H N I N G (1924) para designar lo que crece adherido a los objetos «artificiales» introducidos en el agua. R o i x (1939) usa la misma palabra en sentido algo más amplio; incluyendo a todos los organismos que se desarrollan sobre las superficies libres de objetos sumer­gidos en el agua. En esta forma, el concepto de perifiton equivale a la reunión del Aufwuchs (sobre organismos vivos) y del Bewnchs (sobre objetos inanimados) de diferentes autores europeos ( W I L L E R , 1920; N A U M A N N , 1931). En un trabajo anterior (1946) propuse el término, puramente fisonómico, de pec­ton; analizado con más detalle en otro artículo posterior (1947 a).

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E l concepto de pecton viene a ser casi sinónimo del de perifiton; la única diferencia entre los dos consiste en que el pecton es definido como tal por la fisonomía de la comunidad, indepen­dientemente de la naturaleza compacta o suelta del substrato :sobre el cual se halle, mientras que el perifiton se define por s u carácter de dependencia con respecto a un substrato sólido «continuo. Ambos términos pueden tener sus ventajas y, de ¡momento, no interesa confundirlos.

E n el pecton se encuentran organismos de muchos grupos, dominando las bacterias, hongos, cianofíceas y diatomeas. Se pueden distinguir seis tipos biológicos principales entre las a lgas del pecton : filamentosas (Phormidium), compactas (Nostoc), celulares (Gloeocafisa), pedunculadas (Cymbella), gelatinosas ramificadas (Chaetophora) y algas microscópicas formando un estrato muy delgado (Hydrococcus, diatomeas). Los animales dominantes se distribuyen en tres tipos bioló­gicos : compactos (esponjas), tubícolas aplicados (briozoos, ané­lidos, quironómidos) y tubícolas erguidos (poliquetos : Mer-cierella). Otros muchos organismos se limitan a la superficie del pecton.

I . M É T O D O S APROXIMADOS PARA E L ESTUDIO D E L PECTON

MACRO Y MICROSCÓPICO. —• E l perifiton que vive sobre tallos más o menos consistentes (Scirfius, etc.), se estudia cortando segmentos pequeños de los tallos, de longitud y superficie •calculadas, raspando dichos fragmentos en una cápsula con agua y contando directamente los organismos, bajo un objetivo de foco largo (THOMASSON, 1925; M E S C H K A T , 1934; Y O U N G , 1945).

E l peso del perifiton se obtiene centrifugando, filtrando y •dejando secar las muestras. Para el estudio del perifiton que vive sobre las piedras, Y O U N G (1945) usa un marco cuadrado •de latón con el objeto de limitar la superficie que va a estu­diarse, mientras se raspa y se lava, para quitarlo, el perifiton que queda fuera del cuadro. Después se raspa la superficie que ha quedado protegida por el marco en una cápsula, para

evaluar y pesar los organismos como en el caso de los tallos., La presencia de arena o precipitados minerales dificulta o haee' impracticables estas manipulaciones. G O D W A R D (1937) raspa la superficie entera de las piedras en agua, homogeniza la sus­pensión resultante y cuenta los organismos contenidos en mues­tras representativas de la suspensión.

El pecton de cierto espesor y compacidad permite obtener secciones delgadas y perpendiculares al substrato con bastante facilidad. Los precipitados minerales molestan y puede ser conveniente disolverlos previamente, tratando las muestras con un ácido diluido. Es muy posible que la inclusión de toda la comunidad en parafina permitiría obtener en el mi-crótomo secciones mucho más finas; pero este recurso no es indispensable. Las secciones obtenidas en una u otra forma pueden observarse al microscopio. A veces una sola especie forma casi toda la masa de la comunidad, pero no es raro encontrar varias especies asociadas. En este caso la domi­nancia puede apreciarse fácilmente, sacando dibujos con la cámara clara de las secciones, en las que se pongan de mani­fiesto las áreas que en la sección ocupan las distintas especies, áreas que son proporcionales a la representación respectiva de aquéllas en la masa total del pecton. La evaluación de las áreas relativas puede hacerse de una manera bastante rápida trazando los dibujos en cartulina, recortando luego los fragmentos que corresponden a las distintas especies y pesán­dolos. Debe tenerse presente que las secciones engloban una parte v iva superficial y una parte muerta basal, constituida por vainas, pedúnculos y precipitados minerales; esta parte muerta no debe entrar en el estudio de la composición de la comunidad, pero puede suministrar indicaciones acerca de la sucesión.

