能够作为基因克隆载体的 DNA 分子具备一些特殊的性质。其中最重要的一点是能够在宿主细胞内进行复制，这样才能在宿主细胞中产生出大量重组 DNA 分子并传递给子代细胞。克隆载体还需要有相对较小的体积，理想的情况下不超过 10 Kb ，因为大分子容易在纯化过程中被折断，同时也会给其他一些操作带来困难。在细菌细胞中存在两种 DNA 分子能够满足这些条件：质粒和噬菌体染色体。

Chapter 2: Vehicles for Gene Cloning: Plasmids

and Bacteriophages

2.1 质粒

2.1.1 质粒的基本性质 (basic features)

质粒是细胞中染色体外的一种能自我复制的环状双链 DNA 分子。质粒不能利用染色体上的复制起点，因此，所有的质粒都至少含有一段可作为复制起点的DNA 序列，也就是说质粒能够在细胞内独立于宿主细胞本身的复制周期而实现扩增。小一些的质粒可以利用宿主细胞本身的 DNA 聚合酶来进行自我复制，而大一些的质粒本身携带有能够编码自身质粒复制所需的专一性酶的基因。

A circular, double-stranded unit of DNA that replic

ates within a cell independently of the chromosomal

DNA. Plasmids are most often found in bacteria and

are used in recombinant DNA research to transfer g

enes between cells.

有一小类质粒还能够将自己插入到宿主细胞染色体中进行复制。这些整合型质粒可以以这种形式稳定存在于细胞中很多代，但也会在某些阶段以独立的成分存在。具有这种性质的质粒又叫附加体（ episom

e ）。整合也是一些噬菌体染色体的重要特性。

2.1.2 大小和拷贝数 (size and copy number)

质粒的大小和拷贝数对于基因克隆来说尤为重要。质粒的大小范围从 1.0 到 250 Kb 不等，其中只有很小的一部分能够在克隆实验中得到应用。 拷贝数指的是在通常情况下，一个细菌细胞中某种质粒的分子数。现在还不清楚控制拷贝数的因素。一般来说，一个作为克隆载体的质粒需要在细胞中以多拷贝的形式存在，这样才能够获得大量的重组 DNA 分子。

2.1.3 接合性和相容性 (conjugation and compatibility)

质粒可以分为两大类：结合性质粒（ conjugative plasmid) 和非结合性质粒 (non-conjugative plasmid) 。接合性质粒除了自主复制所必须的基因以外，还有一套能够促进细菌细胞间的有性结合和质粒转移的基因。这些转移基因存在于接合性质粒中，而在非接合性质粒中不存在。图代表接合性质粒从一个细胞向其他细胞进行扩散的过程。

在同一个细胞中能够发现不同种类的质粒，其中一种必定是接合性质粒。事实上，大肠杆菌细胞中已知同时含有多达 7种不同的质粒，这些不同的质粒为了能够共存于同一细胞中，必需能够相容（ compatible ）。如果两个质粒不能够相互适应，不具备相容性，在没有选择压力的情况下，其中一个将很快从细胞中消失。因此，根据不同质粒间是否具备相容性，可以把它们划分成不同的不相容群体（ incompatibility group ）。

质粒不相容性 :同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性。

2.1.4 质粒的种类

根据质粒的主要特征可以把质粒分为一下 5类： （ 1）致育质粒或称 F质粒（ fertility plasmid ）：仅携带转移基因，除了能够促进质粒通过有性接合转移外，不具备其他特征，如大肠杆菌的 F质粒。

oriT

oriV

tra genes32 kb

tra genes32 kb

100 kb100 kb

used to initiate replication for transfer

used to initiate plasmid replication

IS elements (insertion sequences used in transposition)

Discrete region that has transfer genes:

tra & trb loci (~40 genes)(Origin of transfer)

F plasmid

（ 2）耐药性质粒或称 R质粒：携带有能赋予宿主细菌对某一种或多种抗生素抗性的基因，如抗氯霉素、氨苄青霉素或水银。

Tn 9

Tn

21

Tn 10

Tn 8RTF

R determinant

• RTF– Conjugative plasmid– Transfer genes

• R determinant– Resistance genes– Transposons

R plasmids code for enzymes that inactivate the drug, prevent the uptake of the drug, or pump out the antibiotic. The resistance factors can be spread throughout an entire colony by way of plasmid transfer, called conjugation. The plasmid contains a tra region which codes for proteins that allow for the passage of the plasmid between cell.

