biotek farmasi

Bioteknologi Farmasi

Penanggung jawab: Dr Amarila Malik

Departemen Farmasi FMIPA-Universitas Indonesia

FAR 405412 SKS

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Softwarehttp://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

SASARAN PEMBELAJARAN:

Mengetahui konsep-konsep dalam bioteknologi,

keterkaitan beberapa disiplin ilmu dalam

bioteknologi, teknologi rekayasa biologi organisme,

teknologi DNA rekombinan/rekayasa genetika,

pemanfaatan bioteknologi dalam bidang farmasi,

dan penerapan bioteknologi dalam upaya

pemeliharaan kesehatan masyarakat.


PUSTAKA :

•Wink, M. (Ed). An introduction to Molecular Biotechnology, 2006

•Glick, B.R & Paternak, J.J, 1998. Molecular Biotechnology, Principles

and Applications of Recombinant DNA, ASM Press.

•Jognson & Manasse, 1993. Biotechnology in Pharmacy, John E.

Smith, 1985. Biotechnology Principles, Van Nostrand Reinhold (UK)

•Wulf Crueger and Annelies Crueger, 1984. Biotechnology A Text Book of Industrial Microbiology. Sinaeur Association Inc. Sunderland,

MA, USA

•J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989. Moleculer Cloning A

Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Pres, USA

•James D. Watson, John Tooze, Davit T.Kurtz, 1983. Recombinant

DNA, Scientific American Books, New York, USA

•Indra K. Vasil, 1990. Biotechnology, Science, Education, 2nd Commercialization (Editor), Elsevier Scientific Publish. Co.Inc.


Pokok-pokok Bahasan

•Pendahuluan

•Konsep-konsep dalam bioteknologi dan prospeknya dalam

bidang farmasi,

•Disiplin ilmu yang terkait dalam bioteknologi,

•Teknologi bioproses

•Pengembangan galur berpotensi dalam bidang farmasi:

fermentasi dan kinetikanya, proses hilir

•Materi genetik

•Rekayasa genetika dan Teknologi DNA rekombinan

•Terapi gen pada manusia,

•Pemanfaatan organisme prokariot dan eukariot dalam bidang

farmasi,

•Keamanan hayati produk rekayasa genetika dan bioetik.


• Pendahuluan - Bioteknologi Farmasi

• Dampak bioteknologi terhadap bidang farmasi

• Rekayasa genetika-rekombinasi DNA –kloning gen

• Aplikasi teknik molekular

• Produk komersial dari mikroorganisma

• Terapi Gen

Overview


BIOTEKNOLOGI FARMASI

Definisi: Aplikasi dari bioteknologi dalam farmasi

àDampak terhadap : obat-obatandiagnostikvaksin

BIOTEKNOLOGI:

- Pemanfaatan mikroorganisme untuk memproduksi produk-produk yang

penting dan Bermanfaat : protein dan enzim

-Rekayasa genetika hewan dan tanaman agar menghasilkan protein asing

tertentu, juga senyawa kimia lainnya, spt. Vitamin

à Diperlukan “molecular basic knowledge”


PATOFISIOLOGI PENYAKIT

DRUG ACTION

IDENTIFIKASI DAN PRODUKSI TARGET OBAT: RESEPTOR, ENZIM

UNTUK DRUG DISCOVERY DAN DRUG DESIGN


TEKNIK DASAR BIOTEKNOLOGI BERBASIS BIOLOGI MOLEKULER

ORGANISME REKOMBINAN

Human insulin (1978):produk farmasi pertama hasil rekayasa genetika

Sepotong DNA penyandi hormon insulin manusia

Transfer ke mikroorganisme : E. coli

Kontrol ekspresi Human insulin di E. coli

Gene cloning

Teknik : Rekayasa GenetikaGenetically modified/genetically engineered

1994:21 produk farmasi turunan teknologi rekombinasi DNA

150 produk dalam taraf “clinical trial”


Dampak Bioteknologi terhadap Farmasi

TUGAS:

Cari apa saja dampak bioteknologi terhadap farmasi.Diskusikan per kelompokCari protein-protein yang diproduksi secara teknologi

DNA rekombinan

Terhadap profesi farmasis:

àisu-isu ke arah farmakoekonomi dan etika (sosial)

àMenjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat-obat dan efek/akibat penanganan yang tidak tepat


DAMPAK BIOTEKNOLOGI

TERHADAP BIDANG FARMASI

I. Obat – obatan berupa protein dan peptide

• stabilitas, formulasi, penyimpanan, efek samping berbeda dengan obat –obat yang berupa molekul, kecil

Contoh : suhu refrigerator ; tidak boleh terkocok

II. Pilihan produk biotek ( protein & peptida).

• Pertimbangan sistem ekspresi

• Sistem ekspresi berbeda, maka produk sedikit berbeda


III. Obat – obat kelas baru yang beredar di pasaran

• Pemahaman patofisiologi penyakit yang sebelumnya tidak dapat

diatasi .

