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Caracterización de aislamientos de hongos entomopatógenos de

los géneros Beauveria y Metarhizium asociados a insectos plaga

de palma de aceite (Elaeis guineensis Jaqc.)

Carolina Valencia Cortés

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Agronomía

Bogotá, Colombia

2015

Caracterización de hongos entomopatógenos asociados a insectos plaga de palma de aceite (Elaeis guinnensis Jaqc)

Caracterización de aislamientos de hongos entomopatógenos de

los géneros Beauveria y Metarhizium asociados a insectos plaga

de palma de aceite (Elaeis guineensis Jaqc.)

Carolina Valencia Cortés

Tesis o trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Agrárias con énfasis en Entomología

Director: Ph.D., Profesora Liliana María Hoyos Carvajal.

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Agronomía

Bogotá, Colombia

2015


Con todo mi amor para mi familia que en este mundo

me acompaña y para mis ángeles que desde el cielo me cuidan,

Mateo Andrés y Mauricio, para quien sino para ustedes.


Agradecimientos

A la Universidad Nacional de Colombia por permitirme culminar este trabajo.

A el centro de investigación en Palma de Aceite Cenipalma por facilitarme el material

biológico para la realización de este trabajo.

A la Dr. Lilliana María Hoyos Carvajal, docente de la Universidad Nacional de Colombia,

por su orientación, gran paciencia y por alentarme a culminar este proceso.

A mi Madre, a mi Padre y mis Hermanos por su tiempo y colaboración.

A mis compañeros, Hanna Lorena Alvarado, Angie Barragán, Sandra Castillo, Estefanía

Macías, Camilo Gómez Correa.

A Jesús Alberto León y Wadith de León por toda la colaboración en la etapa de

laboratorio.

A mi gran amigo Iván Ayala Díaz.


Tabla de contenido

Resumen ............................................................................................................................. 9

LISTA DE TABLAS ........................................................................................................... 11

LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... 13

LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS ..................................................................... 14

INTRODUCCIÓN GENERAL ............................................................................................... 15

El control biológico con hongos entomopatógenos en el contexto de producción de

palma de aceite ................................................................................................................. 15

Generalidades de los hongos entomopatógenos. ........................................................... 17

Clasificación de los hongos entomopatógenos ................................................................ 20

Beauveria Vuillemin (1912) ........................................................................................... 22

Metarhizium Metschnikoff (1883) ................................................................................. 23

Proceso infectivo de los hongos entomopatógenos en los insectos. .............................. 23

Bibliografía ........................................................................................................................ 27

CAPITULO 1: CRECIMIENTO DE Beauveria sp. y Metarhizium sp. EN DIFERENTES

MEDIOS Y TEMPERATURAS ............................................................................................. 38

1.1 Introducción ................................................................................................................ 38

1.2 Objetivo Específico ..................................................................................................... 40

1.3 Metodología ................................................................................................................ 40

1.3.1 Aislamientos utilizados en el estudio ................................................................... 40

1.3.2 Pruebas de crecimiento radial ............................................................................. 41

1.3.3 Análisis estadístico............................................................................................... 41

1.4. Resultados ................................................................................................................. 42

1.4.1. Crecimiento radial de los aislamientos evaluados en medio de cultivo Agar

Papa Dextrosa y Sabureaud Dextrosa Agar. ............................................................... 42


1.4.2 Crecimiento radial de los aislamientos evaluados a 10°C en dos medios de

cultivo ............................................................................................................................ 43

1.4.3 Crecimiento radial de los aislamientos evaluados a 26.5°C en dos medios de

cultivo ............................................................................................................................ 45


cultivo ............................................................................................................................ 46

1.5 Discusión..................................................................................................................... 48

1.6 Bibliografía .................................................................................................................. 53

CAPITULO 2: TOLERANCIA DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS A LA

RADIACIÓN ULTRAVIOLETA ............................................................................................. 57

2.1 Introducción ................................................................................................................ 57

2.1.1 Efecto de la RUV-B sobre los hongos ................................................................. 58

2.2 Objetivo Específico ..................................................................................................... 59

2.3 Metodología ................................................................................................................ 60


2.3.2 Aplicación de tratamiento con UV-B. ................................................................... 60

2.3.4 Cálculo de porcentaje de germinación. ............................................................... 61


2.4 Resultados .................................................................................................................. 61

2.4.1 Efecto de la UV-B sobre aislamientos de Beauveria .......................................... 61

2.5 Discusión..................................................................................................................... 67

2.6 Bibliografía .................................................................................................................. 71

CAPITULO 3: DETERMINACIÓN DE LA HIDROFOBICIDAD DE CONIDIAS DE HONGOS

ENTOMOPATÓGENOS. ...................................................................................................... 76

3.1 Introducción ................................................................................................................ 76

3.2 Hipótesis y Objetivos Específicos .............................................................................. 77

3.3 Metodología. ............................................................................................................... 78



3.3.2 Pruebas de hidrofobicidad ................................................................................... 78


3.4 Resultados .................................................................................................................. 79

3.5 Discusión..................................................................................................................... 81

3.6 Bibliografía .................................................................................................................. 83

CONCLUSIONES ................................................................................................................. 86

RECOMENDACIONES ........................................................................................................ 87

ANEXOS ........................................................................................................................... 88

Anexo 1. Aislamientos de Beauveria y Metarhizium colectados en diferentes zonas

palmeras procedentes de insectos plaga del cultivo de palma de aceite. ...................... 88

Anexo 2. Registro de cada aislamiento ............................................................................ 90


9

Resumen

Se realizó la caracterización de 36 aislamientos de Beauveria y Metarhizium en ellos se

evaluó la tasa de crecimiento en dos medios de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) y

Sabouraud Dextrosa Agar (SDA), la tolerancia a radiación ultravioleta (UV-B) y la

hidrofobicidad. En los análisis se encontraron diferencias significativas P=0.05 en todos

los parámetros evaluados. Con respecto a la tasa de crecimiento en diferentes medios y

temperaturas se observó un mayor efecto de la temperatura que del medio de cultivo en el

crecimiento de los hongos. Ninguno de los aislamientos evaluados de Metarhizium tiene

la capacidad de crecer a 10°C independiente del medio de cultivo en el que sea

sembrado. Beauveria en general tiene la capacidad de crecer en las tres temperaturas

evaluadas existiendo variaciones en la tasa de crecimiento dependiendo de la

temperatura de incubación. Se observaron diferentes grados de tolerancia a la radiación

UV-B en los aislamientos de Beauveria y Metarhizium. En general en la medida que

aumentó el tiempo de exposición a UV-B también se incrementó la pérdida de

germinación de los aislamientos con respecto al testigo. Se encontraron aislamientos

como B028 con alta sensibilidad y B001 con alta tolerancia a la exposición UV-B. Con

respecto a la hidrofobicidad los aislamientos de Metarhizium y Beauveria evaluados se

comportaron como aislamientos hidrofóbicos y no presentaron diferencias significativas

estadísticas P= 0.05. Los aislamientos de Beauveria mostraron diferencias significativas

P=0.05 mostrando algunos de ellos porcentaje de permanencia de las conidias por

encima del 80% después de la aplicación de los tratamientos, lo que indicaría la presencia

de una cantidad mayor de hidrofobinas con respecto a los aislamientos que mostraron

porcentajes de retención de conidias inferiores al 22%.


10

Summary

A characterization of 36 isolates of Beauveria and Metarhizium was done to evaluate the

grown rate in two culture media such as Potato Dextrose Agar (PDA) and Dextrose Agar

Sabouraud (SDA), the tolerance to UV radiation (UV -B) and the hydrophobicity. All

parameters evaluated showed significant differences (P=0.05). The growth rate had a

higher effect due temperature rather than media culture. None of Metarhizium isolates

tested has the ability to grow at 10 ° C independently of the culture medium evaluated.

Whereas, Beauveria isolates have the ability to grow at all three temperatures tested

showing variations in growth rate depending on the incubation temperature. Different

degrees of tolerance to UV -B radiation in Metarhizium and Beauveria were observed. In

general, when the exposure time to UV-B is increased, the germination of the isolates was

decreased compared with the control. We found isolates with high sensitivity to UV-B such

the isolate B028, and isolates with high tolerance as to UV-B such the B001. With respect

to the hydrophobicity of Metarhizium and Beauveria all isolates tested behaved as

hydrophobics (P=0.05). Beauveria isolates showed significant differences in

hydrophobicity (P=0.05) with percentages of permanence of conidia over 80 % in some

isolates after application of the treatments to evaluate the hydrophobicity, probability

related to the presence of a greater amount of hydrophobins compared to the isolates that

showed percentages retention of less than 22 % conidia.


11

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Microorganismos entomopatógenos empleados para control de insectos plaga en

palma de aceite en Colombia bajo condiciones de laboratorio y campo.

Tabla 1.4. Ejemplos de algunos estudios recientes de investigaciones realizadas con

hongos entomopatógenos de los géneros Beauveria y Metarhizium para el manejo de

insectos plaga en diversos cultivos alrededor del mundo.

Capítulo 1

Tabla 1.1. Análisis de varianza para el área bajo la curva acumulada hasta el día 18 de

evaluación de crecimiento en aislamientos de Beauveria y Metarhizium procedentes de

palma de aceite.

Tabla 1.2. Grupos de crecimiento radial de aislamientos de Beauveria sembrados en

PDA y sometidos a diferentes temperaturas de crecimiento.

Tabla 1.3. Grupos de Crecimiento radial de aislamientos de Metarhizium en medios de

cultivo PDA y SDA incubados a 26.5°C y 30°C.

Capítulo 2

Tabla 2.1. Porcentaje de germinación de Beauveria de cada aislamiento, en función del

tiempo de exposición a la radiación UV-B1.

Tabla 2.2. Disminución de germinación de Beauveria en función del tiempo de

exposición a la radiación UV-B.

Tabla 2.3. Porcentaje de germinación de Metarhizium de cada aislamiento, en función

del tiempo de exposición a la radiación UV-B.

Tabla 2.4. Disminución de germinación de Metarhizium en función del tiempo de

exposición a la radiación UV-B.


12

Capítulo 3

Tabla 3.1. Grupos de medias de los aislamientos de Beauveria en función del número de

conidias suspendidos en fase acuosa.

Tabla 3.2. Grupos de medias de los aislamientos de Metarhizium en función del número

de conidias suspendidos en fase acuosa.


13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1. Ubicación Taxonómica de los géneros de hongos entomopatógenos

Beauveria y Metarhizium.


14

LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS

ADN: Acido Desoxirribonucleico

g: gramo

°C: grados centígrados

ha: hectárea

L: Litro

µl: microlitro

ml: mililitro

mm/día: milímetros / día

nm: nanómetro


15

INTRODUCCIÓN GENERAL

El control biológico con hongos entomopatógenos en el contexto de producción de

palma de aceite

La palma de aceite Elaeis guineensis Jacq. es una planta tropical que se desarrolla hasta

los 500 metros sobre el nivel del mar, entre las semillas oleaginosas es el cultivo de palma

de aceite el que produce mayor cantidad de aceite por hectárea. Su centro de origen es el

Golfo de Guinea (África occidental). Los principales países productores son Indonesia,

Malasia, Tailandia, Nigeria y Colombia (Fedepalma, 2013). En el año 2013, Colombia tuvo

un área sembrada de 452.435 de las cuales 299.953 ha se encontraban en producción y

152.482 ha en desarrollo (Fedepalma, 2013). En el mismo año Colombia contribuyó con el

1,81% de la producción mundial, ubicandose en el país con el primer lugar de producción

en el continente americano (Torres, 2013).

En cifras económicas internas, el sector palmero representa el 3.3% del PIB Agrícola. En

el año 2013, las siembras de palma de aceite se encontraban distribuidas en 116

municipios en 20 departamentos (Fedepalma, 2013) siendo en muchas poblaciones la

fuente primaria de empleo.

En el contexto productivo en Colombia, el cultivo de palma de aceite tiene problemas

fitosanitarios, entre los que se se cuentan un amplio número de especies de insectos y

ácaros fitófagos que causan la reducción del área foliar por consumo directo, como

Stenoma cecropia Meyrick y Loxotoma elegans Zeller (Lepidoptera: Elachistidae), otros

que atacan la raíz como Sagalassa valida Walter (Lepidoptera: Glyphipterygidae);

barrenadores del tallo como Rhynchophorus palmarum L., y Metamasius hemipterus (L.)

(Coleoptera: Curculionidae) o raspadores de fruto como Demotispa neivai (Bondar)

(Coleoptera: Chrysomelidae) (Genty et al. 1978; Calvache, 2003). Existe un grupo de

insectos como Rhynchophorus palmarum (Coleoptera: Dryophthoridae) o Leptopharsa

gibbicarina Froeschner (Hemiptera: Tingidae) considerados inductores o vectores de

algunos problemas de carácter patológico en el cultivo (Aldana et al. 2004).

Durante años se han venido desarrollando diferentes estrategias para el manejo de estos

insectos fitófagos, entre ellas la aplicación de insecticidas químicos, el control etológico


16

que incluye la captura y recolección de insectos en diferentes estados de desarrollo

mediante el uso de trampas con atrayentes, y el control biológico como el uso de insectos

depredadores (Aldana et al. 2004b; Bustillo et al. 2013) y parasitoides (Aldana et al.

2004a, Castillo et al. 2000). Con respecto a hongos entomopatógenos, los trabajos más

recientes asociados a insectos plaga del cultivo han permitido conocer la actividad

patogénica de algunos aislamientos sobre insectos de importancia económica en el cultivo

de la palma de aceite como L. femoratus, S. cecropia, D. neivai, L. elegans y S. aloeus

entre otros (Tabla 1).

Tabla 1 Hongos entomopatógenos empleados para control de insectos plaga en palma de aceite

en Colombia bajo condiciones de laboratorio y campo.

Microorganismo Clase Insecto plaga Estadío Referencia

Beauveria sp. Hongo

Ascomycete

Demotispa neivai

(Coleoptera:

Chrysomelidae)

Adultos Valencia et al. 2007.

Beauveria sp. Hongo

Ascomycete

Stenoma cecropia

(Lepidoptera: Stenomidae) Larvas

Valencia y Torres,

2007.

Beauveria sp. Hongo

Ascomycete

Leucothyreus femoratus

(Coleoptera:

Scarabaeidae)

Larvas Rodríguez et al.

2007.

Beauveria bassiana Hongo

Ascomycete

Loxotoma elegans

(Lepidoptera: Elachistidae) Larvas Monroy et al. 2011.

Beauveria bassiana Hongo

Ascomycete

Rhynchophorus palmarum

(Coleoptera:

Dryophthoridae)

Adultos y

larvas Alvarado et al. 2013.

Metarhizium sp. Hongo

Ascomycete

Leucothyreus femoratus

(Coleoptera: Scarabaeidae) Larvas

Rodríguez et al.

2007.

Metarhizium sp. Hongo

Ascomycete

Strategus aloeus

(Coleoptera: Scarabaeidae) Larvas Valencia et al. 2011.

Metarhizium

anisopliae

Hongo

Ascomycete

Rhynchophorus palmarum

(Coleoptera:

Dryophthoridae)

Adultos y

larvas Alvarado et al. 2013.


17

La eficiencia del uso de estos agentes de control depende entre otros del conocimiento

sobre la biología del insecto y los mecanismos de interacción de estos con el hospedero,

además del ambiente en el cual se aplican. Para lograr programas eficientes de control

utilizando los hongos entomopatógenos es necesario desarrollar estudios de virulencia

biología y genética de estos enemigos naturales que permitan su selección y posterior

incorporación en programas de manejo integrado de plagas por regiones palmeras.

Generalidades de los hongos entomopatógenos.

En los últimos 50 años, la investigación en la protección de los cultivos contra los insectos

plaga ha estado enfocada al uso de agentes de biocontrol (BCA) (Whipps y Lumsden,

2001). La creciente inquietud por los efectos nocivos sobre la salud causados por las

prácticas de la agricultura tradicional intensiva que involucra el uso de insecticidas

sintéticos; la aparición de resistencia a los insecticidas químicos en algunos insectos de

importancia económica hacen que haya un interés cada vez mayor en el uso de

insecticidas de origen biológico (Glare et al. 2012). En consecuencia, desde mediados del

siglo XX ha habido gran expansión del mercado en base a hongos patógenos con

actividad selectiva contra las plagas de insectos (López-Pérez et al. 2014). El uso de

estos métodos de control se deriva de una disciplina denominada control biológico, que

se basa en el principio natural en que muchas especies de organismos se alimentan,

viven y se reproducen sobre otras, cuyas poblaciones son reguladas por las primeras en

los diferentes ecosistemas, indirectamente esto logra que las cantidades alcanzadas por

los grupos poblacionales no sean nocivas al sistema (Madrigal, 2001). Ernest y Brown

(2001) definen la homeostasis como “las interacciones compensatorias entre especies,

que producen estabilidad en un ecosistema”, en consecuencia los hongos

entomopatógenos y las enfermedades que de forma natural causan en los insectos son

un ejemplo claro de esta relación y el control biológico es el aprovechamiento de estas

interacciones regulatorias para disminuir las poblaciones de una plaga.

