BIOLOGIE CELULARA ANUL I, SEMESTRUL I

1.Conceptul actual despre organizarea membranelor celulareConceptul actual despre organizarea membranelor celulare este practic cumulul efectelor a numeroase cercetari si descoperiri biologice si biochimice anterioare, pornind de la intuirea unei structuri menite a asigura celulei o oarecare independenta relativa fara de mediul inconjurator in sensul desfasurii unei activitati eficiente, si ajungand la deslusirea organizarii sistemului membranar celular, strans legata de numele lui Singer si Nicolson.Acestia au elaborat modelul mozaic fluid de organizare a membranelor celulare (1972), care ramane valabil si pentru endomembrane, in fapt pentru toate tipurile de biomembrane. Baza articolului in care au definit acest model reprezinta o alta lucrare a celor doi cercetatori, datand din noiembrie 1971, in care s-au postulat principiile organizarii moleculare a unei membrane celulare, si anume: structura de baza este un bistrat lipidic cu proprietati fluide manifestate bidimensional, axul intregului edificiu molecular bistratul lipidic este mozaicat cu proteine, care pot fi atasate fie la exterioriul bistratului, fie la interior, fie cufundate in acesta, putandu-l strabate atat complet, cat si partial de asemenea, trebuie mentionata si prezenta componentei glucidiceCand vorbim despre membrana celulara, vorbim despre o ultrastructura alcatuita majoritar din lipide polare si proteine, care separa, dar si uneste celula cu mediul. Denumim ultrastructura orice componenta supramoleculara din structurile vii care nu paoate fi observata la MO, ci doar la ME. Biomembranele au o grosime de 7-10 nm, adica sunt de aproximativ 20 de ori mai subtiri decat o structura observabila la MO.Astfel, la baza conceptului de organizare sub forma de mozaic fluid au contribuit majoritar observatiile din preparatele de microscopie electronica obtinute prin tehnica de inghetare-fracturare, care dovedeau prezenta in membrana a unor structuri globulare ce se repartizau fie pe o fata, fie pe cealalta a suprafetei de fractura, cand aceasta trecea pe la nivelul membranei printre cele doua foite ale bistratului, unde se gaseste linia de minima rezistenta la fractura.Membrana celulara este alcatuita din 3 componente principale:1. Plasmalema=complexul lipoproteic, structura trilaminara, grosime de aprox. 7,5 nm2. Glicolema= complex glicoproteic, atasata superficial, pe versantul extern al plasmalemei, grosime de cca 50 nm3. Citoscheletul membrana= retea de proteine ancorata versantului intern al plasmalemei, ce se continua spre interiorul celulei cu citoscheletul asociat matricei

2. Compozitia moleculara globala si functiile membranelor celulare

Membrana celulara contine 20-30 % apa , restul de 70-80% reziduu uscat.Reziduul uscat: 1% substante minerale 99% substante organice*: lipide 40-50% / proteine 50-60% /glucide pana in 10% *Exceptie: la nivelul tecii de mielina, unde functia de bariera este esentiala rolului membranei celulelor Scwann, procentul de masa pt lipide este de 80%Desi in majoritatea sistemelor biologice apa reprezinta aproximativ 70-80%, in membrana situatia sta exact invers, explicatia gasindu-se tocmai din rolul membranei: separarea a doua medii hidrofile, astfel explicandu-se un procent redus de apa, precum si continutul in lipide al structurii de baza a membranei, bistratul, asigurandu-se astfel caracterul hidrofob. Lipidele sunt prezente exclusiv in plasmalema, proteinele sunt anexate ca un mozaic plasmalemei, putand fi atasate atat la exterior, cat si la interiorul acesteia, dar o pot si strabate, cufundandu-se fie complet, fie partial. Componenta glucidica este atasata exclusiv versantului extern al plasmalemei.Legat de functiile membranei celulare, aceasta trebuie sa se comporte ca o barire selectiva, si nu absoluta, intre mediile extracelular si intracelular, permitand interactiunea celulei cu mediul. De aceea, putem afirma ca membrana celulara trebuie sa indeplineasca doua mari categorii de functii: functie de bariera (selectiva) functie metabolica( adica sa asigure celulei schimburi de informatie si substanta cu mediul, in ambele sensuri)

3. Lipidele membranare: definitie, clasificari

Lipidele reprezinta 40-50% din procentul de 99% de substante organice al membranelor celulare. Sub aspect molecular , constituie componenta structurala de baza a membranelor celulare(raportul molecular lipide/proteine fiind de 50/1). DEF: Lipidele membranare reprezinta o categorie larga de substante organice relativ insolubile in apa, dar solubile in cei mai multi solventi organici, cu caracter amfifil, multe dintre ele fiind esteri ai unor alcooli polihidroxilici cu acizi grasi. Sunt molecule mici cu grade mari de libertate in a se misca intre ele la niveul structurii, determinand o anume dinamicitate. Cu cat componentele sunt mai mici, cu atat miscarea este mai frenetica. Au tendinta spontana de asociere, corectand usor eventualele defecte sau reparand leziuni ale bistratului.

Biochimia descrie o mare diversitate de clase de lipide, grupate-n doua mari categorii: lipide complexe(ce contin in structura lor acizi grasi , ex: acilgliceroli, fosfogliceride, sfingolipide, ceruri) lipide simple(steroizi, prostaglandine, terpene)

Cu toate acestea, in membranele celulare intalnim doar 3 tipuri de lipide:1. Fosfolipide(70-75%)2. Colesterol(20-25%)3. Glicolipide(1-10%)

Fosfolipidele, in functie de poliolul din structura, pot fi: fosfogliceride=glicerofosfatide , in cazul in care poliolul este glicerina fosfosfingozide, in cazul in care poliolul este sfingozina

Considerand structura unui fosfoglicerid:

In functie de molecula X a capului hidrofil, fosfogliceridele pot fi: X=colina => fosfatidilcoline(PC) X=etanolamina => fosfatidiletanolamine (PE) X= serina => fosfatidilserine(PS) X=inozitol => fosfatidilinozitoli (PI) X= hidrogen => acid fosfatidic (PA)

4. Fosfolipide membranare. Distributie, mobilitate

Fosfolipidele ilustreaza categoria lipidelor complexe si formeaza majoritatea continutului lipidic din endomembrane , iar in membrana celulara se gasesc in proportie de 75% din continutul lipidic. In functie de poliolul din structura, fosfolipidele pot fi fosfogliceride sau fosfosfingozide. Considerand structura unui fosfoglicerid:

Pe scheletul polialcoolului component=glicerina, in acest caz, se afla grefate pe de o parte , la gruparile oxidrilice din pozitiile 1 si 2, doua lanturi alifatice provenind de la acizii grasi esterificati cu respectivele grupari=> coada hidrofoba a lipidului membranar, iar, pe de alta parte, la oxidrilul din pozitia 3 a glicerinei, se ataseaza o componenta X .In functie de molecula X a capului hidrofil, fosfogliceridele pot fi: X=colina => fosfatidilcoline(PC) X=etanolamina => fosfatidiletanolamine (PE) X= serina => fosfatidilserine(PS) X=inozitol => fosfatidilinozitoli (PI) X= hidrogen => acid fosfatidic (PA)Deoarece fosfolipidele concentreaza la un capat radicalii hidrofil si la celalalt capat radicalii hidrofobi,ele sunt denumite molecule amfipate sau bimodale. Fosfolipidele au astfel tendinta de orientare in monostrat, iar, atunci cand concentratia fosfolipidelor este mai mare decat cea necesara, ele se organizeaza in micelii.Alte tipuri de fosfolipide: cardiolipide (difosfatidil gliceroli), plasmalogene (reprezinta 10% dintre fosfolipidele creierului, iar in muschiul cardiac procentul lor ajunge pana la 50%, avand rol in protectia miocardului fata de actiuntea radicalilor liberi de oxigen).