2 . M É T O D O S E X A C T O S PARA E L ESTUDIO D E L PECTON (PERIFITON) E X C L U S I V A M E N T E MICROSCÓPICO. — El estudio de

las comunidades de muy poco espesor, que no pueden ser ras-

padas sin dañar a un tanto por ciento muy elevado de las •células, plantea problemas completamente diferentes de los •ofrecidos por el estudio de un pecton de más espesor. Su reso­lución puede emprenderse siguiendo dos caminos distintos: a) introducción de una superficie experimental, y b) estudio directo de una superficie natural.

a) Introducción de una superficie experimental. — Los fundamentos de esta técnica son muy sencillos. Se introduce en el agua, por un cierto tiempo, una lámina de cristal o de celuloide, después se retira y se observan directamente con el microscopio los organismos que se han adherido sobre la misma, sin dañarlos, coloreándolos si es necesario —bac te r i a s— y efectuando los recuentos estadísticos que sean del caso. N A U -MANN (1925) aplicó este método a la determinación de las bacterias ferruginosas. Otros autores (HENRICI , 1933; Zo B E L L y A L L E N , 1933, etc., citados por Zo B E L L , 1946) siguen des­arrollando este método dentro de la bacteriología. Con él pretenden alcanzar dos fines : i .° , tener una idea del número to ta l de bacterias presentes en el medio, pues las fijadas sobre las láminas de cristal se hallan en relación numérica con el número de gérmenes que se cuentan por medio de cultivos en placas de agar, habiéndose dado coeficientes de correla­ción entre ambos valores, y 2°, estudiar las bacterias exclusiva­mente perifíticas. Si las láminas han estado sumergidas poco t iempo, se encuentran sobre ellas pocas bacterias; pero si la permanencia es demasiado larga, se forma una película continua en la cual los individuos son imposibles de contar; a esto se añade el desarrollo de otros organismos — algas — que estorban en la enumeración de las bacterias. Se señala como una de las ventajas de este método la de que los organismos moribundos o con poca vitalidad no llegan a adherirse a las láminas, sino solamente los que están en período de franca multiplicación.

B U T C H E R (1932, I946), I V L E V (1933) y G O D W A R D (1934 y z937)> n a n aplicado el mismo método al estudio de las algas. Se utilizan de preferencia portaobjetos o láminas de cristal

algo mayores —-de 50 x 75 mm. —•, que se sujetan a soportes adecuados, mantenidos a la profundidad deseada por medio de boyas y lastres (íig. 1). El autor usa una instalación sen­cillísima, muy cómoda en las largas excursiones, y especial­mente adecuada para ser usada en aguas corrientes. Un

Fig . 1. — Soporte de madera o material plástico para sostener portaobjetos sumergidos en el agua.

Varios de estos soportes pueden distribuirse a lo largo de una misma cuerda, que se m a n ­tiene en posición por medio de un lastre y una boya . (Copiado de Zo B E L L , 1946.)

alambre bastante largo sostiene un portaobjetos en cada uno de sus extremos; en el centro del mismo alambre se hace un aro, que se atraviesa con una rama o tronco delgado, mante­nido sujeto en la posición correcta por medio de grandes pie­dras (fig. 2). A l retirar los portaobjetos, éstos se guardan separadamente en tubos de diámetro ligeramente mayor que la anchura de las láminas, con formol al 4 por 100. A veces se fijan sobre los portaobjetos larvas de Simulium, que luego se •desprenden en el formol; pero pueden recuperarse en el fondo

de los tubos, si interesa contar todos los organismos. Las láminas de cristal se observan directamente bajo el micros­copio, usando cubreobjetos de tamaño grande, de los común-

F i g . 2. — Manera sencilla de disponer dos portaobjetos en la corriente de un ' ar royo.