Entre los microorganismos entomopatógenos, los hongos son considerados controladores

promisorios, ya que pueden infectar a los insectos directamente a través de la penetración

de la cutícula y poseen múltiples mecanismos de acción que les confieren una alta

capacidad para evitar que el hospedero despliegue mecanismos de resistencia (Hayek y

Leger, 1994). Sin embargo, su crecimiento y desarrollo está limitado por las condiciones


18

ambientales externas, en particular por la humedad, la radiación solar y la temperatura,

que determinan la adecuada esporulación y germinación de las conidias (Tanada y Kaya,

1993).

Las características de los hongos entomopatógenos y su potencial en el control de

insectos plaga han dado lugar a una disciplina que ha desarrollado un gran número de

estudios encaminados a seleccionar los aislamientos más patogénicos para el control de

insectos plaga de diferentes órdenes en diversos cultivos alrededor del mundo (Tabla 2).

Tabla 2. Ejemplos de algunos estudios recientes de investigaciones realizadas con hongos

entomopatógenos de los géneros Beauveria y Metarhizium para el manejo de insectos plaga en

diversos cultivos alrededor del mundo.

Hongo

Entomopatógeno Insecto blanco

Área de

Economía

Cultivo o

Problema

asociado

Referencia

Beauveria bassiana Anopheles stephensi

(Diptera: Culicidae) Salud Publica

Transmisor de

Malaria Vogels et al. 2014.

Beauveria bassiana Arge Rosae

(Hymenoptera: Argidae)

Agricultura

Ornamentales Flores Khosravi et al. 2014.

Metarhizium

bruneum

Agriotes lineatus

Agriotes obscurus

Agriotes sputator

(Coleoptera: Elateridae)

Agricultura Papa Eckard et al. 2014.

Beauveria spp.

Metarhizium spp.

Cosmopoplites sordidus

(Coleoptera: Curculionidae) Agricultura Banano Lopes et al. 2013.

Debido al potencial de estos hongos para el manejo de plagas en diversos

agroecosistemas, muchos han sido modificados genéticamente con diferentes propósitos

entre los que se encuentran generar resistencia al fungicida benomyl (Goettel et al. 1990),

a los herbicidas bialaphos y al glufosinato de amonio (Inglis et al. 2000) para que sean

compatibles con planes de manejo integrado en los cuales se usan estos agentes

xenobióticos, también se han realizado modificaciones genéticas en puntos enzimáticos

importantes para el aumento de patogenicidad, la disminución de los tiempos letales

(Leger et al. 1996), sobreproducción de quitinasas en B. bassiana y la producción de

cutinasas en M. anisopliae (Fang et al. 2007) otro tipo de transformaciones incluyen el

aumento o resistencia al estrés particularmente al causado por la radiación ultravioleta

(Tseng et al. 2011).


19

En la actualidad, se han utilizado entre 12 a 15 especies de hongos entomopatógenos

para el desarrollo de aproximadamente 170 productos (Faria y Wraight, 2007) sin

embargo, el número de especies de hongos que afectan insectos es sin duda superior

parasitando individuos en todos los órdenes de insectos, en su mayoría pertenecientes a

los órdenes Hemiptera, Diptera, Coleoptera, Lepidoptera, Hymenoptera y Orthoptera

(Ferron, 1978).

Según Faria y Wraight (2007), entre insecticidas, fungicidas y acaricidas, más 170

productos fueron desarrollados en las últimas tres décadas, 75% de los cuales

actualmente se hallan en proceso de registro. Los microorganismos como agentes de

control de plagas y enfermedades, son considerados un mercado en aumento que

incrementó sus ventas de cerca de 150 millones USD en 2000 a más de 500 millones

USD en 2008 (Ravensberg, 2011). El desarrollo de biopesticidas exitosos en el campo

depende entre otras, de la selección de aislamientos altamente patogénicos partiendo de

un número importante de candidatos que además deben ser resistentes a la desecación,

tolerantes a la radiación ultravioleta, de fácil producción masiva, amigables con el

ambiente e inocuos para seres vivos no blanco (Glare et al. 2012).


20

Clasificación de los hongos entomopatógenos

Desde los primeros estudios realizados con hongos la clasificación de estos ha tenido

cambios importantes y se halla en constante revisión. El Phylum Ascomycota, que agrupa

una considerable cantidad de hongos asociados a insectos, se ha dividido en tres

subphylum Taphirinomycotina (140 especies), Saccharomycotina (915 especies) y

Pezizomycotina (63.011 especies) muchos miembros de Pezizomycotina incluyen

parásitos de abejas y algunos parásitos biótrofos de insectos (Hibbet et al. 2007;

Blackwell, 2011). Los hongos pertenecientes al subphylum Taphirinomycotina son

saprofitos y parásitos de plantas y vertebrados (Schoch et al. 2009), respecto al

subphylum Saccharomycotina se han reportado asociaciones mutualistas con insectos en

donde el insecto sirve como medio de dispersión del hongo y este a su vez provee

enzimas y otras sustancias útiles para el insecto (Vega y Dowd, 2005). El subphylum

Pezizomycotina se considera el más numeroso, además de ser ecológica y

morfológicamente el más complejo (Schoch et al. 2009), su ciclo de vida tiene dos

estados anamorfo y teleomorfo, ambos de ocurrencia en infecciones en insectos. Según

Vega et al. (2012) dentro del orden Hypocreales se evidencian varios ejemplos de este

fenómeno, pues incluye los hongos entomopatógenos más estudiados y empleados

comercialmente. El orden Hypocreales a su vez está dividido en siete familias, dentro de

estas, la familia polifilética Clavicipitaceae que incluye tres familias monofiléticas

Clavicipetaceae propiamente dicha, Cordycipetaceae y Ophiocordycipetaceae.

Comprende géneros como Aschersonia, Hypocrella, Regiocrella y Metarhizium, siendo

este último asociado al teleomorfo Metacordyceps (Vega et al. 2012; Humber, 2009;

Sung et al. 2007), también Beauveria, Isaria, Lecanicillium entre otros géneros (Vega et

al. 2012) (Figura 1.1).


21

Figura 1.1. Ubicación Taxonómica de los géneros de hongos entomopatógenos Beauveria y

Metarhizium

Los anamorfos del orden Hypocreales entre los que se encuentran Beauveria y

Metarhizium son considerados generalistas, oportunistas, hemibiótrofos ya que

inicialmente atacan tejidos vivos del insecto en una fase biotrófica y luego mediante la

producción de toxinas pasan a la fase necrótrofa y luego saprofita (Hensket et al. 2010).

Los parásitos biótrofos de insectos son considerados extraños y únicamente se reportan

algunos casos exitosos en agricultura en el orden Laboulbeniales (Vega et al. 2008).


22

Beauveria Vuillemin (1912)

Es un género cosmopolita, necrótrofo que se encuentra en el suelo, o como endófito en

plantas, saprofito facultativo de importancia para el control de insectos plaga alrededor del

mundo (Vega et al. 2008; Roberts y Hajek 1992; Goettel et al. 2005). También se

considera promisorio en la industria farmacéutica, en la agricultura por el gran número de

metabolitos y enzimas que produce (Vey et al. 2001). Dentro de las especies de este

género Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. (Ascomycota: Hypocreales) ha sido

reportado en varios tipos de interacciones con plantas entre ellos como supresor de

enfermedades y plagas (Vega, 2008; Vega et al. 2008) (Goettel et al. 2008; Ownley et al.

2008).

El género Beauveria Vuillemin (1912) está en constante revisión; Petch en 1926 reconoció

dos especies, B. bassiana (Bals.) Vuill. y B.brongniartii (Sacc.) Petch diferenciados por

sus conidias, posteriormente De Hoog en 1972 describió tres especies B. bassiana, B.

brongniartii y B. alba (Limber) Sacc, que posteriormente este mismo autor, renombra

como Engyodontium album (Limber) (De Hoog, 1978). Más tarde se describen cuatro

nuevas especies B. vermiconia De Hoog y Rao (1975), B. amorpha Samson y Evans

(1982), B. caledonica Bisset Widden (1986) y B. malawiensis Rehner et al. (2006).

Estudios de filogenética molecular ubican a Beauveria dentro de la familia

Cordycipitaceae (Hypocreales) (Sung et al. 2007). En la actualidad B. bassiana y B.

brongniartii son consideradas especies crípticas, por ejemplo B. bassiana incluye un

número aún no determinado de linajes muchos de ellos con distribuciones

intercontinentales (Rehner et al. 2006; Ghikas et al. 2010), y que se encuentran como

complejos de especies múltiples tanto en ambientes agrícolas como en los no

intervenidos (Rehner et al. 2006, Meyling et al. 2009).


23

Metarhizium Metschnikoff (1883)

Desde su descripción en 1883 las especies del genero Metarhizium han sido ampliamente

estudiadas (Rocha et al. 2013), las investigaciones más recientes del complejo

Metarhizium anisopliae s.l. (Metschnikoff) reconocen diez especies: M. anisopliae s.s. y M.

pingshaense y las nuevas especies M. frigidum, M. globosum y M. robertsii, recupera M.

brunneum, eleva al nivel de especies tres variedades M. acridum, M. lepidiotae y M. majus

y finalmente reconoce a M. taii como una sinonimia de M. guizhouense. (Bischoff et al.

2006; Bischoff et al. 2009; Rocha et al. 2013).

Proceso infectivo de los hongos entomopatógenos en los insectos.

La mayoría de estos hongos son patógenos obligados o facultativos que causan en el

insecto enfermedades denominadas micosis (Tanada y Kaya, 1993). El proceso infectivo

comienza con la Adhesión de la conidia a la cutícula del insecto este proceso está

directamente relacionado con el tipo de conidias y la hidrofobobicidad de la cutícula del

insecto, cuando las conidias crecen aéreamente se unen bien a superficies hidrofobicas

pero la adhesión a superficies hidrofílicas es débil; las conidias que crecen sumergidas se

unen bien a ambos tipos de superficies y las blastosporas (In vitro) se unen de una

manera fuerte a superficies hidrofílicas y débilmente a superficies hidrofóbicas (Holder y

Keyhani, 2005). La adhesión de las conidias también puede estar influenciada por la

topografía cuticular, la presencia de setas o espinas puede facilitar este proceso (Sosa-

Gomez et al. 1997). Una vez la conidia se ha adherido comienza el proceso de

germinación que es el retorno de la actividad o metabolismo vegetativo, morfológicamente

es la emergencia de la célula vegetativa en forma de un tubo germinativo que crece sobre

la superficie cuticular formándose un apresorio que penetra la cutícula (Vargas, 2003),

factores como la humedad ambiental, la temperatura y estado de desarrollo, parte del

cuerpo y balance nutricional del insecto pueden influenciar la germinación de la conidia de

un hongo entomopatógeno (Volcy y Pardo, 1994; Tanada y Kaya, 1993). La rápida

germinación de las conidias puede ser una ventaja ya que evita la exposición a ambientes

que pueden ser adversos para el hongo y reduce la posibilidad de que el insecto tenga

una respuesta al ataque del mismo (Vega et al. 2012). Una vez la conidia ha germinado

comienza la penetración en la cutícula del hospedero que ocurre como resultado de una


24

combinación entre la degradación enzimática de la cutícula y la presión mecánica ejercida

por el extremo de una hifa invasiva que forma un botón de penetración donde la capa

cuticular es deformada por presión (Tanada y Kaya, 1993; Humber, 2009). El modo de

penetración principalmente depende de las propiedades de la cutícula del insecto, grosor,

esclerotización y la presencia de sustancias antifúngicas y nutricionales en ella (Charleyn,

1989). El mecanismo químico de penetración de la cutícula involucra una serie de

enzimas como proteasas, aminopeptidasas, esterasas, lipasas y quitinasas, las cuales

causan degradación del tejido en la zona de penetración (Vega et al. 2012). Durante este

proceso de penetración en algunos casos se produce una respuesta no celular, llamada

melanización cuticular que puede retardar o detener el proceso de germinación mediante

el endurecimiento de la cutícula que forma una barrera contra la penetración del hongo

(Humber, 2009; Schrank y Vainstein, 2010). Una vez que el hongo atraviesa la cutícula

debe vencer el sistema inmunológico del hospedero antes de entrar a la hemolinfa y

desarrollarse dentro del insecto (Madrigal, 2001). Después de llegar al hemocele, la

mayoría de los hongos pasan a una fase levaduriforme o de crecimiento por gemación.

Las infecciones causadas por hongos en su gran mayoría tardan más de dos días en

causar la muerte del hospedero. Se producen toxinas y enzimas, aunque algunos hongos

aparentemente no poseen toxinas, matan el insecto al consumir todos los nutrientes o por

destrucción física de sus tejidos (Bustillo, 2001). En la medida que avanza el proceso de

infección el hongo crece y comienza a absorber una proporción cada vez mayor de

nutrientes del hospedero, se da una creciente competencia por el oxígeno disuelto

disponible y por el crecimiento de las estructuras del hongo se produce una invasión del

espacio que impide la circulación de la sangre a través del hemocele (Humber, 2009). La

colonización del hemocele por el hongo produce una alteración del estado fisiológico del

insecto y de sus funciones de excreción y respiración provocando la muerte del insecto

(Humber, 2009). Los insectos tienen una serie de mecanismos de respuesta al ataque de

los hongos como la melanización, la fagocitosis o la encapsulación, también pueden

modificar su comportamiento esponiendose al sol para incrementar su temperatura

corporal (Rolff y Reynolds, 2009; Elliot et al. 2002; Roy et al. 2006). Por otro lado, los

hongos pueden evitar la defensa inmune de los insectos mediante diferentes mecanismos

como desarrollo de protoplastos que no son reconocidos por los hemocitos del insecto, la

formación de cuerpos hifales multiplicándose y dispersándose rápidamente (Samson et al.

1988) y la producción de micotoxinas (Tanada y Kaya, 1993). El papel de las toxinas en el

proceso de patogénesis es entre otros actuar como inhibidores de las reacciones de


25

defensa del hospedante por alteraciones de los hemocitos y retardo en la agregación de

las células de la hemolinfa (López, 1994). Posterior al crecimiento del hongo en el

hemocele, la micosis induce a síntomas fisiológicos anormales en el insecto y cambios en

la coloración en insectos atacados. Después de muerto el insecto, si existe una alta

disponibilidad de agua los hongos emergen al exterior a través de la cutícula y esporulan

sobre el cadáver produciendo inóculo para infectar a otros insectos. Si las condiciones no

son favorables, estos quedan dentro del cadáver, donde pueden sobrevivir por algunos

meses y eventualmente producir conidias cuando lleguen las condiciones favorables.

Las enzimas juegan un papel importante en el proceso patogénico de los hongos

entomopatógenos se han descubierto en el tubo germinativo proteasas, aminopeptidasas,

lipasas, esterasas, y N-acetil-glucosamidasa (quitinasas). Estudios in vitro indican que en

la digestión del integumento sigue una secuencia de lipasa-proteasa-quitinasa (Tanada y

Kaya, 1993). Los hongos B. bassiana, M. anisopliae, Paecilomyces spp. y L. lecanii,

producen grandes cantidades de proteasas y quitinasas en medios de cultivo líquido

(Guillespie, 1988). En varios aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae la enzima

principal es una endoproteasa que disuelve la proteína matriz que cubre la quitina

cuticular. Por lo tanto, la producción de quitinasa ocurre después del proceso de infección

y una vez que el hongo atraviesa la cutícula debe vencer el sistema inmunológico del

hospedero antes de entrar a la hemolinfa y desarrollarse dentro del insecto (Guillespie et

al. 1997).

Beauveria spp. y Metarhizium producen ciclodepsipéptidos que alteran la permeabilidad

de las membranas celulares (Ngoka et al. 1999), estos tienen actividad antibiótica y

producen efectos letales en insectos aún en bajas concentraciones para el caso de

Beauveria el ciclodepsipéptido más conocido y estudiado es la beauvericina, también se

han descubierto otros como beauverolides (Ellsworth y Grove, 1977), bassianolides

(Suzuki et al. 1977), beauveriolides (Mochizuki et al. 1993) y bassiatina (Kagamizono et al.

1995). La oosporina es una dibenzonquinona tóxica producida especialmente por hongos

del género Beauveria, presenta propiedades repelentes y antialimentarias en insectos

(Rosas - Acevedo et al. 2003). Quesada-Moraga y Vey (2004) reportaron la existencia de

otra toxina a la que llamaron bassiacridina demostrando su toxicidad al ser inyectada

dentro del hemocele de langostas. En Metarhizium anisopliae el primer ciclodepsipéptido

aislado fue llamado Dextrusina, esta toxina aparentemente abre los canales de calcio en


26

las membranas de los músculos de los insectos (Schrank y Vainstein, 2010). Metarhizium

spp. produce entre otras toxinas citocalacinas, miroridinas (Kondo et al. 1980), viridoxina

(Gupta et al. 1993), macrolidos (Kozone et al. 2009) y tirosina betaina (Carollo et al.

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biological control agents: status and prospects. Fungal biocontrol agents: progress,

problems and potential, 9-22.


37

OBJETIVO GENERAL

Objetivo general

Caracterizar algunos parametros fisiológicos de hongos entomopatógenos de los

géneros Beauveria y Metarhizium aislados de insectos plagas de la palma de aceite, que

puedan ser útiles en su control.

Objetivos específicos:

Determinar la respuesta en el crecimiento de aislamientos de Beauveria y

de Metarhizium en medios de cultivo incubados a diferentes temperaturas.

Establecer el efecto de la luz ultravioleta, fracción UV-B de la luz solar, sobre la

germinación de aislamientos de Beauveria y Metarhizium.

