capsicum annuum - fe stress

8/3/2019 Capsicum Annuum - Fe Stress

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 8 6 ) 8 2 , 5 1 1 - 5 1 70 0 3 2 - 0 8 8 9 / 8 6 / 8 2 / 0 5 1 1 / 0 7 / $ 0 1 . 0 0 / 0

F u n c t i o n o f R h i z o d e r m a l T r a n s f e r C e l l s i n t h e F e S t r e s sR e s p o n s e M e c h a n i s m o f C a p s i c u m annuum L .

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n D e c e m b e r 3 1 , 1 9 8 5 a n d i n r e v i s e d f o r m May 2 5 , 1 9 8 6E R N S T - C H R I S T I A N L A N D S B E R GI n s t i t u t f u r N u t z p f l a n z e n f o r s c h u n g , P f l a n z e n e r n a h r u n g , T e c h n i s c h e U n i v e r s i t a t B e r l i n , L e n t z e a l l e e 5 5 - 5 7 ,1 0 0 0 B e r l i n 3 3 , F e d e r a l R e p u b l i c o f G e r m a n y

ABSTRACTA v a r i e t y o f r e d p e p p e r ( C a p s i c u m annuum L . , c v Y a g l i k ) r e s p o n d s t o

F e d e f i c i e n c y s t r e s s w i t h s i m u l t a n e o u s l y e n h a n c e d H+ e x t r u s i o n , r e d u c -t i o n o f f e r r i c i o n s a n d s y n t h e s i s o f m a l i c a n d c i t r i c a c i d i n a s w o l l e ns u b a p i c a l r o o t z o n e d e n s e l y c o v e r e d w i t h r o o t h a i r s . I t i s d e m o n s t r a t e dt h a t t h e s e s t r e s s r e s p o n s e s t e m p o r a l l y c o i n c i d e w i t h t h e d e v e l o p m e n t o fr h i z o d e r m a l a n d h y p o d e r m a l t r a n s f e r c e l l s i n t h i s r o o t z o n e. D u r i n g s t r e s sr e s p o n s e t h e t r a n s f e r c e l l s s h o w a m a r k e d a u t o f l u o r e s c e n c e w h i c h c o u l da r i s e f r o m e n d o g e n o u s i r o n c h e l a t o r s o f t h e p h e n o l i c a c i d t y p e . T h ep r e s e n c e o f o r g a n e l l e - r i c h c y t o p l a s m w h i c h o f t e n e x h i b i t s r o t a t i o n a lc y t o p l a s m i c s t r e a m i n g p o i n t s t o h i g h p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t y a n d m a k e st h e s e c e l l s , w i t h t h e i r i n c r e a s e d p l a s m a l e m m a s u r f a c e , p a r t i c u l a r l y w e l ls u i t e d f o r t h e e n t i r e s t r e s s r e s p o n s e m e c h a n i s m . S i n c e F e s t r e s s - i n d u c e da c i d i f i c a t i o n i s d i m i n i s h e d b y v a n a d a t e a n d e r y t h r o s i n B , b o t h s p e c i f i ci n h i b i t o r s o f p l a s m a l e m m a A T P a s e s , i t s e e m s r e a s o n a b l e t o s u p p o s e t h a tH o p u m p i n g f r o m t r a n s f e r c e l l s i s a c t i v a t e d b y a n A T P a s e l o c a t e d i nt h e i r p l a s m a m e m b r a n e . H' e x t r u s i o n i s a l s o s h o w n t o b e i n h i b i t e d b ya b s c i s i c a c i d . R a i s e d p h o s p h o e n o l p y r u v a t e c a r b o x y l a s e a c t i v i t y a n d s i -m u l t a n e o u s a c c u m u l a t i o n o f m a l a t e i n t h e s w o l l e n r o o t z o n e p o i n t t o t h ea c t i o n o f a pH s t a t p r e v e n t i n g a d e t r i m e n t a l r i s e i n c y t o p l a s m i c pH o ft r a n s f e r c e l l s d u r i n g e n h a n c e d H ' e x t r u s i o n . T h e s i m u l t a n e o u s i n c r e a s ei n c i t r i c a c i d c o n c e n t r a t i o n f a v o r s c h e l a t i o n o f i r o n a t t h e s i t e o f i t s u p t a k ea n d t h u s e n s u r e s l o n g d i s t a n c e t r a n s p o r t t o t h e a r e a s o f m e t a b o l i cd e m a n d . A d i r e c t l i n k b e t w e e n c i t r a t e a c c u m u l a t i o n a n d f e r r i c i o n r e d u c -t i o n a s p r o p o s e d i n r e c e n t l i t e r a t u r e f u r t h e r s u p p o r t s t h e c r u c i a l r o l e o ft r a n s f e r c e l l s i n t h e r e s p o n s e t o F e d e f i c i e n c y s t r e s s .

R h i z o d e r m a l t r a n s f e r c e l l s i n d u c e d b y m i n e r a l s t r e s s w e r e f i r s tr e p o r t e d f o r t h e h a l o p h y t e A t r i p l e x h a s t a t a t r e a t e d w i t h h i g hN a C l c o n c e n t r a t i o n s ( 1 3 ) . T h e s t r i k i n g s i m i l a r i t y o f t h e a c c o m -p a n y i n g m o r p h o l o g i c a l s y m p t o m s s u c h a s r o o t t i p s w e l l i n g a n dr o o t h a i r f o r m a t i o n t o a n a l o g o u s s y m p t o m s i n d u c e d i n F e d e f i -c i e n t s u n f l o w e r p l a n t s ( 1 6 ) l e d t o t h e d i s c o v e r y o f t r a n s f e r c e l l si n F e - s t a r v e d r o o t s ( 1 5 ) . E v e n u n d e r s a l t s t r e s s c o n d i t i o n s , t h ei m p o r t a n t r o l e o f i r o n n u t r i t i o n a l s t a t u s f o r t h e d e v e l o p m e n t o ft r a n s f e r c e l l s i s e m ph a s i z e d b y t h e f a c t t h a t t h e i r f o r m a t i o n c a nb e h i n d e r e d b y i n c r e a s i n g F e s u p p l y ( 1 4 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t aN a C l - i n d u c e d F e s h o r t a g e w a s t h e i m m e d i a t e t r i g g e r o f t r a n s f e rc e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n t h a t e x p e r i m e n t .I n a f i r s t a t t e m p t t o c h a r a c t e r i z e t h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n o ft r a n s f e r c e l l s u n d e r F e d e f i c i e n c y , i t w a s p r o p o s e d ( 1 8 ) t h a t t h e i rd e v e l o p m e n t i s r e l a t e d t o e n h a n c e d F e " ' r e d u c t i o n a n d H+ e f f l u x ,b o t h o f w h i c h a r e w e l l known k e y r e a c t i o n s o f t h e s o - c a l l e d F es t r e s s r e s p o n s e m e c h a n i s m ( f o r r e v i e w s e e R e f . 5 ) . On t h e o t h e rh a n d , R o m h e l d a n d K r a m e r ( 2 7 ) s t a t e d i n a c o m p a r a t i v e s t u d yo f v a r i o u s p l a n t s p e c i e s t h a t t r a n s f e r c e l l f o r m a t i o n i s d i r e c t l y

r e l a t e d o n l y t o i n c r e a s e d p r o t o n s e c r e t i o n . H o w e v e r , t h i s g e n e r -a l i z a t i o n s e e m s p r o b l e m a t i c . T h e i r m e a s u r e m e n t s o f F e " ' r e d u c -t i o n w e r e e x p r e s s e d f o r t h e f r e s h w e i g h t o f e x c i s e d r o o t s i n g e n e r a la n d n o t f o r t h e a c t u a l t r a n s f e r c e l l z o n e o f o n l y a f e w mm t h a tv a r i e s s u b s t a n t i a l l y i n l e n g t h f r o m s p e c i e s t o s p e c i e s .T h e p u r p o s e o f t h e p r e s e n t p a p e r i s t o p r o v i d e a m o r e d e t a i l e de l u c i d a t i o n o f t h e f u n c t i o n a l r o l e o f r h i z o d e r m a l t r a n s f e r c e l l su n d e r F e d e f i c i e n c y s t r e s s . T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t , a t l e a s tf o r r e d p e p p e r , t h e s e s p e c i a l i z e d c e l l s a r e i n v o l v e d n o t o n l y i np r o t o n s e c r e t i o n b u t a r e a l s o r e l a t e d t o e n h a n c e d F e " ' r e d u c t i o n ,o r g a n i c a c i d a c c u m u l a t i o n a n d p o s s i b l y t h e p r o d u c t i o n o f p h e -n o l i c i r o n c h e l a t o r s .