Contoh : human insulin ( HumulinR Lilly ) ; Hep B-vaccine

(Engerix – BR Smith Kline Beecham)

IV. Agents diagnostik model baru

• Contoh : ELISA àmonoclonal antibody (Enzyme – Linked immunosorbant Assay) àreaksi warna

• probe untuk Plasmodium falciparum, berupa potongan DNA spesifik

Profesi FARMASIS “

• Isu – isu ke arah farmakoekonomi & etika (ethical )

• Menjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat – obat

dan efek /akibat penanganan yang tidak tepat.


R A K A Y A S A G E N E T I K A

Definisi Adalah proses pembentukan rekombinan baru dari material genetik dengan cara penyisipan suatu molekul asam nukleat asing ( yang dihasilkan di luar sel ) ke dalam suatu vektor, sehingga memungkinkan penggabungan dan kelanjutan berkembang / diperbanyak di dalam sel inang yang baru.

KLON adalah organisme identik yang terbentuk secara genetik dan membawa seluruh potongan DNA yang telah disisipkan, dan memperbanyak molekul yang baru.

Kloning gen à rekayasa genetika, teknologi DNA rekombinanContoh : domba Dolly


RAKAYASA GENETIKA

Material genetik : adalah material yang membawa informasi genetik yang diturunkan dari tetua ke turunannya, yaitu asam nukleat

DNA : deoksi ribonucleic acid RNA : ribonucleic acid

Vektor Kloning :adalah wahana pembawa gen target untuk mengintroduksi gen ke inang tertentu.

Gen :adalah sekuens DNA yang menyandikan protein.


- Menerobos barier alamiah suatu spesies àInsulin manusia diproduksi oleh E. coli à E. coli sebagai pabrik

biologis

-Memungkinkan memperoleh dan memanipulasi secara relatif potongan – potongan DNA yang menyandikan fungsi spesifik terapi gen penyebab penyakit keturunan

Co : Sindrom Hurler ( KOMPAS, 02/08’97)sel sumsum tulang belakang diekrtraksi, dimanipulasi dengan sel – sel normal, diintroduksi kembali melalui pembuluh darah.

ASPEK KLONING


Adanya rekayasa genetika memungkinkan kita tidak hanya mengisolasi dan menskrining, tapi juga dapat mengkonstruksiorganisme, dalam hal ini galur – galur yang produktif.

Mikroorganisme Tanaman BIOREAKTORHewan

ASPEK KLONING

Dua dasar penerapan kloning gen

1. Isolasi dan studi gen – gen tertentuàDiperoleh pengertian yang mendalam mengenai fungsi dan

mekanisme regulasi gen

2. Peningkatan produksi oleh suatu gen spesifik


TEKNIK – TEKNIK DASAR YANG BERKAITAN DENGAN KLONING GEN

•Metode isolasi DNA •Metode memotong dan menyambung molekul – molekul asam nukleat•Metode transformasi pada sel host/ inang ; sebagai dasar : Escherichia coli

( E. coli ) à why ?

Hampir semua pengembangan pertama teknik rekayasa genetika digunakan E. coli sebagai organisme inang :

• Paling banyak dipelajari • Paling lengkap informasi material genetiknya :

- sudah lengkap peta genomnya.