Este sistema es muy práctico para excursiones, puesto que no requiere llevar más que Ios-portaobjetos , un rollo de alambre y unos alicates.

mente empleados para series histológicas. Para apreciar-cuantitativamente la población se cuentan los organismos presentes en cierto número de campos, escogidos al azar. El ' número y extensión de los campos que serán necesarios depen­den, naturalmente, del área mínima de la asociación que se haya establecido sobre el vidrio. Unas 10 áreas de 100 x ioo [i. son, generalmente, suficientes. Puede darse el caso que la población que se ha desarrollado sobre el portaobjetos sea_

tan densa, que imposibilite contar los individuos que la forman. En estas circunstancias, G O D W A R D (1937) raspa el portaobjetos en agua y hace una suspensión, en una fracción definida de la cual puede determinarse el número de organismos. E l uso de láminas presenta otra ventaja, y es la que permite apreciar gravimétricamente, con bastante exactitud, los organismos que se han fijado o crecido sobre ellas.

A l cabo de una semana de haber depositado los porta­objetos en el agua, se encuentra ya una notable población en su superficie; pero el número de organismos continúa aumen­tando durante cierto tiempo. B U T C H E R (1946) estima en veinte días el plazo necesario para completar la colonización, excepto durante el invierno, en cuya estación (en Inglaterra) hacen falta de cuarenta a sesenta días. G O D W A R D (1937) estudia los portaobjetos aproximadamente un mes después de haberlos instalado.

Es esencial tener una idea clara del alcance de este método, y para ello nada mejor que discutir las condiciones en que se verifica la colonización. Es bastante verosímil que gérmenes de todas las especies existentes en el biotopo tienen acceso a la lámina de vidrio; pero sólo una fracción del número total de especies podrán desarrollarse sobre el portaobjetos. Las que sean aptas para vivir de su superficie aumentan rápida­mente en húmero; su población crece de acuerdo con una curva logística, que es general en todos estos casos de ocupación de una nueva residencia ecológica. En tanto la población no se haya aproximado de manera suficiente a la asíntota superior de la curva —• con las inevitables oscilaciones ligadas a los ritmos de la comunidad—, no puede decirse que la vida que analizamos sobre el portaobjetos sea representativa de las co­munidades potenciales estables del biotopo en estudio.

De las observaciones reunidas en el gráfico 3 se deduce que un mes es un lapso de tiempo razonablemente suficiente para suponer que las indicaciones que entonces suministran los portaobjetos tienen ya valor. Sin embargo, es seguro que

a continuación de esta primera fase de ocupación de la super­ficie libre, viene una etapa en la que, por el juego de la com­petencia, se modifican las relaciones numéricas entre las dife-

№ de células de algas por mm?

7.000 -

T i i i " i r 4o 2o 3o 4o 5o 6o

Tiempo en días

Fig . 3. — Desarrollo de las algas sobre láminas de vidr io sumergidas en a g u a . Este gráfico se ha establecido para servir de orientación general acerca del plazo que es-

• necesario para obtener una población sensiblemente estable. I*a curva 1 es la media de 42 series obtenidas por B U T C H E R (1946), en distintos meses del año, para aguas corrientes de Hampshire (Inglaterra); la 2, media de dos series obtenidas en Barcelona, en un depó­sito artificial, entre abril y junio; la 3. media de 42 observaciones de B U T C H E R (1946) en

distintos meses del año y aguas estancadas de Hampshire (Inglaterra).

rentes especies hasta que resulta una composición más estable ( I V L E V , 1933). No tenemos datos sobre el tiempo que es necesario para que la sucesión, en la superficie de las láminas de vidrio, alcance una etapa comparable a aquella en que se hallan las sucesiones iniciadas desde mucho antes en las otras-residencias ecológicas del biotopo.