Establecer la capacidad de adhesión de conidias de Beauveria y Metarhizium a través de

su hidrofobicidad.


38

CAPITULO 1: CRECIMIENTO DE Beauveria sp. y Metarhizium sp.

EN DIFERENTES MEDIOS Y TEMPERATURAS

1.1 Introducción

El crecimiento de los microorganismos es un delta positivo entre la acumulación de

biomasa en relación con el tiempo, mediado por división celular y la formación de la

pared en hongos; está influenciado entre otros, por la luz, la temperatura, iones en el

medio, siendo estos factores limitantes si no se encuentran en las condiciones

específicas para cada tipo de organismo. El conocimientos de las condiciones óptimas

de cultivo de un organismo de importancia en control biológico permite ajustar los

parámetros para su multiplicación masiva con fines comerciales, además conocer las

condiciones favorables para su desarrollo, sugiere los rangos de zonas de vida y

sustratos que puede colonizar, además aporta elementos para el uso diferencial de

cepas de hongos en determinados ambientes. La velocidad a la cual ocurre el

crecimiento de un hongo a diferentes temperaturas y sustratos o medios de cultivo, está

determinada en gran parte por la capacidad del organismo de aprovechar las fuentes de

nutrientes disponibles (carbohidratos y proteínas, entre otros), de degradar las

sustancias presentes en el sustrato de crecimiento y por la habilidad del metabolismo de

ese organismo de funcionar dentro del rango de temperatura ofrecido por el medio

(Iskandarov et al. 2006; Fargues et al. 1992). La tasa de crecimiento de un

microorganismo es un factor importante a la hora de seleccionar un individuo para el

desarrollo de producciones masivas puesto que los hongos con una mayor celeridad de

crecimiento pueden ser buenos candidatos para formulaciones de bioinsecticidas

(Varela y Morales, 1996), un organismo de rápido crecimiento tiene cierta ventaja

competitiva una vez es aplicado en el campo.

Iskandarov et al. (2006) sostienen que la actividad de los hongos entomopatógenos

depende en gran medida de la composición nutricional del medio de cultivo en

laboratorio, ya que la relación C/N necesaria, la presencia de proteínas, y la demanda

de cada nutriente es diferente no sólo entre especies sino entre cepas de la misma

especie, por esto al composición de cada medio de cultivo usado para el crecimiento de

los hongos entomopatógenos tiene una directa relación con la producción y germinación

de las conidias y con la producción de biomasa. Vega et al. (2012) reportan los


39

rendimientos de esporas de tres hongos entomopatógenos en seis diferentes medios

líquidos contrastantes en la relación C/N encontrando que los rendimientos más altos de

esporas se obtuvieron en un medio que contiene una relación C/N de 10:1. En el caso

de M. anisopliae la nutrición influye en variables como el crecimiento, la esporulación y

la virulencia del hongo, encuentran que una relación C/N de 5,2:1 produjo las conidias

más virulentas entre los aislamientos utilizados en su estudio.

Iskandarov et al. (2006) mostraron que la composición del medio de cultivo influye en la

germinación de las conidias en M. anisopliae y B. bassianna comprobando que cada

uno requiere de diferentes condiciones para iniciar la germinación de las mismas, por

ejemplo M. anisopliae únicamente requiere sucrosa. Rangel et al. (2008) y Rangel et al.

(2011) plantean diferentes componentes o condiciones nutricionales en los medios de

crecimiento para inducir la producción de conidias más tolerantes a estrés en M.

robertsii, las conidias producidas bajo estrés nutritivo o estrés osmótico fueron

aproximadamente dos veces más tolerantes al calor y la radiación UV-B y germinaban

en un menor tiempo que las conidias producidas en un medio rico nutricionalmente. En

B. bassiana se han desarrollado estudios en donde se evidenció que la acumulación de

trehalosa y otros azucares está involucrada en el desarrollo de mecanismos de defensa

que protegen a las proteínas y las membranas celulares de la inactivación y

desnaturalización causadas por factores como calor, desecación o congelamiento y

estrés oxidativo causado por radicación solar (Liu et al. 2009; Ferreira et al. 2007).

En general, la esporulación y otros procesos que hace parte del ciclo infeccioso de los

hongos entomopatógenos es altamente dependiente no sólo de nutrientes, sino también

de condiciones ambientales adecuadas principalmente la temperatura y la humedad

relativa (Arthurs y Thomas, 2001). La mayoría de los hongos viven a condiciones

cálidas, con azúcares, medios ácidofílicos con pH entre 4 y 6 y aerobicos, y por

generalidad, la mayoría de los hongos filamentosos se desarrollan a 25°C, sin embargo,

tienen la capacidad de habitar en medios con temperaturas bajas psicrófilos, medias

mesófilos y altas termófilos, presentándose entre los dos primeros grupos los

termolerantes, con temperaturas óptimas de crecimiento por debajo de los rangos a los

cuales pueden resistir sin sufrir daños celulares (Walker y White, 2005). La mayoría de

los hongos entomopatógenos son mesófilos, con un crecimiento entre 10°C y 40 °C con

una temperatura óptima entre 25 y 35°C (Fernandes et al. 2010). De acuerdo a


40

McCammon y Rath (1994), las cepas de M. anisopliae pueden ser separadas por las

tasas de germinación a diferentes temperaturas, pues esta variable tiene un efecto

importante sobre la germinación y el crecimiento micelial de aislamientos por lo que esta

característica es utilizada como criterio de selección de aislamientos en programas de

manejo de plagas. Si bien algunos aislamientos o variedades pueden tolerar estar a

temperaturas altas, pueden sufrir un proceso denominado demora de crecimiento pos

estrés (post-stress growth delay PSGD), este término es acuñado por Keyser et al.

(2014) quienes evaluaron el efecto de la exposición de Metarhizium a 40°C y 5°C por

diferentes periodos de tiempo encontrando que los aislamientos sometidos a altas

temperaturas sobreviven, sin embargo, la exposición a 40°C afecta de una forma

importante el crecimiento, retardando el inicio del proceso de germinación cuando son

llevados a una temperatura de incubación de 28°C. Soares et al. (1983) y Ferron (1978)

afirman que el crecimiento de un aislamiento a una temperatura inferior de la óptima

retarda el desarrollo de la micosis pero no necesariamente afectan la mortalidad total

causada por cada hongo.

1.2 Objetivo Específico

Objetivo específico 1: Determinar la respuesta en el crecimiento de aislamientos

de Beauveria y de Metarhizium en medios de cultivo incubados a diferentes

temperaturas.

1.3 Metodología

1.3.1 Aislamientos utilizados en el estudio

Se evaluaron 31 aislamientos de hongos entomopatógenos, 24 de Beauveria sp. y siete

de Metarhizium , procedentes de diferentes zonas palmeras del país (Anexo 1) que en la

actualidad pertenecen a la colección de hongos entomopatógenos de la Corporación

Centro de Investigación en Palma de Aceite (Cenipalma). Los aislamientos fueron

encontrados afectando insectos asociados al cultivo de la palma. Se realizó su

aislamiento y conservación en Agar Sabureaud Dextrosa (SDA) a 4°C. Para cada vuna


41

de las pruebas cada uno de los aislamientos se sembraron en cajas de Petri con SDA

las cuales fueron incubadas a 26.5 °C durante 10 días, tiempo en el que se verificó la

esporulación.

1.3.2 Pruebas de crecimiento radial

Para evaluar el crecimiento radial de los aislamientos se usaron dos medios de cultivo,

Agar Sabouraud Dextrosa (SDA) Oxoid® (composición g.L-1: peptona micológica 10,

glucosa (dextrosa) 40, agar 15) y Agar Papa Dextrosa (PDA) Oxoid® (composición g.L-1:

extracto de papa 4, dextrosa 20, agar 15) a tres temperaturas 10°C; 26.5°C y 30°C. A

partir de cajas de Petri que contenían los aislamientos a evaluar, se preparó una

suspensión de cada uno y se ajustó la concentración a 1x106 conidias.ml-1. En el centro

de cada caja que contenía el respectivo medio (PDA ó SDA), se ubicó un disco de papel

filtro de 0.64 mm de diámetro, sobre el cual se depositaron 5 µl de suspensión de

conidias de cada aislamiento (aprox. 5000 conidias). Cada combinación aislamiento x

medio fue incubado a tres temperaturas diferentes 10°C, 26.5°C y 30°C. El tiempo de

incubación y evaluación comprendió un total de 30 días, durante los cuales se midió el

diámetro de las colonias cada tercer día con un calibrador Vernier. Se realizaron cuatro

repeticiones por tratamiento por cada uno de los medios de cultivo y temperaturas

evaluadas.

1.3.3 Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza, a partir del cual se detectó que la interacción:

aislamiento por temperatura por medio de cultivo, posteriormente mediante la función

AUDPC, del paquete Agricolae, desarrollado por De Mendiburu (2009), se obtuvo el

área bajo la curva (ABC) para cada una de las combinaciones aislamiento X medio de

cultivo X temperatura hasta la evaluación registrada el día 18 después de siembra,

obteniéndose una base de datos con estructura factorial: 31 aislamientos x 3

temperaturas x 2 medios y, una sola variable respuesta, el ABC acumulada.


42

1.4. Resultados

1.4.1. Crecimiento radial de los aislamientos evaluados en medio de cultivo Agar

Papa Dextrosa y Sabureaud Dextrosa Agar.

Se realizó un análisis de varianza, a partir del cual se detectó que la interacción:

aislamiento por temperatura por medio de cultivo, es altamente significativa, valor p <

2e-16 (Tabla 1.1), por lo que se evaluaron los efectos simples de los aislamientos, de la

temperatura y del medio de cultivo, es decir, cuánto cambia el ABC acumulada hasta el

día 18 de evaluación para un aislamiento, que crece en diferentes medios de cultivo y a

diferentes temperaturas. El criterio de selección de este tiempo se fundamenta en el

hecho de que este día es cuando la mayoría de aislamientos se encuentran al final de la

fase exponencial de su crecimiento en las cajas de Petri de 9 cm de diámetro.

Tabla 1.1. Análisis de varianza para el área bajo la curva acumulada hasta el día 18 de evaluación

de crecimiento en aislamientos de Beauveria y Metarhizium procedentes de palma de aceite.

INTERACCIÓN EVALUADA SCa

GLb

CMc

Fcd

Pr(>F)e

Aislamiento 926,0 30,0 30,9 95,9 <2e-16

Temperatura 6801,0 2,0 3400,5 10572,5 <2e-16

Medio 0,0 1,0 0,0 0,0 0,881

Aislamiento*Temperatura 1239,0 60,0 20,7 64,2 <2e-16

Aislamiento*Medio 285,0 30,0 9,5 29,5 <2e-16

Temperatura*Medio 56,0 2,0 28,0 86,7 <2e-16

Aislamiento*Temperatura*Medio 624,0 59,0 10,6 32,9 <2e-16

Residuales 165,0 514,0 0,3

aSuma de cuadrados,

bgrados de libertad,

ccuadrado medio del error,

d F Calculado,

e Probabilidad

de encontrar un F mayor al Fc

El análisis estadístico realizado a los aislamientos de Beauveria en los dos medios

evaluados a las tres temperaturas detectó diferencias significativas entre aislamientos

sembrados en un mismo medio de cultivo e incubados a una misma temperatura

(Tabla1.2).


43


cultivo

En general, se observó que los aislamientos de Beauveria estudiados tienen la

capacidad de crecer a esta temperatura de incubación en los dos medios de cultivo

evaluados. En PDA, 21 de los 24 aislamientos mostraron algún tipo de crecimiento, en

SDA solo 18 de la totalidad de aislamientos evaluados crecieron a esta temperatura de

incubación después de 18 días de evaluación.

La máxima ABC registrada corresponde a B006 en PDA (4.54), este mismo aislamiento

en SDA se ubicó entre los que tuvieron las mayores ABC hasta el día 18 de evaluación,

B027 presentó un comportamiento similar en los dos medios de cultivo evaluados, en

PDA obtiene el mayor ABC 3.39 y en SDA también se ubica entre los aislamientos que

presentan los mayores valores de ABC 2.66, lo que indicaría que estos dos tienen un

comportamiento psicrófilo. Los aislamientos B005 y B032 que en SDA se ubican entre

los que muestran las mayores ABC 2.98 y 3.98 respectivamente, en PDA tienen valores

mínimos de ABC de 0.34 y 0 respectivamente.

Las ABC registradas en PDA son inferiores a las observadas en SDA en todos los

aislamientos a excepción de B027 que muestra una mayor ABC en PDA (3.39) que en

SDA (2.66). Algunos aislamientos como B001, B002, B013, B024, B041 y B044 no tienen

la capacidad de crecer en SDA mientras que cuando son cultivados en PDA a la misma

temperatura de incubación muestran crecimiento después de 18 días de incubación

(Tabla 1.2). Al realizar un análisis estadístico de los aislamientos sembrados en ambos

medios de cultivo en PDA y en SDA se forman varios grupos estadisticamente diferentes

entre los aislamientos con mayores ABC y con respecto a los demás (Tabla 1.2). De los

siete aislamientos de Metarhizium evaluados en los dos medios de cultivo SDA y PDA

ninguno muestra crecimiento a esta temperatura de incubación.


Tabla 1.2. Grupos de crecimiento radial de aislamientos de Beauveria sembrados en PDA y sometidos a diferentes temperaturas de

crecimiento*.

Medio de

cultivo PDA SDA

Temperatura 10 °C 26.5 °C 30 °C 10 °C 26.5 °C 30 °C

Posición Aislam. Media Grupo Aislam. Media Grupo Aislam. Media Grupo Aislam. Media Grupo Aislam. Media Grupo Aislam. Media Grupo

1 B027 3.39 a B015 9.96 a B044 11.29 a B006 4.54 a B001 10.96 a B019 9.26 a

2 B006 2.92 b B040 9.05 ab B045 8.87 b B032 3.98 b B021 9.31 b B044 9.25 a

3 B045 0.54 c B025 8.84 abc B018 8.47 bc B005 2.98 c B018 9.22 b B015 9.13 ab

4 B042 0.49 cd B018 8.28 abcd B005 8.31 bc B027 2.66 c B045 8.93 b B017 8.44 abc

5 B024 0.43 cde B017 7.79 abcde B043 7.82 bcd B015 0.87 d B017 8.08 bc B045 8.05 abc

6 B017 0.41 cdef B006 7.29 bcdef B040 7.66 bcde B042 0.61 de B027 7.73 bc B035 7.76 abcd

7 B019 0.41 cdef B044 7.21 bcdefg B015 7.59 bcdef B019 0.54 def B040 7.39 cd B041 7.23 abcde

8 B015 0.40 cdef B045 6.84 bcdefgh B019 7.58 cdef B017 0.53 def B013 6.93 cde B002 7.19 abcde

9 B001 0.40 cdef B021 6.71 cdefgh B035 7.51 cdef B021 0.48 defg B002 6.93 cde B042 6.74 abcde

10 B038 0.36 cdef B028 6.44 defgh B041 7.49 cdef B045 0.34 efgh B005 6.80 cdef B038 6.41 abcdef

11 B005 0.34 cdef B001 6.33 defgh B017 7.45 cdef B018 0.23 fgh B019 6.54 cdefg B018 6.34 abcdef

12 B035 0.31 cdefg B043 6.05 efghi B013 7.31 cdef B028 0.21 fgh B025 6.08 defgh B025 6.24 abcdef

13 B037 0.25 defg B038 5.63 efghi B021 7.20 cdef B037 0.19 fgh B024 5.71 efghi B024 6.21 bcdef

14 B028 0.24 efg B035 5.62 efghi B037 7.16 cdef B040 0.18 fgh B035 5.30 fghi B013 6.18 bcdef

15 B044 0.24 efgh B002 5.17 fghi B024 6.85 def B043 0.18 fgh B015 5.12 ghij B040 6.14 cdef

16 B021 0.21 efgh B032 5.09 fghi B028 6.46 efg B035 0.14 gh B032 4.73 hijk B021 5.92 cdef

17 B043 0.21 efgh B019 4.98 fghi B025 6.34 fg B038 0.13 gh B006 4.57 hijk B028 5.77 cdef

18 B002 0.18 fgh B037 4.94 fghi B002 5.41 gh B025 0.06 h B042 4.43 ijk B006 5.12 def

19 B040 0.18 fgh B041 4.94 ghi B027 5.40 gh B001 0.00 h B038 3.76 jkl B001 4.73 efg

20 B013 0.08 gh B024 4.79 ghi B001 5.04 h B002 0.00 h B041 3.69 jklm B005 4.68 efg

21 B041 0.08 gh B013 4.77 hi B006 5.03 h B013 0.00 h B043 3.65 klm B037 3.62 fg

22 B018 0.00 h B005 4.74 hi B038 3.36 i B024 0.00 h B044 3.61 klm B027 3.40 fg

23 B025 0.00 h B042 4.01 ij B042 3.01 i B041 0.00 h B028 2.83 lm B032 3.32 fg

24 B032 0.00 h B027 2.20 j B032 2.30 i B044 0.00 h B037 2.32 m B043 2.10 g

* Tukey (∝= 0.05).