Legat de distributia in bistrat: pe foita interna: PE, PS, PI (cu mentiunea ca aparitia PS in foita externa reprezinta un semn timpuriu al fenomenului de apoptoza celulara) pe foita externa: PC, sfingomieline (echivalentul PC pentru fosfosfingozide) intre foite: colesterol

Legat de mobilitate, putem afirma ca , fosfolipidele, ca orice lipide membranare, pot executa urmatoarele tipuri de miscari:1. Miscari intramoleculare ( realizate in raport cu propria lor axa si geometrie)- de rotatie (109 rotatii/secunda)-de flexie a cozilor hidrofobe( 108 flexii/secunda)

2. Miscari intermoleculare-de translatie(difuzie laterala) = miscarile ale lipidelor in planul membranei, unele pe langa altele, cu o frecventa de schimbari de directie de 107 schimbari/secunda. Prezenta colesterolului in bistrat determina o diminuare a mobilitatii laterale !!!-de flip flop = miscari de trecere a lipidelor dintr-o foita a bistratului in cealalta, cu o frecventa extrem de mica, practic nula, cu exceptia cazului membranei R.E

5. Rolul lipidelor membranareLipidele membranare reprezinta componenta structurala de baza a membranelor ceulare , le confera proprietatea de bariere selective si asigura caracterul hidrofob necesar pentru rolul lor de separare a doua medii hidrofile.Lipidele nu prezinta doar rolulri structurale, ci sunt implicate si in importante functii metabolice, unind celula cu mediul inconjurator si integrand-o in ambianta biosociala. Echilibrul dintre diferitele tipuri de lipide din membrane influenteaza comportamentul normal al celulei, iar modificarea lui poate atrage deviatii patologice( ex: aparitia fosfatidilserinelor in foita externa a bistratului lipidic este un semn timpuriu al fenomenului de apoptoza celulara). Astfel, lipidele membranare pot reprezenta tinte terapeutice.Glicolipidele sunt implicate in fenomene de recunoastere si semnalizare intercelulara. Detalii referitoare la rolurile metabolice ale lipidelor sunt cunoscute pentru fosfolipide. Acestea pot fi modificate de enzime specifice numite fosfolipaze. De regula, acesta modificari se petrec ca urmare a unor procese de semnalizare, parte dintre metabolitii rezultati actionand ca mesageri secunzi si facilitand numerioase procese prin care celulele raspund semnalelor receptate. Exista mai multe tipuri de fosfolipaze, care au proprietatea de a elibera diverse molecule din complexa structura biochimica a fosfolipidelor: fosfolipaza A1( PLA1) -elibereaza acidul gras din pozitia 1 a glicerinei fosfolipaza A2(PLA2)- elibereaza acidul gras din pozitia 2 a glicerinei => lizofosfatide fosfolipaza B( PLB) , care poate scoate acizi grasi din ambele poitii ale glicerolului din structura fosfolipidelor, completand de regula activitatea PLA1 si PLA2; in general, actioneaza asupra lizofosfatidelor, eliminand din bistrat fosfolipidul afectat fosfolipaza C - desface legatura dintre glicerina si fosfat, cu eliberare de diacilgliceroli(DAG), ce raman in bistrat si , de asemenea, cu eliberarea unui compus hidrofil, ce difuzeaza in citosol fosfolipaza D - elimina restul hidrofil X, cu formarea de acizi fosfatidici(legare de hidrogen la legatura ramasa libera)Notam de asemenea si ca fosfolipaza A2, prin actiunea sa, poate elibera acidul arahidonic, care este precursor pentru 4 clase de substante :1. Prostaglandine2. Tromboxani3. Prostacicline4. LeucotrieneToate aceste 4 clase de substante sunt obtinute prin complexe procese de metabolizare a acidului arahidonic proaspat eliberat de fosfolipaza A2. Primele 3 tipuri rezulta pe calea ciclo-oxigenazei, iar cea de-a patra pe calea lipo-oxigenazei.

6. Proteinele membranare: generalitati si clasificariModelul mozaicului fluid de organizare a membranelor biologice ne arata ca, alaturi de lipidele structurate sub forma de bistrat, la constructia acestor componente celulare participa si proteinele. Raportul molecular intre lipide si proteine este de 50/1, unul usor de inteles avand in vedere ca , de regula, compozitia sub aspectul masei de material organic la nivelul membranelor este de aprox. 40% lipide si 50% proteine, lipidele fiind molecule cu greutate moleculara mica, iar proteinele fiind macromolecule.Cu cat functiile metabolice ale unei membrane(sau anumite portiuni definite drept domenii/microdomenii membranare) sunt mai pregnante, cu atat continutul de proteine al acelei membrane/portiuni de membrana este mai ridicat.Cu cat rolul de bariera al unei membrane trebuie sa se manifeste mai pregnant, cu atat continutul in proteine este mai scazut, fiind crescut cel in lipide.Mozaicarea bistratului lipidic cu proteine nu anuleaza, ci amplifica si nuanteaza eterogenitatea, asimetria si comportamentul de fluid bidimensional al structurii.In functie de pozitia lor fata de bistratul lipidic: proteine periferice=extrinseci (atasate de o parte sau de alta a bistratului lipidic, interactionand cu capetele hidrofile ale lipidelor) ectoproteine(la exteriorul foitei externe) endoproteine(pe foita interna, expuse pe fata citoplasmatica) proteine integrale= intrinseci(cufundate in bistratul lipidic) proteine care traverseaza complet bistratul lipidic= proteine transmembranare proteine partial cufundate in bistratul lipidic(ex: citocromul b5 si caveolina)De notat de asemenea ca proteinele periferice reprezinta aprox. 25% din proteinele unei membrane, se extrag din mb cu solutii saline sau agenti chelatori, au caracter hidrofil , iar dupa extragere, isi pastreaza solubilitatea in apa. Proteinele integrale reprezinta de regula 75% din proteinele unei membrane, se extrag din membrane prin folosirea de detergenti, cu distrugerea bistratului, iar dupa extragere, raman asociate cu lipide. Aceste proteine sunt insolubile in apa si au caracter amfifil, cu portiune hidrofoba reprezentata de zona imersata in bistrat, si zona/zone hidrofile, reprezentata/e de domeniile lantului polipeptidic expuse in afara bistratului.