MATERIALS AND M ET H ODSG r o w t h o f P l a n t s . S e e d s o f r e d p e p p e r ( C a p s i c u m annuum L .c v Y a g l i k ) w e r e g e r m i n a t e d a n d g r o w n t o t h e s e e d l i n g s t a g e i nq u a r t z s a n d m o i s t e n e d w i t h C a S O 4 s o l u t i o n ( 0 . 2 m M ) . T h es e e d l i n g s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d f o r 2 w e e k s t o a c o n t i n u o u s l ya e r a t e d n u t r i e n t s o l u t i o n t h a t c o n t a i n e d , i n m M : C a ( N O 3 ) 2 , 2 . 0 ;K 2 S O 4 , 0 . 7 5 ; K H 2 P O 4 , 0 . 5 0 ; M g S O 4 , 0 . 6 5 ; H 3 B O 3 , 1 . 0 x 1 0 - 2 ;

M n S O 4 , 1 . 0 x I 0 - ; C u S O 4 , 5 . 0 x 1 0 - 4 ; Z n S O 4 , 5 . 0 x 1 0 - 4 ;( N H 4 ) 6 M o 7 0 2 4 , 5 . 0 x l 0 - 5 ; F e a s F e " ' E D T A , 2 . 5 x 1 0 - 2 .A l l p l a n t s w e r e g r o w n i n a c o n t r o l l e d g r o w t h c h a m b e r w i t h ad a y / n i g h t r e g i m e o f 1 6 / 8 h a n d l i g h t i n t e n s i t y n e a r 2 8 W/m2( f l u o r e s c e n t t u b e s , O s r a m - L 4 0 W / 2 5 w h i t e a n d 4 0 / 7 7 F l u o r a ,r a t i o 4 : 1 ) . T h e t e m p e r a t u r e w a s 2 4 C ( l i g h t a n d d a r k ) , t h e RHa p p r o x i m a t e l y 7 0 % .pH M e a s u r e m e n t s . To i n d u c e F e d e f i c i e n c y p l a n t s w e r e t r a n s -f e r r e d t o p l a s t i c j a r s ( o n e p l a n t p e r j a r ) , c o n t a i n i n g 6 0 0 m ln u t r i e n t s o l u t i o n w i t h o u t FeEDTA. T h e pH o f t h e s o l u t i o n w a sr e c o r d e d c o n t i n u o u s l y . A f t e r 3 t o 4 d p l a n t s w e r e s e l e c t e d w h i c hs h o w e d a s i m i l a r d e g r e e o f c h l o r o s i s a n d f o r w h i c h t h e pHd e c r e a s e o f t h e a m b i e n t m e d i u m s t a r t e d a t n e a r l y t h e s a m e t i m e .P a t t e r n s o f H+ e f f l u x f r o m i n t a c t F e - s t r e s s e d r o o t s w e r e v i s u -a l i z e d a s p r e v i o u s l y s h o w n ( 1 8 ) . S e l e c t e d s i n g l e r o o t s w e r e r i n s e dw i t h d i s t i l l e d H2 0 a n d ( r e m a i n i n g a t t a c h e d t o t h e p l a n t ) p l a c e di n t o d a r k e n e d P e t r i d i s h e s f i l l e d w i t h 0 . 6 % a g a r m e d i u m c o n -t a i n i n g F e - f r e e n u t r i e n t s o l u t i o n a n d b r o m o c r e s o l p u r p l e ( 5 0 mgL - ' ) w i t h a pH b e i n g a d j u s t e d t o 5 . 8 . T h e a s s e m b l y w a s k e p tu n d e r t h e l i g h t s i n t h e g r o w t h c h a m be r .F o r i n h i b i t o r s t u d i e s o r t h o v a n a d a t e s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e da c c o r d i n g t o O ' N e i l l a n d S p a n s w i c k ( 2 5 ) . ABA s t o c k s o l u t i o nw a s p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g ABA i n a m i n i m a l v o l u m e o f KOHa n d n e u t r a l i z i n g w i t h H C I .O r g a n i c A c i d s . H o t w a t e r e x t r a c t s c o n t a i n i n g g l u t a r i c a c i d a si n t e r n a l s t a n d a r d w e r e c l e a r e d b y p a s s a g e t h r o u g h c a t i o n a n da n i o n e x c h a n g e r e s i n s ( D o w e x 5 0 - X 8 , 2 0 0 t o 4 0 0 m e s h , H+f o r m , a n d Dowex I - X 8 , 2 0 0 t o 4 0 0 m e s h , f o r m a t e f o r m ) . A f t e re l u t i o n w i t h 1 6 M HCOOH t h e a n i o n i c f r a c t i o n w a s b r o u g h t t od r y n e s s u n d e r v a c u u m a t 40C a n d t a k e n u p i n l - m l R e a c t i -

5 1 1


2/7

P l a n t P h y s i o l . V o l . 8 2 , 1 9 8V i a l s f o r d e r i v a t i z a t i o n w i t h M S T F A ' w h i c h a l s o s e r v e d a ss o l v e n t . A f t e r s i l y l a t i o n a t room t e m p e r a t u r e f o r 3 0 m i n 1 - g 1s a m p l e s w e r e a n a l y z e d b y GC ( P e r k i n E l m e r F 2 2 e q u i p p e d w i t hf l a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r ) on a 2 - m l o n g g l a s s c o l u m n p a c k e dw i t h 3% S E 3 0 . T h e t e m p e r a t u r e w a s 8 0 t o 1 8 5 C a t 5 C / m i n .P E P - C a r b o x y l a s e A c t i v i t y . S a m p l e s ( 0 . 2 - 0 . 4 g f r e s h w e i g h t )f r o m d i f f e r e n t r o o t z o n e s ( s w o l l e n z o n e 0 - 8 mm, u n s w o l l e n z o n e1 0 - 2 0 mm b e h i n d t i p ) w e r e g r o u n d w i t h a c o o l e d a l l - g l a s s P o t t e r -E l v e h j e m h o m o g e n i z a t o r i n 6 v o l u m e s o f e x t r a c t i o n m e d i u mc o n t a i n i n g 5 0 mg i n s o l u b l e PVP i n 5 0 mm g l y c y l g l y c i n e b u f f e r ,p H 7 . 4 , w i t h 1 0 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n a t8 0 , 0 0 0 g f o r 2 0 m i n , c r u d e e x t r a c t s w e r e d e s a l t e d o n S e p h a d e xG - 2 5 c o l u m n s ( P h a r m a c i a , P D - 1 0 ) a n d k e p t a t 2 C u n t i l a s s a y e dt h e same d a y a c c o r d i n g t o S m i t h a n d a p R e e s ( 3 6 ) . E n z y m ea c t i v i t y p e r mg p r o t e i n was c a l c u l a t e d f r o m t h e c o n s u m p t i o n o fNADH d u r i n g t h e r e d u c t i o n o f o x a l o a c e t a t e r e s u l t i n g f r o m c a r -b o x y l a t i o n o f P E P . NADH was m o n i t o r e d w i t h a Z e i s s s p e c t r o -p h o t o m e t e r ( l i n e a r r e g i o n o f p r o g r e s s c u r v e s , 2 5 C ) . S o l u b l ep r o t e i n o f t h e e x t r a c t s was m e a s u r e d b y a p r o t e i n d y e - b i n d i n gm e t h o d ( 4 ) . E x t r a c t i o n a n d a s s a y w a s c a r r i e d o u t t h r e e t i m e s .R e s u l t s n e v e r d i f f e r e d b y more t h a n 1 0 % .R o o t R e s p i r a t i o n . 0 2 u p t a k e ( , u m o l 0 2 / g f r e s h w e i g h t . h ) o fr o o t s f r o m i n d i v i d u a l i n t a c t p l a n t s w a s r e c o r d e d w i t h a C l a r k -t y p e e l e c t r o d e ( O r i o n R e s e a r c h ) a t d i f f e r e n t s t a g e s o f F e s t r e s s -i n d u c e d a c i d i f i c a t i o n o f t h e n u t r i e n t s o l u t i o n ( k e p t a t 2 5 C ) .D u r i n g t h e m e a s u r e m e n t , t h e s o l u t i o n w a s l a y e r e d w i t h p a r a f f i no i l t o r e s t r i c t g a s e x c h a n g e w i t h a m b i e n t a i r .R e d u c i n g C a p a c i t y . F r e s h l y c u t r o o t t i p s ( 5 - 8 mm l e n g t h ) f r o mF e - s t r e s s e d p l a n t s w e r e t r e a t e d a c c o r d i n g t o t h e s l i g h t l y m o d i f i e dm e t h o d o f O l s e n a n d B r o w n ( 2 3 ) u s i n g F e r r o z i n e r e a g e n t , w h i c hf o r m s a s t a b l e m a g e n t a c o m p l e x s p e c i e s w i t h F e " . T h e a s s a ym e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 2 mm F e r r o z i n e , 0 . 5 mM F e " ' E D T A , 0 . 5m M C a S O 4 , a n d 1 0 mm s u c r o s e w a s b u f f e r e d w i t h 5 m M M e s a tp H 4 . 8 . S u c r o s e was a d d e d i n o r d e r t o p r e v e n t a p o s s i b l e e n e r g ys h o r t a g e d u e t o r o o t e x c i s i o n . D u r i n g t h e e x p e r i m e n t t h e s o l u t i o n( 4 m l ) was o x y g e n a t e d b y b u b b l i n g a i r a n d k e p t i n t h e d a r k a t2 5 C f o r 6 0 t o 1 2 0 m i n . T h e amount o f F e " r e s u l t i n g f r o m t h er e d u c t i o n o f F e " ' was d e t e r m i n e d b y t h e a b s o r b a n c e o f t h eF e " F e r r o z i n e c o m p l e x a t 5 6 2 nm. T h e s t a i n i n g t e c h n i q u e f o r t h ev i s u a l i z a t i o n o f F e " ' r e d u c t i o n a l o n g t h e r o o t a l s o i n v o l v e dc o m p l e x f o r m a t i o n o f F e " w i t h F e r r o z i n e .I n a d d i t i o n , i n s i t u r e d u c i n g c a p a c i t y was l o c a l i z e d a c c o r d i n gt o S i j m o n s a n d B i e n f a i t ( 3 3 ) u s i n g N i t r o - B T , w h i c h i s k n o w n t oa c t a s an e l e c t r o n a c c e p t o r i n e n z y m e - c a t a l y z e d r e d o x r e a c t i o n sw h e r e b y t h e c o l o r l e s s t e t r a z o l i u m s a l t s a r e c o n v e r t e d t o w a t e r -a n d l i p i d - i n s o l u b l e d a r k b l u e c o l o r e d f o r m a z a n s .M i c r o s c o p y . C r o s s - s e c t i o n s f r o m f r e s h r o o t s were o b t a i n e dw i t h a L e i t z q u i c k f r e e z i n g m i c r o t o m e , m o u n t e d i n 0 . 0 6 7 Mp h o s p h a t e b u f f e r , p H 8 . 4 , a n d i m m e d i a t e l y e x a m i n e d w i t h aZ e i s s p h o t o m i c r o s c o p e . F l u o r e s c e n c e was t e s t e d u s i n g e p i f l u o -r e s c e n c e o p t i c s i n c o n j u n c t i o n w i t h a b e a m s p l i t t e r F T 3 9 5 , a ne x c i t e r f i l t e r G 3 6 5 a n d a b a r r i e r f i l t e r L P 4 2 0 f o r U V - l i g h t e x c i t -a t i o n o r t h e c o m b i n a t i o n F T 5 1 0 , B P 4 5 0 - 4 9 0 a n d L P 5 2 0 f o rb l u e - l i g h t r e s p e c t i v e l y . I l l u m i n a t i o n was p r o v i d e d b y an H BO2 0 0 m e r c u r y a r c l a m p . P h o t o g r a p h s w e r e t a k e n on E k t a c h r o m e4 0 0 d a y l i g h t f i l m r a t e d a t 1 6 0 0 A S A .EM was p e r f o r m e d on s p e c i m e n s f i x e d i n g l u t a r a l d e h y d e /O S 0 4 a n d e m b e d d e d i n e p o x y r e s i n a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( I 1 8 ) .U l t r a t h i n s e c t i o n s w e r e e x a m i n e d i n a Z e i s s EM-9 e l e c t r o nm i c r o s c o p e .