45

1.4.3 Crecimiento radial de los aislamientos evaluados a 26.5°C en dos medios de cultivo

Todos los aislamientos evaluados de Beauveria y Metarhizium mostraron crecimiento a 26.5°C

tanto en PDA como en SDA. Con respecto a Beauveria en SDA, el rango de ABC oscila entre

10.96 (B001) y 2.32 (B037) Aislamientos como B001, B021, B018, B045 y B017 muestran

ABC con valores superiores 10.96, 9.31, 9.22, 8.93 y 8.08 por lo que se podrían considerar

aislamientos con una tasa de crecimiento alta, dentro de este grupo es estadisticamente

diferente de los demás únicamente el aislamiento B001, en contraste este aislamiento no tuvo

la capacidad de crecer en el mismo medio de cultivo cuando fue incubado a 10°C. Los demás

aislamientos con ABC inferiores a 7.73 son estadisticamente diferentes entre ellos Tukey (∝=

0.05). El comportamiento de las ABC de los aislamientos sembrados en PDA es similar

respecto a los valores presentados en SDA, independientemente del hongo evaluado. Las

mayores ABC en PDA fueron las presentadas por B015, B040 y B025 con un valor medio de

9.96, 9.05 y 8.84 respectivamente, siendo entre estos B015 estadisticamente diferente de

B040 y B025 y de los demás aislamientos evaluados Tukey (∝= 0.05). Los aislamientos B017

y B018 se ubican entre los aislamientos con mayores ABC tanto en PDA como en SDA. El

aislamiento B027 en SDA a 26.5°C se ubicó en el tercio de los aislamientos con mayor media

de ABC (7.73) en contraste en PDA ocupó el último lugar en media de ABC (2.20) entre los

aislamientos evaluados lo que indica que es más beneficioso para su desarrollo el medio con

más contenido de proteínas y que a esta temperatura de incubación hay un mayor efecto del

medio de cultivo que de la temperatura sobre la tasa de crecimiento (Tabla 1.2). Aunque B025

no presentó crecimiento a 10°C en PDA, cuando se expone a 26.5°C se ve beneficiado y junto

con B015 y B040 presentan mayores valores de ABC; pero su desarrollo disminuye

nuevamente cuando se incuba a 30°C, este aislamiento entonces se puede considerar un

organismo con un rango de temperatura específico y estrecho para su crecimiento adecuado.

Con respecto a Metarhizium todos los aislamientos sembrados en PDA e incubados a esta

temperatura muestran crecimiento. Mt009 tuvo la mayor ABC (13.82) y Mt010 tuvo la menor

ABC en esta temperatura de incubación (5.16), aunque no son amplias las diferencias, si se

puede deducir un posible efecto del medio de cultivo ya que en PDA, en general las ABC son

levemente mayores que en SDA en donde estadísticamente se forman dos grupos,

Mt006(9.26), Mt002(8.68), Mt009(8.51), Mt005(8.34) y Mt010(7.98) se ubican dentro del grupo

Caracterización de hongos entomopatógenos asociados a insectos plaga de palma de aceite (Elaeis guineensis Jaqc.)

46

con medias mayores, diferenciándose significativamente de los aislamientos Mt001(6.04) y

Mt004(5.84) los cuales presentaron los menores valores de ABC (Tabla 1.3).

Tabla 1.3. Grupos de Crecimiento radial de aislamientos de Metarhizium en medios de cultivo

PDA y SDA incubados a 26.5°C*

Medio de Cultivo PDA SDA

Temperatura 26.5 °C 26.5 °C

Posición Aislam. Media Grupo Aislam. Media Grupo

1 Mt009 13.82 a Mt006 9.26 a

2 Mt006 12.24 b Mt002 8.68 a

3 Mt004 11.15 bc Mt009 8.51 a

4 Mt005 10.11 c Mt005 8.34 a

5 Mt001 8.31 d Mt010 7.98 a

6 Mt002 8.04 d Mt001 6.04 b

7 Mt010 5.16 e Mt004 5.84 b

* Tukey (∝= 0.05).

1.4.4 Crecimiento radial de los aislamientos evaluados a 30°C en dos medios de cultivo

La totalidad de aislamientos evaluados muestran la capacidad de crecer cuando son

sometidos a un leve incremento de la temperatura de incubación. Las ABC de los

aislamientos de Beauveria en PDA a 30°C tienen rangos que van desde 11.29 (B044) a 2.30

(B032). No en todos los aislamientos el efecto del incremento de la temperatura de

incubación es positivo por ejemplo, B015 y B040, que presentaron las mayores ABC a 26.5°C

muestran descenso en su ABC al ser incubados a 30°C, se deduce entonces, que la tasa de

crecimiento radial en mm/día de cada aislamiento con respecto a la temperatura es una

respuesta específica y no es posible generalizar incluso dentro del mismo género. Al comparar

el ABC de B042 a las dos temperaturas de incubación 26°C y 30°C en PDA se observa que

sus valores se ubican entre los mas bajos dentro de los aislamientos de Beauveria evaluados

lo que sugeriría que su tasa de crecimiento es menor al compararla con los demás

aislamientos del genero en el mismo medio de cultivo. A 30 °C, el aislamiento que mayor ABC

presentó en PDA, fue B044, diferenciándose significativamente de los demás aislamientos;

B045, B018 y B005, presentaron igualmente valores altos de ABC, B045 y B018 presentan un

comportamiento similar a 26.5°C ya que se ubican en el rango de los aislamientos con mayor

ABC. En contraste, B005 se encuentra entre los aislamientos menores valores de ABC en


47

PDA a 26.5 °C. Con respecto al ABC de los aislamientos de Beauveria sembrados en SDA e

incubados a 30°C los valores oscilan entre 9.26 (B019) y 2.10 (B043), se observó que las ABC

en general tienen un comportamiento similar al presentado cuando los aislamientos son

incubados a 26.5°C. A 30 °C los aislamientos que en SDA a 10°C mostraban el mayor ABC

como B005, B006, B027 y B032, pasan al tercio de aislamientos con menor ABC con valores

de 4.68, 5.12, 3.40 y 3.32 respectivamente, lo que sugiere un comportamiento psicrófilo,

diferenciándose significativamente de los aislamientos B019, B044, B015, B017, B045 los

cuales presentan la mayor ABC a 30 °C. En SDA a 30 °C, los aislamientos B019 y B044

presentaron la mayor ABC y presentaron diferencias significativas con el resto de

aislamientos, sin embargo, B044 se encontró entre los aislamientos con menor ABC, tanto a

10 °C como a 26.5 °C sugieriendo un efecto positivo del incremento de la temperatura de

incubación.

El ABC de los aislamientos de Metarhizium sembrados en PDA oscila entre 11.24 (Mt006) y

4.44 (Mt002). Al realizar una prueba de Tukey (∝= 0.05) se forman dos grupos de aislamientos

con ABC que muestran diferencias significativas (a,b) en el primero se incluyen los

aislamientos Mt006, Mt009, Mt004 y Mt005 con medias 11.24, 10.49, 9.91, 9.50

respectivamente. En el segundo grupo, se ubican tres aislamientos de Metarhizium Mt010,

Mt001 y Mt002 con medias de ABC 4.83, 4.63 y 4.44 respectivamente (Tabla 1.4). Los

aislamientos de Metarhizium sembrados en SDA incubados a 30°C muestran ABC con medias

que varían entre 12.85 (Mt005) y 9.26 (Mt010). En general, en SDA las medias de las ABC

para los aislamientos de Metarhizium son superiores a las presentadas en PDA, por ejemplo,

Mt002 que tuvo una media de ABC de 4.44 en PDA y de 12,11 en SDA (Tabla 1.4). Al realizar

una prueba de Tukey (∝= 0.05), se observan diferencias significativas en las medias del ABC

formando dos grupos en el primero se todos los aislamientos a excepción de Mt010 que se

ubica en el segundo grupo (Tabla 1.4). Particularmente se debe resaltar que Mt010, presentó

medias bajas de ABC tanto en PDA como en SDA a 30°C sin embargo, esta última a pesar de

ser la más baja dentro del tratamiento es la mejor ABC expresada por este hongo en todo el

ensayo, pudiendo ser que presente intrínsicamente tasas de crecimiento bajas o que el rango

de temperaturas evaluadas no incluyen el óptimo para su crecimiento.


48

Tabla 1.4. Grupos de Crecimiento radial de aislamientos de Metarhizium en medios de cultivo PDA y SDA

incubados a 30°C*

Medio de Cultivo PDA SDA

Temp. 30 °C 30 °C

Posición Aislam. Media Grupo Aislam. Media Grupo

1 Mt006 11.24 a Mt005 12.85 a

2 Mt009 10.49 a Mt006 12.23 ab

3 Mt004 9.91 a Mt002 12.11 ab

4 Mt005 9.50 a Mt004 11.93 b

5 Mt010 4.83 b Mt001 11.86 b

6 Mt001 4.63 b Mt009 11.70 b

7 Mt002 4.44 b Mt010 9.26 c

* Tukey (∝= 0.05).

1.5 Discusión

Teniendo en cuenta que las condiciones ambientales en el campo, no son constantes y las

temperaturas pueden fluctuar ampliamente, es importante conocer la capacidad de los hongos

para crecer a diferentes rangos de temperatura y de esta forma utilizar este conocimiento para

definir los parámetros que se deben tener en cuenta para incorporar los hongos en programas

de control biológico.

El conocimiento de la forma en que factores físicos y químicos influencian la fisiología de un

hongo en términos de crecimiento, especialmente los nutrientes, es primordial para entender al

organismo (Iskandarov et al. 2006) Con respecto a los dos medios usados en este trabajo el

contraste en composición es que SDA es rico en nitrógeno, pues al tener peptonas como

componente principal, ofrece compuestos peptídicos además de la dextrosa, en el caso del

PDA, la infusión de papa ofrece esencialmente polisacáridos en forma almidones y dextrosa.

Las interacciones analizadas de aislamiento*temperatura*medio son altamente significativas en

los resultados aqui hallados, lo cual indica que estos tres factores modifican la respuesta de

tasa de crecimiento en aislamientos de Beauveria y Metarhizium evaluados, esta respuesta es

única para cada caso. Safavi et al. (2007) realizan un contraste entre el crecimientod de

Beauveria y Metarhizium y encuentran que este último mejora sus variables de crecimiento


49

radial, producción de esporas y porcentaje de germinación en medios con altos contenidos de

C y bajos de peptonas. En contraste, tres aislamientos de Beauveria evaluados, crecen mejor

en medios con contenidos de N (SDA) en forma de extracto de levadura o peptonas, sin

embargo, es posible notar que esta respuesta es bastante específica. Keyser et al. (2014)

mencionan que Metarhizium sp. en PDA a 30°C crece menos que en SDA a 26.5°C estos

hallazgos resultan contrastantes con los hallados en este estudio ya que solo algunos de los

Metarhizium aquí evaluados tienen esta tendencia, lo que permite deducir que un adecuado

medio de cultivo contrarresta el posible efecto negativo que sobre el hongo pueden tener las

altas temperaturas, por ello esta interacción o requerimiento nutricional es exclusivo de cada

aislamiento y al parecer no está asociados a taxa particulares.

La temperatura óptima de crecimiento de un hongo entomopatógeno es determinante en la

eficiencia con la que actúe el microorganismo dentro de un programa de manejo de plagas ya

que no solo afecta procesos fisiológicos en general, sino también la virulencia y eficiencia de la

infección. Iskandarov et al. (2006) con respecto al crecimiento de aislamientos de B. bassiana y

M. anisopliae a diferentes temperaturas, definen que los hongos incubados entre 15°y 35°C

tienen una alta germinación (95%) después de 10 a 15 horas de incubación, en contraste, en

los mismos aislamientos incubados a 10°C durante 50 horas no superan el 10% de

germinación. A 40°C las conidias comienzan a germinar a las 48 horas de incubación

expresando una mejor tasa de germinación en M. anisopliae lo que indica una adaptación de

este hongo a las altas temperaturas. Autores como Keyser et al. 2014; Rangel, 2005;

Fernandes et al. 2010 afirman que Metarhizium puede desarrollarse bien a temperaturas

entre 37 a 40°C e incluso por encima de 45°C, los aislamientos de Metarhizium evaluados en

este trabajo muestran un comportamiento similar ya que se observa una tendencia a mayores

ABC acumuladas en la medida en que se incrementa la temperatura de incubación, sin

embargo, las temperaturas aquí evaluadas no son superiores a 30°C, por lo que se tendría que

evaluar el crecimiento de estos a temperaturas entre 35°C y 40°C. Según Fernandes et al.

(2010), ciertas cepas de M. anisopliae que crecen a 37°C no crecen a bajas temperaturas

(5°C), mientras que los aislados que crecen a 5°C no crecen a temperaturas más elevadas,

algunos aislamientos no crecen a 5 o 37°C, pero lo hacen a 25°C. Pero en general en M.

anisopliae se encuentran amplios rangos de termotolerancia (Rangel et al. 2005; Fernandes et

al. 2008). La capacidad de crecer y ser infectivo a bajas o altas temperaturas está relacionado

con el área en donde sea encontrado el hongo De cross y Bidochka (1999) aislaron M.


50

anisopliae en Canada, muchos de los cuales pudieron germinar a 8°C. Fernandes et al. (2008)

y Bidochchka (2006) sugieren que la capacidad de crecimiento de un hongo a diferentes

temperaturas está limitada por la temperatura promedio del sitio en donde se realizó el

aislamiento, los aislamientos evaluados en este estudio proceden de áreas con temperatura

promedio superior a 25°C lo que podría estar relacionado con la incapacidad de estos para

crecer a 10°C. Keyser et al. (2014) también reportaron que aislamientos de Metarhizium

sometidos a 5°C no mostraron ningún crecimiento, coincidente con Fernandes et al. (2010)

reportan que 37 aislamientos de Metarhizium spp. y M.a. var acridum incubados a 5°C durante

15 días, presentan grandes pérdidas en la germinación, y sólo en dos de la totalidad de

aislamientos el efecto de la temperatura no causa grandes pérdidas, igualmente exponerlos a

10°C durante 15 días manifiesta el efecto negativo de la temperatura sobre la germinación, ya

que hace que ésta sea menor. Sin embargo, Keyser et al. (2014) observaron que si los

aislamientos después de ser incubados a 5°C eran expuestos a 28°C su desarrollo volvía a ser

normal, lo que sugeriría que la temperatura induce un periodo de latencia en las conidias que

puede romperse una vez ésta vuelve a ser favorable para el hongo, este comportamiento no

puedo ser corroborado en este trabajo debido que las cajas de petri que contenían el medio de

cultivo en donde se había depositado la suspensión de los hongos eran descartadas una vez

se realizaban las mediciones necesarias y por esto no fueron sometidas a nuevos periodos de

incubación a temperaturas mayores. La mayoría de hongos entomopatógenos crecen a

temperaturas entre los 10°C y 40°C y por ello son clasificados como mesofílicos (Roberts y

Campbell, 1977). Según Walstad et al. (1970) la temperatura máxima en la que muchas

especies de M. anisopliae germinan es 37°C, sin embargo, existen variaciones importantes y

los aislamientos que crecen a altas temperaturas no tienen la capacidad de crecer a

temperaturas inferiores, lo que ha sido utilizado como uno de los criterios de clasificación del

género (Bischoff et al. 2006). Estos hallazgos coinciden con los hechos en este trabajo ya que

se observa que los aislamientos de Metarhizium aquí evaluados tienen tasas de crecimiento

superiores a las de Beauveria a 26.5°C y 30°C, por lo que se podría considerar que leves

aumentos en la temperatura de incubación favorecen su desarrollo. En cuanto a las

preferencias en temperatura Fargues et al. (1992) determinaron que M. anisopliae requiere

para su crecimiento micelial temperaturas entre 25 y 28°C, en este trabajo los aislamientos de

Metarhizium evaluados en las dos temperaturas en donde se presentó crecimiento 26.5°C y

30°C no muestran diferencias altamente contrastantes en cuanto al ABC, independientemente

del medio de cultivo. Berlanga y Hernández (2002) determinaron que M.a. var acridum tiene un


51

crecimiento más lento al ser incubado a 20°C, siendo más tolerante a altas temperaturas en

comparación con algunos aislamientos de M. anisopliae y B. bassiana, en este trabajo se

observó que hay un incremento de las ABC acumuladas cuando los hongos son incubados a

una temperatura mas alta (30°C).

Beauveria bassiana crece en un rango de temperatura entre 8°C y 35°C (Fargues et al. 1992).

El punto de muerte térmico para conidias de B. bassiana reportados por Liu et al. (2009) está

entre 45°C y 50°C incluso algunos aislamientos es cercana a 55°C (Varela y Morales, 1996).

Devi et al. (2005) evaluaron el efecto de la exposición a temperaturas entre 32°C y 42°C en

ciclos de 8 horas/ 16 horas a 25 °C sobre el crecimiento de 29 aislamientos de B. bassiana en

donde observaron que a 32°C no hay un efecto importante sobre la germinación y no se

encuentran diferencias con el testigo, al incrementar la temperatura de incubación a 35°C y

38°C comienzan a verse diferencias entre los aislamientos y su tolerancia. Estos autores

sugieren que la exposición a altas temperaturas por periodos cortos de tiempo seguidas de la

incubación a temperaturas óptimas favorece el desarrollo de los hongos. El rango de

temperatura evaluado en este trabajo es más estrecho que el evaluado por los anteriores

autores, sin embargo se evidencia un comportamiento similar en cuanto al crecimiento ya que

la gran mayoría crece en los rangos aquí evaluados, nueve de los 24 aislamientos evaluados

no muestran ningún tipo de crecimiento en alguno de los dos medios evaluados cuando son

incubados a 10°C lo que sugiere un rango de tolerancia menor al reportado por los anteriores

autores.

