blat de moro_de_laboratori
TRANSCRIPT
Carla Badia
Laura Monton
Natàlia Muñoz
Maria Vilà
INTRODUCCIÓ
En aquest treball us volem presentar la pràctica, realitzada allaboratori de Biotecnologia Vegetal Aplicada de l’EscolaTècnica Superior d’Enginyeria Agrària de la Universitat deLleida, sobre el processament de les mostres d’ADN perconèixer la seva qualitat i la possibilitat de posteriorsaplicacions en el camp de la transgènesi.
L’ADN, o àcid desoxirribonucleic, és la molècula que conté la informació
genètica de tots els éssers vius, amb excepció d’alguns virus.
Guió del procediment de la pràctica:
1.Procés d’extracció d’ADN:
- Lisi inicial de les cèl·lules de la mostra.- Separació del ADN de la resta de molècules de la
cèl·lules.
2. Anàlisi de la mostra d’ADN per conèixer el seu estat:
- Electroforesi- Transil·luminador
3. Aplicació de diverses tècniques relacionades amb latransgènesi a la mostra en bon estat.
1.EXTRACCIÓ D’ADN
1. Prenem les mostres (fulles de blat de moro) i les
congelem en nitrogen líquid.
Tallant i pesant les mostres per
tal de que mesurin aprox. uns
20 grams.
-A partir d’una fulla de blat de moro,
tallem 4 fragments que aproximadament
pesessin uns 20 grams.
-Els emboliquem amb paper d’alumini per
tal de tenir la mostra controlada i evitar
que s’esmicolin, quan les posem en
Nitrogen líquid.
- Aboquem una certa quantitat
de nitrogen líquid del tanc gran
a un petit bidó per poder
treballar amb més comoditat.
Hem de vigilar de no tocar el
nitrogen líquid perquè ens
podríem cremar.
- Col·loquem les 4 mostres dins
del bidó i les hi deixem durant
un minut.
Tanc de nitrogen líquid
Bidó de nitrogen líquid
2. Triturem les mostres congelades amb l’ajuda d’un
morter, i en presència de nitrogen líquid, fins a obtenir
una pols fina.
-Amb l’ajuda d’unes pinces
agafem les mostres de
l’interior del bidó.
-Les desemboliquem i en
posem una a cada morter.Morter i espàtula
Traient les
mostres del bidóDesembolicant
una mostra
- Afegim nitrogen líquid dins del
morter junt amb la mostra i el
comencem a triturar. Cal afegir
nitrogen al morter cada cop que
s’hagi evaporat per tal que no es
degradi l’ADN.
- Cal repetir l’operació anterior
fins que la mostra quedi
totalment una pols fina.
Triturant les fulles de blat
de moro amb el nitrogen
líquid.
3. Transferim la pols a un tub i hi afegim tampó
d’extracció.
El tampó d’extracció és una solució que conté detergents i sals, entre
altres compostos, que provocaran la disrupció de les membranes
cel·lulars i el trencament de les cèl·lules de la mostra.
- Amb una espàtula de metall, passem la
pols que tenim al morter cap al tub.
- Amb una pipeta afegim tampó
d’extracció al tub on ja hi tenim la pols
transferida.
Passant la pols del morter al tub.
4. Barregem bé la mostra i la deixem en agitació.
- Barregem bé la mostra amb el tampó d’extracció. Per tal
que quedi tot ben barrejat, utilitzem l’aparell que es veu
en la fotografia.
- Un cop barrejat, ho deixem
en agitació durant 10 minuts.
Barrejant la mostra.
En agitació durant 10 minuts.
5. Incubem els tubs a 65ºC durant 10 minuts.
- Després de 10 minuts en agitació,
posem els tubs a la incubadora a 65ºC
durant 10 minuts.
- La temperatura de la incubadora es
regula segons la temperatura de
l’aigua que hi ha, i els tubs es
mantenen al bany maria.
- La temperatura elevada agilitza el procés de disrupció cel·lular.
Incubadora amb els tubs.
6. Realitzem una extracció amb fenol-cloroform.
- Aquest procediment permet retirar les
proteïnes de la mostra, juntament amb
altres restes cel·lulars.
El fenol-cloroform desnaturalitza les proteïnes que s’han alliberat
a la dissolució amb el trencament de les cèl·lules, i que podrien
lligar-se a l’ADN o degradar-lo, en el cas d’alguns enzims.