Proteinelor transmembranare li se definesc 3 domenii structurale:1. Ectodomeniu(portiunea expusa pe fata externa a membranei)2. Domeniu transmembranar(portiunea ce strabate bistratul lipidic)3. Endodomeniu(portiunea expusa pe fata interna a membranei)De asemenea, proteinele transmembranare sufera si ele doua clasificari, si anume:In functie de nr. de treceri ale lantului polipeptidic prin planul membranei: unipas multipasIn functie de pozitia capatului amino: prot. transmembranare de tip I ( cu capatul amino in ectodomeniu) prot. transmembranare de tip II ( cu capatul amino in endodomeniu)

7.Exemple de proteine membranare: descriere si mobilitateInainte de exemplificare, trebuie mentionat ca primele si cele mai detaliate informatii asupra proteinelor membranare au fost obtinute din studiul membranelor eritrocitare, din urmatoarele considerente: material biologic usor de obtinut si in cantitate suficienta populatia celulara omogena este usor de asigurat membranele se obtin fara dificultate printr-un simplu soc hipoton urmat de centrifugare, iar membranele obtinute(numite si fantome eritrocitare) nu sunt impurificate cu endomembrane=membrane ale organitelor celulare, inexistente in acest caz GLICOFORINAEste o proteina prezenta din abundenta in membrana eritrocitului, care are caracteristic faptul ca migreaza atipic la electroforeza( se dispune undeva la 90 kDa, desi masa ei moleculara este de numai 30 kDa) . Prezinta 131 AA si este o proteina transmembranara unipas de tip I ( cu capatul amino in ectodomeniu). Ectodomeniul prezinta 16 lanturi glucidice ce practic dubleaza gabaritul acestei molecule, explicandu-se astfel migrarea electroforetica atipica. Endodomeniul este mic, domeniul transmembranar este structurat in alfa helix si contine 23 AA. Toti AA componenti sunt cunoscuti, structura este cunoscuta. Exista mai multe izoforme de glicoforina identificate pana in prezent: A,B,C,D,E. Functia glicoforinei NU este cunoscuta, iar "misterul" este adancit de faptul ca exista eritrocite din a caror membrane glicoforina lipseste , iar functionalitatea nu le este afectata.

BANDA 3 = AE1 (Anion Exchanger 1)Este proteina care structureaza canalul anionic de schimb intre bicarbonat (HCO3-) si clor( Cl-), cu rol in fenomenul de mb Hamburger.Prezinta 911 AA si este o proteina transmembranara multipas cu masa moleculara de 100 kDa.Exact opus glicoforinei, in cazul AE1 , deslusirea detaliilor structurale a evoluat mai anevoios, iar functia a fost rapid si clar stabilita. O alta particularitate in contradictie cu glicoforina este faptul ca , in cazul AE1, endodomeniul este mare, purtand atat partea N- terminala, act si pe cea C-terminala( 359+33 => aprox. 400 AA in endodomeniu), ectodomeniul este mic si poarta o incarcatura glucidica mica(un singur lant), iar domeniul transmembranar prezinta 12-14 treceri in alfa-helix prin bistratul lipidic.In portiunea C terminala(aflata in endodomeniu), AE1 leaga anhidraza carbonica II, importanta pentru fucntia transportorului prin furnizarea anionului bicarbonat. Au fost identificate forme mutante pentru aceasta proteina=> patologii specifice eritrocitelor, iar glicoforina A pare a fi de ajutor in acest caz pentru restabilirea functiei de transport.SPECTRINA Impreuna cu glicoforina si cu AE1 reprezinta peste 60% (in procente de masa) din proteinele membranei eritrocitare. Spectrian este o proteina periferica situata pe fata interna a membranei => este o endoproteina, reprezentand componenta de baza a citoscheletului membranar eritrocitar. Spectrina este un heterodimer format dintr-o subunitate alfa(alfa-spectrina, 280 kDa) si o subunitate beta(beta-spectrina, 246 kDa). Ambele subunitati sunt formate predominant din multiple unitati repetitive de 106 AA. Cele doua subunitati se rasucesc usor una in jurul alteia intr-o structura elicoidala=> bastonase flexibile cu lungimea de 100 nm. Rasucirea este in contrasens, fiecare bastonas avand la capate gruparea N-termina a unei subunitati si gruparea C- terminala a celeilalte. Capatul ce contine gruparea N-terminala a subunitatii alfa este numit capul bastonasului, iar cel ce contine gruparea N-terminala a subunitatii beta este numit coada bastonasului.Bastonasele au capacitatea de a interactiona cate doua, cap la cap => tetrameri lungi de 200 nm, iar capetele tetramerilor se pot asocia cu oligomeri de actina, formand nodurile retelei citoscheletale.ACTINA Este o alta proteina care participa la structurarea citoscheletului membranei, asigurand solidarizarea componentelor acestuia la nivelul nodurilor. In forma sa monomerica, actina este o proteina globulara cu masa de 43 kD si diametru de 5 nm. La nivelul citoscheletului membranar formeaza fragmente mici, de 8-12 monomeri, cu rolul de a asigura asocierea cozilor tetramerilor de spectrina in nodurile retelei citoscheletale.

BANDA 4.1Tot in noduri se localizeaza si banda 4.1, cu masa de 80kD si conformatie globulara.Banda 4.1 interactioneaza dinamic cu spectrina si actina in nodurile retelei citoscheletale si, pe de alta parte, cu endodomeniul glicoforinei C, contribuind la atasarea citoscheletului pe versantul intern al membranei, de aici rezultand un rol structural al unei izoforme a glicoforinei. Atasarea citoscheletului asociat la membrana este datorata si unei alte proteine globulare=ankirina.

Rezumand, citoscheletul membranei este format din tetrameri de spectrina ce organizeaza lanturile ochiurilor retelei, unde, prin intermediul ankirinei se leaga de banda 3 si din mici filamente de actina care leaga cozile tetramerilor de spectrina la nivelul nodurilor retelei, unde, prin intermedierea benzii 4.1, reteaua se ataseaza suplimentar la endodomeniul benzii 3. Aceste interactiuni sunt intr-o dinamica permanenta, aceasta structura nefiind rigida, ci intr-o continua modelare care sa satisfaca nevoile celulei.

8. Mobilitatea proteinelor membranare si semnificatia biologica a acesteia Mobilitatea proteinelor membranare consta in : miscari de rotatie miscari de translatieMiscarea de rotatie a proteinelor membranare in jurul propriei axe= difuzie rotationala este de cel putin 1000 de ori mai lenta decat cea a lipidelor, avand in vedere si diferentele de gabarit. Miscarea de translatie=difuzie laterala, este si ea mult mai lenta decat cea a lipidelor , iar aceasta lentoare nu trebuie inteleasa numai prin diferentele de marime intre proteine si lipide, ci si prin interactiunile pe care proteinele le stabilesc in mod dinamic intre ele, sau cu alte structuri dinauntrul sau din afara celulei. Astfel, aceeasi proteina, in aceleasi conditii de fluiditate a bistratului lipidic, se poate misca mai repede sau mai incet, mai mult sau mai putin, in functie de starea ei functionala de moment.