Con respecto a la capacidad patogénica, esta se puede ver afectada por la temperatura y el

medio en el que se desarrolle el hongo sin embargo, algunos hongos pueden permanecer

infectivos a bajas temperaturas incluso a 2°C (Vega et al. 2012). Se ha encontrado que

algunas variedades responden de manera diferencial al aumento de la temperatura,

Fernandes et al. (2010) reportan que en la medida que se incrementa el tiempo de exposición

a altas temperaturas (45°C), los aislamientos de Metarhizium spp. disminuyen su germinación

mientras que los aislamientos de M.a. var acridum no tienen grandes pérdidas en ella, los

aislamientros que este trabajo presentaron los rangos de crecimiento mas amplios muy

seguramente tendrán un mejor comportamiento en el caso dew que sean utilizados en el

campo.


52

El aumento en la temperatura corporal de algunos insectos como mecanismo de defensa al

ataque de los hongos entomopatógenos restringe severamente el desarrollo del patógeno, lo

que conduce a un retraso considerable en la mortalidad inducida por estos organismos (Inglis

et al. 1997; Blanford y Thomas, 1999; Arthurs y Thomas, 2000; Blanford y Thomas, 2000;

Ouedraogo et al. 2004). Por ejemplo, el límite superior para el crecimiento de M.anisopliae var.

acridum está en el rango de 35-40 °C tales temperaturas corporales afectan el proceso

infectivo de hongos no tolerantes a las mismas.En condiciones de temperatura ambiental

consideradas ideales 25°C - 32 °C, el tiempo de la muerte de langostas después de ser

tratadas con M. anisopliae var. acridum es de 7 días (Lomer et al. 2001). Welling et al. (1994)

mencionan que aislamientos de M.anisopliae y M.a. var. acridum pueden resistir temperaturas

de 40 ºC o mayores durante algunas horas, pero con una marcada reducción en su grado de

crecimiento, indicando que el aislamiento de M.a. var. acridum fue más resistente a

temperaturas entre 44°C y 25 ºC. Lanza et al. (2009) evaluaron el efecto de la temperatura y

la humedad en tres tipos de suelo sobre la supervivencia de M. anisopliae, encontrando que la

supervivencia de los aislamientos de M. anisopliae evaluados se ve afectada a 31.5°C. pero

no entre 21°C y 26°C valores de temperatura que se encuentran en los evaluados en este

trabajo en donde los resultados fueron similares.

Las temperaturas a las que fueron sometidas los aislamientos evaluados en este trabajo

permiten evidenciar que de acuerdo a lo reportado por otros autores hay un efecto sobre la

tasa de crecimiento, y que la temperatura optima de crecimiento de cada género es diferente,

sin embargo, es evidente la capacidad de los aislamientos a crecer en un amplio rango de

temperaturas, lo que coincide con lo encontrado en la naturaleza. Al igual que la temperatura el

medio en el que se desarrolle un hongo tiene un efecto importante sobre la tasa de crecimiento

y la patogenidad de los hongos. Por lo anterior, es necesario realizar estudios específicos entre

otros con respecto al medio de cultivo o propagación y la temperatura de incubación con los

aislamientos candidatos a ser incorporados como estrategia de manejo de insectos plaga.


53

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57

CAPITULO 2: TOLERANCIA DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

A LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA

2.1 Introducción

La radiación consiste en la propagación de energía en forma de ondas electromagnéticas o

partículas subatómicas a través del vacío o de un medio material. La energía requerida para

los procesos físicos y biológicos terrestres depende en casi un 99% de la radiación proveniente

del sol, la cual es de tipo electromagnética, y va desde los 15 a 400 nm (radiación ultravioleta -

UV-). La radiación solar afecta a los hongos en condiciones de campo a través de dos

procesos diferentes: el efecto fotónico, causado por longitudes de onda corta (UV y fotones

visibles) y el efecto térmico causado por la radiación infrarroja cercana (700 – 3000 nm), lo

cual resulta en un incremento de la temperatura (Pavone, 2003).

La radiación responsable del efecto fotónico UV se divide en tres tipos: Radiación Ultravioleta

A (UV-A) entre 315- 400 nm; Radiación Ultravioleta B (UV-B) entre 280-315 nm y Radiación

Ultravioleta C (U\/- C) entre 200-280 nm (Devotto y Gerding, 2003; Paul y Gwynn-Jones,

2003). Aunque esta clasificación es arbitraria, se hace útil para considerar los efectos

biológicos y ecológicos de la UV. La energía de un fotón de radiación es inversamente

proporcional a su longitud de onda, y por lo tanto la radiación UV-C, es la más energética de la

tres bandas de frecuencia, por tener la menor longitud de onda (Paul y Gwynn-Jones, 2003).

La UV-C a pesar de ser la más nociva, es fuertemente absorbida por el oxígeno y el ozono en

la estratosfera. La UV-A y UV-B son capaces de atravesar la atmósfera terrestre, la UV-A no

es absorbida por el ozono y llega en su totalidad a la tierra, la radiación UV-B aunque es

absorbida en un 90% por la capa de ozono y solo el 10% logra ingresar a la litosfera es

nociva ya que afecta las moléculas de ADN induciendo reacciones fotoquímicas que llevan a

mutaciones.


58

2.1.1 Efecto de la RUV-B sobre los hongos

Los hongos al igual que todos los demás organismos vivos son sensibles a la luz solar, por ello

son afectados luego de una exposición prolongada especialmente al componente UV-B de

ésta (Alves et al. 1998, Braga et al. 2001; 2002; Fernandes et al. 2007). La radiación

ultravioleta (UV) (entre 200 y 400 nm) es una causa importante de la disminución de la

viabilidad del inóculo de hongos aplicado en campo debido a los efectos fisiioloicos que tiene

sobre las conidias, este tipo de radiación varía en intensidad con el tiempo del día, el área

geográfica y la estación del año (Huang y Feng, 2009). Para los organismos expuestos la UV

impone la selección intensa, resultando en cambios en las especies y en la composición de

estas en una comunidad en escalas de tiempo incluso de horas (Jacobs y Sunding, 2001). Por

lo anterior, la tolerancia a la radiación UV es una característica importante en hongos y

bacterias, ya que durante una parte de su ciclo de vida están expuestos a esta condición,

siendo especialmente vulnerables durante procesos como la esporulación, dispersión y el

proceso de infección en sus hospederos.

Según Diffey, 1991 y Griffiths et al. 1998 el efecto que tiene la UV sobre los microorganismos,

se debe a la presencia de grupos cromóforos situados en diferentes estructuras celulares,

estos son capaces de absorber ciertas longitudes de onda, que a su vez pueden ocasionar

daños directos o indirectos sobre algunas moléculas (p. ej.; carotenoides, esteroides,

quinonas, proteínas y ácidos nucleicos entre otros). Paul y Gwynn-Jones (2003) mencionan

que el daño en el Acido Desoxirribucleico ADN es probablemente el principal efecto de la UV

induciendo cambios heredables traducidos en variación genética. En el ADN la radiación UV-C

y UV-B forma dímeros de bases pirimidinas sobre la misma cadena tipo timina- timina, timina -

citosina y citosina-citosina (Nicholson et al. 2005), además, se da la formación de hidratos de

pirimidina y entrecruzamientos entre ADN y proteínas (Devotto y Gerding, 2003). Los daños

indirectos de la radiación sobre la célula se deben principalmente a la formación de peróxido

de hidrógeno y radicales libres que oxidan la pentosa presente en el ADN rompiendo la hebra

de la molécula; en general los daños ocasionados se reflejan en mutaciones, retraso en el

crecimiento o muerte celular (Braga et al. 2001a). La UV también causa daños a proteínas y

peroxidación de lípidos que reaccionan con los ácidos grasos de los fosfolípidos, afectando la

fluidez de la membrana celular (Pavone, 2003; Gutteridge y Halliwell, 1990; Aikens y Dix,

1991). El ADN mitocondrial también puede sufrir alteraciones (Krutmann, 2006).


59

En términos de efectos en poblaciones, se considera que el aumento de radiación UV-B puede

cambiar no sólo los individuos, sino también la estructura de las comunidades, considerado

este uno de los factores que reducen la eficiencia de los agentes de control biológico (Johnson,

2003). Durante la aplicación en el día de las conidias de hongos, la principal preocupación es

la 'inactivación' debida a la UV. Ignoffo et al. (1977) propusieron al peróxido producido por la

fotooxidación de los aminoácidos debido a UV-A y UV-B como el responsable de la falta de

efectividad de un hongo entomopatógeno sometido a UV. Por ello en la actualidad se emplean

protectores de luz UV y se seleccionan aislamientos basados en su tolerancia a la radiación,

todo esto con el fin de conservar su efecto en campo.

El presente estudio se realiza una prueba de la tolerancia a luz UV-B en aislamientos de

Beauveria y Metarhizium procedentes de insectos plaga asociados al cultivo de la palma de

aceite.

2.2 Objetivo Específico

Objetivo específico 2: Establecer el efecto de la luz ultravioleta, fracción UV-B de la luz solar,

sobre la germinación de aislamientos de Beauveria y Metarhizium .


60

2.3 Metodología


Se evaluaron 31 aislamientos de hongos entomopatógenos, 29 de Beauveria sp. y siete de

Metarhizium (Anexo 1), estos en la actualidad pertenecen a la colección de hongos

entomopatógenos de la Corporación Centro de Investigación en Palma de Aceite (Cenipalma).

Los aislamientos fueron mantenidos en Agar Sabouraud Dextrosa (SDA) Oxoid® (composición

g.L-1: peptona micológica 10, glucosa 40, agar 15) y multiplicados según necesidad.

2.3.2 Aplicación de tratamiento con UV-B.

Se evaluó el efecto de la radiación ultravioleta (UV-B) sobre el porcentaje de germinación al

exponer los hongos a esta radiación durante diferentes tiempos: 0, 15, 30, 45 y 60 minutos.

Para ello, se tomaron conidias de cada uno de los aislamientos a evaluar y se se preparó una

suspensión en 10 ml de agua destilada estéril + Tween 80 al 0,1%, se homogenizó la

suspensión y se ajustó la concentración a 1 x 10 7conidias.ml-1. Luego, en cajas de Petri que

contenían SDA se depositó 1 µl de suspensión de cada aislamiento sobre cinco puntos

diferentes del medio de cultivo, lo que constituyó una unidad experimental. Las unidades

experimentales se expusieron a radiación UV-B en una cámara de flujo laminar con una

lámpara General Electric® que produce una radiación de 300 nm ubicando las cajas de Petri a

una distancia de 30 cm de la lámpara. Luego de someter cada unidad experimental a los

tratamientos, éstas se llevaron a la incubadora por 24 horas a 26.5 °C en oscuridad total para

evitar efectos de fotoreparación. Los testigos (no expuestos a UVB) se dispusieron igualmente

en la incubadora en similares condiciones.

Para cada aislamiento se realizaron cuatro repeticiones por cada uno de los tiempos de

exposición. La variable evaluada fue el porcentaje de germinación como indicador del número

de conidias que sobrevivieron a la exposición a la radiación. Una vez se cumplió el tiempo de

incubación, se realizó el conteo de conidias germinadas y no germinadas utilizando el objetivo

40X en un microscopio marca Olympus® CX21.


61

2.3.4 Cálculo de porcentaje de germinación.

Se consideró que una conidia estaba germinada cuando el tubo germinal observado es como

mínimo el doble del diámetro de la conidia. La determinación del porcentaje de germinación se

hizo mediante la utilización de la siguiente fórmula:


Para el análisis estadístico mediante Tukey, se agruparon las medias de cada uno de los

aislamientos en función del tiempo de exposición a RUV-B con un nivel de significancia del

95%; en todos los casos, se cumplieron con los supuestos de normalidad y homocedasticidad

(valor p > 0.01).

2.4 Resultados

2.4.1 Efecto de la UV-B sobre aislamientos de Beauveria

En general, para todos los aislamientos de Beauveria evaluados se oberva que en la medida

que aumenta el tiempo de exposición a la UV-B, disminuye el porcentaje de germinación de

las conidias con respecto a su testigo, este es mayor y difiere significativamente en la medida

que aumenta el tiempo de exposición a 30, 45 y 60 minutos (Tabla 2.1). Con respecto al

menor tiempo de exposición evaluado 15 minutos, en la mayoría de aislamientos de Beauveria

aunque las medias de germinación varían no se observan diferencias significativas entre 0

minutos (testigo) y 15 minutos. Algunos aislamientos como B028 y B042 presentaron las

mayores diferencias entre el tiempo 0 y 15 minutos. B028 al tiempo 0 tuvo un porcentaje de

germinación del 95.06% y luego de 15 minutos de exposición el valor fue 72.71%, para B042

a los 0 minutos de exposición la media de germinación fue 92.35% y después de 15 minutos

de exposición fue 74.82%. En B007 aunque la media del porcentaje de germinación es mayor


62

a los 15 minutos de exposición a UV-B (90.25%), con respecto a 0 minutos de exposición

(testigo) (89.37%) estos valores no tienen diferencia estadística significativa. En los primeros

15 minutos de exposición a UV-B entre los aislamientos que no muestran diferencias

significativas al compararlos con el tiempo 0 se presentan disminuciones porcentuales de la

germinación en rangos que van desde -0.98 (B007) a 16.74 (B019) (Tabla 2.2).

Al comparar los porcentajes de germinación de los aislamientos cuando son expuestos por 15

y 30 minutos a UV-B a excepción de B006, B019, B035 y B036 que no muestran diferencias

significativas entre estos dos tiempos de exposición, los demás aislamientos si las presentan

lo que indica que es después de este tiempo de exposición cuando se empieza a evidenciar el

efecto que sobre la germinación de las conidias tiene la UV-B. La disminución en el porcentaje

de germinación después de 30 minutos de exposición con respecto al testigo oscila entre el

22.73% para B002 y 37.61% para B042 superiores a los porcentajes de disminución al ser

expuestos durante 15 minutos a UV-B (Tabla 2.2). Al comparar las medias de germinación de

los aislamientos a los 30 y 45 minutos de exposición únicamente B036 muestra diferencias

estadísticamente significativas entre estos dos tiempos de exposición sin embargo, esto no

sugiere que este aislamiento tenga una menor tolerancia a la UV-B, ya que al observar las

medias de disminución en el porcentaje de germinación de las conidias después de 45

minutos de exposición con respecto al tiempo 0 algunos aislamientos como B042, B041, B035

tienen medias de disminución del porcentaje de germinación de 46.92%, 45.17% y 45.20%

respectivamente, superiores a B036 cuya valor de disminución del porcentaje de germinación

de las conidias fue 40.17% (Tabla 2.2).

Después de 60 minutos de exposición a UV-B todos los aislamientos tienen pérdidas en la

germinación y muestran diferencias estadísticamente significativas con respecto a las conidias

no expuestas a radiación. Al realizar la comparación entre los valores medios de germinación

a 45 y 60 minutos de exposición únicamente los aislamientos B002, B013, B016, B025, B028,

B038 y B044 muestran diferencias significativas (Tabla 2.2). El mayor porcentaje de

disminución de la germinación al compararlo con la presentada al tiempo 0 después de 60

minutos de exposición a UV-B se presentó en B025 60.52%, los demás aislamientos tienen

porcentajes de disminución de la germinación en un rango entre 57.53% y 38.79% siendo

B001 el que menor porcentaje de pérdida presentó 38.79% (Tabla 2.2). B036, se caracterizó

por presentar un mayor porcentaje de germinación cuando se expuso a 60 minutos de UV-B,


63

en comparación con el porcentaje de germinación presentado cuando fue expuesto durante 45

minutos de UV-B, sin embargo, éstos valores no tienen diferencias estadísticas significativas

(Tabla 2.2).

Tabla 2.1. Porcentaje de germinación de Beauveria de cada aislamiento, en función del tiempo de

exposición a la radiación UV-B1.

