Análisis de Flujos Metabólicos (MFA)

BT7434/5301 - Ingeniería Metabólica y FermentaciónAyudante: Carlos Humberto Gomez R.

10 de abril de 2014

La ingeniería metabólica evalúalos cambios que se generan enforma controlada en elmetabolismo

Estrategias basadas en laaplicación de la IngenieríaGenética, así como laoptimización del proceso logranincrementar de maneraimportante el rendimiento delproducto.

pero ?

Para lograr rendimientos de expresión cercanos al teórico, solo se lograría con la alteración de algunas de las rutas del metabolismo.

La velocidad de formación comoel rendimiento están limitadosen última instancia por lacanalización del carbono desdeel metabolismo central hacia laruta de biosíntesis del Producto.

Se debe contar entonces conmodelos matemáticos quedescriban el metabolismo de lacélula de interés.

La simulación matemática de unared metabólica permitedeterminar los nodos principales

de la misma y el rendimientoteórico del producto

Niveles de regulación de las rutas metabólicas

Control de la velocidad de reacción.

Control de las enzimas reguladoras.

Control genético.

NODO FLEXIBLE

Clasificación de los Nodos

NODO DÉBILMENTE RIGIDO

Clasificación de los Nodos

NODO FUERTEMENTE RIGIDO

Clasificación de los Nodos

Ejemplos

Fig. 3 Nodo débilmente rígido

Fig. 5 Nodo fuertemente rígido

Control de la velocidad de reacción.

Control de las enzimas reguladoras.

Flujos metabólicos

• Concepto:

– Flujo metabólico: tasa o velocidad a la que un sustratose convierte en producto mediante reaccionesbioquímicas, rutas metabólicas.

SustratoMetabolito Intermedio Producto

– Los metabolitos intracelulares (intermediarios) son muydifíciles de cuantificar.

– Desarrollo de herramientas para solucionar esteinconveniente.

Mediante el MFA se obtiene la distribución de flujos intracelulares en función de la medición de metabolitos externos.

Análisis de flujos metabólicos (MFA)

• Concepto:

– Análisis de flujos metabólicos (MFA): cálculo y elanálisis de la distribución de flujos de una víametabólica en un sistema biológico.

Ejemplo 1

Nomenclatura Significado

A Sustrato

C, E, F Producto

B, D, NADH Metabolitos intermediarios

NADH Co-factor

v Flujo metabólico

Definir el sistema.

Identificar las entradas y salidas del sistema.

Identificar restricciones (metabolitos).

Numero de reacciones.

Plantear los balances de materia.

Determinar los grados de libertad.

Modelación matemática del metabolismo

𝒅𝑵𝒊𝒅𝒕= 𝑭𝒊𝟎 − 𝑭𝒊+

𝒋=𝟏

𝒋=𝒏

𝜶𝒊𝒋𝒅𝜺𝒊𝒅𝒕

𝑁𝑖 = cantidad de sustancia del compuesto i

𝐹𝑖0= flujo de la sustancia i que entra al sistema (mol/tiempo)

𝐹𝑖= flujo de la sustancia i que sale del sistema (mol/tiempo)

𝛼𝑖𝑗= coeficiente estequiometrico del metabolito i

n = numero de reacciones en la red metabólica (sistema)

𝑑𝜀𝑖

𝑑𝑡=velocidad de la reacción o flujo metabólico

Ejemplo 1

Nomenclatura

Significado

A Sustrato

C, E, F Producto

B, D, NADH

Metabolitos intermediarios

NADH Co-factor

v Flujo metabólico

Plantear los balances de materia.

𝒅𝑵𝑨

𝒅𝒕= 𝑭𝑨𝟎 − 𝑭𝑨 - V1 + 0 + 0 + 0 + 0

𝒅𝑵𝒊𝒅𝒕= 𝑭𝒊𝟎 − 𝑭𝒊+

𝒋=𝟏

𝒋=𝒏

𝜶𝒊𝒋𝒅𝜺𝒊𝒅𝒕

𝒅𝑵𝑪

𝒅𝒕= 𝑭𝑪𝟎 − 𝑭𝑪+ 0 + V2 + 0 + 0 + 0

𝒅𝑵𝑩

𝒅𝒕= 𝑭𝑩𝟎 − 𝑭𝑩+ V1 - V2 - V3 + 0 + 0

𝒅𝑵𝑫

𝒅𝒕= 𝑭𝑫𝟎 − 𝑭𝑫+ 0 – 0 + V3 – V4 - V5

𝒅𝑵𝑬

𝒅𝒕= 𝑭𝑬𝟎 − 𝑭𝑬 + 0 + 0 + 0 + V4+ 0

𝒅𝑵𝑭

𝒅𝒕= 𝑭𝑭𝟎 − 𝑭𝑭 + 0 + 0 + 0 + 0 + V5

𝒅𝑵𝑵𝑨𝑫𝑯

𝒅𝒕= 𝑭𝑵𝑨𝑫𝑯𝟎 − 𝑭𝑵𝑨𝑫𝑯+0+V2+ 0 – 0 - 2V5

Importante:

Asumir estado pseudo-estacionario para los metabolitos intermediarios

B, D y NADH, los cambios metabólicos son muy rápidos (milisegundos

a décimas de segundos) en comparación con el crecimiento celular

(horas a días)

Ejemplo 1

𝒅𝑵𝑪

𝒅𝒕= 𝑭𝑪𝟎 − 𝑭𝑪+ 0 + V2 + 0 + 0 + 0

𝒅𝑵𝑨

𝒅𝒕= 𝑭𝑨𝟎 − 𝑭𝑨 - V1 + 0 + 0 + 0 + 0

𝒅𝑵𝑩

𝒅𝒕= 𝑭𝑩𝟎 − 𝑭𝑩+ V1 - V2 - V3 + 0 + 0

𝒅𝑵𝑫

𝒅𝒕= 𝑭𝑫𝟎 − 𝑭𝑫+ 0 + 0 + V3 – V4 - V5

𝒅𝑵𝑬

𝒅𝒕= 𝑭𝑬𝟎 − 𝑭𝑬 + 0 + 0 + 0 + V4+ 0

𝒅𝑵𝑭

𝒅𝒕= 𝑭𝑭𝟎 − 𝑭𝑭 + 0 + 0 + 0 + 0 + V5

𝒅𝑵𝑵𝑨𝑫𝑯

𝒅𝒕= 𝑭𝑵𝑨𝑫𝑯𝟎 − 𝑭𝑵𝑨𝑫𝑯 +0 +V2 + 0 + 0 - 2V5

−1000100

0100−101

0000−110

00100−10

00010−1−2

𝐴𝐶𝐸𝐹𝐵𝐷𝑁𝐴𝐷𝐻

= .

𝑉1𝑉2𝑉3𝑉4𝑉5

Ejemplo 1

Grados de libertad ?𝟎 = 𝟎 − 𝑭𝑪+ 0 + V2 + 0 + 0 + 0

𝟎 = 𝑭𝑨𝟎 − 𝟎 - V1 + 0 + 0 + 0 + 0

𝟎 = 𝟎 − 𝟎 + V1 - V2 - V3 + 0 + 0 𝑩

𝟎 = 𝟎 − 𝟎 + 0 + 0 + V3 – V4 - V5 (D)

𝟎 = 𝟎 − 𝑭𝑬 + 0 + 0 + 0 + V4 + 0

𝟎 = 𝟎 − 𝑭𝑭 + 0 + 0 + 0 + 0 + V5

𝟎 = 𝟎 − 𝟎 + 0 + V2 + 0 + 0 - 2V5 (NADH)

Importante:

Asumir estado pseudo-estacionario para los metabolitos intermediarios

B, D y NADH, los cambios metabólicos son muy rápidos (milisegundos

a décimas de segundos) en comparación con el crecimiento celular

(horas a días)

Ejemplo 1

Grados de libertad = # de reacciones - # metabolitos

Grados de libertad = 5 -3Nomenclatura

Significado

A Sustrato

C, E, F Producto

B, D, NADH Metabolitos intermediarios

NADH Co-factor

v Flujo metabólico

T: matriz de coeficientes estequiométricos

𝐴𝐶𝐵𝐷𝑁𝐴𝐷𝐻

= .

𝑉1𝑉2𝑉3𝑉4𝑉5

𝑭𝑪 = 0 + V2 + 0 + 0 + 0

−𝑭𝑨𝟎= - V1 + 0 + 0 + 0 + 0

𝟎 = V1 - V2 - V3 + 0 + 0 𝑩

𝟎 = 0 + 0 + V3 – V4 - V5 (D)

𝑭𝑬 = 0 + 0 + 0 + V4 + 0

𝑭𝑭 = 0 + 0 + 0 + 0 + V5

𝟎 = 0 – 0 + V3 –V4 - V5 (NADH)

Ejemplo 1

−1 0 0 0 00 1 0 0 0100

−101

−110

0−10

0−1−2

r : vector de flujos medibles

experimentalmente.

V : vector de flujos

intracelulares.

r = T T · V

T -1 *r = v

Revolver para :

A=1.0 mol/s

C=0.5 mol/s

Resolviendo (en unidades de mol/s).