' A b b r e v i a t i o n s : M S T F A , N - m e t h y l - t r i m e t h y l s i l y l t r i f l u o r o a c e t a m i d e ;F e r r o z i n e , d i s o d i u m s a l t o f 3 - ( 2 - p y r i d y l ) - 5 , 6 - ( 4 - p h e n y l s u l f o n i c a c i d ) -1 , 2 , 4 , - t r i a z i n e ; N i t r o - B T , 2 , 2 ' - d i - p - n i t r o - p h e n y l - 5 , 5 ' - d i p h e n y l - 3 , 3 ' -( 3 , 3 ' - d i m e t h o x y - 4 , 4 ' - b i p h e n y l e n e ) d i t e t r a z o l i u m c h l o r i d e ; D E S , d i e t h y l -s t i l b e s t r o l ; DCCD, d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e ; T I B A , 2 , 3 , 5 - t r i i o d o b e n -z o i c a c i d ; P E P , p h o s p h o e n o l p y r u v a t e .

RESULTSP h y s i o l o g i c a l R e s p o n s e t o F e D e f i c i e n c y S t r e s s . P l a n t s g r o wi n g i n F e E D T A - f r e e n u t r i e n t s o l u t i o n t u r n e d m o d e r a t e l y c h l or o t i c ( p a l e y e l l o w i n g o f t h e y o u n g e s t l e a v e s ) a f t e r t h e 4 t h d o f Fd e p r i v a t i o n . S h o o t a n d r o o t g r o w t h w e r e n o t n o t i c e a b l y a f f e c t ea t t h a t t i m e . S i m u l t a n e o u s l y , t h e m a i n r o o t a n d many n e w l

d e v e l o p e d l a t e r a l s s h o w e d a t y p i c a l s u b a p i c a l s w e l l i n g d e n s e lc o v e r e d b y r o o t h a i r s ( F i g . 2 a ) a n d d i s p l a y e d s t r o n g a u t o f l u o r e sc e n c e u n d e r UV - o r b l u e - l i g h t ( F i g s . 2 b a n d 3 ) . C o n t r o l s d i d n oe x h i b i t t h i s r e s p o n s e ( F i g . 2 b ) . C r o s s - s e c t i o n s d e m o n s t r a t e t h at h e f l u o r e s c e n c e p r e d o m i n a n t l y comes f r o m t h e r h i z o d e r m a l c e ll a y e r ( F i g . 4 ) .T h e p H o f t h e n u t r i e n t s o l u t i o n r a p i d l y d e c r e a s e d a t t h i s s t a gf r o m a b o u t 6 . 8 t o v a l u e s b e l o w 4 . 0 . R o o t r e s p i r a t i o n w a s s l i g h t li n c r e a s e d d u r i n g p e a k p r o t o n e x t r u s i o n ( a b o u t 25% o f t h e c o nt r o l s ) . A d d i n g o r t h o v a n a d a t e , a w e l l k n o w n i n h i b i t o r o f p l a smamembrane A T P a s e s ( 2 5 ) , t o t h e n u t r i e n t s o l u t i o n a t t hb e g i n n i n g o f t h e p H d r o p s l o w e d t h e r a t e o f pH d e c r e a s e a l m o si m m e d i a t e l y ( F i g . I A ) . T h e same e f f e c t ( n o t s h o w n i n t h e g r a p hwas a c h i e v e d w i t h e r y t h r o s i n B ( 3 0 m M ) , a n o t h e r p l a s m a l e m mA T P a s e i n h i b i t o r ( 2 0 ) , a n d w i t h ABA ( F i g . 1 A ) . DES a n d D C C D ,r e c e n t l y u s e d a s A T P a s e i n h i b i t o r s w i t h F e - d e f i c i e n t s u n f l o w er o o t s ( 3 0 ) d i d n o t p r o v e u s e f u l b e c a u s e e v e n t h e l o w c o n c e n t r at i o n s o f e t h a n o l n e e d e d f o r s o l u b i l i z a t i o n s i g n i f i c a n t l y i n t e r f e r e

6I

-C

1

01 61 2

1 4

C . MALC A C I DI0 L2a C I T M C A C I D

4D .aMt.

t i m e l h )F I G . 1 . E f f e c t o f F e d e f i c i e n c y s t r e s s o n s i m u l t a n e o u s H + - e f f l u x , f e r r ir e d u c t i o n a n d o r g a n i c a c i d c o n t e n t o f r e d p e p p e r r o o t s . F e - s u f f i c i e np l a n t s t r a n s f e r r e d t o F e - f r e e s o l u t i o n s t a r t e d r e s p o n d i n g t o F e s t r e s s a f t ea b o u t 4 d o f F e d e p r i v a t i o n ( t i m e ' z e r o ' o n a b s c i s s a ) b y d r o p p i n g t h e pHo f t h e n u t r i e n t s o l u t i o n ( A ) . V a n a d a t e o r ABA w e r e a d d e d t o t h e s o l u t i od u r i n g pH d e c r e a s e ( a r r o w s ) . A t s e l e c t e d p o i n t s o f t h e pH d r o p s w o l l e n

r o o t t i p s ( 0 - 8 mm) a n d t h e p r o x i m a l u n s w o l l e n z o n e ( 8 - 2 0 m m ) w e r ee x c i s e d a n d a n a l y z e d f o r t h e i r c a p a c i t y t o r e d u c e f e r r i c t o f e r r o u s i r o nm e a s u r e d a s F e " F e r r o z i n e ( B ) a n d f o r m a l i c ( C ) a n d c i t r i c a c i d ( D )a c c u m u l a t i o n . E x p e r i m e n t s w e r e t h e mean o f f o u r r e p l i c a t i o n s S E .