AISLAMIENTOS

Porcentaje de germinación de conidias en diferentes tiempos de exposición a radiación UV-B en

minutos

0 15 30 45 60

B001 86,91 a2

84,66 a 64,63 b 56,48 b 53,2 b

B002 86,73 a 86,36 a 67,02 b 65,2 b 49,27 c

B005 92,21 a 80,19 a 58,93 b 60,5 b 49,02 b

B006 91,6 a 76,45 ab 62,3 bc 56,48 bc 46,3 c

B007 89,37 a 90,25 a 60,06 b 58,65 b 54,21 b

B013 91,51 a 88,65 a 68,54 b 69,62 b 52,98 c

B015 90 a 77,82 a 55,43 b 55,34 b 52,84 b

B016 90,56 a 87,59 a 65,9 b 66,41 b 44,96 c

B017 89,35 a 82,9 a 60,06 b 55,15 b 45,42 b

B018 92,16 a 84,05 a 64,55 b 60,09 b 52,59 b

B019 91,49 a 76,17 ab 64,6 bc 58,61 bc 51,5 c

B021 94,04 a 84,34 a 67,66 b 58,78 b 53,99 b

B024 93,78 a 92,03 a 63,09 b 60,64 b 52,22 b

B025 91,7 a 83,79 a 59,09 b 58,77 b 36,2 c

B027 93,75 a 87,95 a 61,88 b 54,81 b 50,09 b

B028 95,06 a 72,71 b 65,88 b 63,82 b 40,37 c

B030 95,84 a 81,68 a 63,99 b 57,67 b 50,01 b

B032 92,71 a 86,95 a 60,52 b 59,35 b 47,73 b

B035 95,66 a 82,01 ab 66,02 bc 52,42 cd 44,3 d

B036 94,35 a 84,15 ab 71,52 b 56,45 c 54,99 c

B037 96,97 a 80,4 a 60,52 b 60,03 b 49,77 b

B038 94,84 a 86,53 a 63,45 b 62,27 b 46,83 c

B039 91,09 a 87,72 a 63,01 b 54,16 b 49,84 b

B040 94,08 a 86,13 a 59,64 b 59,21 b 46,99 b

B041 92,99 a 81,97 a 53,02 b 50,99 b 50,56 b

B042 92,35 a 74,82 b 57,62 c 49,02 c 48,42 c

B043 92,77 a 86,57 a 59,43 b 55,41 b 47,82 b

B044 92,47 a 80,41 a 60,42 b 56,38 b 39,39 c

B045 94,61 a 80,17 a 60,18 b 57,54 b 52,62 b

1 Tukey α = 0.05.


64

2 Para cada aislamiento, la misma letra en diferentes tiempos de exposición, indica que no existen diferencias

significativas entre el porcentaje de germinación para los tiempos comparados.

Tabla 2.2. Disminución de germinación de Beauveria en función del tiempo de exposición a la radiación

UV-B1

AISLAMIENTOS

Porcentaje de pérdida de germinación de conidias en diferentes tiempos de exposición

a radiación UV-B en minutos

15 30 45 60

B001 2,59 25,64 35,01 38,79

B002 0,43 22,73 24,82 43,19

B005 13,04 36,09 34,39 46,84

B006 16,54 31,99 38,34 49,45

B007 -0,98 32,80 34,37 39,34

B013 3,13 25,10 23,92 42,10

B015 13,53 38,41 38,51 41,29

B016 3,28 27,23 26,67 50,35

B017 7,22 32,78 38,28 49,17

B018 8,80 29,96 34,80 42,94

B019 16,74 29,39 35,94 43,71

B021 10,31 28,05 37,49 42,59

B024 1,87 32,73 35,34 44,32

B025 8,63 35,56 35,91 60,52

B027 6,19 33,99 41,54 46,57

B028 23,51 30,70 32,86 57,53

B030 14,77 33,23 39,83 47,82

B032 6,21 34,72 35,98 48,52

B035 14,27 30,98 45,20 53,69

B036 10,81 24,20 40,17 41,72

B037 17,09 37,59 38,09 48,67

B038 8,76 33,10 34,34 50,62

B039 3,70 30,83 40,54 45,28

B040 8,45 36,61 37,06 50,05

B041 11,85 42,98 45,17 45,63

B042 18,98 37,61 46,92 47,57

B043 6,68 35,94 40,27 48,45

B044 13,04 34,66 39,03 57,40

B045 15,26 36,39 39,18 44,38


65

2.4.2 Efecto de la UV-B sobre aislamientos de Metarhizium

Las conidias de Metarhizium presentan la misma tendencia de pérdida de la germinación que

las de los aislamientos de Beauveria cuando se incrementa el tiempo de exposición a UV. Las

medias del porcentaje de germinación de cada uno de los hongos después de ser expuestos a

la UV durante 0 y 15 minutos, aunque muestran una disminución en el porcentaje de

germinación no tienen diferencias significativas en estos dos tiempos, a excepción de Mt010

(Tabla 2.3). Se observa en los aislamientos expuestos a UV-B durante 15 minutos, que Mt010

muestra el mayor porcentaje de pérdida de germinación del 31.07% con respecto al testigo,

los demás aislamientos Mt004; Mt001; Mt006 y Mt009 muestran disminuciones en

germinación del 16.29%; 9.96%; 9.36% y 8.39% respectivamente. En Mt002 y Mt005 la

disminución en la germinación a los 15 minutos de exposición con respecto a la presentada en

el testigo no supera el 3% (Tabla 2.4). Cuando aumenta el tiempo de exposición a UV-B a 30

minutos todos los tratamientos, a excepción de Mt001 muestran diferencias significativas al

compararlas con el testigo, se observa una disminución generalizada en las medias de los

porcentajes de germinación (Tabla 2.3). El comportamiento de los aislamientos expuestos 45

minutos a la radiación UV-B es similar al presentado cuando fueron expuestos a la misma

condición 30 minutos, y en ninguno se presentan diferencias significativas con respecto al

tiempo de exposición inmediatamente anterior. Después de 60 minutos de exposición, los

aislamientos de Metarhizium evaluados tienen una disminución de mínimo el 39.55% (Mt001)

y máximo el 57.33% (Mt010) en la media del porcentaje de germinación respecto al alcanzado

cuando los aislamientos no son expuestos a UV-B. En este tiempo de evaluación no se

presentan diferencias estadísticas de los aislamientos con respecto a 45 minutos de

exposición. El aislamiento Mt005, se caracterizó porque el porcentaje de germinación fue

mayor cuando el aislamiento se expuso a 45 minutos de UV-B, en comparación con el

porcentaje de germinación obtenido cuando éste se expuso a 30 minutos de UV-B, sin

embargo estadísticamente no se presentan diferencias. En los aislamientos Mt002, Mt005 y

Mt009 no se encontraron diferencias estadísticas significativas después de 30 y hasta 60

minutos de exposición a UV-B.


66

Tabla 2.3. Porcentaje de germinación de Metarhizium de cada aislamiento, en función del tiempo de

exposición a la radiación UV-B1.

AISLAMIENTOS

Porcentaje de germinación de conidias en diferentes tiempos de exposición a radiación

UV-B en minutos

0 15 30 45 60

Mt001 83,6 a2

75,27 ab 63,52 abc 56,16 bc 50,54 c

Mt002 92,57 a 90,05 a 61,31 b 57,99 b 45,69 b

Mt004 95,31 a 79,78 ab 65,17 bc 53,81 c 49,58 c

Mt005 89,63 a 87,28 a 55,94 b 56,77 b 48,58 b

Mt006 91,33 a 82,78 a 65,11 b 56,03 bc 43,91 c

Mt009 91,59 a 83,91 a 58,65 b 53,79 b 44,76 b

Mt010 90,1 a 62,11 b 58,99 b 47,38 bc 38,45 c

1 Tukey α = 0.05.

2 Para un aislamiento, la misma letra en diferentes tiempos de exposición, indica que no existen diferencias

significativas entre el porcentaje de germinación para los tiempos comparados.

Tabla 2.4. Disminución de germinación corregida de Metarhizium en función del tiempo de exposición a la

radiación UV-B

AISLAMIENTOS

Porcentaje de pérdida de germinación de conidias en diferentes tiempos de exposición a

radiación UV-B en minutos

15 30 45 60

Mt001 9,96 24,02 32,82 39,55

Mt002 2,72 33,77 37,36 50,64

Mt004 16,29 31,62 43,54 47,98

Mt005 2,62 37,59 36,66 45,80

Mt006 9,36 28,71 38,65 51,92

Mt009 8,39 35,96 41,27 51,13

Mt010 31,07 34,53 47,41 57,33

Mediante Tukey, se agruparon las medias de cada uno de los aislamientos en función del

tiempo de exposición a la radiación UV con un nivel de significancia del 95%; en todos los

casos, se cumplieron con los supuestos de normalidad y homocedasticidad (valor p > 0.01).


67

2.5 Discusión

Los resultados del efecto de la UV-B sobre la germinación de hongos de los géneros

Beauveria y Metarhizium encontrados este trabajo coinciden con lo reportado por autores

como Long et al. 2013 y Fernandes et al. 2007 en donde al exponer conidias de diferentes

aislamientos de los géneros Beauveria y Metarhizium a UV-B registran una disminución en la

tasa de germinación, la cual se comporta inversamente proporcional al tiempo de exposición.

Fargues et al. (1997), determinaron la influencia de la luz solar artificial en la supervivencia de

esporas de una gran cantidad de aislamientos de 4 especies de hongos entomopatógenos (B.

bassiana, M. anisopliae, M. flavoviridae y Paecilomyces fumosoroseus) al irradiar estos

hongos con luz solar artificial durante 0, 1, 2, 4 y 8 horas, la supervivencia de todos los

aislamientos disminuyó con el aumento del tiempo de exposición, siendo la exposición de dos

horas la más perjudicial para todos los aislamientos. Generalmente, una hora de exposición a

rayos UV-B en irradiancias similares que se encuentran en la naturaleza no perjudica

notablemente conidias de hongos entomopatógenos, pero después de dos horas, una mayor

variabilidad en la tolerancia a la radiación UV-B se encuentra entre las especies y cepas

(Braga et al. 2001a; Fargues et al. 1996; Rangel et al. 2006). Con respecto a los resultados

anteriores en esta investigación, se observó que después de 30 minutos de exposición a UV-B

las conidias de Beauveria tienen una disminución de mínimo el 20% de germinación con

respecto al testigo en los aislamientos de Metarhizium evaluados, la situación es similar,

inclusive Mt010, pierde el 31.07% de germinación con respecto al testigo no irradiado después

de tan solo 15 minutos de exposición a UV-B, lo que sugiere que esta tolerancia es especifica

por aislamiento y que es después de aumentar el tiempo de exposición que realmente se

evidencia la susceptibilidad o tolerancia de cada aislamiento La vida media de un

entomopatógeno en condiciones de campo es estimada en menos de una hora para el más

susceptible y de cerca de 80 horas para el más resistente, por ejemplo en Noumarea rileyi, se

reporta hasta un máximo de 60 horas de supervivencia (Pavone, 2003). Velez y Montoya,

1995 sostienen que la vida media de los diferentes tipos de inóculo de hongos expuestos a la

luz solar es de un tiempo aproximado de 1 hora para el hongo entomopatógeno más

susceptible y de 96 horas para el más resistente de los evaluados por estos investigadores.

Los resultados hallados en este trabajo hacen pensar que las pérdidas en campo puedan ser

similares, más aun cuando allí se conjugan además de la radiación, la humedad relativa, la

desecación, la precipitación y la competencia con otros microorganismos presentes en el


68

ambiente que pueden afectan su desempeño ya que, aumentos en los tiempos de

germinación o la disminución de esta por efecto de la radiación en campo, aumenta la

posibilidad de que los insectos generen respuesta inmune de defensa al ataque de los

hongos.

Fernandes et al. (2007), evaluaron el efecto de la UV-B sobre aislamientos de B. bassiana,

Beauveria spp. y Engyodontium album (B. alba) encontrando una alta variabilidad a la

tolerancia a la exposición a la UV con valores entre 0% y 80% después de ser expuestas

durante dos horas a la radiación. El rango de disminución de la germinación de los

aislamientos evaluados en el presente trabajo con respecto a cada uno de los testigos

después de 60 minutos de exposición a UV-B, fue de 38.78% (B001) a 60.25% (B025) lo que

sugiere un rango más estrecho de tolerancia en estos aislamientos que los reportados por

estos autores. Loong et al. 2013 encontraron que algunos aislamientos de M. anisopliae y P.

fumosoroseus disminuyen su germinación hasta en un 50% después de una hora de

exposición a UV-B valor que va aumentando en la medida que se incrementa el tiempo de

exposición, estos resultados concuerdan con los encontrados para los aislamientos de

Metarhizium, que después de una hora de estar expuestos a UV-B disminuyen entre el

39.55% y el 57.33% su germinación. Posadas et al. 2012 describen una alta tolerancia natural

en los aislamientos de B. bassiana expuestos a UV-B incluso reportan que uno de los

aislamientos tiene una germinación del 78.5% después de exponer sus conidias a UV-B

durante cuatro horas, todos los aislamientos evaluados por estos autores después de 60

minutos de exposición a UV-B muestran porcentajes de germinación con respecto al testigo

superiores al 80 %, a pesar de que las condiciones de distancia en que la lámpara fue ubicada

con respecto a las cajas de Petri y las longitudes de onda de las lámparas utilizadas son

similares a las utilizadas en estos ensayos, sus resultados son contrastantes con los hallados

en este trabajo en donde ninguno de los aislamientos evaluados tiene porcentajes de

germinación superiores al 55% después de 60 minutos de exposición a UV-B, posiblemente el

medio de cultivo utilizado por Posadas et al. 2012, favorece el desarrollo de tolerancia a la UV-

B. A este respecto, Rangel et al. 2006 reportan que las conidias de M. anisopliae producidas

en medios que causen estrés al hongo, tienen al menos 2 veces más tolerancia a la radiación

UV-B que las producidas en medios enriquecidos, estos autores indican que posiblemente la

energía que se gasta en producir enzimas para fuentes no preferidas de carbono generan

conidias más tolerantes a la UV-B, en este trabajo se utilizaron SDA y PDA que proporcionan


69

las fuentes de carbono y nitrógeno para el crecimiento de estos hongos, por lo anterior es

pertinente evaluar el comportamiento de los aislamientos seleccionados por este y otros

parámetros en medios diferentes para medir si hay un incremento en la tolerancia a UV-B.

También la tolerancia de los hongos a la radiación UV-B y a las altas o bajas temperaturas

puede estar asociada con el lugar en donde se realiza el aislamiento del hongo ya que la

radiación aumenta con la disminución de la latitud y el incremento de la altitud (Fernandes et al.

2008; Rangel et al. 2005). En general, pocas horas de exposición directa a la radicación solar

en el trópico son suficientes para inactivar las conidias de la mayoría de hongos

entomopatógenos (Fernandes et al. 2007) a este respecto, Braga et al. 2001 afirman que los

aislamientos encontrados cerca del ecuador son más tolerantes a la radiación UV-B que los

encontrados en las latitudes superiores a 40° norte o sur de la línea ecuatorial. Fernandes et

al. 2007 observaron amplios rangos de tolerancia de entre 16% y 80% en aislamientos de

Beauveria sometidos a UV-B durante dos horas, siendo los aislamientos colectados en

diferentes locaciones de Brasil entre los 0° y 28° de latitud sur, los más tolerantes a la radiación,

lo que sugiere una adaptación latitudinal a la radiación, los aislamientos evaluados en este

trabajo han sido encontrados en zonas palmeras del territorio Colombiano ubicadas entre 12°

latitud norte y 4° latitud sur, por lo que se supondría que estos aislamientos tengan una

tolerancia relativamente alta a la UV, sin embargo, la disminución en la germinación de las

conidias para los aislamientos más tolerantes fue de 38.79% (Beauveria) y 39.55%

(Metarhizium ) después de tan solo 1 hora de exposición, lo que indica que estos tienen una

baja tolerancia a UV-B , los hallazgos realizados contrastan con los resultados de Mustafa y

Kaur, 2009; Fernandes et al. 2007 y Braga et al. 2001; quienes evaluaron diferentes

aislamientos de Beauveria y Metarhizium encontrados en latitudes ubicadas en la zona cálida

de la tierra entre los Trópicos de Cáncer y Trópico de Capricornio, encontrando que estos

aislamientos no tenían disminuciones importantes en el porcentaje de germinación de las

conidias después de su exposición a UV-B. Lo anterior sugiere que la latitud no es el único

factor que afecta la adaptación a la UV-B otros factores como la humedad atmosférica, la

inclinación del sol, el ecosistema e incluso el insecto hospedero influyen en esta característica

(Bidochka et al. 2001; Brooks et al. 2004; Polar et al. 2005).

Gahjar et al. (2006) determinaron que la exposición de conidias de Plectosporium alismatis a

UV-B por 15 o 30 minutos únicamente retrasa la germinación, por el contrario la exposición


70

por más de 60 minutos si causa muerte a las conidias, los resultados obtenidos en este

trabajo en los aislamientos de Beauveria y Metarhizium muestran pérdidas porcentuales en la

germinación de las conidias con valores que oscilan entre 33.71% y 55.50% al comparar la

media de germinación a 0 y a 60 minutos de exposición, probablemente la media de

germinación obtenida en los aislamientos después de 60 minutos de exposición a la UV-B

varía si el efecto del tratamiento fuera sobre la velocidad de germinación y no sobre la

supervivencia de las conidias.

Cepas tolerantes a la UV, emplean mecanismos de defensa tales como la secreción de

pigmentos de absorción (Hullo et al. 2001; Saxene et al. 2002). Braga et al. 2006 determinaron

que la pigmentación de las conidias de M. anisopliae confieren a este hongo una mayor

tolerancia a la radicación UV, sin embargo, al comparar la tolerancia de los aislamientos de

Beauveria y Metarhizium evaluados en este trabajo, el comportamiento es similar y no se

puede sugerir una mayor tolerancia de Metarhizium ya que entre los aislamientos de

Beauveria algunos muestran disminución en la germinación menor que los registrados en los

aislamientos de Metarhizium después de una hora de exposición.

Las diferencias encontradas entre la tolerancia de los aislamientos evaluados en este trabajo y

en los realizados por diferentes investigadores alrededor del mundo sugieren que además de

diferencias genéticas que confieren tolerancia a la radiación, las diferencias en la metodología

de realización de los trabajos influye directamente sobre los resultados obtenidos y hace que

las comparaciones sean siempre relativas, sin embargo, si se observa un efecto negativo de

la exposición a la UV-B, lo que coincide con los resultados obtenidos en los trabajos

presentados por diferentes autores.

