CHARAKTERISIERUNG DER AM METABOLISMUS SUBSTITUIERTERNAPHTHALINSULFONSAUREN DURCH PSEUDOMONAS SP.BN6 BETEILIGTEN

ENZYME

Von der Fakultät Geo- und Biowissenschaften derUniversität Stuttgart zur Erlangung der Würde eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)genehmigte Abhandlung

vorgelegt vonANDREA KUHM

aus Sindelfingen

Hauptberichter: Prof. Dr. H.-J. KnackmussMitberichter: Prof. Dr. D. H. Wolf

Tag der mündlichen Prüfung: 14. 12. 92

Institut für Mikrobiologie der Unsiversität Stuttgart1992

INHALTSVERZEICHNIS:

1.

2.

2.1.

2.2.

2.3.

2.4.

2.5.

2.6.

2.7.

2.8.

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2.8.2.

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2.8.8.

2.8.9.

2.8.10.

2.8.11.

2.8.12.

2.9.

2.10.

2.11.

2.12.

EINLEITUNG

MATERIAL UND METHODEN

Organismen

Stammerhaltung

Nährlösung

Zellanzuchten

Messung des Bakterienwachstums

Herstellung von Rohextrakten

Proteinbestiinmungen

Bestimmung von Enzymaktivitäten

Naphthalin-1,2-Dioxygenase

l,2-Dihydroxy-l,2-dihydronaphthalin-Dehydrogenase

1,2-Dihydroxynaphthalin-Dioxygenase

2-Hydroxychromen-2-carbonsäure-Isomerase

as-2'-Hydroxybenzalpyruvat-Aldolase

Salicylaldehyd-Dehydrogenase

Brenzcatechin-2,3-Dioxygenase

Gentisinsäure-1,2-Dioxygenase

2,3-Dihydroxybiphenyl-l,2-Dioxygenase

2-Hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoat-(HOPDA)-Hydrolase

Katalase

1,2-Naphthochinon-Reduktase

Bestimmung von Enzymaktivitäten mit Hilfe der HPLC

Anreicherung von Enzymen

Ultrafiltration

Bestimmung des Molekulargewichtes von Proteinen durch

Seite

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33

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35Gelfiltration

2.13. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 36

2.14. Native Polyacrylamidgelelektrophorese 38

2.15. Aminosäure-Sequenzierung 39

2.16. Konzentrationsbestimmung von Substraten und Metaboliten 39

2.16.1. Bestimmung von Pyruvat 39

2.16.2. Bestimmung von Glukose 39

2.16.3. Bestimmung von Thiolgruppen 40

2.16.4. Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) 41

2.17. Synthesen von Chemikalien 41

2.17.1. Synthese von Hydroxy-l,2-naphthochinonen 41

2.17.1.1. Herstellung von 5-Hydroxy-l,2-naphthochinon 41

2.17.1.2. Präparation von 6-Hydroxy-l,2-naphthochinon 43

2.17.1.3. Synthese von 7-Hydroxy-l,2-naphthochinon 43

2.17.2. Synthese von Trihydroxynaphthalinen 44

2.17.2.1. Präparation von 1,2,6-Trihydroxynapthalin 44

2.17.2.2. Synthese von 1,2,7-Trihydroxynaphthalin 44

2.17.2.3. Synthese von 1,2,5-Trihydroxynaphthalin 44

2.17.3. Enzymatische Präparation von 2-Hydroxychromen-2-carbonsäure 45

2.17.4. Herstellung von 2,5- und 2,6-Dihydroxychromen-2-carbonsäure 46

2.17.5. Herstellung von 2-Hydroxybenzo[g]chromen-2-carbonsäure 46

2.17.6. Herstellung von cw-2'-Hydroxybenzalpyravat 47

2.17.7. Herstellung von 2',4'-Dihydroxybenzalpyruvat 47

2.17.8. Herstellung von 2',6'-Diyhdroxybenzalpyruvat 48

2.17.9. Synthese von Benzalpyruvat 48

2.17.10. Herstellung von 2-Hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoat (HOPDA) 48

2.18. Bestimmung der Autoxidationsraten von (substituierten) Dihydroxy- 49naphthalinen

2.19. Präparative Aufarbeitung von Metaboliten durch Hochdruck- 49flüssigkeitschromatographie (HPLC)

2.20. Schmelzpunktbestimmung 50

2.21. Spektroskopische Methoden 50

2.21.1. UV-Spektroskopie 50

2.21.2. Massenspektrometrie 50

2.22. Chemikalien 50

3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 52

3.1. Induktion der am Abbau von Naphthalin-2-sulfonsäure beteiligten 52Enzyme inPseudomonas sp. BN6

3.2. Hemmung der Naphthatinsulfonsäure-Dioxygenase aus 54Pseudomonas sp. BN6 durch Naphthalin

3.3. Trennung der am Abbau von Naphthalin-2-sulfonsäure beteiligten 55Enzyme aus Pseudomonas sp. BN6 durch Anionenaustausch- »Chromatographie