5 1 2 LANDSBERG

M 1


3/7

RHIZODERMAL TRANSFER CELLSw i t h H' e f f l u x o f r e d p e p p e r .S i m u l t a n e o u s l y w i t h pH d r o p t h e r e d u c i n g c a p a c i t y o f t h es w o l l e n r o o t z o n e i n c r e a s e d a s c o m p a r e d t o t h e p r o x i m a l u n -s w o l l e n z o n e ( F i g . 1 B ) . T h e s l i g h t r i s e s h o w n f o r t h e l a t t e r mayb e a t t r i b u t e d t o t h e p a r t i a l d e v e l o p m e n t o f new s h o r t l a t e r a l s i nt h i s a r e a .D u r i n g t h e pH d r o p t h e c o n c e n t r a t i o n o f m a l i c a n d c i t r i c a c i da l s o r o s e m a r k e d l y , p r i m a r i l y i n t h e r o o t s w e l l i n g ( F i g . 1 , C a n dD ) , w h e r e t h e s t r e s s - i n d u c e d p r o t o n e f f l u x i s l o c a t e d ( F i g . 5 ) . I tw a s a c c o m p a n i e d b y a 1 8 5 % i n c r e a s e o f P E P - c a r b o x y l a s e a c t i v i t yi n t h i s z o n e , w h i l e i n t h e p r o x i m a l u n s w o l l e n r o o t a re a t h e

e n z y m e a c t i v i t y r e m a i n e d n e a r l y c o n s t a n t .T h e s h o r t - t e r m i n c u b a t i o n i n t h e a g a r m e d i u m m a d e i t p o s s i -b l e t o e x a c t l y d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s u b a p i c a l s w e l l i n g z o n ea n d t h e a p i c a l m e r i s t e m : i n c r e a s e d H ' e f f l u x o b v i o u s l y i s r e -s t r i c t e d t o t h e f o r m e r ( F i g . 5 ) . T h e e n h a n c e d F e " ' r e d u c t i o n i sa l s o e x a c t l y c o n f i n e d t o t h e r o o t s w e l l i n g ( F i g . 6 ) . C o n t r a r y t ot h e r e s u l t s o f R o m h e l d a n d M a r s c h n e r ( 2 8 ) , w h o s t a t e d t h a t i r o nr e d u c t i o n i n r o o t s o f F e - s t r e s s e d p l a n t s a l s o t a k e s p l a c e a t t h ea p i c a l m e r i s t e m , F i g u r e 6 c l e a r l y d e m o n s t r a t e s t h e a b s e n c e o fe n h a n c e d r e d u c t i o n a t t h e a p e x . T h i s i s c o r r o b o r a t e d b y s i m i l a rr e s u l t s o b t a i n e d f o r F e d e f i c i e n t b e a n r o o t s ( 3 3 ) .

F I G . 2 . P a i r e d d a r k f i e l d ( 2 a ) a n d e p i f l u o r e s c e n c e ( 2 b ) p h o t o g r a p h s o f t h e s a m e r e d p e p p e r r o o t t i p d u r i n g F e s t r e s s r e s p o n s e . C o n t r o l r o o t o nl e f t i n e a c h p i c t u r e . S t r e s s - i n d u c e d a u t o f l u o r e s c e n c e i s c o n f i n e d t o t h e s u b a p i c a l s w o l l e n r o o t z o n e d e n s e l y c o v e r e d w i t h r o o t h a i r s . C o n t r o l ( a r r o w )d o e s n o t s h o w a u t o f l u o r e s c e n c e . M a r k e r b a r = 5 mm .F I G . 3 . F e s t r e s s - i n d u c e d a u t o f l u o r e s c e n c e i n t h e s u b a p i c a l s w e l l i n g o f a y o u n g l a t e r a l r o o t . M a r k e r b a r = 1 . 5 mm.F I G . 4 . C r o s s s e c t i o n o f s t r e s s - i n d u c e d s w o l l e n r o o t z o n e ( 3 mm b e h i n d t i p ) s h o w i n g a u t o f l u o r e s c e n c e c o n f i n e d t o t h e r h i z o d e r m a l c e l l l a y e r .M a r k e r b a r = 0 . 1 mm .F I G . 5 . F e s t r e s s - i n d u c e d H' e f f l u x f r o m s u b a p i c a l s w o l l e n r o o t z o n e o f a n i n t a c t r e d p e p p e r p l a n t . Made v i s i b l e t h r o u g h a 1 0 m i n i n c u b at i o n o ft h e r o o t i n a g a r medium m i x e d w i t h b r o m o c r e s o l p u r p l e ( p H a d j u s t e d t o 5 . 8 ) . A c i d i f i c a t i o n i s s h o w n b y t h e l i g h t a r e a ( y e l l o w i n t h e o r i g i n a l c o l o rp r i n t ) . C o n t r o l r o o t ( a t t o p ) d o e s n o t s h o w a n y a c i d i f i c a t i o n . M a r k e r b a r = 5 mm .

5 1 3

r


4/7

P l a n t P h y s i o l . V o l . 8 2 , 1 9 8 66 ~ ~ ~ ~

i9

_ I m .

F I G . 6 . F e s t r e s s - i n d u c e d f e r r i c r e d u c t i o n a l o n g a s u b a p i c a l s w o l l e n r o o t z o n e a f t e r a 1 0 m i n i n c u b a t i o n i n F e r r o z i n e t e s t s o l u t i o n . D a r k a r e a( p u r p l e - r e d c o l o r a t i o n o n t h e o r i g i n a l c o l o r p r i n t ) i n d i c a t e s f o r m a t i o n o f F e " F e r r o z i n e . C o n t r o l r o o t a t t o p d o e s n o t e x h i b i t v i s i b l e f e r r i c r e d u c t i o n .M a r k e r b a r = 5 mm .F I G . 7 . F e r r i c r e d u c t i o n s i t e o n f r e s h l y p r e p a r e d c r o s s s e c t i o n o f a s w o l l e n r o o t z o n e ( 3 mm b e h i n d t i p ) a s s h o w n i n F i g u r e 6 . D a r k a r e a s i n d i c a t eF e " F e r r o z i n e f o r m a t i o n i n t h e r h i z o d e r m i s a f t e r 1 0 m i n i n c u b a t i o n i n t e s t s o l u t i o n . M a r k e r b a r = 0 . 1 mm .F I G . 8 . C r o s s s e c t i o n o f a s w o l l e n r o o t z o n e ( 3 mm b e h i n d t i p ) m a d e 1 0 m i n a f t e r i n c u b a t i o n i n 0 . 1 s t r e n g t h F e - f r e e n u t r i e n t s o l u t i o n c o n t a i n i n g1 0 0 M m t e t r a z o l i u m s a l t N i t r o - B T a s e l e c t r o n a c c e p t o r . H i g h r e d u c i n g c a p a c i t y o f t h e r h i z o d e r m a l c e l l l a y e r i n c l u d i n g r o o t h a i r s i s i n d i c a t e d b y d a r kb l u e c o l o r a t i o n d u e t o t e t r a z o l i u m r e d u c t i o n . M a r k e r b a r = 0 . 0 5 m m .F I G . 9 . L o c u s o f f e r r i c r e d u c t i o n i n r e s p o n s e t o a l t e r n a t i n g F e d e f i c i e n c y s t r e s s . A r e a b e t w e e n a r r o w s s h o w s p r i o r r o o t s w e l l i n g w i t h f r i n g e o fs h o r t r o o t h a i r s ( f i r s t F e s t r e s s r e s p o n s e ) . P o i n t e r i n d i c a t e s c u r r e n t s i t e o f f e r r i c r e d u c t i o n ( d a r k c o l o r a t i o n d u e t o F e " F e r r o z i n e a s i n F i g . 6 ) a l o n gn e w s w e l l i n g z o n e ( s e c o n d F e s t r e s s r e s p o n s e ) . M a r k e r b a r = 5 m m.