Fenol-cloroform que vam utilitzar a la pràctica
Ribonucleasa, més coneguda com RNAsa, és un
enzim (nucleasa) que catalitza la hidròlisi d'ARN en
components més petits. Poden classificar-se en
endonucleases i exonucleases, i comprenen diverses
subclasses dins de les classes d'enzims EC 3.1
7. Tractament amb RNAsa durant una hora a 37ºC.
8. Repetim l’extracció amb fenol-cloroform per
retirar l’enzim RNAsa de la mostra. Obtindrem una
solució aquosa on hi haurà bàsicament ADN i
diverses sals.
9. Afegim isopropanol a la solució aquosa.
- L’ADN no és soluble en alcohol i, per tant, l’addició d’isopropanol
provoca la precipitació d’aquest. Quan precipita, les diferents
molècules d’ADN de la mostra s’agrupen formant un aglomerat que,
si hi ha prou quantitat, es fa visible amb un color blanquinós.
Afegint l’isopropanol.
L' isopropanol és un alcohol incolor, inflamable, amb una olor intensa.
És molt miscible amb l’aigua. La seva fórmula química semi
desenvolupada és H3C-HCOH-CH3. És l’exemple més senzill
d’alcohol sencundari, on el carboni del grup de l’alcohol està unit als
altres dos carbonis. És un isòmer del propanol.
L' isopropanol s’utilitza molt en la neteja de les lents d’objectius
fotogràfics i contactes d’aparells electrònics, ja que no deixa marques
i és de ràpida evaporació.
La seva obtenció es dóna per mitjà de l’oxidació del propè amb àcid
sulfúric o per hidrogenització de l’acetona.
Fórmula química
de l’ isopropanol
10. Efectuem una etapa de rentat amb una solució
d’etanol al 70% per tal de retirar part de les sals
associades a l’ADN.
11. Retirem l’etanol i diluïm l’ADN en el volum
d’aigua que desitgem.
12. Agafem l’ADN precipitat amb l’ajuda d’una
pipeta, i el dissolem en el volum d’aigua que
desitgem.
2. ANÀLISI DE LA MOSTRA DE DNA: ELECTROFORESI
Tècnica de l’electroforesi
Consisteix en introduir una mostra del nostre ADN en un gel porós (geld’agarosa) sota l’influencia d’un camp elèctric que provocarà eldesplaçament de les molècules d’ ADN a través del gel.
Les molècules d’ADN estan carregades negativament, de manera quees desplaçaran cap al pol positiu. Totes les molècules d’ ADN tenen lamateixa càrrega per unitat de mida, i per tant el seu desplaçament através del gel depèn del tamany de la molècula.
En acabar l’electroforesi tindrem un gel on es trobaran separades les diferents molècules d’ ADN segons la seva mida, distribuïdes en diferents bandes.
Per dur a terme una electroforesi, primer cal preparar el gel i les mostres:
Preparació del gel d’agarosa
L’agarosa és un polímer que a temperatures elevades es troba en estat
líquid i quan es deixa refredar adquireix una consistència gelosa.
Agafem agarosa en pols i el tampó TBE i afegim aigua destil·lada.
Posem la mostra al microones per tal d’escalfar-la a uns 50-60ºC, per
obtenir-ne una consistència líquida.
Afegim el bromur d’etidi:
El bromur d’etidi es lliga a l’ADN tot intercalant-se amb les bases dels àcids
nucleics, i produeix fluorescència de color taronja - vermell en exposar-se a
la llum ultraviolada, cosa que permet detectar la presència de l’ADN dins el
gel en passar la mostra resultant de l’electroforesi pel transil·luminador.
El deixem refredar una mica, procurant que encara no agafi consistència
gelatinosa.
Omplim el motlle en el que es dura a terme l’electroforesi.
Quan el gel ha adquirit la consistència gelatinosa, omplim la cubeta amb
buffer d’electroforesi, que és l’encarregat de donar unes condicions
òptimes per tal de que les molècules d’ADN puguin córrer a través del gel.
Barrejant l’agarosa, el
tampó i l’aigua
destil·lada, en calent.
Pesant la pols d’agarosa.
Preparació de les mostres
Per preparar les mostres barregem l’ADN amb tampó de càrrega, cosa que
permet que la mostra caigui directament al pou, quan és injectada en el
gel, i que en canvi no es dissolgui amb el buffer d’electroforesi.
Preparem cinc mostres de les quals dos estan formades per ADN no
transgènic, dos per ADN convencional i la última per un marcador de pes
molecular.
EL MARCADOR DE PES MOLECULAR
És una dissolució que conté una barreja de molècules d’ADN amb unes
mides determinades, de manera que després de l'electroforesi formen un
patró de bandes concret que ens serveix per conèixer la mida de les
bandes de les nostres mostres mitjançant la comparació de les mostres
Preparant la mostra: en la primera imatge, col·locant el
tampó de carrega i en la segona les mostres d’ADN en si.