（ 3） Col 质粒（ Col plasmid ）编码大肠杆菌素（ colicins ），一种能够杀死其他细菌的蛋白质，比如大肠杆菌的 ColE1 质粒。 （ 4）降解质粒（ degradative plasmid)使宿主菌能够代谢一些通常情况下无法利用的分子，如甲苯和水杨酸，例如，假单胞菌中的 TOL质粒。 （ 5）毒性质粒（ virulence plasmid ）赋予宿主菌致病性，比如根瘤农杆菌中的 Ti 质粒，能够在双子叶植物中诱导根瘤菌。

2.1.5 细菌外其他生物体中的质粒

尽管质粒在细菌中广泛存在，但在其他生物体中却并不常见。人们在酿酒酵母均株中观察到了 2 μm质粒。 2 μm 质粒的发现是非常幸运的，因为人们可以利用 2 μm 质粒构建载体来转化酵母这种非常重要的生物。

2.2 噬菌体

2.2.2 噬菌体的基本特征

噬菌体（ bacteriophage, 简称 phage ）是一类能够特异性地侵染细菌细胞的病毒。噬菌体的结构非常简单，具有一条携带一定数量基因的 DNA （或 RNA ）分子，其中包括与复制有关的基因。在 DNA （或 RNA ）分子的外面包围着一层保护性的蛋白质外壳或称衣壳（ capsid ）。

噬菌体的侵染模式如下： （ 1）噬菌体颗粒附着到细菌的外表面，将自身的染色体 DNA注入到宿主细胞中。 （ 2）噬菌体 DNA 被复制，这一过程通常是在噬菌体自身基因编码的特异性复制酶催化下完成的。 （ 3）噬菌体 DNA 指导衣壳的蛋白质的合成，接着子代噬菌体被组装起来，并从宿主细菌中释放出来(图 2－ 6）。

对于一些噬菌体来说，完成整个侵染循环是一个非常迅速的过程，可能不超过 20 min 。这种快速侵染的过程称作裂解周期（ lytic cycle ），因为在释放新生成的噬菌体过程中同时伴随有宿主菌的裂解。裂解性噬菌体（侵染细胞并最终裂解细胞的噬菌体）的特征是噬菌体 DNA 在复制完成后立即开始衣壳蛋白的合成，而且噬菌体 DNA 分子在宿主细胞内永远都无法以稳定的状态存在。

2.2.2 溶源性噬菌体

相对于裂解性侵染，溶源性侵染的标志是噬菌体 DNA 分子在宿主细胞中能够稳定存在。对许多溶源性噬菌体来说，噬菌体 DNA 要插入到宿主细胞的 DNA 分子中。这种处于整合状态的噬菌体 DNA （称作前噬菌体， prophage ）是静止的，而一个携带有前噬菌体的细胞（这里指的是溶源菌 ,lysogen ）通常从生理上无法与未被侵染的细菌细胞相区分。然而，前噬菌体最终会从宿主细胞的染色体中释放出来，指导子代噬菌体的形成，并裂解细胞。

另有很少一部分溶源性噬菌体进行的是一个完全不同的侵染循环。当 M13 或与其相关的噬菌体侵染大肠杆菌时，新的噬菌体颗粒连续组装并从宿主细胞中释放出来。 M13 DNA 并不整合到细菌的基因组中，因此也不会变成静止状态。对于这类噬菌体来说，细胞裂解永远不会发生，而被侵染的细菌能够持续生长和分裂，然而与未被侵染的细菌相比，生长和分裂的速度较慢。图显示了 M13的侵染循环。

