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19/05/2014 1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA EFICIÊNCIA Centro Universitário Franciscano Área de Ciências Tecnológicas Programa de Pós-Graduação em Nanociências Profa. Dr. Patrícia Gomes CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) - Método físico-químico de separação; - High performance liquid chromatography (HPLC). ANALITO FASE MÓVEL (FM) FASE ESTACIONÁRIA (FE) FE FE FE FM CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) VANTAGENS VANTAGENS - FE: utilizada várias vezes; - Tempo reduzido de análise; - Elevada resolução; - Análise qualitativa: identificação (tempo de retenção, espectro de absorção no UV e espectro de massas); - Análise quantitativa: DPR (< 5%); - Automação. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) DESVANTAGENS DESVANTAGENS - Elevado custo: equipamento e manutenção; - Geração de resíduos; - Experiência do operador. FE FE FE B A B A A A B B A A A B B B B A A A A A B B B B FM FM MECANISMOS DE SEPARAÇÃO MECANISMOS DE SEPARAÇÃO MECANISMOS DE SEPARAÇÃO MECANISMOS DE SEPARAÇÃO PROCESSOS MECÂNICOS MECÂNICOS FÍSICOS FÍSICOS - Adsorção - Partição: fase normal e fase reversa - Exclusão QUÍMICOS QUÍMICOS - Troca iônica

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Page 1: CLAE 2014.pdf

19/05/2014

1

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIAEFICIÊNCIA

Centro Universitário FranciscanoÁrea de Ciências Tecnológicas

Programa de Pós-Graduação em Nanociências

Profa. Dr. Patrícia Gomes

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)

- Método físico-químico de separação;

- High performance liquid chromatography (HPLC).

ANALITO

FASE MÓVEL

(FM)

FASE ESTACIONÁRIA

(FE)

FE

FE

FE

FM

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)

VANTAGENSVANTAGENS

- FE: utilizada várias vezes;

- Tempo reduzido de análise;

- Elevada resolução;

- Análise qualitativa: identificação (tempo de retenção, espectro

de absorção no UV e espectro de massas);

- Análise quantitativa:

� DPR (< 5%);

- Automação.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)

DESVANTAGENSDESVANTAGENS

- Elevado custo: equipamento e manutenção;

- Geração de resíduos;

- Experiência do operador.

FE

FE

FE

BA

BA

A AB

B

A

AA

B

B

B

B

A

A

A

A

A

B

B

BB

FM

FM

MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO

PROCESSOS

MECÂNICOSMECÂNICOSFÍSICOSFÍSICOS

- Adsorção- Partição: fase normal e

fase reversa- Exclusão

QUÍMICOSQUÍMICOS

- Troca iônica

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MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO

ADSORÇÃOADSORÇÃO

- Fase estacionária (FE): sólida

- Fase móvel (FM): líquido

- A separação baseia-se na competição que existe entre as

moléculas da amostra e as da FM em

ocupar os sítios ativos na

superfície de um sólido (FE).

MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO

PARTIÇÃOPARTIÇÃO

- A separação baseia-se nas diferentes solubilidades que

apresentam os componentes da amostra na FM e FE;

- Os componentes de maior afinidade (solubilidade) com

a FE serão seletivamente retirados por

ela, enquanto que os de menor afinidade

serão transportados mais

rapidamente pela FM.

FASE NORMAL: FE POLAR FM APOLARFASE NORMAL: FE POLAR FM APOLAR

FASE REVERSA: FE APOLAR E FM POLARFASE REVERSA: FE APOLAR E FM POLAR

MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO

TROCATROCA IÔNICAIÔNICA

- Separação de compostos iônicos e compostos muito polares;- FE: resinas trocadoras de íons;- Otimização: força iônica, fatores de carga e pH.

EXCLUSÃO POR TAMANHOEXCLUSÃO POR TAMANHO- Não envolve forças químicas de interação;- FE: diâmetros de poros ;- Cromatografia por exclusão de tamanho: size exclusion

chromatography

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

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INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

FASE MÓVEL

- Elevado grau de pureza: HPLC- Água: tipo Milli-Q®- Baixa viscosidade.- Elevado ponto de ebulição- Baixa toxicidade- Custo compatível- Cuidados: filtração e desgaseificação

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

BOMBA

- Pressurização da FM para facilitar a passagem pela FE e reduzir o tempo de análise

- Ampla faixa de fluxo- Fácil de trocar de solvente- Gradientes de eluição

Tempo (min)

Solv

ente

B (

%)

Tempo (min)

Solv

ente

B (

%)

ISOCRÁTICOISOCRÁTICO GRADIENTEGRADIENTE

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

INJETOR

- Sistema de introdução da amostra;- Alça de amostragem (injection loop): 1 a 500 µl- Tipo: manual e automática (auto sampler)

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

INJETOR

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4

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

INJETOR

VmáximoVmáximo ((µlµl)= )= ππππππππ (raio)(raio)22 (comprimento) (0,01)(comprimento) (0,01)

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

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19/05/2014

5

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

PRÉ-COLUNAS

- Localizada entre o injetor e a coluna de separação;- Comprimento: 2-5 cm e Diâmetro=coluna de separação;- Mesma fase estacionária da coluna de separação;

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

COLUNAS

- Cartuchos de aço ou plástico: comprimento, diâmetro interno e tamanho da partícula;

- Separação: adsorção ou partição.