1 = 1.0

2 = 0.5

3 = 0.5

4 = 0.25

5 = 0.25

Ejemplo 2

Sustrato (S)

1

Metabolito Intracelular 1 (A)

2 3

Metabolito Intracelular 2 (B) Producto 1 (P1)

4

Metabolito Intracelular 3 (C)

5 6

Producto 2 (P2) Producto 3 (P3)

Definir el sistema.

Identificar las entradas y salidas del sistema.

Identificar restricciones (metabolitos).

Numero de reacciones.

Plantear los balances de materia.

Determinar los grados de libertad.

Ejemplo 2

Paso 2: Balance en estado estacionario para metabolitos intracelulares

A: 1 - 2 = 0 1 = 2

B: 2 - 3 - 4 = 0 2 = 3 + 4

C: 4 - 5 - 6 = 0 4 = 5 + 6

Balance en estado estacionario.

Ecuación de balance metabólico

-rs -1 0 0 0 0 0 1

rp1 0 0 1 0 0 0 2

rp2 0 0 0 0 1 0 3

rp3 = 0 0 0 0 0 1 4

0 1 -1 0 0 0 0 5

0 0 1 -1 -1 0 0 6

0 0 0 0 1 -1 -1

6 reacciones, 3 metabolitos en estado estacionario.Hay 3 grados de libertad, hay que medir 3 flujos:

rs = 1 rp1 = 0,3 rp2 = 0,5

Ecuación de balance metabólico

-1 -1 0 0 0 0 0 1

0,3 0 0 1 0 0 0 2

0,5 0 0 0 0 1 0 3

0 = 1 -1 0 0 0 0 4

0 0 1 -1 -1 0 0 5

0 0 0 0 1 -1 -1 6

Se omitió rp3, la cual queda en función de v6. Es posible calcular rp3 resolviendo el sistema. Esto se utiliza para corroborar lo medido experimentalmente (rp3).

rp3 = 0 0 0 0 0 1

Ecuación de balance metabólico

-1 -1 0 0 0 0 0 1

0,3 0 0 1 0 0 0 2

0,5 0 0 0 0 1 0 3

0 1 -1 0 0 0 0 = 4

0 0 1 -1 -1 0 0 5

0 0 0 0 1 -1 -1 6

-1

Ecuación de balance metabólico

-1 0 0 0 0 0 -1 1

-1 0 0 -1 0 0 0,3 2

0 1 0 0 0 0 0,5 3

-1 -1 0 -1 -1 0 0 = 4

0 0 1 0 0 0 0 5

-1 -1 -1 -1 -1 -1 0 6

Resultado

1 1

1 2

0,3 3

0,7 = 4

0,5 5

0,2 6

Ejercicio 1BA

C

D E

F G

H

1

ATP

CO2

2 NAD+

NADH

3ATP

4

CO2

5

ATP

CO2

6 NAD+

NADH

7

NAD+

NADH

ATP

ADP

ADP

ADP

ADP

Reacciones

1

1. A + ATP C + CO2

2

2. B + NAD+ C3

3. C D + ATP4

4. C E + CO2

5

5. D + ATP F + CO2

6

6. D G + NAD+

7

7. F + ATP H + NAD+

Ojo! Sólo considerar una especie de cada par de co-factor: o ATP o ADP; o NAD+ o NADH, etc.

Balance en estado estacionario para metabolitos intracelulares

C: 1 + 2 - 3 - 4 = 0 1 + 2 = 3 + 4

D: 3 - 5 - 6 = 0 3 = 5 + 6

F: 5 - 7 = 0 5 = 7

ATP: - 1 + 3 - 5 - 7 = 0 3 = 1 + 5 + 7

NAD+: - 2 + 6 + 7 = 0 2 = 6 + 7

Balance en estado estacionario.

7 incógnitas, 5 metabolitos en estado estacionario 2 grados de libertad, hay que medir 2 metabolitos:rA = -2 rB = -3

Ecuación de Balance Metabólico

RA -1 0 0 0 0 0 0

RB 0 -1 0 0 0 0 0

RE 0 0 0 1 0 0 0 ν1

RG 0 0 0 0 0 1 0 ν2

RH 0 0 0 0 0 0 1 ν3

RCO2 = 1 0 0 1 1 0 0 ν4

0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν5

0 0 0 1 0 -1 -1 0 ν6

0 0 0 0 0 1 0 -1 ν7

0 -1 0 1 0 -1 0 -1

0 0 -1 0 0 0 1 1

7 incógnitas, 5 metabolitos en estado estacionario 2 grados de libertad, hay que medir 2 metabolitos:RA = -2 RB = -3