3.4. Anreicherung und Charakterisierung einer 1,2-DihydroxynaphthaIin- 57Dioxygenase (DHNDO) aus Pseudomonas sp. BN6

3.4.1. Anreicherung der DHNDO aus Pseudomonas sp. BN6 57

3.4.2. Moiekulargewichtsbestimmung der DHNDO und ihrer Untereinheiten 62

3.4.3. Bestimmung der NHL-termmalen Aminosäuresequenz der DHNDO 65aus Pseudomonas sp.TBN6

3.4.4. Produktanalyse des Umsatzes von 1,2-Dihydroxynaphthalin (1.2DHN) 66durch eine vollständig aufgereinigte DHNDO aus Pseudomonassp. BN6 und durch Rohextrakte verschiedener Stämme

3.4.5. Abhängigkeit der DHNDO aus Pseudomonas sp. BN6 von zweiwertigen 67Eisen-Ionen

3.4.6. Hemmung der angereicherten DHNDÖ aus Pseudomonas sp. BN6 68durch verschiedene potentielle Inhibitoren

3.4.7. Autoxidation von 1.2DHN und von verschiedenen Trihydroxy- 69naphthalinen

3.4.8. Umsatzaktivitäten der DHNDO aus Pseudomonas sp. BN6 mit 72verschiedenen Substraten und Analyse der Reaktionsprodukte

3.4.8.1. Umsatz von Di- und Trihydroxynaphthalinen 72

3.4.8.2. Umsatz von 1,2-Dihydroxyanthracen und Alizarin 74

3.4.8.3. Umsatz von (substituierten) Brenzcatechinen 75

3.4.8.4. Umsatz von Dihydroxybiphenylen 77

3.4.9. Relative Aktivitäten der angereicherten DHNDO aus Pseudomonas 79sp. BN6 und von Rohextrakten aus verschiedenen Naphthalinverwertenden Stämmen mit 1,2-Diolen

3.5. Toxische Metabolite beim Abbau von (substituierten) Naphthalin- 82sulfonsäuren

3.6. Anreicherung und Charakterisierung von 2-Hydroxychromen-2- 87carbonsäure-Isomerase(n) aus verschiedenen Naphthalin- bzw.Naphthalin-2-sulfonsäure verwertenden Bakterien

3.6.1. Versuche mit Rohextrakten 87

3.6.2. Anreicherung von HCCA-Isomerasen aus Pseudomonas testosteroni A3 89und Pseudomonas sp. BN6 durch Anionenaustauschchromatographie

3.6.3. Nachweis von freien SH-Gruppen und Glutathion oxidierenden 92Aktivitäten in Rohextrakten verschiedener Naphthalin- und 2NS-verwertender Bakterienstämme

3.6.4. Glutathion als möglicher Cofaktor der HCCA-Isomerasen aus 93Pseudomonas testosteroni A3 und Pseudomonas sp. BN6

3.6.5. Stabilität und Reaktivierung der HCCA-Isomerasen aus Pseudomonas 96testosteroni A3 und Pseudomonas sp. BN6 durch Glutathion beiverschiedenen pH-Werten

3.6.6. Die Wirksamkeit anderer Thiole für die Aktivierung der HCCA- 98Isomerasen aus Pseudomonas testosteroni A3 und Pseudomonas sp. BN6

3.6.7. Hemmung der HCCAI aus Pseudomonas testosteroni A3 durch 100p-Chlormercuribenzoat

3.6.8. Bestimmung der Kj.-Werte der HCCA-Isomerasen aus Pseudomonas 101testosteroni A3 und Pseudomonas sp. BN6 für ihr Substrat

3.6.9. pH-Optima der HCCA-Isomerasen aus Pseudomonas testosteroni A3 und 102Pseudomonas sp. BN6