Procedim a introduir les mostres en el gel d’agarosa, muntem el kit
d’electroforesi i el posem en funcionament durant 30 minuts
aproximadament.
Introduint les mostres un cop
ja han estat preparades en el
gel d’agarosa.
Kit d’electroforesi ja muntat
i en ple funcionament.
Transil·luminador
En acabar el procediment, introduïm el gel en un transil·luminador que ens
permetrà obtenir una visió de les bandes d’ADN dins del gel, i
posteriorment analitzem els resultats obtinguts.
Introduint del motlle
resultant de l’electroforesi en
el transil·luminador.
Els resultats obtinguts gràcies al transil·luminador ens permeten veure
l’estat de l’ADN de les mostres.
En la imatge obtinguda, podem veure que les tres primeres mostres
començant per l’esquerra són molt deficients en quan a qualitat de l’ADN,
ja que és una molècula que té un pes molt elevat, i per tant si queda per
sota vol dir o que està degradat o que no és ADN sinó que és ARN.
En les dues últimes mostres, el resultat és òptim ja que les mostres es
queden a dalt, cosa que vol dir que pesen més i que per tant són mostres
formades per ADN en bon estat. A partir d’aquí treballarem amb les
mostres que ens han donat el millor resultat.
El cas que totes ens haguessin sortit deficients, hauríem de tornar a fer
l’extracció d’ADN.
Resultats
Imatge del motlle resultant de
l’electroforesi obtinguda amb el
transil·luminador.
3. APLICACIÓ DE
DIVERSES TÈCNIQUES RELACIONADES AMB LA TRANSGÈNESI A LA MOSTRA EN BON ESTAT
Tècniques relacionades amb la transgènesi a la mostra en bon estat
Presentem a continuació les principals opcions que tenim:
Si volem comprovar si la planta, de la que hem extret l’ADN, éstransgènica o no, podem fer una PCR que ens permet amplificar laseqüència d’ADN del transgen.
Si dessitgem aïllar un gen "X" del genoma de la planta per exempleper caracteritzar-lo, també faríem una PCR.
Per saber, en cas que es tracti d'una planta transgènica, si eltransgen s'ha integrat en un sol lloc del genoma o, si per contra,tenim diverses còpies del transgen repartides en diferents posicionsdel genoma de la planta, es podria realitzar un Southern Blot.
PCR:
SOUTHERN BLOT:
Reacció en cadena de la polimerasa:
És una tècnica de biologia molecular desenvolupada en 1986, amb
l’objectiu d’obtenir un gran nombre de copies d’un fragment d’ADN
particular.
És una tècnica de biologia molecular que té com a objectiu hibridar
un fragment d’una cadena d’ADN amb una sonda marcada d’ADN
complementari per a facilitar la seva detecció i estudi.
Valoració
Un cop acabat el treball, tot el grup participant coincidim en la nostra opinió:
-Realitzar un treball relacionat amb els transgènics, amb una part pràctica
que, a més, ha estat realitzada en un laboratori específic, ens ha aportat
una visió molt diferent de la que teníem sobre el tema.
-Després de realitzar la pràctica, recopilar les dades i fer el treball, podem
dir que hem pogut gaudir d’una experiència molt interessant.
-Hem treballat amb gent molt qualificada que en tot moment ha donat
resposta a tots els nostres dubtes, hem après tècniques de laboratori, com
manipular aparells específics i productes nocius i hem satisfet els objectius
principals de la nostra participació en aquest projecte.
Per tot això la nostra valoració és absolutament positiva.
Agraïments
Volem agrair:
A l’Eduard Pérez Massot i la Gemma Farré Martínez, investigadors delGrup de Biotecnologia Vegetal Aplicada de l’Escola Tècnica Superiord’Enginyeria Agrària de la Universitat de Lleida, per mostrar-nos com és laseva feina al laboratori, amb tanta dedicació i paciència, i deixar-nos-hiparticipar.
A en Jordi Bermúdez Mas, del Departament de Ciències Fisiològiques II de la Universitat de Barcelona, que com a coordinador del projecte Investiga la Ciència de la Societat Catalana de Biologia, s’ha preocupat per atendre les nostres demandes i ha fet tot el possible per facilitar-nos la nostra participació en aquest projecte.
A la Fundación Española para la Ciencia y la Tecnologia (FECYT) que ha posat els mitjans econòmics per a que el projecte sigui una realitat.