Otra razón que limita seriamente el valor de los datos obtenidos por el método que discutimos es la diferencia de naturaleza que existe entre l a superficie de los portaobjetos y las superficies naturales presentes en el biotopo •—piedras, conchas, plantas, madera—. De esta forma el método de la superficie experimental nos ilustra acerca de comunidades potenciales; pero no sobre las comunidades reales, porque la naturaleza del material y el relieve de su superficie influyen grandemente en la colonización. El vidrio acanalado o esme­rilado es más densamente colonizado que el liso, y cualquier material fibroso o poroso lo es más que una substancia com­pacta ( G O D W A R D , 1934; P O M E R A T y W E I S S , 1946). Los úl­

timos autores citados, estudiando la preferencia de diversos organismos marinos •—especialmente cirrípedos— con respecto a distintos materiales, distribuyen a éstos en la siguiente serie, que empieza por los predilectos y termina por los evitados: amianto, madera, plomo, vidrio, materiales plásticos, níquel, pintura, cinc.

Finalmente, debe señalarse un inconveniente de carácter práctico en la aplicación de este método, cuando se recorre una comarca para hacer un reconocimiento bidrobiológico, y es que resulta sumamente engorroso y a veces hasta imposible el volver a recoger, un mes más tarde, las láminas que se han dejado instaladas en las estaciones visitadas. Lo que acon­tece, generalmente, es que se recogen antes de tiempo, y enton­ces los datos que suministra su estudio tienen muy poco valor.

b) Estudio directo de una superficie natural. — Rocas, maderos, tallos, tubos de tricópteros y conchas de moluscos no pueden ser cómodamente estudiados al microscopio con luz reflejada, para contar y reconocer los organismos que cons­ti tuyen el perifiton. Tampoco puede pensarse en rasparlos o desprenderlos de una manera sencilla. Pero puede usarse un excelente artificio consistente en obtener un molde de colodión de la superficie, que incluya a la vez todas las partículas que se hallen depositadas sobre la superficie, o sea todo el perifiton.

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Este método no es nuevo. Había sido ideado en botánica y a desde principios de siglo (BUSCALIONI y P O L L A C C I , 1901, •citados por W E N Z L ) para estudiar la topografía superficial de las hojas y especialmente la distribución y estado de abertura de los estomas. También se ha empleado para investigar los hongos epífitos. E l mismo método se ha usado para la busca de esporas de carbones fósiles en Norteamérica (según una referencia incidental en K O S A N K E , 1943), y presenta numerosas ventajas en el estudio paleoecológico de sedimentos lacustres ( M A R G A L E F , 1947 b).

El detalle de las manipulaciones ha sido desarrollado por L O N G y C L E M E N T S (1934) y por W E N Z L (1940, 1941). Se han

ensayado diferentes productos para obtener las películas — ni­trocelulosa, metilcelulosa, oxipropilcelulosa, etilcelulosa, ecetil-celulosa—, pero se ha visto que los mejores resultados se •obtienen con nitrocelulosa y acetilcelulosa. En general, se prefiere la nitrocelulosa (celoidina) disuelta en una mezcla de alcohol etílico y éter (colodión), a la que se recomienda añadir unas gotas de aceite de ricino para disminuir la rigidez de las películas y evitar resquebrajaduras y ondulaciones. La aplicación de este método al estudio del perifiton constituye una novedad, y por esta razón se explica en lo que sigue con •cierta extensión la manera de operar.

Piedras pequeñas o fragmentos de tamaño adecuado de rocas mayores, así como pedazos de madera, tallos, conchas y otros objetos cuya superficie desee estudiarse, se recolectan y conservan en formol, como cualquier muestra de algas. Como que la observación del perifiton se hará en el seno de un medio más refringente que el agua — celoidina —, puede ser conve­niente teñir previamente a los organismos, para apreciar luego mejor sus detalles. Se usa cualquiera de los métodos de tin­ción corrientes, introduciendo la piedra o el objeto, por entero, en el colorante. Luego se lava y se pasa por la serie de alco­holes hasta deshidratación completa. Finalmente se l leva al mismo disolvente de la nitrocelulosa, o sea, a una mezcla de

una parte de alcohol absoluto y tres partes de éter. Todas-

estas manipulaciones pueden quedar listas en medio día. Las

piedras se extraen de la mezcla alcohol-éter y, sin aguardar a

que su superficie quede completamente seca, pero sí a que

se haya evaporado una parte del líquido que la moja, se vierte

con cuidado una pequeña cantidad de colodión, en disolución

poco espesa, y se deja secar unos minutos, hasta que, evaporán­

dose el disolvente, quede la nitrocelulosa formando una pelí­

cula consistente. Conviene que el grosor de la película sea

mínimo, aunque proporcionado al espesor de la comunidad que

va a estudiarse. Se procede después a desprender fragmentos

de la película, que no es necesario que sean muy extensos.