Ecuación de balance metabólicoRA -1 0 0 0 0 0 0

RB 0 -1 0 0 0 0 0

RE 0 0 0 1 0 0 0 ν1

RG 0 0 0 0 0 1 0 ν2

RH 0 0 0 0 0 0 1 ν3

RCO2 = 1 0 0 1 1 0 0 ν4

0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν5

0 0 0 1 0 -1 -1 0 ν6

0 0 0 0 0 1 0 -1 ν7

0 -1 0 1 0 -1 0 -1

0 0 -1 0 0 0 1 1

Ecuación de Balance Metabólico

-2 -1 0 0 0 0 0 0 ν1

-3 0 -1 0 0 0 0 0 ν2

0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν3

0 = 0 0 1 0 -1 -1 0 ν4

0 0 0 0 0 1 0 -1 ν5

0 -1 0 1 0 -1 0 -1 ν6

0 0 -1 0 0 0 1 1 ν7

Ecuación de Balance Metabólico

-1 0 0 0 0 0 0 -2 ν1

0 -1 0 0 0 0 0 -3 ν2

0 -1 0 1 1 0 1 0 ν3

-1 0 -1 -1 -1 0 -1 0 = ν4

0,5 -0,5 0 0,5 1 -0,5 0,5 0 ν5

-0,5 -0,5 0 -0,5 0 0,5 0,5 0 ν6

0,5 -0,5 0 0,5 0 -0,5 0,5 0 ν7

Resultado

2 ν1

3 ν2

3 ν3

2 = ν4

0,5 ν5

2,5 ν6

0,5 ν7

2 3

3

2

0.5

2.5

0.5

BA

C

D E

F G

H

ATP

CO2

NAD+

NADH

ATP

CO2

ATP

CO2

NAD+

NADH

NAD+

NADH

ATP

ADP

ADP

ADP

ADP

Matriz de coeficientes estequiométricos

Nomenclatura Significado

S Sustrato

P Producto

M Metabolitos intermediarios

T =

Matriz:1. Rango Completo. No hay dependencia lineal.2. Número de condicionamiento <100. Baja propagación de error.

• Sistema exactamente determinado:– Si el número de tasas de metabolitos medidos es igual al

número de grados libertad del sistema, entonces lasolución es única.

• Según la estructura de la matriz estequiométrica, el sistemapuede encontrarse de 3 formas:1. Determinado.2. Sobredeterminado.3. Subdeterminado

Análisis de flujos metabólicos

vT)(T r (T) -1-1

r -1)(T v

vT r

Análisis de Flujos metabólicos• Según la estructura de la matriz estequiométrica, el sistema puede

encontrarse de 3 formas:1. Determinado.2. Sobredeterminado.3. Subdeterminado

vT r

• Sistema sobredeterminado:– Si el número de tasas de metabolitos medidos es mayor al

número de grados libertad del sistema, entonces lasredundancias de valores de flujos pueden ser usadas para:– Calcular la «mejor» distribución de flujos intracelulares.– Corroborar la hipótesis de estado estacionario comparando

los valores calculados de flujos extracelulares versus losvalores experimentales (no empleados para solucionar elsistema).

• Sistema subdeterminado:– Si el número de tasas de metabolitos medidos es menor al

número de grados libertad hay un número infinito desoluciones para la red metabólica.

– Es necesario agregar restricciones: solución con optimizaciónlineal, imponiendo una función objetivo apropiada (max.biomasa; min. hidrólisis de ATP, etc.).

– Así, se obtiene una única distribución de flujos intracelularespor medio de la optimización.

Análisis de Flujos metabólicos

vT r

• Según la estructura de la matriz estequiométrica, el sistemapuede encontrarse de 3 formas:1. Determinado.2. Sobredeterminado.3. Subdeterminado

max biomasa

Análisis de flujos metabólicos (MFA)

• Herramienta utilizada para determinar flujos metabólicosintracelulares en función de las tasas de consumo (o producción) decompuestos medibles extracelularmente.

• Se emplean modelos estequiométricos de las vías y balances de masapara metabolitos intracelulares.

• Se miden los flujos de metabolitos extracelulares.– Unidad de medida característica: [mmol X · gDCW-1 · h-1]. Donde X es un

compuesto medible extracelularmente; DCW: biomasa en peso seco; h:tiempo (horas, días, etc.).

• Se obtiene un mapa de flujos metabólicos que permite comparardistintas condiciones y encontrar particularidades en la vía:– Nodos rígidos.

Por lo tanto, para utilizar MFA se necesita:• Matriz estequiométrica (T ).• Vector de flujos en estado estacionario (v).• Vector de flujos medibles (r). Considerar grados de libertad.

• Indica el número mínimo de tasas extracelulares a medir para resolverel sistema.Grados de libertad = n° Reacciones – n° metabolitos intracelulares.

PREGUNTAS