DEFINISI

§Isolasi DNA

mengekstraksi molekul DNA dari sel

§Memotong DNA ( digestion )

memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi

§Menyambung DNA ( Ligation )

Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase

§Transformasi

§Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang

DEFINISI

§Isolasi DNA

mengekstraksi molekul DNA dari sel

§Memotong DNA ( digestion )

memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi

§Menyambung DNA ( Ligation )

Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase

§Transformasi

§Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang


ISOLASI DNA

1.Penghancuran dinding sel : - mekanik - enzimatis

2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat - Triton X – 100

3. Membersihkan debris sel - sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven

organikContoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ;

atau proteinase-K

4. Presipitasi - + alkohol à sentrifugasi gradien CsCl ; elektro-- + alcohol + NH4 asetat

ISOLASI DNA

1.Penghancuran dinding sel : - mekanik - enzimatis

2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat - Triton X – 100

3. Membersihkan debris sel - sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven

organikContoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ;

atau proteinase-K

4. Presipitasi - + alkohol à sentrifugasi gradien CsCl ; elektro-- + alcohol + NH4 asetat


Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom

1. Beda struktur tersier : DNA plasmid : supercoiled à Covalently Closed Circular ( CCC )DNA kromosom/genom : linier

2. Sifat denaturasi - dengan alkali, pemanasan - DNA plasmid lebih mudah renaturasi

3. Ultrasentrifugasi : CsCl gradien à DNA plasmid berada di bawah

4. Mobilitas di elektroforesis gel agaroseàDNA plasmid lebih diskret /tajam pitanya

CsCl / EtBr : DNA linier (kromosom)DNA Supercoiled (plasmid)

Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom

1. Beda struktur tersier : DNA plasmid : supercoiled à Covalently Closed Circular ( CCC )DNA kromosom/genom : linier

2. Sifat denaturasi - dengan alkali, pemanasan - DNA plasmid lebih mudah renaturasi

3. Ultrasentrifugasi : CsCl gradien à DNA plasmid berada di bawah

4. Mobilitas di elektroforesis gel agaroseàDNA plasmid lebih diskret /tajam pitanya

CsCl / EtBr : DNA linier (kromosom)DNA Supercoiled (plasmid)


Agarose gel electrophoresis

DNA size

lamda lamda plasmid plasmid

+RE +RE


ANALISIS KUALITAS DAN KUANTITAS DNA

•Elektroforesis - DNA diwarnai dengan Etidium bromida- dilarikan pada gel agarose dari kutub (–) ke (+)- dapat diketahui adanya degradasi

Degradasi :Ik. Fosfodiester putus

Penyimpanan :> - 200C - DNAse tidak aktif

- mencegah degradasi oleh DNAse> TE buffer : mencegah degradasi oleh DNAse


METODE – METODE ISOLASI PLASMID

§skala besar : sentrifugasi gradien CsCl

§skala kecil ~ mini prep, midiprep

•sentrifugasi gradien

•alkalin lisis

•metode ammonium asetat

•metode partikel gelas ( glass milk )

•metode partikel magnetic ( magnetic beads )

•kromatografi ( exclusion chromatography)


VEKTOR KLONING

PLASMID

bereplikasi diri ( self replicating )

utas ganda : d s

molekul DNA sirkulator

di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk ekstrakromosomal

copy number ( Jumlah kopi per sel ):

high copy number 10 – 100 kopi / sel

low copy number 1 – 4 kopi / sel

medium copy number diantaranya

Ukuran : 1 s/d 500 kb

VEKTOR KLONING

PLASMID

bereplikasi diri ( self replicating )

utas ganda : d s

molekul DNA sirkulator

di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk ekstrakromosomal

copy number ( Jumlah kopi per sel ):

high copy number 10 – 100 kopi / sel

low copy number 1 – 4 kopi / sel

medium copy number diantaranya

Ukuran : 1 s/d 500 kb


VEKTOR KLONING

Spektrum inang :broad hostrangeà dapat bereplikasi pada sejumlah spesies

bakterinarrow hostrangeà hanya dapat bereplikasi pada spesies khusus

Beberapa ciri khas plasmid untuk vektor cloning :§Ukuran kecil §Mempunyai situs – situs pengenalan ER yang unik ( tunggal ),

tempat insert disisipkan / diklon.§Satu atau lebih penanda seleksi genetic, untuk mengindentifikasi

sel resipien yang membawa kontruksi DNA vektor - insert.§Plasmid cloning vector harus di-genetically engineered

Contoh : pBR 322, pUC 19


PLASMID

-Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri, berbentuk sirkular, utas ganda.

- Terutama ditemukan pada bakteria, juga : KapangEukariotik ( beberapa )

- Plasmid alami menyandikan : 1. Resistensi AB2. Colicin = Bakteriosin 3. Virulensi 4. Aktivitas metabolit

PLASMID

-Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri, berbentuk sirkular, utas ganda.