El conocimiento de la tolerancia de los aislamientos a este y otros factores ambientales

permitirá orientar las investigaciones para el desarrollo de estrategias que minimizen el

impacto del ambiente cuando los hongos son aplicados en el campo, esto mediante el

desarrollo de formulaciones con filtros solares o sustancias que actúen como protectores

solares, o también mediante el uso de medios de cultivo que induzcan tolerancia a la UV

(Mulero, 2004).


71

2.6 Bibliografía

Aikens, J., y Dix, T. A. 1991. Perhydroxyl radical (HOO.) initiated lipid peroxidation. The role of

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76

CAPITULO 3: DETERMINACIÓN DE LA HIDROFOBICIDAD DE

CONIDIAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS.

3.1 Introducción

La hidrofobicidad es una característica de repelencia de una sustancia al agua. En los hongos

miceliales está determinada por la proteína hidrofobina secretada únicamente por ellos

(Wessels, 2000).

Las hidrofobinas son proteínas anfipáticas compuestas por 100 a 150 aminoácidos, con una

característica típica, la presencia de ocho residuos de cisteína en lugares conservados a lo

largo de la cadena de aminoácidos (Wessels, 2000). Las hidrofobinas han evolucionado para

intervenir en diferentes procesos celulares como la adhesión de los conidias a la cutícula de los

insectos (Li Jun et al. 2010), que es el primer paso en la patogénesis en hongos como

B. bassiana y Metarhizium ( Boucias y Pendland, 1991) también permiten un primer intercambio

de señales para que el hongo desarrolle hifas aéreas implicadas en la adherencia a las cutícula

de los insectos (Boucias et al. 1988), la formación de cuerpos fructíferos (Wessels, 1997), la

difusión de esporas por las corrientes de aire (Wessels, 1997; Linder et al., 2005) en muchos

hongos el papel exacto de la hidrofobinas particularmente en términos de virulencia y

propiedades de la capa de esporas aun no es claro (Zang et al. 2011) (Linder et al. 2005).

Las hidrofobinas son capaces de reconvertir la carga de una superficie, de hidrofílica a

hidrofóbica y viceversa (Boucias et al. 1988, Acevedo 2003). Se ha encontrado que ejercen una

acción de protección de las conidias contra el calor, la desecación y condiciones adversas del

ambiente y son un mecanismo de defensa de los hongos contra la respuesta inmune de los

insectos enmascarando componentes de la pared celular de hongos altamente inmunogénicos

(Heddergott et al. 2012. Paris et al, 2003). La hidrofobicidad de las estructuras de los hongos

conidias y micelio es determinada por las hidrofobinas, el recubrimiento que estas proteínas

producen es llamado capa rodlet (Bayry et al. 2012). La formación de estos recubrimientos

hidrófobos se asocia con la maduración de las esporas (Kim et al., 2010).


77

Wessels (1994) describe dos clases de hidrofobinas y las denomina Clase I y Clase II. Los

hongos pueden producir conidias hidrofóbicas (baja afinididad con el agua) o hidrofílicas (alta

afinidad con el agua). La cubierta externa de los conidias hidrofóbicas como las de Beauveria

bassiana o Metarhizium anisopliae es la estructura inicial donde se lleva a cabo la interfase de

unión con la cutícula del insecto hospedero (Boucias et al. 1988). Algunos hongos

entomopatógenos como Hirsutella thompsonii, producen conidias hidrofílicas que se

caracterizan por que tienen una capa externa mucilaginosa producida durante su maduración

que sirve como antisecante y adhesivo que protege a las conidias de polifenoles tóxicos

presentes en la cutícula del hospedero (Boucias et al. 1988; Acevedo, 2003). Las especies de

hongos con conidias hidrofóbicas son generalmente más tolerantes a las altas temperaturas

que las especies con conidias hidrofílicas (Souza et al. 2014; Bayry et al. 2012).

Las propiedades de fijación de los tipos de células B. bassiana reveló que conidias aéreas se

adhieren mal a superficies débilmente polares, y rápidamente a ambas superficies hidrófobas e

hidrófilas. (Boucias et al. 1988; Holder y Keyhani, 2005). En blastosporas in vitro, sin embargo,

se observa que estas tienen una débil unión a superficies hidrófobas, superficies

moderadamente a débilmente polares, y rápidamente a las superficies hidrófilas. Conidias

sumergidas muestran un espectro más amplio de unión, y pueden adherirse a superficies

hidrófobas, débilmente polares e hidrófilas.

3.2 Hipótesis y Objetivos Específicos

Objetivo específico 3: Establecer la capacidad de adhesión de conidias

de Beauveria y Metarhizium a través de su hidrofobicidad.


78

3.3 Metodología.


Se evaluaron 31 aislamientos de hongos entomopatógenos, 29 de Beauveria sp. y siete de

Metarhizium (Anexo 1), que en la actualidad pertenecen a la colección de hongos

entomopatógenos de la Corporación Centro de Investigación en Palma de Aceite (Cenipalma).

Los aislamientos fueron mantenidos en SDA Agar Sabouraud Dextrosa (SDA) Oxoid®

(composición g.L-1: peptona micológica 10, glucosa 40, agar 15).

3.3.2 Pruebas de hidrofobicidad

Se preparó una suspensión de conidias en 10 ml de agua destilada estéril + Tween 80 al 1%.

Se homogenizó la suspensión utilizando un agitador magnético. Mediante diluciones en serie,

se ajustó y determinó la concentración de conidias de la suspensión preparada a 1 x 10

6conidias.ml-1. Luego se tomó un ml de la suspensión de conidias y se depositó en un tubo de

ensayo, al que se le agregó un ml de tolueno. El tubo de ensayo fue centrifugado a 500 rpm

durante 40 minutos. Después de centrifugados los tubos de ensayo se ubicaron verticalmente y

de la fase acuosa se extrajeron diez µl que se depositaron en la cámara de Neubauer. Se

realizó el conteo de las conidias en la fase acuosa. El cálculo del porcentaje de conidias

presentes en la fase acuosa se realizó teniendo en cuenta el conteo inicial de conidias en la

suspensión y el conteo realizado en la muestra de la fase acuosa después de la centrifugación.

Para cada uno de los aislamientos se realizaron cinco repeticiones.


Se realizó un análisis de varianza con un nivel de significancia del 95%. Para cada uno de los

generos Beauveria, y Metarhizium. En ambos casos, se verificó que se cumplieran los

supuestos de normalidad y homocedasticidad con un nivel de significancia del 99%.


79

3.4 Resultados

Solo se encontraron diferencias significativas (valor p < 2e-16) entre los aislamientos de

Beauveria, por lo que mediante Tukey y con un nivel de significancia del 95% se agruparon las

medias (Tabla 3.1). En general, todos los aislamientos de Beauveria mostraron ser hidrofóbicos

ya que las suspensiones de conidias mantuvieron su concentración inicial en la fase acuosa

después de la centrifugación.

De los 29 aislamientos de Beauveria evaluados 23 tuvieron medias de conidias suspendidas en

la fase acuosa por encima de 50%, con valores que oscilaron entre el 89.37 para B030 y 52.01

para B042, todos los aislamientos cuyas medias se agrupan en este rango se ubican en varios

grupos estadísticos siendo B030 el aislamiento con la media mas alta 89.37 (Tabla 3.1). Los

aislamientos de Beauveria B005, B006, B013, B017, B035 y B037, presentaron valores medios

para el porcentaje de conidias suspendidos en la fase acuosa, inferiores al 50%, sin embargo,

B005 y B006, no se diferenciaron significativamente de algunos aislamientos que tienen un

valor medio para el porcentaje de conidias suspendidos en la fase acuosa, superior al 50%. Los

aislamientos B013, B017, B035 y B037, se ubican como aislamientos con baja hidrofobicidad,

ya que entre el 77.7% y 88.9%, de los conidias, migraron a la fase oleosa solo entre el 11.1% y

22.3%, permaneció suspendido en la fase acuosa (Tabla 3.1).

Tabla 3.1. Grupos de medias de los aislamientos de Beauveria en función del número de conidias

suspendidos en fase acuosa 1

Aislamiento Media Grupo2

B030 89.372 a

B001 88.214 ab

B032 86.730 ab

B043 84.980 ab

B019 81.749 abc

B025 81.433 abcd

B021 81.171 abcd

B024 80.818 abcd

B044 76.303 abcde

B038 76.274 abcde


80

Aislamiento Media Grupo2

B007 72.741 abcdef

B018 72.141 abcdef

B015 71.025 abcdefg

B036 70.034 abcdefg

B002 68.702 abcdefg

B045 67.695 abcdefg

B028 65.515 abcdefgh

B040 64.154 bcdefgh

B027 59.094 cdefgh

B016 57.562 defgh

B039 53.757 efgh

B041 53.216 efgh

B042 52.016 fgh

B005 47.030 gh

B006 43.197 hi

B037 22.257 ij

B017 17.115 j

B035 15.368 j

B013 11.093 j 1Tukey para un α = 0.05.

2 La misma letra en

diferentes hongos indica que no existen diferencias significativas entre los

aislamientos

Con respecto a los aislamientos de Metarhizium no se encontraron diferencias significativas

entre las medias de conidias suspendidas en la fase acuosa (Tabla 3.2) (valor p = 0.648), el

valor medio del porcentaje de conidias suspendidos en la fase oleosa estuvo entre 59.2% y

75.3%, lo que permitiría considerar que los aislamientos de Metarhizium evaluados son

hidrofóbicos.


81

Tabla 3.2. Grupos de medias de los aislamientos de Metarhizium en función del número de

conidias suspendidos en fase acuosa1.

AISLAMIENTO MEDIA GRUPO2

Mt002 75.246 a

Mt005 74.068 a

Mt004 73.337 a

Mt001 67.929 a

Mt010 65.510 a

Mt006 62.074 a

Mt009 59.148 a 1Tukey para un α = 0.05.

2 La misma letra en

diferentes hongos indica que no existen diferencias significativas entre los

aislamientos.

3.5 Discusión

Los hongos de los géneros Beauveria y Metarhizium son reportados como géneros con alta

hidrofobicidad (Souza et al. 2014), lo que concuerda con los hallazgos hechos en este trabajo.

De acuerdo con lo reportado por Kim et al. 2010; Linder et al. 2005; Boucias et al. 1988, la

hidrofobicidad de estos aislamientos permite pensar que tendrían cierta ventaja en términos de

patogenicidad, termotolerancia, adhesión a superficies de los insectos y resistencia a la

desecación características deseables en los hongos entomopatógenos sin embargo, al realizar

la comparación de los aislamientos más hidrofóbicos y los más tolerantes a las altas

temperaturas sembrados en SDA evaluados en este trabajo no es clara esta relación, aunque

se encuentra una tendencia a que los aislamientos que mantuvieron un porcentaje de conidias

relativamente alto en la fase acuosa tengan las medias de ABC mayores con respecto a su

tolerancia a crecer a temperaturas mayores a las comúnmente utilizadas para el cultivo de los

hongos. Yim y Feng (2004) encontraron una relación entre entre la acumulación de hidrofobinas

y la tolerancia en Beauveria bassiana al estrés causado por el calor siendo los aislamientos con

mayor cantidad de hidrofobinas los más tolerantes, aunque en este trabajo no se cuantificó la

cantidad de hidrofobinas presentes en cada aislamiento se esperaría un comportamiento similar

de los aislamientos al evaluar este parámetro.


82

Rangel et al. 2006; Kim et al. 2011 reportan que la producción de hidrofobinas y la inducción de

una mayor hidrofobicidad, está relacionada con el medio en el que se desarrollan los hongos

conidias de B. bassiana y M. anisopliae producidas en agar de millo son más hidrofobicas y

tienen una mayor tolerancia a altas temperaturas que las producidas en SDA o Agar extracto de

levadura los medios con lactosa también inducen una alta hidrofobicidad en las conidias,

aunque en un alto porcentaje los aislamientos evaluados en este trabajo mantuvieron el número

de conidias por encima del 70% en la fase acuosa este valor podría aumentar si se utiliza un

medio de cultivo diferente a SDA que induzca la producción de hidrofobinas.

Holder y Keyhani, 2005 detectaron que las conidias aéreas generan una capa de bastoncillos

que no permiten que los conidios se suspendan fácilmente en el agua, este comportamiento

causado por una capa hidrofobinas no se evidencia en blastosporas o conidias que crecen

sumergidas, las conidias utilizadas en este ensayo fueron conidias aéreas que no se suspenden

fácilmente en el agua lo que corrobora esta observación.

Kim et al. 2010 encontraron que la edad de las conidias y la termotolerancia de los aislamientos

esta relacionada con su capacidad hidrofóbica, las conidas más viejas son mas termotolerantes

que las más jóvenes por esta razon en futuros trabajos la combinación entre edad de las

conidias y temperaturas de incubación en relación con su capacidad hidrifóbica deberian ser

evaluados en condiciones de laboratorio antes de realizar pruebas en campo.


83

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86

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos son contrastantes incluso en aislamientos colectados en la

misma zona geográfica, sugiriendo que la tasa de crecimiento en diferentes medios y

temperaturas, la tolerancia a luz ultra violeta y la hidrofobicidad son caracteres

particulares de cada aislamiento.

Se ratifica la importancia de la temperatura de incubación y su efecto positivo o

negativo en el crecimiento de los hongos, encontrándose en algunos casos que leves

incrementos en la temperatura favorecen el crecimiento de los hongos, lo que podría

indicar tolerancia o adaptación a las temperaturas de las zonas en donde fueron

encontrados los aislamientos objeto de estudio. La interacción medio de cultivo-

temperatura es determinante en el desarrollo de los aislamientos

La exposición de los hongos evaluados a radiación UV-B, afecta de forma gradual la

germinación de las conidias. Se observó que independientemente del género al que

pertenezca el aislamiento la tolerancia a la radiación UV-B es específica.

La hidrofobicidad de los aislamientos de Beauveria en general se considera alta,

posiblemente por un alto contenido de hidrofobinas característica deseable para los

hongos entomopatógenos esto les conferiría cierta ventaja en términos de

patogenicidad, termotolerancia, adhesión a superficies de los insectos y resistencia a

la desecación.


87

RECOMENDACIONES

Una vez se seleccione un aislamiento con alta capacidad de virulencia sobre un insecto

de interés económico se deben realizar pruebas que permitan conocer las

características de cada hongo y así determinar las condiciones de producción mas

adecuadas para mantener sus carateristicas de virulencia en campo.

Para futuras pruebas de tolerancia a UV-B se debe evaluar la germinación después de

tiempos de incubación mayor, debido a que el efecto de la exposición a UV-B no

necesariamente es la muerte de las conidias, sino el aumento en los tiempos de

germinación de las mismas después de ser expuestas. Además se debe evaluar la

patogenicidad de las conidias después de ser expuestas a simuladores de radiación

solar.

La Hidrofobicidad hallada en los aislamientos evaluados sugiere que es necesario el uso

de surfactantes para garantizar la dispersión en una solución para ser aplicados en

campo, de otra forma el inóculo queda adherido a las superficies de los recipientes que

los contienen, reduciendo su potencial eficiencia en campo.


ANEXOS

Anexo 1. Aislamientos de Beauveria y Metarhizium colectados en diferentes zonas palmeras procedentes de insectos

plaga del cultivo de palma de aceite.

N.D.: No Disponible, a

Temperatura, b

Humedad Relativa,

c Tolerancia a Radiación UV-B,

d Crecimiento Radial,

e Hidrofobicidad.

Código Aislamiento Localidad Departamento Coordenada

s Hospedero

Estadío

Orden: familia Msnm

Precipitación promedio

(mm anuales)

Temperatura promedio

anual (°c)

Humedad relativa promedio anual

(%)

UV-B

C.R. HF.

B001 Beauveria spp. San Carlos de Guaroa

Meta 3°42'40''N 73°14'33''O

Episibine spp. Larva Lepidoptera:Limacodidae 250 2.700 25,9 80,5 X X X

B002 Beauveria San Carlos de Guaroa

Meta 3°42'40''N 73°14'33''O

Episibine spp. Larva Lepidoptera:Limacodidae 250 2.700 25,9 80,5 X X X

B005 Beauveria /Cenicafé/ N.D. N.D. Hypothenemus

hampei Larva Coleptera: Curculionidae N.D.* N.D. N.D. N.D.