F r e s h l y p r e p a r e d t r a n s v e r s e s e c t i o n s t a k e n f r o m t h e r o o t s w e l l -i n g i n d i c a t e t h a t t h e r e d u c t i o n s i t e s p r i m a r i l y a r e c o n f i n e d t o t h er h i z o d e r m a l c e l l l a y e r i n c l u d i n g r o o t h a i r s ( F i g . 7 ) . A s i m i l a rr e s u l t w a s o b t a i n e d u s i n g N i t r o B T , w h i c h f o r m s d a r k b l u ei n s o l u b l e d i f o r m a z a n a f t e r r e d u c t i o n i n t h e r h i z o d e r m i s ( F i g . 8 ) .T h e b i o c h e m i c a l F e s t r e s s r e s p o n s e r e a c t i o n s c l e a r l y a r e o ft r a n s i e n t n a t u r e ; w i t h i n a b o u t 8 h a f t e r p e a k p r o t o n r e l e a s e a n dp r o d u c t i o n o f r e d u c t a n t s a n d o r g a n i c a c i d s t h e v a l u e s o f e a c hc o m p o n e n t s t a r t e d r e t u r n i n g t o t h e i r i n i t i a l l e v e l s ( F i g . 1 ) , p r o b -a b l y r e s u l t i n g f r o m m o b i l i z a t i o n o f i r o n p r e c i p i t a t e d a s f e r r i ch y d r o x i d e o r f e r r i c p h o s p h a t e a t t h e r o o t s u r f a c e a n d i n t h e f r e es p a c e d u r i n g p r e c u l t u r e w i t h FeEDTA. Ne w a p i c a l g r o w t h w i t h

a ' n o r m a l ' r a t e o f e l o n g a t i o n s t a r t e d i m m e d i a t e l y . H o w e v e r , a f t e rc o n t i n u e d g r o w t h i n t h e F e E D T A - f r e e s o l u t i o n F e d e f i c i e n c yo c c u r r e d a g a i n a n d t h e d e s c r i b e d c h a n g e i n r o o t t i p m o r p h o l o g yw a s r e p e a t e d ( F i g . 9 ) . F u r t h e r m o r e , t h i s p i c t u r e d e m o n s t r a t e st h a t F e " ' r e d u c t i o n o n l y o c c u r s a t t h e n e w l y b u i l t r o o t t h i c k e n i n g .C y t o l o g i c a l R e s p o n s e t o F e D e f i c i e n c y S t r e s s . E l e c t r o n m i c r o -s c o p i c i n v e s t i g a t i o n o f F e - s t r e s s e d r o o t s r e v e a l e d t h e o c c u r r e n c eo f n u m e r o u s t r a n s f e r c e l l s i n t h e r h i z o d e r m i s a n d h y p o d e r m i s o ft h e s w o l l e n r o o t z o n e . S e r i a l s e c t i o n i n g c o n f i r m e d t h a t t h e s e c e l l sd o n o t o c c u r i n t h e m e r i s t e m a t i c z o n e o f t h e r o o t a p e x n o r i nt h e u n s w o l l e n p r o x i m a l r o o t p a r t . F i g u r e 1 0 r e p r e s e n t s a t y p i c a lr h i z o d e r m a l t r a n s f e r c e l l w i t h d e n s e c y t o p l a s m a n d l a b y r i n t h i a n

5 1 4 LANDSBERG4 . . .. L


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RHIZODERMAL TRANSFER CELLS

A

a o

F I G . 1 0 . E p i d e r m a l t r a n s f e r c e l l w i t h e x t r e m e l y e l a b o r a t e d w a l l i n g r o w t h s ( W I ) o n t h e o u t e r c e l l w a l l a n d a c c u m u l a t i o n o f m i t o c h o n d r i a ( M )( x 1 4 , 5 0 0 ) . M a r k e r b a r = 1 j A m .F I G . I 1 . E p i d e r m a l c e l l o f c o n t r o l r o o t . P l a s t i d ( P ) w i t h s t a r c h g r a i n s ( x 8 , 4 0 0 ) . M a r k e r b a r = 1 g m .F I G . 1 2 . R o o t h a i r w i t h w a l l i n g r o w t h s a n d h i g h p r o p o r t i o n o f c y t o p l a s m ( x 6 , 0 0 0 ) . M a r k e r b a r = 1 g m .

c e l l w a l l p r o t u b e r a n c e s o n t h e o u t e r t a n g e n t i a l w a l l s . R h i z o d e r -m a l c e l l s o f c o n t r o l r o o t s a r e t o t a l l y d e v o i d o f w a l l i n g r o w t h sa n d a r e h i g h l y v a c u o l a t e d ( F i g . 1 1 ) . Y o u n g r o o t h a i r s a l s o s h o wt r a n s f e r c e l l f e a t u r e s ( F i g . 1 2 ) . U n d e r s u i t a b l e d a r k f i e l d i l l u m i -n a t i o n , r o o t h a i r s o f t e n d i s p l a y e d r o t a t i o n a l c y t o p l a s m i c s t r e a m -i n g a l o n g t h e i r l o n g i t u d i n a l w a l l s .T h e c h a r a c t e r i s t i c e n r i c h m e n t i n m i t o c h o n d r i a a n d p l a s t i d s o ft r a n s f e r c e l l s i s s h o w n i n more d e t a i l i n F i g u r e 1 3 . T h e p l a s t i d sa r e l a c k i n g f u l l y d e v e l o p e d s t a r c h g r a i n s e v e n w h e n s a m p l e s w e r et a k e n f r o m p l a n t s w h i c h p e r f o r m e d t h e s t r e s s r e s p o n s e r e a c t i o n sa t t h e e n d o f t h e l i g h t p e r i o d . T h e i r o f t e n a m o e b o i d s h a p e w i t hi n v a g i n a t i o n s w h i c h s o m e t i m e s e n c i r c l e m i t o c h o n d r i a p r o b a b l yf a v o r s i n t e n s e m e t a b o l i t e e x c h a n g e . T h e p l a s t i d s o f F e s u f f i c i e n t

r h i z o d e r m a l c e l l s a r e m u c h l e s s v a r i a b l e i n s h a p e a n d a r e d e n s e l yp a c k e d w i t h s t a r c h b o d i e s ( F i g . 1 1 ) .A s s o o n a s maximum a c t i v i t y o f t h e F e s t r e s s r e s p o n s e r e a c -t i o n s d r o p s , t h e t r a n s f e r c e l l s s t a r t d e g e n e r a t i n g : t h e a m o u n t o fc y t o p l a s m d e c r e a s e s , a l a r g e c e n t r a l v a c u o l e i s f o r m e d a n d t h ec e l l w a l l p r o t u b e r a n c e s r e d i f f e r e n t i a t e t o r e m n a n t s o f t h e f o r m e rw a l l l a b y r i n t h .DISCUSSION

T h i s p a p e r d e m o n s t r a t e s t h a t t r a n s f e r c e l l f o r m a t i o n s p a t i a l l ya n d t e m p o r a l l y c o i n c i d e s w i t h t h e a c t i o n o f t h e t h r e e m a i n F es t r e s s r e s p o n s e r e a c t i o n s : p r o t o n e f f l u x , F e " ' r e d u c t i o n a n d o r -

5 1 5


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P l a n t P h y s i o l . V o l . 8 2 , 1 9 8 6

F I G . 1 3 . Hypodermal t r a n s f e r c e l l w i t h numerous mitochondriaanda m o e b o i d p l a s t i d s ( P ) (x8, 500). Marker bar=,um.g a n i c a c i d a c c u m u l a t i o n . S i n c e Fe"' r e d u c t i o n has proventobean e n z y m i c a l l y c o n t r o l l e d membrane-bound process (3), transferc e l l s a p p e a r t o b e p a r t i c u l a r l y well suited for reduction ofextra-c e l l u l a r i r o n . T h e i r extremely e n l a r g e d plasmalemma surfacel e a d s t o an i n c r e a s e d number o f F e " ' reducing sites percell.Ther o o t s u r f a c e e n l a r g e m e n t al read y achieved byenhancedroothairf o r m a t i o n i n t h i s zone ( F i g . 2 a) i s thus additionally amplified.The l a b y r i n t h i a n c e l l w a l l s y s t e m protruding far intothecyto-plasm would s h o r t e n transport d i s t a n c e s between theplasmam e m b r a n e - l o c a l i z e d redox system and the cytosolic compart-m e n t s f o r d e l i v e r y o f r e d u c t a n t power. Bienfait e t al. (3)showedt ha t t h e apparent p H o p t i m u m o f the Fe"' reducing systemisr a t h e r l o w . I n c r e a s e d tra n s - p l a s m a l e m m a ferricyanide reductionh a s b e e n shown i n response to f u s i c o c c i n which isknowna c t i v a t e H ' e f f l u x ( 8 ) . The l o c a t i o n o f both Fe"' reduction andproton pumping s i t e s i n the plasmalemma oftransfercellswouldt h u s a l l o w e f f i c i e n t coupling of th e two processes. Additionally,t h e p r o t o n m o t i v e f o r c e a r i s i n g from high proton extrusion couldb e u s e d f o r F e " uptake d i r e c t l y a t the reduction sites.The a l m o s t complete dis appearance of visible starchgrainst r a n s f e r c e l l p l a s t i d s , t o g e t h e r w i t h the increased numberofm i t o c h o n d r i a ( F i g . 1 3 ) , points to i n t e n s e carbohydrate oxidationd u r i n g s t r e s s r e s p o n s e . Probably most of the sugars transported