3.6.10. Abhängigkeit der HCCA-Isomerasen aus Pseudomonas testosteroni A3 103und Pseudomonas sp. BN6 von Metallionen

3.6.11. Aktivierbarkeit der HCCA-Isomerase aus Pseudomonas testosteroni A3 104durch Imidazol

3.6.12. Anreicherung der HCCAI aus Pseudomonas testosteroni A3 105

3.6.13. Anreicherung der HCCAI aus Pseudomonas sp. BN6 113

3.6.14. Abschätzung der molekularen Massen der HCCA-Isomerasen aus 114Pseudomonas testosteroni A3 und Pseudomonas sp. BN6 durchGelfiltration

3.6.15. Analyse der aus HCCA durch angereicherte HCCA-Isomerasen aus 115Pseudomonas testosteroni A3 und Pseudomonas sp. BN6 gebildetenProdukte

3.6.16. Umsatz von (substituierten) 2-Hydroxychromen-2-carbonsäure(n) durch 117Ruhezellen von Pseudomonas sp. BN6 und Pseudomonas testosteroni A3

3.6.17. Relative Umsatzraten der HCCA-Isomerasen in Rohextrakten 120verschiedener Stämme und angereicherten HCCA-Isomerasen ausPseudomonas testosteroni A3 und Pseudomonas sp. BN6 für (substituierte)2-Hydroxychromen-2-carbonsäuren

3.7. Anreicherung und Charakterisierung der cir-2'-Hydroxybenzalpyruvat- 124Aldolase (HBPA) aus Pseudomonas sp. BN6

3.7.1. Stabilität der HBPA aus Pseudomonas sp. BN6 unter verschiedenen 124Lagerbedingungen

3.7.2. Anreicherung der cis-2'-Hydroxybenzalpvruvat-Aldolase aus 124Pseudomonas sp. BN6

3.7.3. Molekulargewichtsbestimmung der os-2'-Hydroxybenzalpyruvat- 128Aldolase und ihrer Untereinheiten

3.7.4. pH-Optimum der c«-2'-Hydroxybenzalpyruvat-Aldolase (HBPA) aus 130Pseudomonas sp. BN6

3.7.5. Bestimmung der NH^terminalen Aminosäuresequenz 130

3.7.6. Analyse der Produkte aus dem Umsatz von as-2'-Hydroxybenzalpyruvat 131durch die aufgereinigte HBPA aus Pseudomonas sp. BN6

3.7.7. Hemmung der HBPA aus Pseudomonas sp. BN6 durch 132p-Chlormercuribenzoat

3.7.8. Intermediäre Bildung einer Schiff sehen Base während des Umsatzes von 134c£s-2'-Hydroxybenzalpyruvat durch die HBPA aus Pseudomonas sp. BN6

3.7.9. Produkthemmung der HBPA aus Pseudomonas sp. BN6 durch 136Salicylaldehyd und 4-Hydroxysalicylaldehyd

3.7.10. Hemmung der HBPA aus Pseudomonas sp. BN6 durch 2-Hydroxy-6- 137oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoat(HOPDA)

3.7.11. Umsatz von Dihydroxybenzalpyruvaten durch die HBPA aus 139Pseudomonas sp. BN6 und Analyse der Reaktionsprodukte

3.7.12. Bestimmung der Substratspezifitäten der HBPA aus Pseudomonas 142sp. BN6 und Vergleich mit den Substratspezifitäten andererNaphthalin oder Naphthalinsulfonsäuren verwertenden Stämmen

3.8. Untersuchungen zur 2,3-Dihydroxybiphenyl-l,2-Dioxygenase und 1452-Hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoat-HydrolaseinPseudomonas paueimobilis Ql

3.8.1. Induktion der am Umsatz von Naphthalin und Biphenyl beteiligten 145Enzyme aus Pseudomonas paueimobilis Ql

3.8.2. Anionenaustauschchromatographie mit Rohextrakten aus Pseudomonas 147paueimobilis Ql nach Wachstum mit Naphthalin oder Biphenyl