- Terutama ditemukan pada bakteria, juga : KapangEukariotik ( beberapa )

- Plasmid alami menyandikan : 1. Resistensi AB2. Colicin = Bakteriosin 3. Virulensi 4. Aktivitas metabolit


STABILITAS PLASMID kondisi optimum, stabil medium tumbuh - Mandiri à tidak tergantung kromosom

ada gen ORI : untuk replikasi mandiri

- Plasmid rekayasaUntuk teknologi DNA rekombinan

STABILITAS PLASMID kondisi optimum, stabil medium tumbuh - Mandiri à tidak tergantung kromosom

ada gen ORI : untuk replikasi mandiri

- Plasmid rekayasaUntuk teknologi DNA rekombinan


• Diperoleh dari bakteri sbg mekanisme pertahanan terhadap infeksi virus DNA

• Endonucleases = memotong (cleave) di dalam utasan DNA

• Telah diketahui ada 3,139 enzyme

Restriction Enzymes = enzim restriksi

PEMOTONGAN DNA (digesti )


Enzyme Site Recognition =situs pengenalan enzim restriksi

• Setiap enzim mendigesti (memotong) DNA pada sekuens spesifik = situs restriksi (restriction site)

• Enzim mengenali 4- atau 6- pasangan basa , dengan sekuens palindromik (eg GAATTC)


5’ versus 3’ overhang

• Enzyme cuts à5’ GAATTC 3’

3’ G 5’

5’ G 3’

3’ CTTAAG 5’

5’ G 3’

3’ CTTAA 5’

5’ AATTC 3’

3’ G 5’

§ Generates 5’ overhang


Common Restriction Enzymes

• EcoRI– Escherichia coli

– 5’ overhang

• PstI– Providencia stuartii

– 3’ overhang

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

5’ CTGCAG 3’

3’ CACGTC 5’


The DNA Digestion

Restriction Buffer provides optimal conditions

– NaCl provides the correct ionic strength

– Tris-HCl provides the proper pH

– Mg2+ is an enzyme co-factor


DNA Digestion Temperature• Why incubate at 37°C?

Body temperature is optimal for these and most other enzymes

• What happens if temperature is too hot or cool? G Too hot = enzyme may be denatured, killed

J Too cool= enzyme activity lowered, requiring longer digestion time


Agarose Electrophoresis

• Arus listrik yang membawa DNA bermuatan negatif ke elektroda muatan (warna merah)positif melalui suatu gel agaros

• Gel agarose memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran– Fragmen kecil bergerak lebih di depan (front) di

dibandingkan fragmen besar


PENYAMBUNGAN DNA ( Ligasi )

- Penyambungan gugus 3’OH dan DNA insert. ( Gb. )- Ligasi lebih mudah pada ujung – ujung sticky ( dengan ER

sama / isoschizomer / isocaudomer).- Reaksi Ligasi

DNA vektor 3 1 : 2 ( s/d 1: 10 )DNA insert 6Buter T4 DNA ligase 5x 4T4 DNA ligase 1dH2O ( destilata bebas ion ) 6Total 20

•Inkubasi : 40 – 150 C semalam ( 18 – 24 jam )- Ujung blunt end : dapat diligasi, walaupun didigesti dengan ER berbeda.Pada reaksi Ligasi, selalu sertakan pula control – control : k. Transformasi : vector utuhk. ligasi : vector linier / terpotong + enz – ligase


à Pengambilan DNA rekombinan oleh E.coli dengan cara mengintroduksi DNA murni (purified) ke dalam sel yang sudah kompeten.

TRANSFORMASI

GFP


E.coli sebagai sel inang :

> sudah dimodifikasi genetik, antara lain :

> Rec A- : tidak mempunyai gen untuk endonuklease restriksi

sehingga DNA rekombinan yang diintroduksi tidak didegradasi

contoh : E.coli DH5α, E.coli HB101

TRANSFORMASI


• Electroporation– Electrical shock yang menyebabkan membran

menjadi permeabel terhadap DNA

• Calcium Chloride/Heat Shock– Chemically-competent cells mengambil DNA

setelah heat shock

E.coli dibuat kompeten dengan cara kimia:-Peningkatan suhu dan CaCl2 à heat shock pada 370 C – 420 C, dalam larutan CaCl2

- Setelah ditransformasi, disebar pada medium seleksi

TRANSFORMASI


Electroporation

Electric shock

Membuat pori-pori kecil pada membran sel


SELEKSI

E.coli ( plasmid DNA rekombinan ) di seleksi terhadap E.coli yang tidak membawa rekombinan

Macam seleksi : ( 4 )

1.Seleksi langsung : contoh: ABR = ABS (inaktivasi penyisipan )

à perlu teknik cawan replika (replica plating)

2. seleksi warna koloni : X – gal ®, memanfaatkan gen lacZ

yang menghasilkan enz. β – galactosidase.

