caracterizaÇÃo superfÍcie foliar ceras … · caracterização da superfície foliar e das ceras...

Planta Daninha, Viçosa-MG, v.22, n.2, p.203-210, 2004

203Caracterização da superfície foliar e das ceras ...

1 Recebido para publicação em 8.12.2003 e na forma revisada em 18.6.2004.2 Professora substituta do Departamento de Recursos Naturais do Centro de Ciências Agrárias – CCA-UFSCar, RodoviaAnhanguera, Km 174, 13600-970 Araras-SP, <[email protected]>; 3 Professor Associado do Dep. de Produção Vegetal daUniversidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Piracicaba-SP, Brasil. 4 Departamento de Bioquímicae Biologia Molecular, Universidad de Málaga - Espanha.

CARACTERIZAÇÃO DA SUPERFÍCIE FOLIAR E DAS CERAS

EPICUTICULARES EM Commelina benghalensis, Ipomoea grandifolia EAmaranthus hybridus1

Leaf Surface Characterization and Epicuticular Wax Composition in Commelina benghalensis,Ipomoea grandifolia and Amaranthus hybridus

MONQUERO, P.A.2, CHRISTOFFOLETI, P.J.3, MATAS, J.A.4 e HEREDIA, A.4

RESUMO - Este estudo teve o objetivo de caracterizar a superfície foliar e a composição deceras epicuticulares das plantas daninhas Commelina benghalensis, Ipomoea grandifolia eAmaranthus hybridus. As ceras foram extraídas, quantificadas e empregadas em cromatografiade camada delgada, a fim de se determinar a composição química. Partes centrais dasfolhas foram submetidas à microscopia eletrônica de varredura, para caracterização dasuperfície foliar adaxial e abaxial. Em A. hybridus as ceras foram constituídas basicamentepor substâncias hidrofílicas (álcool, ésteres); a superfície foliar não apresentou tricomasou glândulas, com grande quantidade de estômatos e as ceras formando pequenos grânulos.

I. grandifolia apresentou ceras epicuticulares essencialmente hidrofílicas e superfície foliarrugosa, sem tricomas e sem a presença de cristais de ceras. Em C. benghalensis, as cerasapresentaram na sua constituição química os hidrocarbonos (n-alcanos), sendo, portanto,relativamente mais hidrofóbicas, o que pode influenciar a menor penetração de herbicidashidrofílicos, como o glyphosate. A superfície foliar apresentou tricomas e estômatosrecobertos pela cera epicuticular. Foi observada também a presença de ceras dispersas nasuperfície adaxial. Com base nos dados obtidos, concluiu-se que um dos mecanismos detolerância em C. benghalensis a herbicidas é a penetração diferencial devido à composiçãoquímica das ceras epicuticulares, que apresentam componentes de natureza lipofílica emmaior concentração que as demais espécies estudadas.

Palavras-chave: absorção, tolerância, glyphosate.

ABSTRACT - This study aimed to characterize the foliar surface and the epicuticular wax compositionof the weeds Commelina benghalensis, Ipomoea grandifolia and Amaranthus hybridus.The epicuticular waxes were extracted, quantified and submitted to thin layer chromatography inorder to determine the chemical composition. Central parts of the leaves were submitted to electronmicroscopy to characterize the adaxial and abaxial foliar surface. In A. hybridus the waxes wereconstituted mostly by hydrophilic substances (alcohols, steres), and absence of tricomes andglandules on the foliar surface, with a great number of stomata and waxes were in the smallgrains. I. grandfolia presented epicuticular waxes formedchemically by alcohols and esters anda coarse e foliar surface, without trichomess and wax crystals. In C. benahalensis, the waxespresented hydrocarbons (n-alkenes) in their chemical constitution, being relatively more hydrophobic,what can influence the lower penetration of hydrophilic herbicides such as glyphosate. The foliarsurface presents trichomess and a lower number of stomata. All the stomata were recovered byepicuticular wax, being possible to observe the presence of dispersed wax on the adaxial surface.Based on the data obtained, it can be concluded that one of the tolerance mechanisms to herbicidesin C. benghalensis is the differential penetration due to the chemical composition of the epicuticularwaxes, which contain lipophilic components in higher concentration than the other studied species.