t o t h e r o o t s a r e i m m e d i a t e l y u s e d f o r e n e r g y d e l i v e r y o r s t o r e di n a n e a s i l y a v a i l a b l e f o r m , s o t h a t n o s t a r c h d e p o s i t s a r e r e t a i n e da s i n F e s u f f i c i e n t r o o t s . A h i g h e n e r g y t u r n o v e r w o u l d b e ap r e r e q u i s i t e n o t o n l y f o r p r o t o n e x t r u s i o n a n d o r g a n i c a c i da c c u m u l a t i o n b u t a l s o f o r s u f f i c i e n t s u p p l y o f NADPH, t h e k e ye l e c t r o n d o n o r f o r F e " ' r e d u c t i o n ( 3 3 ) .I t w a s r e c e n t l y p r o p o s e d t h a t c i t r a t e a c c u m u l a t i o n m a y c o n -t r i b u t e v i a c y t o s o l i c i s o c i t r a t e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y t o h i g hNADPH l e v e l s a n d t h u s i n c r e a s e F e " ' r e d u c t i o n ( 2 ) . T h i s c o r r e -s p o n d s w i t h t h e a c c u m u l a t i o n o f c i t r i c a c i d i n t h e s w o l l e n r o o tz o n e a n d t h e n u m e r o u s m i t o c h o n d r i a i n t r a n s f e r c e l l s s i n c e c i t r i ca c i d s y n t h e s i s t a k e s p l a c e i n t h e s e o r g a n e l l e s . I n a d d i t i o n , c i t r a t ei s w e l l k n o w n a s a s p e c i f i c c h e l a t o r f o r i r o n ( 3 7 ) a n d w o u l d t h u se n s u r e i t s l o n g d i s t a n c e t r a n s p o r t d i r e c t l y f r o m t h e s i t e s o fr e d u c t i o n a n d u p t a k e t o t h e a r e a s o f m e t a b o l i c d e m a n d . C i t r a t ea c c u m u l a t i o n u n d e r F e d e f i c i e n c y h a s b e e n t h o u g h t t o b e c a u s e db y a d e c r e a s e i n t h e a c t i v i t y o f t h e i r o n - c o n t a i n i n g m i t o c h o n d r i a le n z y m e a c o n i t a s e w h i c h m e d i a t e s t h e c o n v e r s i o n o f c i t r i c a c i dt o a c o n i t i c a c i d i n t h e K r e b s c y c l e ( 1 ) . D u r i n g a c i d i f i c a t i o n ,h o w e v e r , n o d e c r e a s e i n enzyme a c t i v i t y c o u l d b e d e t e c t e d ( E CL a n d s b e r g , u n p u b l i s h e d d a t a ) , s u g g e s t i n g t h a t a t t h i s e a r l y s t a g eo f F e d e f i c i e n c y t h e i r o n s u p p l y o f t h e m i t o c h o n d r i a i s n o t y e tm a r k e d l y i m p a i r e d . T h i s m a y a l s o b e i n d i c a t e d b y t h e s l i g h t l ye n h a n c e d r o o t r e s p i r a t i o n d u r i n g s t r e s s r e s p o n s e .T h e m a r k e d r i s e i n P E P - c a r b o x y l a s e a c t i v i t y a n d m a l a t e c o n -c e n t r a t i o n d u r i n g H' e f f l u x i n d i c a t e a n e l e v a t e d C O 2 d a r k f i x a -t i o n r a t e . T h i s c o u l d s e r v e t o r e p l e n i s h t h e K r e b s c y c l e f o ri n c r e a s e d c i t r a t e e x p o r t f r o m t h e m i t o c h o n d r i a d u r i n g s t r e s sr e s p o n s e a n d t h u s g u a r a n t e e i t s c o n t i n u e d o p e r a t i o n . I n a d d i t i o n ,t h e m a l a t e a c c u m u l a t i o n p r o b a b l y r e f l e c t s t h e a c t i o n o f a pHs t a t w h i c h w o u l d b e r e q u i r e d f o r c y t o p l a s m i c pH c o n t r o l i n t h et r a n s f e r c e l l s d u r i n g e n h a n c e d p r o t o n e x t r u s i o n . S u c h a m e c h a -n i s m h a s a l r e a d y b e e n s h o w n f o r o t h e r p h y s i o l o g i c a l processesw h e r e l a r g e pH c h a n g e s h a v e t o b e b a l a n c e d b y o r g a n i c a c i ds y n t h e s i s ( 3 5 ) .O r g a n i c a c i d a c c u m u l a t i o n w a s a l s o r e p o r t e d f o r r o o t s o f F ed e f i c i e n t g r a s s e s w h i c h d i d n o t s h o w a n y a c i d i f i c a t i o n o f t h en u t r i e n t s o l u t i o n ( 1 7 ) . H o w e v e r , a m a r k e d a c c u m u l a t i o n waso n l y d e t e c t a b l e a f t e r p r o l o n g e d F e d e f i c i e n c y w h e n s e v e r e c h l o -r o s i s h a d d e v e l o p e d ( 1 7 ) a n d r o o t g r o w t h as w e l l as r e s p i r a t i o nw e r e a l r e a d y s i g n i f i c a n t l y d i m i n i s h e d ( E C L a n d s b e r g , u n p u b -l i s h e d d a t a ) . T h e o r g a n i c a c i d b u i l d u p t h u s a p p e a r s t o b e t h er e s u l t o f a d i s t u r b e d m e t a b o l i s m r a t h e r t h a n p a r t o f a c o n t r o lm e c h a n i s m . T h i s f i t s i n t o t h e m o d e l r e c e n t l y p r o p o s e d f o r F es t r e s s r e s p o n s e o f g r a s s e s w h i c h d o e s n o t d e p e n d on a c i d i f i c a t i o na n d F e " ' r e d u c t i o n a t t h e p l a s m a l e m m a b u t r a t h e r p r i m a r i l y o np r o d u c t i o n o f p h y t o s i d e r o p h o r e s ( 2 9 ) .I t h a s b e e n s u g g e s t e d e a r l i e r t h a t t h e s t e e p d e c r e a s e i n n u t r i e n ts o l u t i o n pH u p o n F e d e f i c i e n c y o f d i c o t s i s d u e t o a n energyd r i v e n H' e f f l u x pump m e d i a t e d b y a p l a s m a m e m b r a n e A T P a s e( 1 7 , 1 8 ) . T h e i n h i b i t i o n o f pH l o w e r i n g a f t e r t r e a t m e n t w i t hv a n a d a t e a n d e r y t h r o s i n B , b o t h s p e c i f i c i n h i b i t o r s o f p l a s m a -l e m m a A T P a s e s ( 2 0 , 2 5 ) , s u p p o r t s t h i s h y p o t h e s i s . F e s t r e s s -i n d u c e d p r o t o n e x t r u s i o n i s t h o u g h t t o b e t h e most a c t i v eH+e f f l u x pump s o f a r k n o w n i n r o o t s o f i n t a c t p l a n t s ( 3 0 ) . I t h a s t ob e d i s t i n g u i s h e d f r o mH + e f f l u x c o u p l e d t o t r a n s m e m b r a n ee l e c t r o n t r a n s p o r t o f t h e F e " ' r e d u c i n g s y s t e m w h i c h t a k e s p l a c eo n l y i n t h e p r e s e n c e o f e x t r a c e l l u l a r e l e c t r o n a c c e p t o r s a n d d o e sn o t r e a c h s u c h h i g h r a t e s o fH+ e f f l u x ( 3 4 ) .Up t o n o w i t w a s n o t k n o w n w h a t s i g n a l s c o n t r o lH+ p u m p i n gi n d u c e d u p o n F e s t r e s s . T h e t r a n s f e r c e l l s c o u l d p e r h a p s f u n c t i o na s t a r g e t c e l l s f o r a h o r m o n a l c o n t r o l o f t h i s pump. A u x i n mayb e a s s u m e d t o b e i n v o l v e d h e r e i n a s i m i l a r way a s i n t h e c l a s s i c a lc o l e o p t i l e s y s t e m ( 7 ) o r i n a c i d i f i c a t i o n p e r f o r m e d b y p e a r o o tm i c r o s o m a l v e s i c l e s( 1 1 ) . The d e c r e a s e d r a t e o fH+ e f f l u x upont r e a t m e n t o f F e d e f i c i e n tp lants w i t h ABA(Fig.1A) m i g h ti n d i r e c t l y a r g u e f o r t h i s assumption since ABA h a s b e e n s h o w n