9.Citoscheletul asociat membranei: descriere si functii

Citoscheletul asociat membranei este una din cele 3 componente principale ale unei membrane celulare, alaturi de glicolema si plasmalema, si este o structura aflata pe versantul intern al bistratului lipidic.Citoscheletul este o retea de endoproteine cu ochiuri si noduri, solidara atat membranei ,prin atasarea la endodomeniul unor proteine transmembranare, cat si citoscheletui citosolic, cu care se continua , sub forma unei retele structurale continue responsabile de mentinerea/modificarea formei celulelor , precum si a geometriei membranelor. In continuare vom descrie citoscheletul membranar eritrocitar, cu notiunea ca detaliile structurale se pastreaza in cazul tuturor membranelor:Componenta de baza a retelei citoscheletale este reprezentata de spectrina , ale carei subunitati alfa si beta se rasucesc in contrasens una in jurul celeilalte=> bastonase, care se lipesc la capete cate 2=> tetrameri lungi de 200 nm, iar capetele acestor tetrameri se pot asocia cu oligomeri de actina, formand nodurile retelei citoscheletale.Astfel, actina este o alta proteina care participa la structurarea citoscheletului membranei, asigurand solidarizarea componentelor acestuia la nivelul nodurilor. Banda 4.1 interactioneaza dinamic cu spectrina si actina in nodurile retelei citoscheletale si, pe de alta parte, cu endodomeniul glicoforinei C, contribuind la atasarea citoscheletului pe versantul intern al membranei, de aici rezultand un rol structural al unei izoforme a glicoforinei. Atasarea citoscheletului asociat la membrana este datorata si unei alte proteine globulare=ankirina. Toate aceste interactiuni anterior prezentate sunt intr-o dinamica permanenta, citoscheletul nefiind o structura rigida, ci una intr-o continua modelare , pentru satisfacerea nevoilor celulare, fenomen la care participa si miscarile proteinelor, de difuzie rotationala, respectiv laterala. Citoscheletul este de asemenea o structura asimetrica.Nodurile citoscheletului membranar au o anumita dinamica si permit membranei sa isi schimbe curbura. Prin aceasta organizare citoscheletala de la nivelul eritrocitului i se poate explica acestuia capacitatea de a-si modifica forma cand trece prin capilare.

10. Rolul proteinelor membranareCa si in cazul lipidelor membranare, proteinele au atat rol structural ( de ex in structura citoscheletului) cat si rol metabolic. Rolurile metabolice ale proteinelor membranare se manifesta in ceea ce priveste schimburile de informatii si substanta dintre celule, sau dintre acestea si mediu. Astfel, proteinele membranare pot fi receptori(pentru hormoni, factori de crestere etc.), transportori prin membrana(canale ionice, pompe ionice, aquaporine) sau transportori cu membrana(clatrina, caveolina).Proteinele membranare mai pot functiona ca enzime(fosfolipaze, kinaze) sau ca proteine implicate in semnalizare(de ex: proteine G).In toate aceste roluri, asimetria structurarii membranei este deosebit de importante. Astfel, receptorii, dar si proteinele de adeziune, prin asimetria lor structurala, permit interactiunea prin ectodomenii cu liganzii specifici, iar prin endodomenii asigura transmiterea informatiei catre interiorul celului si declansarea unor procese celulare care se constituie ca un raspuns celular la semnalele receptate. De remarcat ca in transmiterea semnalelor prin receptori un rol important revine domeniului transmembranar al acestor proteine integrale. Domeniile transmembranare au capacitatea de a suferi rearanjari conformationale, induse de legarea ligandului, rearanjari conformationale ce asigura transmiterea, din afara celulei in citoplasma, a informatiei purtate de ligand si predate prin interactiunea cu receptorul specific, fenomen numit si transductie a semnalului.Odata ajunsa la nivelul endodomeniului receptorului, informatia este preluata, prelucrata, si, de regula, amplificata de participantii la diverse procese de semnalizare(mesageri secunzi sau direct efectori intracelulari). De mentionat aici ca efectele asupra conformatiei domeniilor transmembranare sutn dependente si de fluiditatea membranei din acel moment.Deci, proteinele membranare sporesc eterogenitatea compozitionala si asimetria membranelor si moduleaza proprietatile fluide ale acesteia, adica, accentueaza si modeleaza caracteristicile induse de bistratul lipidic. Altfel spus, proteinele membranare coopereaza cu lipidele atat in structurarea membranei cat si in perfectarea functionalitatii acesteia, prin rolul lor metabolic, cel care asigura integrarea celulei cu mediul. Principalul rol al proteinelor este cel metabolic. Cu cat functiile metabolice ale unei membrane(sau anumite portiuni definite drept domenii/microdomenii membranare) sunt mai pregnante, cu atat continutul de proteine al acelei membrane/portiuni de membrana este mai ridicat.In exercitarea rolurilor metabolice, proteinele membranare pot antrena atat lipidele membranare, cat si componente citosolice sau extracelulare.

11. Glicocalixul: definitie, caracterizare generalaGlicocalixul reprezinta invelisul glucidic al celulelor, constituit din structuri oligozaharidice sau polizaharidice inserate pe lipide ale foitei externe a bistratului sau pe ectoproteine sau pe ectodomeniile proteinelor transmembranare. Deci, glicocalixul reprezinta o parte componenta a membranei celulare, alaturi de plasmalema si de citoscheletul membranar, si este ancorat intotdeauna versantului extern al bistratului lipidic. Glicolipidele poarta doar structuri oligozaharidice, iar proteinele pot purta atat structura oligozaharidice, cat si polizaharidice.Din punct de vedere al structurii biochimice globale, trei sunt componentele membranare ce participa la structurarea glicocalixului prin partile glucidice din structura lor: glicolipidele glicoproteinele proteoglicaniiToate aceste trei categorii de componente sunt denumite generic, glicoconjugate.Grosimea glicocalixului este in medie intre 20 si 50 nm, cu variatii de la un tip de celula la altul, dar si pentru aceeasi celula de la un domeniu membranar la altul(spre ex la celulele epiteliilor unistratificate, intre polul apical si cel latero-bazal). O regula pe care o aplicam in intelegerea grosimii glicocalixului este ca acesta are o grosime cu atat mai mare, cu cat celulele sunt mai putin implicate in interactiuni intercelulare sau cu substrate din matricea extracelulara. In mediile deosebit de agresive(stomac, intestin), glicocalixul celulelor epiteliale unistratificate este ingrosat de secretii glicoproteice de tip mucinic. In structurarea glicocalixului nu participa toate monozaharidele existente in natura, ci doar 7: glucoza(Glc) galactoza(Gal) manoza(Man) fucoza(Fuc) (!! sg zaharida din seria L, restul apartin seriei D) N-acetil glucozamina(GlcNAc) N-acetil galactozamina(GalNAc) acizii sialici (SA) Spunem acizi sialici(la plural) deoarece ne referim la o intreaga clasa de compusi derivati din acidul neuaraminic(precum acidul N-acetil neuraminic sau N-glicolil neuraminic). Diversitatea SA este vasta, intrucat reprezentantii de baza pot fi O-acetilati la hidroxilii de la carbonii 4,7,8 si 9, iar, mai departe, pot fi mono/di/tri acetilati.In afara de aceste sapte componente, in proteoglicani intalnim si monozaharidul xiloza(necesar pentru a lega structura glucidica de o serina din partea proteica), precum si acizi uronici(glucuronic si iduronic).Dupa aceasta enumerare de componente, putem accentua putin ideea eterogenitatii structurarii membranelor(indusa de lipide, si amplificat de proteine si de structurile glucidice), prin faptul ca insiruirea glucidelor din lanturi oligozaharidice nu este aceeasi, ea diferind intre diversele glicolipide si glicoproteine. Mai mult, legarea monozaharidelor intre ele se poate face in mai multe moduri, intrucat exista mai multe grupari hidroxil disponibile. Totusi, nu toata aceasta gama larga de posibilitati este exploatata de celula, lucrurile fiind limitate de tipurile de ezine numite glicoziltransferaze. In legatura cu succesiunea monozaharida a lanturilor oligozaharide, se pot face urmatoarele afirmatii cu caracter de regula: glucoza nu se gaseste NICIODATA in pozitia termina a lantului acizii sialici se gasesc aproape intotdeauna in pozitia terminala a lantului Glicocalixul protejeaza structura membranei celulare impotriva agresiunilor fizico-chimice din mediu.