Key words: absorption, tolerance, glyphosate.

MONQUERO, P.A. et al.


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INTRODUÇÃO

Como conseqüência da evolução químicae biológica, os organismos vivos têm desen-volvido uma série de estruturas de naturezapolimérica, que os isolam e os protegem domeio externo. Nas plantas superiores essafunção é assumida pela cutícula vegetal oumembrana cuticular (Heredia et al., 1998). Demodo geral, desde o interior até o exterior, amembrana é constituída por cutícula secun-dária (capa cuticular cutinizada), cutículaprimária (cutícula propriamente dita) comceras embebidas e, na parte mais externa, asceras epicuticulares. A composição químicada membrana cuticular é variada, sendo oscomponentes principais a cutina e as ceras.A cutina é um biopoliéster insolúvel de elevadograu de entrecruzamento entre os ácidosgraxos hidroxilados de cadeia longa que a com-põem, enquanto as ceras aparecem embebidasneste polímero (intracelulares) ou depositadasno exterior da cutícula (epicuticulares). Asceras epicuticulares podem ser depositadasem uma variedade de formas físicas. Emalgumas plantas, formam camadas finas, e emoutras podem formar placas ou cristais dediferentes tamanhos e formas.

Devido à sua composição química, que sereflete no grau de cristalinidade, e à possibili-dade de constituir na superfície da membranacuticular uma película que atua como inter-fase entre a célula vegetal e o meio, as cerasse destacam como a principal barreira prote-tora contra perda de água por transpiraçãoexcessiva, ação de patógenos, radiações sola-res e entradas de produtos químicos e conta-minantes (Heredia et al., 1998).

O conhecimento das propriedades proteti-vas da cutícula requer também entendimentoda composição das ceras cuticulares e da su-perfície foliar. Nos últimos anos, a composiçãoqualitativa e quantitativa das ceras de maisde 80 espécies de plantas e as característicasda superfície foliar têm sido determinadas. Astaxas de absorção foliar e, portanto, da eficáciabiológica da aplicação de pesticidas depende,em grande parte, do tipo de estrutura encon-trada nas folhas e da permeabilidade das cutí-culas de culturas e plantas daninhas (Baker,1982).

As ceras epicuticulares são constituídasde um filme de cera amorfa, de onde emer-gem estruturas cristalinas de diferentesformas. As estruturas mais freqüentementeobservadas são os túbulos, placas ou lamelas,bastonetes, filamentos, grânulos de formadeterminada ou não. Apesar de a morfologiadas ceras ser controlada geneticamente, aquantidade e a distribuição podem ser modi-ficadas pelas condições ambientais (Barthlottet al., 1998).

No Brasil, a tolerância ao glyphosate temsido detectada em algumas espécies de plan-tas daninhas (Santos et al., 2001; Durigan etal., 1988, Monquero, 2003). Entretanto, a razãopara essa tolerância diferencial não foi aindatotalmente compreendida.

Há vários exemplos na literatura demons-trando que a tolerância de plantas daninhasao glyphosate se deve a uma penetração ou auma translocação diferencial (Sandberg et al.,1980; Chachalis et al., 2001). Satichivi et al.(2000) observaram que a absorção foliar de14C-glyphosate, 72 horas após a aplicação, foimaior em Setaria faberi (43%) do que emAbutilon theophrasti (26%). Estes mesmospesquisadores constataram que a adição de 1%de sulfato de amônio aumentava a absorçãode glyphosate em ambas as espécies.

A absorção e translocação diferencial deglyphosate foram citadas como a principalrazão para a tolerância diferencial de plantascomo Apocynum cannabium, Asclepsias syriaca

e Abutilon theophrasti (Wyrill & Burnside, 1976).

Monquero (2003), estudando a absorção, atranslocação e o metabolismo de 14C-glyphosatepelas plantas daninhas C. benghalensis eI. grandifolia, concluiu que o principal meca-nismo de tolerância de C. benghalensis aoglyphosate foi a absorção diferencial e ometabolismo do herbicida por esta planta. EmI. grandifolia a tolerância ocorreu devido a umamenor translocação do herbicida, não havendoevidências de metabolismo diferencial doherbicida por esta planta.