Enzim tsb mengubah substrat X- gal menjadi β-gal biru

3.Komplementasi = gen Lacz pada vector vs pada E. coli

DHS α ( inang )

4. Analisa hibridisasi : - dot blot; colony hybridization


REPLICA PLATING

• Pertama sebar sel pada cawan agar mengandung AMPICILLIN– Semua TRANSFORMAN menghasilkan koloni (tumbuh)

= Transforman AMPR

• Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin– Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh

Kain Beludru

AMP LATE

BLOCK

PRESS


AMP LATE

BLOCK

REPLICA PLATING


Kain Beludru

AMP LATE

BLOCK

PRESS

AMP LATE

BLOCK

TET PLATE

BLOCK


TETRES NON-RECOMBINANTS

TET PLATE

GROW

• Cawan TET dan cawan AMP dibandingkan– Ambil REKOMBINAN dari TETSENS AMPRES

dari cawan AMP

TETRES NON-RECOMBINANTS

AMP LATE

TET PLATE

REPLICA PLATING



VERIFIKASI DAN PEMETAAN DNA REKOMBINAN

Dilakukan menggunakan Enzim endonuklease restriksi (ER).

Vertifikasi : àMemastikan adanya DNA insert / asing yang di klon pada vektor, menggunakan satu dan dua (ganda) ER (single digest dan double digest), berdasarkan ukuran DNA dengan di larikan (running) di elektroforesis gel agarose.

Pemetaan :

Manfaat ER dalam biologi molekuler.

Untuk mengetahui ukuran DNA rekombinan berdasarkan situs – situs

Enzim restriksi.

à Disebut Physical mapping ( pemetaan fisik ):

pemetaan fisik yang lengkap memerlukan berbagai ER.


KLONING SEKUENS DNA PENYANDI PROTEIN EUKARIOT

Perlu teknik khusus àProkariot tidak dapat melakukan intron splicing àDNA eukariot besar karena mengandung banyak intronàEkspresi akan kacau oleh prokariot

Oleh karena itu :

-menggunakan MRNA mature- Enzim Reverse transcriptase yang mensintesis satu utas DNA dari RNA kmd dilanjutkan dengan kerja Klenow fragment yang mensintesis utas kedua DNA dari template DNA

Sehingga akan diperoleh dua macam c DNA ( complementary DNA ) :yang utuh & parsial


PRODUK BIOTEKNOLOGI MOLEKULER

SEKTOR :

Medicinal :

-Human Therapeutic

-Human Diagnostic

Non medical :

-Agriculture

-Specialities

-Non-medical Diagnostic

Contoh : INDIGO à pewarna jeans


INDIGO

-diekstraksi dari tanaman

-batubara

-rekombinan DNA

Lintasan Indigo : banyak dipakai untuk industri Blue Jeans

Genencor International : green route to blue dye

Indol diubah menjadi cis – indole 2,3 – dehydrodiol dengan

gen dari Pseudomonas putida yang disisipkan pada E. coli


DIAGNOSTIK MOLEKULER

Kemajuan bidang pengobatan karena berhasil didapatkannya virus – virus spesifik, bakteri, fungi dll, juga molekul – molekul kecil.