X X X

B006 Beauveria San Andres de

Tumaco Nariño

1°48'24''N

78°45'53''O Stenoma cecropia Larva Lepidoptera: Elachistidae 40 3.000 26 88

X X X

B007 Beauveria Puerto Wilches Santander 7°20'54''N 73°53'54''O

Opsiphanes cassina Larva Lepidoptera: Nymphalidae 80 2.850 28 77 X X

B013 Beauveria Cumaral Meta 4°16'11''N 73°29'11'O

Loxotoma elegans Larva Lepidoptera: Elachistidae 260 2.800 26 80,5 X X X


Antaeotricha sp Larva Lepidoptera:Oecophoridae 80 2.850 28 77 X X X


Stenoma cecropia Larva Lepidoptera: Elachistidae 80 2.850 28 77 X X

B017 Beauveria Puerto Wilches Santander 7°20'54''N

73°53'54''O Dirphia gragatus Larva Lepidoptera:Saturniidae 80 2.850 28 77

X X X


Stenoma cecropia Larva Lepidoptera: Elachistidae 80 2.850 28 77 X X X





B024 Beauveria Puente Sogamoso Santander 7°20'54''N 73°53'54''O

Leptopharsa gibbicarina

Adulto Hemiptera : Tingidae 92 2.850 28 79 X X X


Stenoma cecropia Pupa Lepidoptera: Elachistidae 92 2.850 28 79 X X X


Dirphia gragatus Larva Lepidoptera:Saturniidae 92 2.850 28 79 X X X



Adulto Hemiptera : Tingidae 92 2.850 28 79 X X X

B030 Beauveria N.D. N.D. N.D. Producto comercial N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. X X


Demotispa neivai Adulto Coleptera: Chrysomelidae 92 2.850 28 79 X X X



B036 Beauveria Tucurinca Magdalena 10°45'51''N 74°09'26''O


Adulto Hemiptera : Tingidae 20 1.130 27,6 80 X X


89


Brassolis sophorae Larva Lepidoptera: Nymphalidae 20 1.130 27,6 80 X X X


Brassolis sophorae Larva Lepidoptera: Nymphalidae 20 1.130 27,6 80 X X X


Stenoma cecropia Larva Lepidoptera: Elachistidae 80 2.850 28 77 X X



B041 Beauveria Barrancabermeja Santander 7°04'03''N 73°50'50''O

Antaeotricha sp Larva Lepidoptera:Oecophoridae 80 2.538 27,1 83 X X X


Euprosterna elaeasa Larva Lepidoptera: Limacodidae 80 2.850 28 77 X X X


Elaidobius kamerunicus

Adulto Coleoptera:Curculionidae 80 2.850 28 77 X X X


Meta 3°42'40''N 73°14'33''O

N.D. Larva N.D. 250 2.700 25,9 80,5 X X X


Meta 3°42'40''N 73°14'33''O

Loxotoma elegans Larva Lepidoptera: Elachistidae 250 2.700 25,9 80,5 X X X

Mt001 Metarhizium Puerto Wilches Santander 7°20'54''N 73°53'54''O

N.D. N.D. N.D. 80 2.850 28 77 X X X

Mt002 Metarhizium Puerto Wilches Santander 7°20'54''N 73°53'54''O

Strategus aloeus Larva Coleoptera: Scarabaeidae 80 2.850 28 77 X X X

Mt004 Metarhizium San Andres de Tumaco

Nariño 1°48'24''N 78°45'53''O

Sagalassa valida Larva Lepidoptera: Glyphipterygidae

40 3.000 26 88 X X X

Mt005 Metarhizium Barrancabermeja Santander 7°04'03''N 73°50'50''O

Demotispa neivai Adulto Coleptera: Chrysomelidae 90 2.538 27,1 83 X X X





Mt010 Metarhizium Yarima Santander 6°52'55''N 73°24'43''O

Strategus aloeus Larva Coleoptera: Scarabaeidae 90 2.538 27,1 83 X X X


90

Anexo 2. Registro de cada aislamiento

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 10.96 4.73

0.40 6.33 5.04

0 MINUTOS 15 MINUTOS 30 MINUTOS 45 MINUTOS 60 MINUTOS

HIDROFOBICIDAD DE CONIDIOS

MEDIA 88.21

87.74DESPLAZAMIENTO

TOLERANCIA A RADIACIÓN ULTRAVIOLETA

(GERMINACIÓN A DIFERENTES TIEMPOS DE EXPOSICIÓN )

CONIDIOS INICIALES 43

CONIDIOS FINALES 38

86.91 84.66 53.2056.4864.63

TIEMPO DE INCUBACIÓN:

CRECIMIENTO RADIAL A DIFERENTES TEMPERATURAS

1205U 128U

PDA SDA

CODIGO DE COLORES DE ACUERDO A CATALOGO PANTONE

PDA SDA

BLANCO BLANCO

TEMPERATURA DE INCUBACIÓN:

HOSPEDERO Episibine spp.

CULTIVO PALMA DE ACEITE

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

LOCALIDAD AISLAMIENTO San Carlos de Guaroa (Meta)

CÓDIGO DEL AISLAMIENTO B001

GENERO Beauveria

PAIS DE ORIGEN Colombia

PDA

SDA

(mm/ día)

ANVERSO

REVERSO


91

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 6.93 7.19

0.18 5.17 5.41


MEDIA 68.70

23

16

69.23

CONIDIOS INICIALES

CONIDIOS FINALES

DESPLAZAMIENTO


GENERO Beauveria



HOSPEDERO Episibine spp.


PDA


BLANCO BLANCO

PDA

SDA

SDA

7403 U 1245U


(mm/ día)

REVERSO

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA




PDA SDA ANVERSO


(GERMINACIÓN A DIFERENTES TIEMPOS DE EXPOSICIÓN)

86.73 86.36 67.02 65.20 49.27


92

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

2.98 6.8 4.68

0.34 4.74 8.31


92.21 80.19 49.0260.5058.93

CÓDIGO DEL AISLAMIENTO

GENERO

PAIS DE ORIGEN

B005

Beauveria

Colombia

LOCALIDAD AISLAMIENTO

HOSPEDERO

CULTIVO

Cenicafé

Hypothenemus hampei

CAFÉ

PDA SDA

SDA




PDA

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

BLANCO BLANCO

CONIDIOS FINALES

ANVERSO

REVERSO

10

PDA SDA

7499U 128U


(mm/ día)

SDA

PDA

46.79



DESPLAZAMIENTO

MEDIA 47.03




93

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

4.54 4.57 5.12

2.92 7.29 5.03




91.60 76.45 62.30 56.48 46.30

CONIDIOS FINALES 9

DESPLAZAMIENTO 43

MEDIA 43.2

(mm/ día)

SDA

PDA







ANVERSO PDA SDA

BLANCO BLANCO

REVERSO PDA SDA

7499U 7508U

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA


HOSPEDERO

CULTIVO

San Andres de Tumaco (Nariño)

Stenoma cecropia

PALMA DE ACEITE


GENERO

PAIS DE ORIGEN

B006

Beauveria

Colombia


94

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 6.93 6.18

0.08 4.77 7.31


91.51 52.9869.6268.5488.65


GENERO

PAIS DE ORIGEN

B013

Beauveria

Colombia

Cumaral (Meta)

Loxotoma elegans

PALMA DE ACEITE




PDA


HOSPEDERO

CULTIVO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA



SDA


PDA SDA

7499U 7508U


(mm/ día)

SDA

PDA

MEDIA 11.09

CONIDIOS FINALES 2

ANVERSO

REVERSO


BLANCO BLANCO

DESPLAZAMIENTO 11.58


95

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.87 5.12 9.13

0.4 9.96 7.59


Puerto Wilches (Santander)

Anteotricha sp

PALMA DE ACEITE

90.00 77.82 55.43 52.8455.34


GENERO

PAIS DE ORIGEN

B015

Beauveria

Colombia




PDA


HOSPEDERO

CULTIVO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA



SDA

CONIDIOS FINALES 15

PDA SDA

7499U 1215U


(mm/ día)

SDA

PDA

MEDIA 71.03


ANVERSO

REVERSO


BLANCO BLANCO



96

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.53 8.08 8.44

0.41 7.79 7.45


89.35


HOSPEDERO

CULTIVO


Dirphia gragatus

PALMA DE ACEITE


GENERO

PAIS DE ORIGEN

B017

Beauveria

Colombia


CONIDIOS INICIALES

CONIDIOS FINALES 3

DESPLAZAMIENTO 17.2

55.15 45.4260.0682.90

19



MEDIA 17.12

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA




SDA

PDA SDA

PDA

PDA

BLANCO 7499UANVERSO

REVERSO 127U 1215U


(mm/ día)

SDA


97

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.23 9.22 6.34

0 8.28 8.47


52.5960.0964.5584.0592.16


GENERO

PAIS DE ORIGEN

B018

Beauveria

Colombia


HOSPEDERO

CULTIVO


Stenoma cecropia

PALMA DE ACEITE

PDA SDA

SDA




PDA

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

(mm/ día)

SDA

PDA





ANVERSO

REVERSO

BLANCO 7499U

MEDIA 72.14


CONIDIOS FINALES 18

PDA SDA

7499U 129U



98

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.54 6.54 9.26

0.41 4.98 7.58


PALMA DE ACEITE

B019

Beauveria

Colombia


Stenoma cecropia


GENERO

PAIS DE ORIGEN

51.5058.6164.6076.1791.49


HOSPEDERO

CULTIVO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

BLANCO


(mm/ día)




PDA SDA

BLANCO BLANCO

128U

ANVERSO

REVERSO

MEDIA 81.75




SDA

PDA



CONIDIOS FINALES 15

PDA


99

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.48 9.31 5.92

0.21 6.71 7.2



Stenoma cecropia

PALMA DE ACEITE

94.04 84.34 53.9958.7867.66


GENERO

PAIS DE ORIGEN

B021

Beauveria

Colombia




PDA


HOSPEDERO

CULTIVO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA



SDA

PDA SDA

7499U 7499U


(mm/ día)

SDA

PDA


CONIDIOS INICIALES

MEDIA 81.17

CONIDIOS FINALES 12

ANVERSO

REVERSO

15

7499U 7499U



100

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 5.71 6.21

0.43 4.79 6.85


93.78 52.2260.6463.0992.03


GENERO Beauveria





PDA

LOCALIDAD AISLAMIENTO Puente Sogamoso (Santander)

HOSPEDERO Leptopharsa gibbicarina


R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA



SDA

CONIDIOS FINALES 16

PDA SDA

7499U 7499U


(mm/ día)

SDA

PDA

MEDIA 80.82


ANVERSO

REVERSO


7499U BLANCO

DESPLAZAMIENTO 80


101

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.06 6.08 6.24

0 8.84 6.34


91.70 36.2058.7759.0983.79


GENERO Beauveria





PDA


HOSPEDERO Stenoma cecropia


R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA



SDA

PDA SDA

464U BLANCO


(mm/ día)

SDA

PDA


CONIDIOS INICIALES

MEDIA 81.43

CONIDIOS FINALES 14

ANVERSO

REVERSO

17

7506U BLANCO



102

Puente Sogamoso (Santander)

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

2.66 7.73 3.40

3.39 2.20 5.40



GENERO Beauveria



HOSPEDERO Dirphia gragatus





PDA ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA



SDA

PDA SDA

7499U BLANCO


(mm/ día)

SDA

PDA



7499U BLANCO

REVERSO

93.75 87.95 61.88 54.81 50.09


MEDIA 59.09

CONIDIOS FINALES 10


103

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.21 2.83 5.77

0.24 6.44 6.46



GENERO Beauveria





PDA


HOSPEDERO Leptopharsa gibbicarina


ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 12

PDA SDA

BLANCO 7499U


(mm/ día)

SDA

PDA



BLANCO BLANCO

REVERSO

MEDIA 65.52

95.06 40.3763.8265.8872.71





104

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

3.98 4.73 3.32

0.00 5.09 2.30



GENERO Beauveria





PDA


HOSPEDERO Demotispa neivai


ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 22

PDA SDA

BLANCO 1215U


(mm/ día)

SDA

PDA



BLANCO 7499U

REVERSO

MEDIA 83.73

47.7359.3560.5286.9592.71





105

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.14 5.30 7.76

0.31 5.62 7.51



GENERO Beauveria





PDA

LOCALIDAD AISLAMIENTO Puerto Wilches (Santander)



ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 3

PDA SDA

7499U 1225U


(mm/ día)

SDA

PDA



BLANCO BLANCO

REVERSO

MEDIA 15.37

44.3052.4266.0282.0195.66





106

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.19 2.32 3.62

0.25 4.94 7.16



GENERO Beauveria


LOCALIDAD AISLAMIENTO Tucurinca (Magdalena)

HOSPEDERO Brasolis sophorae





PDA ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA



SDA

PDA SDA

7499U 7507U


(mm/ día)

SDA

PDA



7499U BLANCO

REVERSO

49.7760.0360.5280.4096.97


MEDIA 22.26

CONIDIOS FINALES 5


107

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.13 3.76 6.41

0.36 5.63 3.36



GENERO Beauveria





PDA

LOCALIDAD AISLAMIENTO Tucurinca (Magdalena)

HOSPEDERO Brasolis sophorae


ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 15

PDA SDA

7402 U BLANCO


(mm/ día)

SDA

PDA



BLANCO BLANCO

REVERSO

MEDIA 76.27

46.8362.2763.4586.5394.84





108

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.18 7.39 6.14

0.18 9.05 7.66



GENERO Beauveria





PDA




ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 10

PDA SDA

BLANCO 1215U


(mm/ día)

SDA

PDA



BLANCO BLANCO

REVERSO

MEDIA 64.15

46.9959.2159.6486.1394.08





109

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

3.69 0.00 7.23

0.08 4.94 7.49



GENERO Beauveria





PDA

LOCALIDAD AISLAMIENTO Barrancabermeja (Santander)

HOSPEDERO Anteotricha sp


ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 10

PDA SDA

7499U 7409U


(mm/ día)

SDA

PDA



7499U BLANCO

REVERSO

MEDIA 53.22

50.5650.9953.0281.9792.99





110

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.61 4.43 6.74

0.49 4.01 3.01



GENERO Beauveria



HOSPEDERO Euprosterna elaeasa





PDA ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA



SDA

PDA SDA

7403 U 1215U


(mm/ día)

SDA

PDA



BLANCO BLANCO

REVERSO

92.35 48.4249.0257.6274.82


MEDIA 52.02

CONIDIOS FINALES 12


111

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.18 3.65 2.10

0.21 6.05 7.82



HOSPEDERO Elaidobius kamerunicus


GENERO Beauveria



PDA SDA

SDA ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

(mm/ día)




PDA

7409U 7401U


REVERSO

BLANCO BLANCO

PDA SDA

92.77 86.57 47.8255.4159.43



SDA

PDA



CONIDIOS FINALES 16


MEDIA 84.98


112

San Carlos de Guaroa (Meta)

NO DISPONIBLE

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 3.61 9.25

0.24 7.21 11.29



GENERO Beauveria





PDA


HOSPEDERO


ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 14

PDA SDA

BLANCO 1225U


(mm/ día)

SDA

PDA



BLANCO BLANCO

REVERSO

MEDIA 76.3

DESPLAZAMIENTO 76.6



39.3956.3860.4280.4192.47


113

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0.34 8.93 8.05

0.54 6.84 8.87



GENERO Beauveria





PDA


HOSPEDERO Loxotoma elegans


ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 16

PDA SDA

127U 1205U


(mm/ día)

SDA

PDA



BLANCO BLANCO

REVERSO

MEDIA 67.7

52.6257.5460.1880.1794.61





114

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 6.04 11.86

0 8.31 4.63


CÓDIGO DEL AISLAMIENTO Mt001

GENERO Metarhizium





PDA


HOSPEDERO NO DISPONIBLE


ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 15

PDA SDA

7404U 7402U


(mm/ día)

SDA

PDA



5865U 5845U

REVERSO

MEDIA 67.93

50.5456.1663.5275.2783.60





115

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 8.68 12.11

0 8.04 4.44


SDA

A

N

V

E

R

S

O

ANVERSO 457U


GENERO Metarhizium



HOSPEDERO Strategus aloeus


REVERSO

456U

PDA

PDA SDA

SDA




PDA

R

E

V

E

R

S

O

PDA

75.25

CONIDIOS FINALES 26

(mm/ día)

SDA

PDA

SDA

7404U 7401U


92.57 90.05 61.31


57.99 45.69





MEDIA


116

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 5.84 11.93

0 11.15 9.91



GENERO Metarhizium


LOCALIDAD AISLAMIENTO San Andres de Tumaco (Nariño)

HOSPEDERO Sagalassa valida





PDA ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA



SDA


PDA SDA

1255U 1525U


(mm/ día)

SDA

PDA


456U 458U

REVERSO

49.5853.8165.1779.7895.31


MEDIA 73.34

CONIDIOS FINALES 24


117

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 8.34 12.85

0 9.50 10.11



GENERO Metarhizium





PDA




ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 13

PDA SDA

1225U


(mm/ día)

SDA

PDA



456U 4495U

REVERSO

MEDIA 74.07

48.5856.7755.9487.2889.63




1235U


118

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 9.26 12.23

0 11.24 12.24



GENERO Metarhizium





PDA




ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 23

PDA SDA

609U 145U


(mm/ día)

SDA

PDA



5757U 450U

REVERSO

MEDIA 62.07

91.33 82.78 65.11 56.03 43.91

DESPLAZAMIENTO 61.5




119

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 8.51 11.70

0 13.82 10.49



GENERO Metarhizium





PDA




ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 12

PDA SDA

129U 1235U


(mm/ día)

SDA

PDA



4525U 4545U

REVERSO

MEDIA 59.15

44.7658.65 53.7983.9191.59





120

26.5°C

12 DIAS

10°C 26.5°C 30°C

0 7.98 9.26

0 5.16 4.83



GENERO Metarhizium





PDA

LOCALIDAD AISLAMIENTO Yarima (Santander)

HOSPEDERO Strategus aloeus


ANVERSO

R

E

V

E

R

S

O

PDA SDA

A

N

V

E

R

S

O

PDA SDA

SDA

CONIDIOS FINALES 23

PDA SDA

1595U 129U


(mm/ día)

SDA

PDA



4485U 4495U

REVERSO

MEDIA 65.51

90.10 62.11 38.4547.3858.99




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