O objetivo deste experimento foi carac-terizar a superfície foliar e a composição dasceras epicuticulares das plantas daninhasC. benghalensis, I. grandifolia e A. hybridus,



correlacionando-as com a absorção diferencialdo glyphosate entre essas espécies.

MATERIAL E MÉTODOS

Os estudos de caracterização das cerasepicuticulares e da superfície foliar foramconduzidos nos laboratórios e nas instalaçõesdo Departamento de Bioquímica e BiologiaMolecular, Universidad de Málaga, Espanha,sob a orientação do Prof. Antonio Heredia.

Caracterização das ceras epicuticulares

As ceras epicuticulares foram extraídas de20 plantas de C. benghalensis, I. grandifolia eA. hybridus que se desenvolveram em câmarade crescimento com temperatura dia/noite de32/18 oC, respectivamente, fotoperíodo de16 horas de luz (350 µmol m-2 s-1) e umidaderelativa constante de 80%, irrigando-se diaria-mente, visando a manutenção da umidadesatisfatória. As análises foram feitas quandoas plantas apresentaram quatro folhas verda-deiras, seguindo a metodologia proposta porHamilton (1995), com algumas modificações.As folhas de cada espécie de planta foramintroduzidas separadamente em placas comclorofórmio e metanol (90:10 mL) por 30 segun-dos, agitando-se levemente. Esses procedi-mentos foram feitos cuidadosamente para seevitar a ruptura das folhas e a conseqüenteliberação de clorofila e outros compostos. Osextratos obtidos foram filtrados e deixadosevaporar sobre uma placa a 55 oC, até reduziro volume para aproximadamente 15 mL. Estasolução (clorofórmio+ceras) foi transferida paravials de 25 mL de peso conhecido. O clorofórmiofoi evaporado em temperatura ambiente e osvials foram mantidos para pesagem dois equatro dias após a obtenção do resíduo sólido(ceras). A quantificação das ceras foi expressapor quantidade de ceras por unidade de áreafoliar (µg.cm-2). Para isso, a área das folhas decada espécie, utilizadas para a extração dasceras, foi medida através do aparelho fotoe-létrico de medição de área foliar LICOR-3100.O experimento foi conduzido em delineamentointeiramente casualizado, com quatro repe-tições para cada espécie. Foram calculadas asmédias das quatro repetições, juntamentecom os respectivos desvio-padrões.

Para a análise química das ceras, os resí-duos sólidos (ceras) obtidos foram ressus-pendidos com 500 µL de clorofórmio e utilizadosem cromatografia de camada delgada. Osextratos de cada espécie foram aplicados emdois volumes diferentes (250 e 500 µL) sobrecromatoplacas, TLC plates 5 X 10 cm Sílicagel 60 F

254, Merck, que foram previamente

ativadas por aquecimento a 100 oC. Como fasemóvel foram empregados 8 mL de benzeno.Após a migração das amostras, a placa foiretirada do benzeno e banhada por uma soluçãode TLC (94 mL de água, 6 mL de H

2SO

4, 1,5 g

de H3Mo

12O

40P e 1 g de Ce

2(SO

4)3). Por último, a

placa foi seca, primeiro, em temperaturaambiente e posteriormente a 100 oC, para oaparecimento das bandas. Para a deter-minação do Rf (razão de fluxo), segundo afórmula sugerida por Collins et al. (1990): Rf=(Distância percorrida pela amostra)/(Distân-cia percorrida pelo eluente), marcou-se adistância percorrida pela fase móvel e pelasbandas nas cromatoplacas.

Caracterização da superfície foliar pormicroscopia eletrônica de varredura

As plantas C. benghalensis, I. grandifolia eA. hybridus, desenvolvidas em condições jámencionadas, apresentando quatro folhas ver-dadeiras, foram utilizadas neste experimento.Amostras de 1cm2 foram cortadas da regiãocentral de folhas jovens, porém totalmenteexpandidas, fixadas em pequenos cilindros dealumínio (stubber) e recobertas com uma capade ouro de espessura de 0,05 µm. Dessa forma,as amostras foram observadas em microscópioeletrônico de varredura JEOL JSM-840 (Jeol-Japão), empregando-se 15 kV e sendo foto-grafadas as melhores imagens.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Caracterização das ceras epicuticulares

A quantidade de ceras por unidade de áreafoliar foi maior em I. grandifolia (37,0 µg cm-2),seguida por C. benghalensis (34,5 µg cm-2) eA. hybridus (31,7 µg cm-2) (Figura 1). A quan-tidade de ceras epicuticulares na maioria dasespécies varia de 10 a 200 µg cm-2 (McWhorter& Ouzts 1993), embora quantidades acima de



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300 µg cm-2 já tenham sido relatadas (Baker,1982).