11*. Metodologia de studiu a glicocalixului Prezenta glicocalixului la suprafata celulelor a fost evidentiata la ME prin metode de citochimie ultrastructurala: nespecifice( evidentiaza structura, fara indicii referitoare la compozitia ei biochimica) specifice ( metode ce permit descrierea, cel putin partiala, a biochimiei structurii)Ca exemplu de metoda nespecifica, amintim folosirea rosului de ruteniu. Acest compus interactioneaza cu sarcinile negative de la nivelul glicocalixului, impregnandu-i gromsimea cu nucleii grei ai ruteniului, conferind structurii electrono-opacitate. Putem caracteriza astfel glicocalixul sub aspectul grosimii sale si a densitatii lanturilor glucidice care il compun.

Ca metoda specifica, prezentam citochimia ultrastructurala cu lectine. Lectinele = proteine sau glicoproteine ce leaga specific structuri glucidice, au cel putin doua situri de legare identice, si NU sunt de origine imuna, adica nu sunt anticorpi.Lectinele mai sunt cunoscute si sub denumriea de aglutinine, deoarece pot aglutina celulele sanguine. Lectinele au fost initial identificate in si extrase din plante. Ulterior, activitati de tip lectinic au fost evidentiate si in organismele animale.In citochimia ultrastructurala, lectinele pot fi folosite fie sub forma nativa, fie cuplate cu trasori electrono-opaci ( ex: feritina, hempeptizi, aur coloidal).Folosirea in forma nativa a lectinelor implica utilizarea unor metode-n doi pasi, numite metode Sandwich. La primul pas, suprafata celulelor este incubata cu lectina aflata-n exces in solutie. Excesul este apoi indepartat, iar lectinele ramase sunt deci atasate specific prin unul din siturile de legare de componentele glucidice ale membrane. Acest lectine vor fi vizualizate prin legarea lor de glicoproteine corespunzatoare, cuplate cu trasori electrono-opaci. Deci, aceste glicoproteine marcate cu trasori electrono-opaci se fixeaza pe siturile de interactiune ale lectinelor ramase disponisibile dupa legarea cu celalalt sit la glicocalix ( deci, la al doilea sit al lectinelor folosite initial, primul sit fiind folosit pentru atasarea la glicocalix ce a avut loc in primul pas).Avantajul acestor metode este ca lectinele sunt folosite cu capacitatile de legare (afinitatea si specificitatea) nealterate. Afinitatea si specificitatea acestor unelte de studiu pot fi afectate-n cazul folosirii directe a unor conjugate lectina-trasor electrono-opac, din cauza reactiilor chimice petrecute-n cadrul cuplarii, sau a posibilelor impiedicari sterice care pot aparea-n conjugat.

In caracterizarea partiala a glicocalixului, a fost folosita o gama larga de lectina, precum:1. Concanavalina A : leaga alfa-Manoza din miezul trimanozidic al structurilor N-glicozidice, sau leaga alfa-Glucoza din pozitie terminala ( deci, la nivelul glicocalixului, Concanavalina A nu se leaga de Glucoza, aceasta nefiind niciodata gasita la nivel terminal)2. Lectina I , izolata din Ulex europaeus (UEA I) recunoaste alfa-Fucoza aflata-n pozitia terminala a lantului glucidic3. DBA leaga structuri ce contin alfa-GalNAc legata de o alta GalNAc4. WGA/LPA : leaga acizi sialici si pot recunoaste si beta-GlcNAc5. PNA si RCA I : pentru beta-Galactoza( PNA se leaga exclusiv de Gal aflata-n pozitie terminala, in timp ce RCA I poate recunoaste si Gal aflata-n pozitie subterminala, doar daca acidul sialic terminal e inserat la hidroxilul carbonului 6 al acesteia)

Cu cat spectrul lectinelor folosite este mai larg, cu atat imaginea asupra glicocalixului este mai detaliata. In plus, combinarea acestor metode cu folosirea exo- sau endo-glicozidazelor pentru degradarea specifica secventiala sau globala a lanturilor glucidice, completeaza fericit caracterizarea citochimica a glicocalixului.

12. Functiile glucidelor membranareGlicocaliaxul protejaza structura membranei celulare impotriva agresiunilor fizico-bio-chimice. Modul in care glicocalixul este strucutrat confera membranei rezistenta mecanica, controland accesul catre straturile profunde ale sale, deci, catre bistratul lipidic si catre componentele proteice ale acesteia. Rolul acesta este cu atat mai important cu cat accesibilitatea factorilor agresivi este mai mare. Aceasta este o motivatie pentru care celulele sanguine, sau polii apicali ai celulelor epiteliale dispuse in monostrat au glicocalixul abundent. Mai mult, in anumite situatii in care agresiunile pot fi mai accentuate, membranele sunt protejate de secretii glicoproteice abundente(precum mucinele).Prin componentele acide din structura lor (acizi sialici, acizi uronici, grupari sulfat), lanturile oligo/polizaharidice ale glicocalixului participa la sarcina negativa a suprafetei celulare, o caracteristica general valabila tuturor celular, care face ca interactiunile dintre celule sa nu se poata realiza decat sub control celularl, in microdomenii membranare inalt specializate in realizarea acestei functii. Asadar, componentele structurale ale glicocalixului sunt implicate in fenomene de recunoastere celulara, cu rol in organizarea de tesuturi si organe, atat prin interactiuni ale celulelor intre ele, cat si prin aderarea acestora la substrate extracelulare.De asemenea, exista si fenomene fiziologice care se desfasoara pe baza unor modificari ale structurilor glucidice ale suprafetei celulare. De exemplu, eritrocitele de mamifer , dupa desialilarea structurilor din glicocalix, sunt eliminate din circulatie la nivelul ficatului si splinei. Pierderea de acid sialic din pozitia terminala a structurilor glucidice din glicocalix reprezinta semnal de imbatranire a acestor celule. La fel si in cazul plachetelor sanguine: cele desialilate isi micsoreaza timpul de viata in circulatie si se determina astfel sporirea trombocitopoiezei. Eliminarea din circulatie a celulelor cu structurile glucidice desialilate implica receptori cu activitate lectinica indreptata impotriva galactozei ajunsa in pozitie terminala, receptori aflati pe suprafata celulelor cu rol de macrofage din organele curatitoare.Alte exemple de fenomene de recunoastere celulara care implica structuri glucidice sunt: extravazarea leucocitelor si monocitelor in zonele de inflamare tisulara fertilizarea si fenomenul de capacitare a spermiilor compatibilatile de grup sanguin ale sistemului AB0 (purtatoarele antigenelor de grup sanguin sunt glicolipide si glicoproteine din membranele celulelor sanguine)In final, putem afirma ca implicarea glicocalixului in fiziologia si patologia celulara a facut ca acesta sa fie considerat tinta terapeutica in tratamentele multor boli.