Untuk kepentingan pencegahan, control, pengobatan dari penyakit –penyakit infeksi maka perlu identifikasi dini dan akurat terhadap organisme pathogen penyebab penyakit

à ditumbuhkan/dikultur à amati sifat – sifat fisiologis

KENDALA : lamamahal

à ada yang tidak dapat ditumbuhkan/dikulturkan

à sulit mendeteksi organisme penyebab penyakit


Untuk mengatasi kendala – kendala tersebut maka dikembangkan prosedur – prosedur diagnostik molekular:

1. Metode immunologi detectionCo : ELISA monoclonal antibody yang diproduksi di E. coli

( Enzyme – linked immunosorbent assay )

2. Metode deteksi DNA yaitu deteksi menggunakan pelacak DNA

Prinsip hibridisasi asam. NukleatEssei ini : cepat

reliablespesifisitas tinggi : hanya berhibridisasi dengan sekuens

nukleotida target


PRODUK KOMERSIAL REKAYASA MIKROBA

HUMAN PROTEIN PHARMACEUTICALS

- jumlah sangat terbatas

- produksinya mahal

-biological mode of action belum dikarakterisasi jelas

+ 300 macam protein terapeutis manusia yang potensial telah

diklon, dan telah melalui berbagai uji selama bertahun–tahun

sebelum tersedia secara komersial. (Tabel 7.1)


Pharmaceutical biotechnology

• Diabetes Insulin

• Haemophilia Factor VIII

• Stroke Tissue plasminogen activator

• Growth failure Human growth hormone

• Anaemia Erythropoietin

• Viral infection Interferon


Strategi teknologi rekombinan DNA human protein pharmaceutical

Isolasi cDNA

Engineering (Rekayasa)

Optimizing Gene Expression


§Isolasi cDNA

Strategi I:

Isolasi protein target

Determinasi sekuens asam amino

Deduksi menjadi sekuens DNA penyandi

Sintesis oligonukleotida

Gunakan sebagai probe utk mengisolasi gen atau cDNA dari pustaka genom atau pustaka cDNA


Strategi II: Jika suatu protein khusus disintesis di suatu jaringan khusus

à Pustaka cDNA dapat dibuat dari mRNA ; tidak perlu dari

protein.

mRNA berfungsi sebagai probe untuk sekuens DNA target.

Contoh : Insulin à disintesis hanya dijaringan khusus di

pancreas yaitu di pulau Langerhans.

Oleh karena itu fraksi mRNA yang diisolasi dari jaringan tersebut

70 % menyandikan insulin.

MRNA (mature)

Reverse transcribed

cDNA


§Engineering

-sistem ekspresi prokariot dan eukariot beda

-jika menggunakan prokariot sebagai sel inang akan menurunkan biaya

-namun dipertanyakan apakah efektifitas sintesis bentuk fungsional protein heterogous masih tetap??

Strategi untuk mendesain protein – protein, dengan cara mengatur

kombinasi domain – domain fungsional suatu protein, atau dengan

cara mutagenesisis terarah, agar dapat mempelajari mode of action

suatu protein.

§Optimizing Gene Expression


Harus dipilih berdasarkan kriteria :

-memproduksi protein heterologus yang mirip dengan mature

authentic protein, selain

-mampu tumbuh dengan densitas sel tinggi

-mudah dipurifikasi

Contoh : human interleukin – 3

Produksi paling baik di Bacillus licheniformis

meskipun produksi banyak di E. coli, tapi menghasilkan protein interleukin-3 yang salah.

§Optimizing Gene Expression


Sintesis L-Ascorbic Acid ( Vit. C)

D-glucose

D-Sorbitol L-sorbose 2 KLG (2-keto-L-gluconic acid)

L- ascorbic Acid

à Satu tahap fermentasi mikroba à sejumlah tahap – tahap kimia

Dari penelitian – penelitian biokimia mengenai lintasan – lintasan

metabolit diketahui bahwa beberapa mikroorganisme menunjukkan

kemungkinan untuk mensintesis 2 - KLG


AcetobacterGluconobacter D. glucose 2,5 – diketo- D- glukonic acid (2,5 – DKG)Erwinia

melalui beberapa lintas metabolisme

Corynebacterium 2,5-DKG reduktase

Brevibacterium 2,5 – DKG 2 – KLG

Arthrobacter1 lintas metabolisme

Gen penyandi enzim 2.5 – DKG reduktase dari Corynebacterium di klon di Erwinia


•MENINGKATKAN PRODUKSI ANTIBOTIK

Produksi antibiotik dari Streptomyces spp dengan Fermentasi

à lama – lama konsentrasi oksigen dalam media cair berkurang

Pertumbuhan Streptomyces spp menurun dan produksi antibiotik

menurun

Vitreoscilla sp adalah bakteri aerob yang dapat hidup dalam kondisi miskin O2

Bakteri ini dapat memproduksi suatu protein hem homodimerik yangberfungsi mirip dengan hemoglobin eukariot, yaitu dapat mengikat O2

dari medium kemudian menyalurkannya ke dalam sel.