As ceras epicuticulares de A. hybridus,C. benghalensis e I. grandifolia são consti-tuídas de maneira geral de hidrocarbonos,álcoois e ésteres, com uma clara distinçãoentre as espécies (Figura 2). Quanto maior ovalor de Rf, mais apolar é o constituintequímico e, portanto, mais hidrofóbica é a cera.Em C. benghalensis, as ceras epicuticularespossuíram na sua composição n-alcanos

(Rf=0,9), que são compostos altamentehidrofóbicos. É importante lembrar que oglyphosate é altamente hidrofílico (Sandberget al., 1980); portanto, uma das razões damenor absorção do glyphosate por esta planta(66% do 14C-glyphosate aplicado foi absorvido),relatada por Monquero (2003), foi a composi-ção química das ceras epicuticulares. Deacordo com Hamilton (1995), os hidrocarbonos(n-alcanos) estão presentes em quase toda asuperfície lípidica das plantas, variandoquantitativamente de traços até 50% de todaa planta, porém são predominantes em poucoscasos. As ceras, em I. grandifolia e A. hybridus,foram compostas basicamente por álcooisprimário e secundário (Rf= 0,1 e 0,4) e ésteres(0,8). Esses compostos não são barreiras paraa penetração do herbicida glyphosate, já quesão hidrofílicos. Os álcoois são, na maioria doscasos, os principais componentes das ceras,variando de pequenas porcentagens até 60%das ceras totais, dependendo da espécie. Emplântulas de milho, por exemplo, constituem63% de toda a cera epicuticular, um valor quechega a 14% em folhas imaturas. Ésterespodem chegar até a 80% da cera total, e osácidos podem estar presentes em grandeproporção – um exemplo são as folhas desorgo, que possuem cerca de 40% de ácidos

C. benghalensis A. hybridus I. grandifolia

Cer

as e

picu

ticul

ares

(µg

cm-2

)

0

10

20

30

40

50

Figura 1 - Quantidade de ceras epicuticulares (µg cm-2) nasplantas daninhas estudadas.

Figura 2 - Cromatografia de camada delgada de ceras epicuticulares com valores de Rf. C= C. benghalensis; I= I. grandifolia;A = A. hybridus.



na composição das ceras epicuticulares(Hamilton, 1995).

A composição química das ceras epicu-ticulares é variável entre os distintos gruposfilogenéticos, ocorrendo diferenças tambémdentro dos mesmos grupos, espécies, ou nosdiferentes estádios de crescimento de ummesmo indivíduo. Os principais componen-tes químicos das ceras epicuticulares sãon-alcanos, ésteres, álcoois e ácidos graxos. Aimportância da composição química destasceras está relacionada com a sua morfologia.Os hidrocarbonos e álcoois primários, porexemplo, cristalizam na forma de placas; osálcoois secundários e as cetonas, como túbu-los; os aldeídos, na forma de grânulos; e osdioles, como pequenas tiras. No caso dos triter-penóides e acil ésteres, não há a formação decristais, sendo as estruturas majoritaria-mente amorfas (Chachalis et al., 2001).

Mendonça (2000), estudando algumascaracterísticas da superfície foliar de váriasespécies daninhas, observou que C. benghalensis

foi a que apresentou ceras epicuticulares commaior porcentagem de compostos apolares, oque pode prejudicar a absorção de herbicidascom baixo Kow. De acordo com Silva et al.(2000), os herbicidas lipofílicos (alto Kow) sesolubilizam nos componentes lipofílicos dacutícula e se difundem através desta. Comrelação aos herbicidas hidrofílicos, admite-seque a cutícula tenha uma estrutura porosa,que se mantém hidratada, dependendo dascondições ambientais, sendo esta água de hi-dratação da cutícula a rota de penetraçãohidrofílica. Velini & Trindade (1992) citam comooutra possível rota de absorção dos herbicidaspolares os filamentos de pectina dispersos namatriz da cutina, que podem cruzar toda a cutí-cula. Esses filamentos, desde que hidratados,podem atuar como via de transporte dessesprodutos.