13. Conceptul de microdomenii de membrana; exemple. Semnificatia biologica a organizarii microdomeniilor de membranaManifestarea bidimensionala a fluiditatii bistratului lipidic da membranei celulare caracterul de structura cu proprietati mezomorfe, proprietati specifice cristalelor lichide. Acest comportament mezomorf este accentuat de capacitatea lipidelor de a organiza microdomenii bogate in sfingolipide, colesterol si anumite proteine membranare. Aceste microdomenii sunt denumite plute lipide(lipid rafts) si au importanta atat structurala(organizeaza ultrastructuri specializate ale membranei, precum caveolele), cat si metabolica, tinand laolalta molecule si macromolecule destine a functiona impreuna in complexe supramoleculare.Pentru a intelege mai bine structurarea microdomeniilor de membrana, sa mentionam ca lipidele, asa cum nu sunt echilibrat repartizate intre cele doua foite ale bistratului, nu sunt omogen amestecate nici in cadrul fiecarei foite a bistratului, ci se asociaza in mod neomogen pe considerente fizice. Plutele lipide fie planare, fie invaginate sub forma caveolelor, se caracterizeaza printr-o fluiditate mai mica in comparatie cu restul bistratului.Prezenta plutelor lipidice si eterogenitatea lor sustin si nuanteaza ideea de organizare a membranelor ca un mozaic fluid. Plutele lipide pot fi asemuite unor sloiuri de forme, dimensiuni si compozitie biochimica variate, ce plutesc in oceanul lipidic mai putin specific organizat. Caveolele reprezinta o forma de plute lipidice, ce se dispun individual, sau in ciorchini la nivelul membranei.Eterogenitatea plutelor lipidice a fost evidentiata prin interpretarea rezultatelor diferitelor metode: diversi detergenti neionici utilizati , ce duc la fractiuni cu compozitie diferita sonicarea preparatelor de membrane si analizarea fractiunii usoare, cu rezultate diferite analize imunocitochimice(diferite incarcaturi proteice la nivelul diverselor microdomenii)Astfel, putem extrage cateva caracteristici generale ale plutelor lipidice: Colesterolul este de 3-5 ori mai abundent decat in restul membranei si reprezinta 33-50% din totalul lipidelor la acest nivel sfingolipidele si glicolipidele sunt imbogatite glicerofosfolipidele sunt sarac reprezentate lipidele specifice foitei interne a bistratului (PS,PI) sunt slab reprezentate la nivelul plutelor lipidice in foita interna de la nivelul plutelor, lipidele contin preferential acizi grasi saturati, lucru ce realizeaza necesarul de rigiditate corespunzator celei a foitei externe, unde sfingolipidele sunt bogat reprezentatePlutele lipidice se caracterizeaza si prin capacitatea de a aglomera anumite tipuri de proteine membranare. Organizarea lipidelor membranare in microdomenii accentueaza aspectul de mozaic fluid al membranelor.

14. Caile de semnalizare: definitie, criterii de clasificareSemnalizarea celulara reprezinta modalitatea esentiala prin care celulele pot comunca intre ele indiferent de distanta la care se afla. Asadar, semnalizarea celulara presupune, de regula, cooperarea intre doua celule: una care trimite semnalul, cealalta, care il recepteaza. In functie de distanta la care se afla celulele care semnalizeaza intre ele, caile pot fi: endocrine, atunci cand celulele se afla la distanta, iar molecula semnal trebuie sa fie transportata de umorile organismului( de regula, de sange) paracrine, atunci cand celulele se afla in imediata vecinatate autocrine, atunci cand semnalul este transmis si receptat de aceeasi celula juxtacrine, cand celulele sunt jonctionate( semnalizarea juxtacrina presupune interactiunea unor molecule din structura membranelor celor doua celule: semnalizatoare, respectiv tinta, spre deosebire de primele 3 cai , unde semnalizarea se face prin molecule secretate de celula semnalizatoare)Raspunsul celular in urma fenomenului de semnalizare determina unul din trei efecte:1. Supravietuire2. Proliferare3. Moarte celulara programata=apoptoza(apare fie in lipsa oricarui semnal, fie in prezenta unor semnale specifice)Indiferent de raspunsul celular determinat, se definesc patru etape ale procesului de semnalizare celulara:1. Initierea semnalizarii prin legarea ligandului de receptor ( prin interactiuni specifice de o mare afinitate)2. Transductia semnalului si activarea receptorului( aceasta etapa presupune modificari conformationale la nivelul moleculei receptorului, datorate interactiunii cu ligandul)3. Activarea efectorului si amplificarea semnalului 4. Atenuarea semnalului si desensibilizarea celulei ( aceasta etapa presupune inactivarea efectorilor si desfacerea ligandului de receptor, prin degradarea ligandului sau prin lizarea moleculelor activatoare, de ex scindarea GTP la GDP)

15. Receptorii pentru hormoni si neurotransmitatori:definitie, criterii de clasificareIn functie de proprietatile fizico-chimice ale moleculei semnal, receptorii se impart in:1. Receptori pentru molecule semnal lipofile (hidrofobe)2. Receptori pentru molecule semnal hidrofileReceptorii pentru liganzi lipofili sunt proteine citosolice care preiau hormonul dupa difuzia acestuia prin membrana si dupa formarea complexului ligand-receptor acesta este transportat in nucleu, unde isi indeplineste functia, aceea de a modula exprimarea genica. Sunt cunoscute 6 tipuri de receptori pentru liganzi lipofili: receptor la cortizol receptor la estrogeni receptor la progesteron receptor la vitamina D receptor la hormoni tiroidieni receptor la acid retinoicOricare ar fi tipul de receptor, ei prezinta unele caracteristici comune, precum: sit de legare a hormonului sit de legare la molecula de ADN domeniu de activare a transcrieriiIn stare inactiva, in citosol, inainte de a interactiona cu ligandul, receptorul este cuplat la un complex proteic inhibitor. In aceasta stare complexata, inactiva, receptorul are mascate situl de legare la ADN si domeniul de activare a transcrierii. Dupa legarea ligandului, receptorul se desprinde de complexul de inactivare si este translocat in nucleu unde, datorita expunerii locului de legare la ADN, se atasaza in zone favorabile activarii genei a carei transcriere este determinata , iar procesul de transcriere este declansat.