Es to se hace fácilmente por medio de unas pinzas puntiagudas,

levantando un borde y arrancando con suavidad; también

puede ser útil romper la piedra, o lo que sea, desde la parte

opuesta a la película que se va a aprovechar. Los fragmentos-

de película se montan entonces, extendiéndolos en una gota

del medio de montaje, que se ha dispuesto previamente sobre

un portaobjetos. A veces resulta útil anotar si la cara de la

película que mira hacia arriba en la preparación, es la que

estaba dirigida hacia la piedra o es la opuesta. E l balsama

del Canadá es un buen medio de montaje, pero requiere una

deshidratación cuidadosa, que no siempre es fácil de obtener

si se t rabaja rápidamente con mucho material. Por esta

razón puede resultar práctico usar como medio de montaje

una de las mezclas de hidrato de cloral, goma arábiga y glice-

rina, que emplean los entomólogos — la fórmula de H O Y E R , por ejemplo.

Las preparaciones dan una fiel imagen de la superficie

del objeto tratado, con todo el perifiton, de modo que es em­

presa fácil contar el número de individuos en una área deter­

minada. Estos recuentos son de fiar, pues si se trata de obte­

ner nuevas películas en una superficie ya tratada, se comprueba

como la primera película arrancada se ha llevado consigo prác­

ticamente todo el perifiton. E l área mínima de las asocia-

ciones perifíticas en la superficie de las rocas — y posiblemente también en la de la madera-—• es bastante mayor que la de las asociaciones que se hallan sobre los portaobjetos, porque el substrato es menos uniforme, de relieve desigual con mínimas diferencias de exposición y aun de naturaleza heterogénea en el caso de una roca formada por un agregado de minerales dife­rentes. Otra manera de describir este estado de cosas sería decir que nos hallamos frente a un mosaico de fragmentos de asociación microscópicos. De esto se deduce que la superficie real es mucho más compleja, como residencia ecológica, que la superficie experimental constituida por un portaobjetos. La investigación, aunque sea somera, de la distribución del peri-fiton sobre rocas de diversa naturaleza, a diferentes profundi­dades y con diferente exposición, pero situadas en una misma masa de agua, da idea de lo complicada que es la distribución de los organismos y plantea interesantes problemas de ecología de laboriosa resolución.

B I B I J O G R A F I A

* B E H N I N C , A. L., 1924 : Zur Erforschung der am Flussboden der Wol­ga lebenden Organismen. Monogr. d. biol. Wolga-Stat., n.° 1, pägs. 1-398.

B U T C H E R , R. W., 1932 : Notes on new and little known algae from the beds of rivers. New Phyto!., vol. 31, pag. 20-308.

—•, 1946 : Studies in the Ecology of Rivers, vr. The algal growth jn certain highly calcareous streams. / , Ecol., vol. 33, pägs. 268-283.

GODWARD, M., 1934 : A-n investigation of the causal distribution of algal epiphytes. Beih. Bot. Chi., vol. 52a, pägs. 506-539.

—, 1937 : An ecological and taxonomic investigation of the littoral algal flora of lake Windermere. / . Ecol., vol. 25, pägs. 496-568.

IviyEV, V. S., 1933 : Ein Versuch zur experimentellen Erforschung der Oekologie der Wasserbiocoenosen. Arch. f. Hydrob., vol. 25, pä-ginas 177-191. (Ref. en Ann. Biol., 1934, P^g- 184).

K O S A N K E , R. M., 1943 : The characteristic plant microfossils of the Pittsburgh and Pomeroy Coals of Ohio. Amer. Midi. Nat., vol. 29, pägs. ng -132 .