Gen yang menyandikan protein heme tersebut di klon di Streptomyces


TERAPI GEN

• Beberapa penyakit genetik manusia dapat dikaitkan terhadap suatu mutasi di suatu gen tunggal, atau mungkin juga lebih kompleks, yaitu terhadap sejumlah gen-gen berbeda yang bermutasi.

• TUJUAN utama riset dalam genetika molekuler manusia àmenentukan kecacatan pada level gen, dan bagaimana keadaan tersebut menyebabkan simtom penyakit genetik yang spesifik


PENDEKATAN

Protein yang terlibat

Isolasi dan karakterisasi

Sekuensing asam amino

Investigasi sekuen penyandi

Buat pelacak spesifik

Isolasi gen target dari pustaka genom


• Dasar pemikiran terapi gen:

– Jika versi normal dari gen untuk penyakit manusia telah berhasil diklon, maka sangat berbuna untuk memperbaiki kecacatan/mutasi gen tersebut


Ex vivo gene therapy

Sel diambil dari orang penderita penyakit (pasien)

Perbaiki cacat genetik dengan cara transfer gen

Seleksi dan tumbuhkan sel-sel yang telah dikoreksi secara genetik (remedial cell)

Infuskan atau transplantasikan kembali ke pasien

Gen remedial diintroduksi ke sel oleh suatu retrovirus mencit yang seudah direkayasa sehingga tidak mampu mengkonversi sel normal menjadi sel kanker.Retrovirus (rekombinan) menginfeksi sel manusia sehingga gen remedial masuk


In vivo gene therapy

Menggunakan adenovirus : ds DNA

low pathogenicity in human

Gen remedial

Konstruksi pada vektor virus di bawah promotor khusus yang spesifik menginfeksi

sel khusus (sel target)


Antisense therapy

Dirancang untuk pencegahan;

- penurunan ekspresi gen tertentu,

- bekerja pada tahap translasi (mRNA)

Ada 2 cara:A.Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas)B.Menggunakan gen antisense yang diklon

Antisense adalah utas asam nukleat DNA yang tidak ditranskripsikan, merupakan utas pasangan dari utas yang ditranskripsikan (utas sense).


A. Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas):DNA------ A G C T G A T -----------------T C G A C T A ----------

transcription

antisense mRNA oligonukleotida

A G C U G A U T C G A C T A

Base pairing

A G C U G A U

T C G A C T A

No translation


B. Menggunakan gen antisense yang diklon

DNA------ A G C T G A T ---------- -------T G C G A C T A--------------T C G A C T A ---------- -------A C G C T G A T-------

transcription

mRNAA G C U G A U U C G A C U A

Base pairing

A G C U G A U

T C G A C T A

No translation

mRNA sense

mRNA antisense


PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULER

I. DNA sequencing techniques

1. prosedur Dideoxynucleotide :

- Maxam – Gilbert : chemical based

- Sanger : enzymatic based

2. Penggunaan Bacteriophage M13

Untuk memperoleh ss.DNA

Target DNA + 500 bp

< 2000 bp : harus dipotong – potong menjadi beberapa fragmen overlap dengan ER

• Primer Walking :

• Uk. DNA > 5000 BP


II. Polymerase Chain Reaction ( PCR )

- Amplifikasi molekul DNA

- Esensial :

1. Dua buah primer sintesis oligonukleotida

(masing – masing ~ 20 nt )

2. sekuens target pada sampel DNA

3. DNA polymerase yang thermostabil àmencapai suhu 950 C

atau lebih

4. Empat macam deoxynucleotidatriphosphat (dNTP) :

dATP, dCTP, dGTP, dTTP



II. Polymerase Chain Reaction ( PCR )

Tahap – tahap :-denaturasi : - suhu 950 C : ds-DNA menjadi ss-DNA

- enzim Taq DNA polymerase- primer

-renaturasi /annealing : suhu diturunkan perlahan sampai 550C primer berikatan dengan template DNA

-sintesis : - suhu dinaikkan sampai 750C, suhu optimum untuk fungsi katalisis enzim Taq DNA polymerase untuk

mensintesis DNA.

Ketiga tahap diulangi beberapa siklus sampai diperoleh molekulDNA dalam jumlah besar.



biotek farmasi

Documents