16. Explicati modularea activitatii adenilatciclazei membranare de catre receptorii cuplati cu proteinele G heterotrimerice*Inainte de a citi, a se urmari cu atentie urmatorul filmulet , care explica totul (textul e practic explicatia din video) :http://www.youtube.com/watch?v=3RHQ2Kol1ac

Sunt proteine atasate versantului intern al bistratului lipidic, alcatuite din 3 subunitati : alfa, beta si gama. Se gasesc cuplate cu receptori -proteine transmembranare-, subunitatea alfa urmand a functiona drept mesager prim in diverse tipuri de semnalizare mediate pe calea proteinelor G heterotrimerice.Receptorii cuplati cu proteine G heterotrimerice sunt proteine transmembranare multipas tip I cu 7 treceri prin planul membranei, cu ectodomeniu mare, structurand situl de legare a ligandului, si cu endodomeniu continand situl de interactiune cu proteinele G heterotrimerice, cat si locuri de fosforilare necesare desensibilizarii. Succint, mecanismul de actiune al acestor receptori implica urmatoarele etape:1. Legarea ligandului si activarea receptorului2. Interactiunea receptorului activat cu proteinele G heterotrimerice si activarea acestora prin eliberarea GDP, legarea GTP si disocierea trimerului in subunitate alfa plus heterodimer beta-gama3. Transmiterea semnalului la efectorul din aval (activand sau inhiband adenilat-ciclaza)Receptorii cuplati cu proteine G heterotrimerice au mecanisme diferite, actionand asupra unor efectori diferiti si inducand raspunsuri diferite in functie de tipul de proteina G heterotrimerica asociata.Au fost identificate mai multe tipuri de proteine G heterotrimerice: Gs, Gi, Gq(activeaza fosfolipaza C-Beta),G0,proteine G olfactorii (activeaza adenilat ciclaza in neuronii olfactorii, proteine Gt(transducine).Ca mecanism: legarea ligandului pe ectodomeniul receptorului cuplat cu proteina G heterotrimerica determina modificari conformationale ce se transmit proteinei G, a carei subunitate alfa, initial continand GDP, inlocuieste intreaga molecula de GDP cu, una de GTP din citosol. Odata inlocuit GDP cu GTP, subunitatea alfa se detaseaza de complexul receptor-proteina G heterotrimerica si se ataseaza unei proteine efector, avand deci rol de mesager prim. Tipurile de proteine efector sunt variate, si depind de tipul de ligand, tipul de receptor , si mai ales de tipul de proteina G heterotrimerica asociata. Mesagerul prim , adica, subunitate alfa cu GTP, poate determina din partea efectorului, in functie de tipul ligandului, un raspuns inhibat sau excitat. Dupa terminarea rolului de mesager prim, subunitatea alfa hidrolizeaza GTP-ul inapoi la GDP, se dezataseaza de efector, si se reataseaza proteinei G heterotrimerice de care apartine.Un exemplu de receptor ce functioneaza cuplat cu proteine G heterotrimerice ar fi cel al receptorilor adrenergici. Adrenalina este ligandul, se leaga la receptor-> modificari conformationale-> fosforilarea GDP la GTP , detasarea subunitatii alfa, care se leaga de efectorul ADENILAT CICLAZA ,o enzima proteica ce catalizeaza reactia de formare a mesagerului secund AMP ciclic, din ATP.Hormonii care activeaza adenilat ciclaza sunt reprezentati de glucagon, adrenalina(prin receptorii beta1 si beta2), ACTH, parathormon , acestia legandu-se de receptorii legati de proteine G heterotrimerice de tip stimulator.Hormonii care inhiba adenilat ciclaza sunt adrenalina(legata prin receptori alfa2) si somatostatina.Presupunand o activare a adenilat ciclazei A , aceasta va sintetiza AMP ciclic, mesager secund ce va migra mai departe si va interactiona cu o alta proteina, numita protein-kinaza A. Toate protein-kinaza au o structura ce contine un cap si 2 cozi. Fiecare coada are cate o subunitate reglatoare si cate o subunitate catalitica.Atata timp cat subunitatea reglatoare si cea catalitica sunt amandoua anexate cozii, protein-kinaza A este inactiva.In schimb, la interactiunea cu AMP ciclic, subunitatile catalitice disociaza in citosol, ele fiind responsabile de efectele adrenalinei, in acest caz.Regulatori negativi ai proteinelor G 1) Presupunand o proteina G heterotrimerica ramasa activa in mod anormal, ramasa deci fara subunitate alfa pentru o perioada mare de timp, si deci aflata in plin proces de semnalizare, rezulta ca , receptorul va avea atasate doar subunitatile beta si gama. Acestea, in lipsa subunitatii alfa, ataseaza o alta proteina numita beta-adrenergic receptor kinase(BARK), care va fosforila proteina G.Regiunile fosforilate anterior de BARK vor atrage alte proteine, numite BETA-ARRESTINS , care vor trage intreg complexul receptor-subunitati beta-gama in interiorul celulei, astfel inactivandu-l, prin scoaterea din contact cu moleculele ligand, care se gasesc in afara celulei.2) Un alt regulator negativ este proteina fosfodiesteraza, care are o abordare ceva mai putin radicala decat beta-arrestins, contracarand practic actiunea adenilat ciclazei, adica, transformand AMPciclic, aflat in cantitati mari in celula in urma activitatii prelungite a lantului de semnalizare pornti de la proteina G, inapoi in AMP aciclic.Cofeina este un inhibitor al fosfodiesterazei, ducand deci la prezenta in organism a cantitati crescute de AMP-ciclic, lucru ce confera senzatia specifica de energie.

17. Mesagerii secunzi: definitie, exemple, efectori intracelulariMesagerii secunzi sunt componente ale cailor (cascadelor) de semnalizare si reprezinta molecule sintetizate-n urma activarii receptorului de catre ligand= mesagerul prim.Mesagerii secunzi activeaza diverse sisteme enzimatice cu rol in raspunsul celular, avand rol in amplificarea semnalului.In continuare, vom descrie cateva cai de semnalizare, folosind mesagerii secunzi si efectorii lor drept exemple pentru rezolvarea acestui subiect :

1. Modularea activitatii adenilat-ciclazei de catre GPCR ( G-protein coupled receptors) , unde:Efectorul intracelular = ADENILAT CICLAZAMesagerul secund = AMP c *pt abordarea completa a acestui exemplu, a se vedea subiectul 16

2. Calea fosfolipazei C *Inainte de a citi, a se urmari cu atentie urmatorul filmulet , care explica totul (textul e practic explicatia din video) :http://www.youtube.com/watch?v=FvPKbogo2pkAceasta cale cuprinde : un receptor transmembranar multipas, cu 7 treceri prin bistrat, cu situs de legare pentru ligand in ectodomeniu si endodomeniu "cuplat" cu o proteine G heterotrimerica.Efector intracelular 1: PLC (fosfolipaza C)Sub actiunea PLC, din PIP2 =>mesagerii secunzi: DAG ( diacilglicerol ) si IP3 (Inozitol trisfosfat) . Cunoscand structura amfipata a glicerofosfatidelor, stim deci ca :DAG va avea caracter hidrofob si deci va ramane in membrana, actionand ca mesager secund si activand PKC(protein kinaza C). Acesta fosforileaza diverse enzime, pe unele activandu-le, pe altele inhibandu-le.IP3 va avea caracter hidrofil si va intra in citosol, unde va patrunde-n RE si va actiona ca mesager secund, determinand RE sa elibereze Ca2+ in citoplasma, iar Ca2+ va activa PKC ( protein kinaza C). Nota (de impresie pt examen): Ca2+ functioneaza drept mesager intracelular ubicuitar.

3. Oxidul nitric gazos (NO)Cand acetilcolina este eliberata de nervii autonomi ai vaselor sanguine in peretii acestora, ea va determina relaxarea muschilor din peretii vasului.Acetilcolina actioneaza indirect, determinand celulele endoteliale sa elibereze NO(=mesager secund !! ), care semnalizeaza apoi celulelor muschiului neted sa se relaxeze.NO este suficient de hidrofobic si de mic pentru a trece prin membrana plasmatica a celulei tinta, determinand procese de reglare intracelulare.Acest efect al NO asupra vaselor sanguine explica mecanismul de actiune al ntiroglicerinei, utilizata de peste 100 de ani in tratamentul anginei pectorale, fiind convertita la NO pentru a relaxa vasele sanguine din inima, asigurand cresterea fluxului sangvin spre muschiul cardiac. Alte roluri ale NO: este produs ca mediator local de catre neutrofilele si macrofagele activate pentru a ucide microorganismele invadatoare eliberat de nervii autonomi din penis, determinand dilatarea locala a vaselor sanguine responsabile pentru erectie

Clasificari ale transportului membranarA se vedea cursul doctorului Leabu despre transportul membranar, unde se va gasi clasificarea ca atare.