( i3 ) Los mét. para la invest, de las comunidades acuát. adnadas 259

L O N G , F . L . , a n d C L E M E N T S , F . E . , 1934 : T h e m e t h o d of c o l l o d i o n

f i l m s for s t o m a t a . Amer. J. Bol., v o l . 2 1 , p á g s . 7 - 1 7 . M A R G A I , E F , R . , 1946 : Ma te r i a l e s p a r a el e s tud io de la b i o l o g í a de l

l a g o de B a ñ ó l a s . Puhl. Inst. Biol. Api, v o l . 1, p á g s . 27-78.

— , 1947a : L i m n o s o c i o l o g í a . Monogr. Ciencia Moderna, 1 1 . 0 10, p á g s . 1-93.

— , 1 9 4 7 b : O b s e r v a c i o n e s m i c r o p a l e o n t o l ó g i c a s sob re l o s s ed imen tos l a cus t r e s m i o c é n i c o s de L i b r o s (Terue l ) . Estudios geológicos, n . ° 5, p á ­g i n a s 1 7 1 - 1 7 7 .

M E S C H K A T , A . , 1934 : D e r B e w u c h s in den R ö h r i c h t e des P l a t t e n ­

sees. Arch. f. Hydrobiol., v o l . 27, p á g s . 436-517 . (Ref . en Bot. Centralb.,

1935 . p á g . 375 )

N A U M A N N , F . , 1925 : W a s s e r w e r k b i o l o g y . Abderhalden's Handb. d.

biol Arbeitsmeth., Abt. 9, Teil 2 (1) , p á g s . 229-232.

—•, 1929 : D i e Z u c h t der A u f w u c h s e s u n d e r A n w e n d u n g de r

M e t h o d e des A u f w u c h s t r ä g e r s . Abderhalden's Handb. d. biol. Arbeits­

meth., Abt. 9, Teil 2 (2), p á g s . 1475-1480.

— , 1931 : L i m n o l o g i s c h e T e r m i n o l o g i e . Abderhalden's Handb. d.

biol. Arbeitsmeth., Abt. 9, Teil 8, p á g s . 1-776.

P O M E R A T , C . M . , and W E I S S , C . M . , 1946 : T h e in f luence of t e x t u r e

a n d c o m p o s i t i o n of sur face o n t he a t t a c h m e n t of s e d e n t a r y mar ine

o r g a n i s m s . Biol. Bull., v o l . 9 1 , p á g s . 57-65.

*Roi , l , , H . , 1939 : Z u r T e r m i n o l o g i e des P e r i p h y t o n s . Arch. f. Hydro­

biol, v o l . 35, p á g s . 59-69.

T H O M A S S O N , H . , 1925 : M e t h o d e n zur U n t e r s u c h u n g der M i k r o -

p h ) r t e n der l imn i schen L i t o r a l u n d P r o f u n d a l z o n e . Abderhalden's Handb.

d. biol. Arbeitsmeth. Abt. 9, Teil 2, p á g s . 6 8 1 - 7 1 2 .

W E N Z I , , H . , 1940 : D i e U n t e r s u c h u n g e p i p h y t i s c h e P i l z e n a c h d e m

A b d r u c k v e r f a h r e n . Chronica Botánica, v o l . 6, p á g . 103.

—•, 1941 : D i e B e s t i m m u n g des S p a l t ö f f n u n g s z u s t a n d e s m i t t e l s

Z j l o i d i n a b d r u c k e n . Chronica Botánica, v o l . 6, p á g . 250.

W n X E R , A . , 1920 : U e b e r d e n A u f w u c h s der U n t e r Wasserpflanzen.

Schrift. Physik.-Ökonom. Ges. Königsberg i. Pr., Festschrift M. Braun

{61-62) , p á g s . 55-56.

Y O U N G , O . W . , 1945 : A l i m i i o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n of p e r i p h y t o n

i n D o u g l a s L a k e , M i c h i g a n . Trans. Amer. Micr. Soc, v o l . 64, p á g s . 1-20.

Z o BEIJ,, C , 1946 : Mar ine M i c r o b i o l o g y . Chronica Botánica,

Waltham, XV + 240 p á g s .

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