Algumas pesquisas demonstraram que acomposição das ceras pode mudar com a idadedas plantas. Em Sorghum halepenses, alcanose ácidos aumentaram, enquanto houve dimi-nuição de álcoois em ceras de folhas maisvelhas (McWorter & Ouzts, 1993). Portanto,pode-se correlacionar o fato de a C. benghalensis

ser mais tolerante ao glyphosate quando adultacom uma maior quantidade de alcanos nasfolhas maduras.

Caracterização da superfície foliar pormicroscopia eletrônica de varredura

A superfície foliar das plantasC. benghalensis, I. grandifolia e A. hybridus

apresentaram diferença marcante em suamicromorfologia. A superfície adaxial deC. benghalensis apresentou elongados tricomase um pequeno número de estômatos distri-buídos em fileiras, recobertos por uma camadade cera epicuticular (Figura 3). O menor núme-ro e a obstrução dos estômatos pelas ceras denatureza hidrofóbica são uma provável causada menor absorção do herbicida glyphosateatravés da membrana cuticular que cobre ascélulas-guarda. Podem-se observar tambémcamadas de ceras na superfície adaxial emforma de filamentos pouco definidos. Santoset al. (2002) observaram, nesta planta, pêlostectores, que são de dois tipos: longos comextremidade afilada e curtos com extremidadecurva – os pêlos longos concentraram-se naepiderme abaxial e os pêlos curtos, na epidermeabaxial. Em I. grandifolia, a superfícieadaxial de folhas jovens se apresentou demaneira rugosa, sem a presença de tricomasou glândulas (Figura 4). Os estômatos semqualquer tipo de obstrução foram observadosem maior quantidade, quando comparado aC. benghalensis. Deposição cristalina de cerasnão foi observada; ceras amorfas também foramidentificadas em outras espécies de plantascomo Vitis vinifera, Beta vulgares e Trifolium

repens. Todas essas espécies apresentaramum ponto em comum: a grande quantidade deálcool primário na composição de ceras. Há ahipótese de que a natureza amorfa das ceraspode ser uma conseqüência da baixa quanti-dade de ceras na superfície foliar ou decorrenteda composição química (Baker & Bukovac,1971).

Procópio et al. (2003) observaram que aprincipal barreira foliar à penetração de herbi-cidas em Galinsoga parviflora foi a baixa den-sidade estomática na face adaxial; no casode Crotalaria incana, o principal obstáculo àpenetração de herbicidas foi a grande quanti-dade de ceras epicuticulares. Já em relação aConyza bonariensis a alta densidade tricomá-tica, a grande espessura da cutícula na faseadaxial e a baixa densidade estomática foramas principais barreiras à penetração dos herbici-das. Em Ipomoea cairica, a grande espessura



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Figura 3 - Superfície foliar de C. benghalensis. (A) vista geral da superfície adaxial; (B) detalhe de estômato recoberto por ceras;(C) detalhes das ceras epicuticulares da superfície adaxial; (D) detalhes das ceras na superfície abaxial.

A B

C D

A B

C D

Figura 4 - Superfície foliar de I. grandifolia. (A) vista geral da superfície adaxial; (B) detalhe de um estômato; (C) superfície adaxialsem presença de cristais de ceras; (D) detalhes da superfície abaxial.



da cutícula na fase adaxial e a baixa densidadeestomática foram os possíveis obstáculos apenetração de herbicidas aplicados em pós-emergência.

A superfície foliar de A. hybridus apre-sentou-se lisa, sem a presença de tricomas

ou glândulas e com grande quantidade deceras granulares tanto na superfície adaxialcomo na abaxial (Figura 5). Os estômatos seencontraram em depressão em relação àsuperfície foliar, rodeados por cristais deforma alongada.

A B

C D

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Figura 5 - Superfície foliar de A. hybridus. (A) vista geral da superfície adaxial; (B) detalhe de um estômato com ceras ao redor; (C)superfície adaxial com cristais de ceras; (D) detalhes da superfície abaxial.



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