尽管噬菌体的种类繁多，但是只有 λ和 M13噬菌体被开发用作克隆载体。接下来对这两种噬菌体进行更加详细的介绍。 ※λDNA 分子中的基因组织方式 λ是一种典型的头－尾结构的噬菌体， DNA 被包含在多面体的头部，而尾部所起的作用就是使噬菌体附着在细菌表面并将噬菌体注入细菌细胞中。

λDNA 分子的大小为 49 Kb ，其中的绝大多数基因都得到了确定和定位。 λ基因图谱的一个特征是功能上相关的一系列基因在基因组中聚集在一起。例如，编码衣壳蛋白成分的基因聚集在 DNA 分子的左边，控制前噬菌体整合到宿主染色体的基因在分子的中间聚集。相关基因排列在一起对于控制 λ噬菌体基因组的表达具有深刻意义，基因的这种排列方式意味着可以通过类似开关的原理控制着一群基因的作用，而不是对单个基因进行控制。这种簇集现象，在以 λ噬菌体为基础的克隆载体构建中，也起着非常重要的作用。

DNA

※ 线性 λDNA 和环形 λDNA

对于构建克隆载体来说， λ噬菌体第二个重要的特征是 λDNA 分子的结构。存在于 λ噬菌体头部结构中的 λDNA 是一种双链、线性 DNA 。在分子的两端各有一段短的由 12 个核苷酸组成的单链序列。这两个单链DNA片段是互补的，因此能够实现碱基配对最终形成一个环状 DNA 分子。

DNA 分子这种互补的单链末端称作黏末端（ cohesive ends ），因为它们之间的碱基配对能够将一条（或者两条） DNA 分子的两个黏末端连接起来。 λDNA 的黏末端被称作 cos位点。当线性 DNA 分子被注入到细菌细胞以后，通过 cos位点，线性 DNA 分子闭合成环这是噬菌体 DNA 分子插入到细菌基因组的必要条件。

Bacteriophage : cos sequences circularizea linear genome

gal bio

gal bio

gal

bio

gal

bio

gal bio

gal bio

gal bio

cos位点的第二个作用与上面的完全不同。当前噬菌体脱离宿主基因组后，通过滚环复制模式（ rolling circle ）产生大量新的 λ噬菌体 DNA ，这是一个新生的 DNA 链不断从模板 DNA 上滚落下来的机制。结果形成一个包含一系列线性基因组的连环体 (catenane ) ，它们在 cos位点处连接在一起。此时的 cos位点是一种限制性内切酶的识别序列，该内切酶是 λDNA 分子中基因 A的表达产物，能够在 cos位点处交错切开双链 DNA 分子并形成单链的黏性末端，并与其他一些蛋白质一起，将每个 λ基因组包裹入一个噬菌体头部的过程中发挥作用。

Rolling circle replication

Rolling circle replication generates multiples (concatamers ，连环体 ) of the phage genome, which are then processed by the phage nuclease into single genomes.This is an essential intermediate step in viral replication and allows rapid and efficient viral replication.

One phage genome

5’

在进行滚环复制时，首先在双链环状 DNA 分子一条链的特定位点上产生一个切口，切口的3’－羟基末端围绕着另一条环状模板被 DNA聚合酶延伸，这样新合成的链就取代原来的亲本链形成滚环。

一轮过后，被置换的链到达一个单位的长度，连续延伸可以产生多个拷贝组成的连环体。被置换出的单链可以作为模板合成互补链形成双链体。

Consider a circular molecule of double-stranded DNA with a nick in one of the two phosphodiester backbones. As long as there is a free 3' OH end, this can serve as a template for DNA polymerase. When the 3' OH end is extended, the 5' end can be displaced in a manner analogous to the strand displacement reaction. Synthesis on this strand is also analogous to leading strand synthesis. The displaced strand can, in turn, serve as an template for replication as long as a suitable primer is available. Synthesis on this strand is analogous to lagging strand synthesis.