5 1 6 LANDSBERG


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RHIZODERMAL TRANSFER CELLSt o a n t a g o n i z e a u x i n - i n d u c e d H+ e f f l u x i n o a t c o l e o p t i l e s o r r a p ep r o t o p l a s t s ( 2 6 , 3 2 ) . F u r t h e r m o r e , a d e c r e a s e i n F e s t r e s s - i n d u c e dH+ e f f l u x w a s o b s e r v e d u p o n t r e a t m e n t o f F e d e f i c i e n t p l a n t sw i t h TIBA ( 1 7 , 1 9 ) , a p r e s u m e d i n h i b i t o r o f p o l a r a u x i n t r a n s p o r tw h i c h a l s o p r e v e n t s t h e d e v e l o p m e n t o f a u x i n - m e d i a t e d H +e f f l u x d u r i n g g r a v i t r o p i c c u r v a t u r e o f r o o t s a n d p h o t o t r o p i cc u r v a t u r e o f s p o r o p h y t e s ( 9 , 2 2 ) . I t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a tt h e c h a n g e s i n o r g a n i c a c i d s w h i c h o c c u r d u r i n g F e s t r e s s r e -s p o n s e c o u l d b e s u b j e c t t o a s i m i l a r h o r m o n a l c o n t r o l m e c h a -n i s m : a u x i n h a s b e e n s h o w n t o s t i m u l a t e m a l i c a c i d s y n t h e s i sd u r i n g H+ e f f l u x f r o m e l o n g a t i n g o a t c o l e o p t i l e s e g m e n t s a s w e l la s c i t r a t e s y n t h a s e p u r i f i e d f r o m b e a n r o o t t i p s ( 1 2 , 3 1 ) . M o r ed e t a i l e d r e s e a r c h o n a p o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f h o r m o n e s i n t h er e g u l a t i o n o f F e s t r e s s r e s p o n s e i n c l u d i n g t r a n s f e r c e l l d i f f e r e n t i a -t i o n s e e m s h i g h l y d e s i r a b l e .A n o t h e r i n t e r e s t i n g f e a t u r e o f F e s t r e s s - i n d u c e d t r a n s f e r c e l l so f r e d p e p p e r i s t h e i r s t r o n g a u t o f l u o r e s c e n c e ( F i g s . 2 - 4 ) . Tod a t e , o n e c a n o n l y s p e c u l a t e o n t h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h e s ef l u o r e s c i n g s u b s t a n c e s : s i n c e s i d e r o p h o r e c o m p o u n d s o f p h e n o l i ca c i d t y p e a r e k n o w n f o r t h e i r t y p i c a l a u t o f l u o r e s c e n c e u n d e r UVl i g h t ( 1 0 ) , s i m i l a r i r o n c h e l a t i n g p h e n o l i c s may b e s y n t h e s i z e db y t r a n s f e r c e l l s a n d , b y a n a l o g y t o s o i l f u n g i , e x c r e t e d i n t o t h es o i l s o l u t i o n . E n h a n c e d e x u d a t i o n o f a l i g h t - b l u e f l u o r e s c i n gc o m p o u n d b y r o o t s o f F e e f f i c i e n t s o y b e a n s w a s r e p o r t e d e a r l i e r( 6 ) . A p h e n o l i c F e l i g a n d e x c r e t e d b y F e - s t r e s s e d t o m a t o r o o t sh a s b e e n f o u n d b y O l s e n e t a l . ( 2 4 ) . B i n d i n g t o s u c h e n d o g e n o u sc h e l a t o r s w o u l d p r e v e n t r a p i d p r e c i p i t a t i o n o f f e r r i c i o n s i n t h er h i z o s p h e r e a n d t h u s a i d t h e i r t r a n s p o r t a t l e a s t t h r o u g h t h e f r e es p a c e o f t h e l a b y r i n t h i a n c e l l w a l l s y s t e m t o t h e a c t u a l r e d u c t i o na n d u p t a k e s i t e s a t t h e p l a s m a m e m b r a n e . F u r t h e r s t u d i e s a r en e e d e d t o i d e n t i f y t h e c h e m i c a l s t r u c t u r e o f t h e f l u o r e s c e n tc o m p o u n d s a n d t o i n v e s t i g a t e t h e i r r o l e i n t h e F e s t r e s s r e s p o n s eo f t r a n s f e r c e l l s .

A c k - n o v i l e d g r n e n t s - T h e a u t h o r i s i n d e b t e d t o M r s . U . O r t m a n n a n d M r s . C .W o l f r a m - W i e n b e r g f o r e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .LITERATURE CITED

1 . BACON J S D . PC D E K O C K . J P A L M E R 1 9 6 1 A c o n i t a s e l e v e l s i n t h e l e a v e s o fi r o n - d e f i c i e n t m u s t a r d p l a n t s ( S i n a p i s a l h a ) . B i o c h e m J 8 0 : 6 4 - 7 02 . B I E N F A I T H F , PC S I J M O N S 1 9 8 4 B i o c h e m i c a l b a s i s o f F e e f f i c i e n c y i n d i c o t y -l e d o n o u s p l a n t s . I n P r o c e e d i n g s o f t h e V l t h I n t e r n a t i o n a l C o l l o q u i u m f o rt h e O p t i m i z a t i o n o f P l a n t N u t r i t i o n , M o n t p e l l i e r , F r a n c e , p p 1 5 - 1 63 . B I E N F A I T H F . R J B I N O . AM VAN DER B I J E K , J F D u I V E N V O O R D E N . JM F o U N -T A I N E 1 9 8 3 C h a r a c t e r i z a t i o n o f f e r r i c r e d u c i n g a c t i v i t y i n r o o t s o f F e - d e f i c i e n tP h , a s e o 1 l u s i ' l g a r i s . P h y s i o l P l a n t 5 9 : 1 9 6 - 2 0 24 . B R A D F O R D MM 1 9 7 6 A r a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r t h e q u a n t i t a t i o n o fm i c r o g r a m q u a n t i t i e s i n p r o t e i n u t i l i z i n g t h e p r i n c i p l e o f p r o t e i n - d y e b i n d -i n g . A n a l B i o c h e m 7 2 : 2 4 8 - 2 5 45 . BROWN J C 1 9 7 8 M e c h a n i s m o f i r o n u p t a k e b y p l a n t s . P l a n t C e l l E n v i r o n 1 :2 4 9 - 2 5 76 . BROWN J C , RS H O I M E S . LO T I F F I N 1 9 6 1 I r o n c h l o r o s i s i n s o y b e a n s a s r e l a t e dt o t h e g e n o t y p e o f r o o t s t a l k . 3 . C h l o r o s i s s u s c e p t i b i l i t y a n d r e d u c t i v e c a p a c i t ya t t h e r o o t . S o i l S c i 9 1 : 1 2 7 - 1 3 27 . C L E L A N D RE 1 9 8 2 T h e m e c h a n i s m o f a u x i n - i n d u c e d p r o t o n e f f l u x . I n PFW a r i n g , e d . P l a n t G r o w t h S u b s t a n c e s 1 9 8 2 . A c a d e m i c P r e s s , Ne w Y o r k , p p2 3 - 3 18 . C R A I G T A , FL CRANE 1 9 8 5 R e d o x p o t e n t i a l o f t h e d o n o r a n d t h e H+ r e l e a s eo f t h e t r a n s p l a s m a l e m m a r e d o x s y s t e m o f c a r r o t c e l l s . P l a n t P h y s i o l 7 7 : S -1 4 59 . E L L I S JG I V . R J THOMAS 1 9 8 5 P h o t o t r o pi s m o f P e / l i a : e v i d e n c e f o r m e d i a t i o nb y a u x i n - s t i m u l a t e d a c i d e f f l u x . J P l a n t P h y s i o l 1 2 1 : 2 5 9 - 2 6 4