ADSORÇÃO: grupos polares da molécula nos grupos polares da

fase estacionáriaFE: sílica-gel

PARTIÇÃO: entre a porção lipofílica da molécula na fase

estacionáriaFE: octadecilsilano ou C18 ou ODS

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

COLUNAS

- ODS (C18): fase mais utilizada- Octil (C8) e butil silano (C4): alternativa a C18- Cianopropil sílica-gel (CN)

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

DETECTORES

- UV/VIS

- Arranjo de fotodiodos (DAD/PDA)

- Fluorescência

- Eletroquímico

- Massa

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

DETECTOR UV/VIS

- Moderadamente seletivo e sensível

- Amplamente utilizado

- Aplicação simples

- Nível de detecção: ng ou µg

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INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

DETECTOR PDA/DAD

- PDA: Photodiode array detector

- DAD: Diode array detector

- Comprimento de onda variável

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

DETECTOR PDA/DAD

- Pureza do pico

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160

*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\003-0301.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\005-0501.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\007-0701.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\009-0901.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\011-1101.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\013-1301.D)*DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (DLX CINETICA ACIDA\DLX CINETICA HCL 0_1N2008-10-03\015-1501.D)

2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 min

A

B

DETECTOR PDA/DAD

- Pureza do pico

Figura - Estudo da cinética de degradação ácida das soluções de duloxetina

(DLX) (10 µg/ml) nos tempos: zero, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos, onde (A)

DLX e (B) produto de degradação majoritário, PDA-14.

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

DETECTOR PDA/DAD

- Pureza do pico

min0 2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750 2

.34

6

4.5

90

14

.22

5

Figura - Cromatograma do produto de degradação ácida (PDA-14) isolado em CCD preparativa.

min0 2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

100

200

300

400

DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DULOXISOLAM\DEG000000.D)

14.2

15

nm200 220 240 260 280 300 320 340 360 380

mAU

0

100

200

300

400

500

*DAD1, 14.212 (589 mAU, - ) Ref=13.799 & 14.799 of DEG000000.D a

min0 2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DULOXETINA300409\DLXPDIDENTIFIC2009-04-30\009-0801.D)

12

.22

1

nm200 220 240 260 280 300 320 340 360 380

mAU

0

100

200

300

400

*DAD1, 12.224 (504 mAU,Apx) Ref=11.597 & 12.797 of 009-0801.Dc

min0 2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

DAD1 A, Sig=230,4 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DULOXETINA300409\DLXPDIDENTIFIC2009-04-30\008-0701.D)

14

.48

1

nm200 220 240 260 280 300 320 340 360 380

mAU

0

50

100

150

200

*DAD1, 14.557 (240 mAU, - ) Ref=0.291 & 15.091 of 008-0701.D

b

Figura - Cromatogramas obtidos para PDA-14 (a), 1-naftol (b) e 2-naftol (c).

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

DETECTOR FLUORESCÊNCIA

- Altamente seletivo e sensível

- Compostos que sofrem fluorescência ou pode ser derivatizados

com grupos fluorescentes

- λ de excitação e λ de emissão

- Nível de detecção: pg

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INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

DETECTOR- ELETROQUÍMICO

- Altamente seletivo e sensível

- Compostos que sofrem reação de oxidação ou redução

- Nível de detecção: pg

- Uso: catecolaminas, fenóis e diversos fármacos

INSTRUMENTAÇÃOINSTRUMENTAÇÃO

DETECTOR- MASSAS

- Altamente seletivo e sensível

- Compostos orgânicos que se ionizam

- Especificidade: leitura da massa (carga) dos íons

- Nível de detecção: pg

O

S

NH . H Cl

CH 3

PM= 297 PM= 297

((TheThe MerckMerck, 2001), 2001)

� TEMPO DE RETENÇÃO (tR): Medida entre o ponto de injeção e omáximo do pico;

� TEMPO MORTO (tM):Tempo de eluição de um soluto não retido;

� tR’ : tempo que o soluto permanece na fase estacionária.

PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOSPARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOSPARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

• SIMETRIA DO PICO ((TailingTailing factorfactor))

tP: largura do pico medida da cauda a partir do máximo do pico

fP: largura do pico medida da frente a partir do máximo do pico

P

Ps

f

tA =