If synthesis continues in this manner, the consequence of this mechanism of replication can be the production of concatemer copies of the circular molecule. As a result, multiple copies of a genome are produced.

A rolling circle mode of replication is seen both during replication of bacteriophage lambda where rapid production of many copies of the genome is desired, and in the replication of bacteriophage M13 where only a single copy is produced each time.

Lambda DNA is linear in viruscos sequence is 12 nucleotides and single strandedThe two cos sequences are complementary

Replicates by rolling ciricle in E. colito produce concatemerscos lambda DNA cos etc etc

cos sequences hybridise in E.colito form circular genome

Lambda head genes transcribed and translatedto produce head proteins

Endoglucanase A cuts at cossequence

Endoglucanase A expressed. Cuts DNA at cos sequenceand assists packaging lambda DNA into viral capsid(head proteins)

Tail genes then expressed

Tail bind to heads to form virus

Lambda virus produces lysozyme that hydrolysesbacterial cell wall releasing viruses to attack other bacterial cells

※ M13—— 纤维状噬菌体

M13是纤维状噬菌体的一个代表，在结构上与λ噬菌体有着很大的不同。 M13 DNA 分子比λDNA 要小得多 ,仅有 6 407 个核苷酸。基因组为环状单链 DNA 。 M13的衣壳仅仅是由 3种不同的蛋白质组装而成，而 λ噬菌体的头尾结构则包含 15种不同的蛋白质，而且 M13的侵染周期相对 λ来说也要简单一些，并不需要将基因插入到宿主基因组中。

■ M13-----filamentous phage

Gene 9 protein

Gene 6 protein

Gene 3 protein

Gene 8 protein

Circular ssDNA

Distal end

Proximal end

Gene 7 protein

M13 DNA 分子是通过大肠杆菌的纤毛进入细菌细胞的。在宿主细胞内，单链 DNA 分子作为模板生成一条互补链，形成正常的双链 DNA 分子（ replication form, RF）。这个双链 DNA 分子不会插入细菌基因组，但会持续复制直到细菌中的拷贝数超过 100 。当细菌分裂时，每个子细胞都能得到一个或多个噬菌体基因组的拷贝，这些拷贝也能继续复制，以保证每个细胞具有恒定的拷贝数。

RF DNA再以滚环方式进行复制，形成完整的单链子代DNA ，接着新合成的子代 DNA 被切下来，并进一步环化形成单位长度的 M13基因组 DNA 。游离的 M13基因组 DNA 被不断包装成为 M13噬菌体颗粒，并释放出来。每个被侵染细胞在经过一代复制后，都能够产生 1 000 个新的噬菌体。

Genome:Single stranded circular DNA molecule, covalently closed,6 407 nucleotides10 non overlapping genesHoused in a flexible protein cylinder

◆M13 Gene Functions

Gene Function Amino Acids Mol Wt

II DNA Replication 410 46137

X DNA Replication 111 12672

V Binding ssDNA 87 9682

VIII Major capsid protein 50 5235

III Minor capsid protein 406 42522

VI Minor capsid protein 112 12342

VII Minor capsid protein 33 3599

IX Minor capsid protein 32 3650

I Assembly 348 39502

IV Assembly 405 43476

XI Assembly 108 12424

◆M13

的侵染循

环

M13 作为克隆载体的吸引力

M13的一些特征使得它作为克隆载体具有相当的吸引力。它的基因组小于 10 Kb ，对一个潜在的载体来说恰好处于一个令人满意的范围内。此外， M13基因组的复制型非常像质粒，因此也能像质粒一样被处理。而且， M13基因组容易从大肠杆菌培养中获得，也能够通过转染而重新引入。 在重要的是，以 M13为载体克隆基因，能够得到单链形式的 DNA 。单链形式的克隆基因在一些技术中能够发挥作用，在 DNA测序和体外突变产生中尤为明显。使用 M13载体是一种获得单链，并进行这些工作简单而有效的方法。