1 0 . F E K E T E F A , J T S P E N C E , T E M E R Y 1 9 8 3 A r a p i d a n d s e n s i t i v e p a p e r e l e c t r o -p h o r e s i s a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f m i c r o b i a l s i d e r o p h o r e s e l i c i t e d i n s o l i d -p l a t i n g c u l t u r e . A n a l B i o c h e m 1 3 1 : 5 1 6 - 5 1 91 1 . G A B A T H U L E R R , RE C L E L A N D 1 9 8 5 A u x i n r e g u l a t i o n o f a p r o t o n t r a n s l o c a t i n gA T P a s e i n p e a r o o t p l a s m a m e m b r a n e v e s i c l e s . P l a n t P h y s i o l 7 9 : 1 0 8 0 - 1 0 8 51 2 . HASCHKE H P , U L U C T T G E 1 9 7 5 S t o i c h i o m e t r i c c o r r e l a t i o n o f m a l a t e a c c u m u -l a t i o n w i t h a u x i n - d e p e n d e n t K + - H + e x c h a n g e a n d g r o w t h i n A v e n a c o l e o p t i l es e g m e n t s . P l a n t P h y s i o l 5 6 : 6 9 6 - 6 9 81 3 . KRAMER D 1 9 7 8 T r a n s f e r c e l l s i n t h e e p i d e r m i s o f r o o t s o f t h e h a l o p h y t eA t r i p l e x h a s t a t a L . N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 6 5 : 3 3 91 4 . KRAMER D 1 9 8 3 T h e p o s s i b l e r o l e o f t r a n s f e r c e l l s i n t h e a d a p t a t i o n o f p l a n t st o s a l i n i t y . P h y s i o l P l a n t 5 8 : 5 4 9 - 5 5 51 5 . KRAMER D , V R O M H E L D , EC L A N D S B E R G , H MARSCHNER 1 9 8 0 I n d u c t i o n o ft r a n s f e r - c e l l f o r m a t i o n b y i r o n d e f i c i e n c y i n t h e r o o t e p i d e r m i s o f H e l i a n t h u sa n n i u z i s L . P l a n t a 1 4 7 : 3 3 5 - 3 3 91 6 . L A N D S B E R G EC 1 9 7 9 E i n f l u f d e s S a u r e s t o f f w e c h s e l s u n d d e r N i t r a t r e d u k t i o na u f E i s e n m a n g e l - b e d i n g t e V e r a n d e r u n g e n d e s S u b s t r a t - p H - W e r t e s b e i mon-o k o t y l e n u n d d i k o t y l e n P f l a n z e n a r t e n . PhD t h e s i s . T e c h n i c a l U n i v e r s i t y o fB e r l i n1 7 . L A N D S B E R G EC 1 9 8 1 O r g a n i c a c i d s y n t h e s i s a n d r e l e a s e o f h y d r o g e n i o n s i nr e s p o n s e t o F e d e f i c i e n c y s t r e s s o f mono- a n d d i c o t y l e d o n o u s p l a n t s p e c i e s .J P l a n t N u t r 3 : 5 7 9 - 5 9 11 8 . L A N D S B E R G EC 1 9 8 2 T r a n s f e r c e l l f o r m a t i o n i n t h e r o o t e p i d e r m i s : A p r e r e q -u i s i t e f o r F e e f f i c i e n c y ? J P l a n t N u t r 5 : 4 1 5 - 4 3 21 9 . L A N D S B E R G EC 1 9 8 2 S h o o t - r o o t i n t e r a c t i o n s i n t h e r e g u l a t i o n o f F e - d e f i c i e n c ys t r e s s - i n d u c e d H+ e f f l u x f r o m s u n f l o w e r r o o t s . I n A S c a i f e , e d , P l a n t N u t r i -t i o n 1 9 8 2 , P r o c e e d i n g s o f t h e N i n t h I n t e r n a t i o n a l P l a n t N u t r i t i o n C o l l o -q u i u m , C o m m o n w e a l t h A g r i c u l t u r a l B u r e a u x , p p 3 1 0 - 3 1 52 0 . MARRE M T , G R O M A N I , E MARRE 1 9 8 3 T r a n s m e m b r a n e h y p e r p o l a r i s a t i o na n d i n c r e a s e o f K + u p t a k e i n m a i z e r o o t s t r e a t e d w i t h p e r m e a n t w e a k a c i d s .P l a n t C e l l E n v i r o n 1 : 2 4 9 - 2 5 72 1 . D e l e t e d i n p r o o f .2 2 . MULKEY J T , ML E V A N S 1 9 8 2 S u p p r e s s i o n o f a s y m m e t r i c a c i d e f f l u x a n dg r a v i t r o p i s m i n m a i z e r o o t s t r e a t e d w i t h a u x i n t r a n s p o r t i n h i b i t o r s o r s o d i u mo r t h o v a n a d a t e . J P l a n t G r o w t h R e g u l 1 : 2 5 9 - 2 6 52 3 . O L S E N R A , J C BROWN 1 9 8 0 F a c t o r s r e l a t e d t o i r o n u p t a k e b y d i c o t y l e d o n o u sa n d m o n o c o t y l e d o n o u s p l a n t s . I I . T h e r e d u c t i o n o f F e 3 " a s i n f l u e n c e d b yr o o t s a n d i n h i b i t o r s . J P l a n t N u t r 2 : 6 4 7 - 6 6 02 4 . O L S E N R A , JH B E N N E T , D B L U M E , J C BROWN 1 9 8 1 C h e m i c a l a s p e c t s o f t h eF e s t r e s s r e s p o n s e m e c h a n i s m i n t o m a t o e s . J P l a n t N u t r 3 : 9 0 5 - 9 2 12 5 . O ' N E I L L S D , RM S P A N S W I C K 1 9 8 4 E f f e c t s o f v a n a d a t e o n t h e p l a s m a m e m -b r a n e A T P a s e o f r e d b e e t a n d c o r n . P l a n t P h y s i o l 7 5 : 5 8 6 - 5 9 12 6 . R A Y L E DL 1 9 7 3 A u x i n - i n d u c e d h y d r o g e n - i o n s e c r e t i o n i n A v e n a c o l e o p t i l e sa n d i t s i m p l i c a t i o n s . P l a n t a 1 1 4 : 6 3 - 7 32 7 . ROMHELD V , D KRAMER 1 9 8 3 R e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r o t o n e f f l u x a n d r h i z o -d e r m a l t r a n s f e r c e l l s i n d u c e d b y i r o n d e f i c i e n c y . Z P f l a n z e n p h y s i o l 1 1 3 : 7 3 -8 32 8 . ROMHELD V . H MARSCHNER 1 9 8 3 M e c h a n i s m o f i r o n u p t a k e b y p e a n u t p l a n t s .I . F e " ' r e d u c t i o n , c h e l a t e s p l i t t i n g , a n d r e l e a s e o f p h e n o l i c s . P l a n t P h y s i o l 7 1 :9 4 9 - 9 5 42 9 . ROMHELD V , H MARSCHNER 1 9 8 6 E v i d en c e f o r a s p e c i f i c u p t a k e s y s t e m f o ri r o n p h y t o s i d e r o p h o r e s i n r o o t s o f g r a s s e s . P l a n t P h y s i o l 8 0 : 1 7 5 - 1 8 03 0 . ROMHELD V , C M U L L E R , H MARSCHNER 1 9 8 4 L o c a l i z a t i o n a n d c a p a c i t y o fp r o t o n pumps i n r o o t s o f i n t a c t s u n f l o w e r p l a n t s . P l a n t P h y s i o l 7 6 : 6 0 3 - 6 0 63 1 . S A R K I S S I A N I V 1 9 7 2 M o d i f i c a t i o n o f e n z y m e a c t i v i t y , c o n f o r m a t i o n a n d s i z eb y i n d o l e a c e t i c a c i d . I n D J C a r r , e d , P l a n t G r o w t h S u b s t a n c e s 1 9 7 0 . S p r i n g e r ,B e r l i n , p p 2 6 5 - 2 7 13 2 . S C H U B E R T S , H MATZKE 1 9 8 5 I n f l u e n c e o f p h y t o h o r m o n e s a n d o t h e r e f f e c t o r son p r o t o n e x t r u s i o n b y i s o l a t e d p r o t o p l a s t s f r o m r a p e l e a v e s . P h y s i o l P l a n t6 4 : 2 8 5 - 2 8 93 3 . S I J M O N S P C . H F B I E N F A I T 1 9 8 3 S o u r c e o f e l e c t r o n s f o r e x t r a - c e l l u l a r F e ( I I I )r e d u c t i o n i n i r o n - d e f i c i e n t b e a n r o o t s . P h y s i o l P l a n t 5 9 : 4 0 9 - 4 1 5

3 4 . S I J M O N S P C , F C L A N F E R M E I J E R , AH DE B O E R , HBA P R I N S , HF B I E N F A I T 1 9 8 4D e p o l a r i z a t i o n o f c e l l m e m b r a n e p o t e n t i a l d u r i n g t r a n s - p l a s m a m e m b r a n ee l e c t r o n t r a n s f e r t o e x t r a c e l l u l a r e l c t r o n a c c e p t o r s i n i r o n - d e f i c i e n t r o o t s o fP l i a s e o l u s w u l g a r i s L . P l a n t P h y s i o l 7 6 : 9 4 3 - 9 4 63 5 . S M I T H F A , J A RAVEN 1 9 7 9 I n t r a c e l l u l a r pH a n d i t s r e g u l a t i o n . Annu R e vP l a n t P h y s i o l 3 0 : 2 8 9 - 3 1 13 6 . S M I T H AM, T AP R E E S 1 9 7 9 P a t h w a y s o f c a r b o h y d r a t e f e r m e n t a t i o n i n t h er o o t s o f m a r s h p l a n t s . P l a n t a 1 4 6 : 3 2 7 - 3 3 43 7 . T I F F I N LO 1 9 6 6 I r o n t r a n s l o c a t i o n . I I . C i t r a t e / i r o n r a t i o s i n p l a n t s t e me x u d a t e s . P l a n t P h y s i o l 4 1 : 5 1 5 - 5 1 8

5 1 7

capsicum annuum - fe stress

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