3.8.3. Substratspezifität der beiden durch AAC getrennten ringspaltenden 150Dioxygenasen aus Pseudomonas paueimobilis Ql

3.8.4. Identifizierung des von Taira et al. (1988) klonierten und sequenzierten 151DHBPDO-kodierenden Gens

3.8.5. HBP-AldolaseundHOPDA-Hydrolaseausfteudo/jio/iaspaMamoW/wQl 152und Vergleiche mit der HBPA aus Pseudomonas sp. BN6

3.9. Trennung der am Naphthalin-, Naphthalinsulfonsäure- oder Biphenyl- 156abbau beteiligten Enzyme aus verschiedenen Bakterienstämmen durchAnionenaustauschchromatographie und Vergleich der Elutionspofile

3.9.1. Kurze Charakterisierung der durch AAC angereicherten extradiol 161spaltenden Dioxygenasen aus verschiedenen Bakterienstämmen

3.9.2. Trennung von Brenzcatechin-2,3-Dioxygenasen und 1,2-Dihydroxy- 163naphthalm-Dioxygenasen durch native Gelelektrophorese

3.9.3. Abhängigkeit der 2-Hydroxychromen-2-carbonsäure-Isomerasen 165verschiedener Stämme von reduziertem Glutathion

4. DISKUSSION 167

4.1. Abbau von Naphthalinsulfonsäuren und von Naphthalin 167

4.1.1. Die initiale Dioxygenierung 169

4.1.2. Mechanismen der Rearomatisierung von 1,2-Dihydroxy-1,2- 170dihydronaphthalinen

4.1.3. Induktion der am Abbau von Naphthalin und Naphthalinsulfonsäure 171beteiligten Enzyme

4.2. Vergleich der 1,2-Dihydroxynaphthalin-Dioxygenase aus Pseudomonas 173sp. BN6 mit anderen extradiol spaltenden Dioxygenasen

4.2.1. Primärstruktur und molekularer Aufbau 173

4.2.2. Substratspezifitäten 177

4.3. Die 2-Hydroxychromen-2-carbonsäure-Isomerase 179

4.3.1. Die Beteiligung der 2-Hydroxychromen-2-carbonsäure-Isomerase 179(HCCAI) am Metabolismus von Naphthalin und Naphthalinsulfonsäuren

4.3.2. Der Einfluß von Thiolen auf die 2-Hydroxychromen-2-carbonsäure- 179Isomerasen

4.3.3. Vergleich der 2-Hydroxychromen-2-carbonsäure-Isomerasen aus 181Pseudomonas sp. BN6 und Pseudomonas testosteroni A3 mit dementsprechenden Enzym aus Pseudomonas putida NCIB 9816

4.3.4. Substratspezifität 182

4.4. Die c£s-2'-Hydroxybenzalpyruvat-Aldolase (HBPA) aus Pseudomonas 184sp. BN6

4.4.1. Vergleich von as-2'-Hydroxybenzalpyruvat-Aldolase (HBPA) 184und 2-Hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoat-Hydrolase (HOPDAH)

4.4.2. Mechanismus einer Aldolase-Reaktion 186

4.4.3. Vergleich der HBPA aus Pseudomonas sp. BN6 mit anderen Aldolasen 187

4.4.4. Einfluß von Substituenten der Substrate auf die Umsetzbarkeit durch 191die HBPA

4.4.5. Bakterieller Metabolismus (substituierter) Zimtsäuren 192

4.5. Analyse und Bewertung der durch die DHNDO aus Pseudomonas 194sp. BN6 mit verschiedenen Substraten gebildeten Produkte

4.5.1. Dioxygenierungvonl,2DHN 194

4.5.2. Oxidationvonl,2,5THN 197

4.5.3. Oxidationvonl,2,6THN 200

4.5.4. Oxidationvonl,2,7THN 202

4.5.5. Oxidationvon2,3-und3,4DHBP 205

4.6. Vergleich der Abbauwege ein- und mehrkerniger Aromaten 207

4.6.1. Mikrobielle Strategien bei der Mineralisierung aromatischer 207Verbindungen

4.6.2. Substratspezifität der am Abbau verschiedener aromatischen 208Verbindungen beteiligten isofunktionellen Enzyme

4.6.3. Genetische Organisation von extradiol spaltenden Abbauwegen 209

4.6.4. Metabolismus von 1,2-Dihydroxyanthracen (1,2DHA) durch 210Pseudomonas sp. BN6

4.6.5. Metabolismus von Naphthalin und Biphenyl durch Pseudomonas 213paueimobilis Ql

4.7. Ausblick 215

5. LITERATURVERZEICHNIS 218

6. ANHANG 228