18. Transportul pasiv: clasificare, exempleTransportul pasiv este un tip de transport prin membrana, acesta din urma fiind specific ionilor si moleculelor mici(sub 10 angstromi, sub 800 Da).In functie de necesarul de energie , transportul prin membrana se clasifica in: transport pasiv transport activTransportul pasiv este numit si transport disipativ, de la procesul de difuziune= trecerea de substanta de la concentratie mare la concentratie mica. Unele molecule mici pot strabate membrana celulara strecurandu-se printre lipidele membranare. Astfel de molecule sunt moleculele nepolare=hidrofobe(O2, N2, CO2, NO, CO, eter etilic, benzen), dar si moleculele polare mici(sub 100 Da), precum apa, etanol, uree, glicerina. Acest tip de transport este numit difuzie simpla.Pentru moleculele polare mari (100-800 Da), dar si pentru ioni, transportul prin membrana se face doar prin implicarea de proteine transmembranare, ce poarta in acest caz denumirea de transportori(pentru molecule polare mari: glucoza, aminoacizi, nucleotide) sau canale ionice(pt ioni: H,Na, HCO3, K, Ca2+, Cl-, Mg2+). Transportul pasiv prin transportori sau prin canale ionice se numeste si difuzie facilitata.In functie de numarul tipurilor de substante transportate simultan, difuzia facilitata poate fi clasificata in: transport uniport(este transportata o singura entitate chimica) transport cuplat=co-transport(sunt transportate simultan doua sau mai multe entitati chimice) transport simport(toate substantele sunt transportate in acelasi sens) transport antiport(cel putin una din substante merge-n sens opus celorlalte)Ca exemplu de transport uniport, amintim transportorul de glucoza din mb eritrocitara GLUT1, o proteina multipas de 45 kDa, cu 12 treceri in alfa-helix prin planul membranei. In mb eritrocitara exista peste 200 000 de molecule de transportor GLUT1 pentru o celula. GlUT1 face parte dintr-o familie de transportori de glucoza cu 14 membri ( GLUT1 -14), toti cu cate 12 treceri in alfa-helix prin planul membranei si cu capetele N- si C- terminale in endodomeniu.Ca exemplu de transport simport, amintim co-transportorul de sodiu/glucoza (SGLT1) din membrana apicala a enterocitelor. Acest transportor foloseste disiparea gradientului De na pentru a transporta glucoza din lumenul intestinal in citosolul enterocitelor impotriva gradientului de concentratie a glucidului. Un astfel de transportor mai este numit si transport activ secundar, deoarece se bazeaza practic pe energia consumata anterior de celula pentru mentinerea gradientului de Na+. SGLT1 este o proteina transmembranara multipas cu 14 treceri in alfa-helix prin planul membranei, din care trecerile 10-14 au fost dovedite ca structurand calea de trecere a glucozei. Ambele capete ale lantului polipeptidic sunt in ectodomeniu. La om, SGLT1 face parte dintr-o familie de co-transportori sodiu/glucoza ce numara 11 membri.Ca exemplu de transport antiport, amintim canalul de schimb anionic HCO3- / Cl- din mb eritrocitara, cunoscut si drept banda 3/ AE1 (Anion Exchanger 1).

Legat de canalele ionice, acestea nu sunt permanent deschise, iar celula poate controla functionarea lor.In functie de mecanismul prin care este controlat regimul de deschidere a lor, canalele ionice se pot imparti in 3 categorii:1. Canale ionice operate electric2. Canale ionice operate chimic(prin liganzi)3. Canale ionice operate mecanic( depind de exercitarea unor tensiuni mecanice asupra mb)Activarea canalelor respecta un mecanism ciclic, ce asigura inactivarea lor chiar in conditiile care au determinat deschiderea. Canalele ionice pot prezenta trei stari: Stare inchisa= de repaus, in absenta stimulului Stare deschisa, dupa aparitia stimulului Stare inactiva, inchisa la prezenta prelungita a stimulului

Trecerea apei printr-o membrana poarta denumirea de osmoza. Apa poate trece prin mb celulara atat prin dufuzie simpla, cat si prin difuzie facilitata, prin complexe proteice transmembranare cu numele de aquaporine, prin care apa poate trece in ambele sensuri, depinzand de presiunile coloid-osmotice existente de cele doua parti ale membranei.

19. Calea de semnalizare JAK-STAT Marea familie a receptorilor cytokinici include receptori pentru multe tipuri de mediatori locali, denumiti colectiv cytokine, precum si receptori pentru hormoni, spre ex pentru prolactina. Acesti receptori cytokinici, transmembranari, sunt asociati cu tyrozin-kinaze din citoplasma ( deci, legate la endodomeniu), denumite Janus Kinases ( JAK's). Exista 4 tipuri de JAK's: JAK 1 JAK 2 JAK 3 Tyk 2JAK's se fosforileaza intre ele, precum si fosforileaza si astfel activeaza proteine numite STATs (signal transducers and activators of transcription). Proteinele STAT sunt localizate in citosol si sunt gene regulatorii latente, deoarece ele migreaza in nucleu si induc transcriere DOAR dupa ce sunt activate.

Mecanismul cailor JAK-STAT ( a se urmari desenul in paralel cu cititul , pentru o completa intelegere)Receptorii pentru cytokine sunt dimeri sau trimeri stabil asociati cu 1 sau 2 din kinazele Janus cunoscute ( JAK1,JAK2,JAK3, Tyk 2) . Legarea ligandului de tip cytokinic ( spre ex: gama interferon, alfa interferon, eritropoetina) produce modificari conformationale, in sensul in care apropie intre ele kinazele Janus de pe fiecare monomer al receptorului cytokinic. Astfel, JAK's se fosforileaza intre ele, sporindu-si reciproc activitatea. De asemenea, JAK's fosforileaza resturi de tyrozina din structura receptorului, creand situsuri fosfotyrozinice. Aici se vor lega STAT's.Dupa legarea proteinelor STAT in situsurile fosfotyrozinice, sunt si ele la randul lor fosforilate de JAK's => dezatasarea fiecarei proteine STAT de pe receptorul dimeric , urmand dimerizarea in citosol a celor 2 STAT , prin intermediul domeniilor SH2. In aceasta forma, dimerul STAT este translocat in nucleu, unde activeaza transcrierea genica.Ca mecanisme de feedback/inhibitie, trebuie precizat faptul ca dimerii STAT pot activa transcrierea unor gene ce codifica sinteza unor proteine inhibitorii ale caii in sine, prin desfosforilari fie ale kinazelor Janus, fie ale dimerilor STAT. Nota: Legarea cytokinei la receptor fie induce dimerizarea a 2 lanturi polipeptidice(monomeri) ale (ai) receptorului, fie le orienteaza catre un dimer preformat. In orice sens, scopul este apropierea tyrozin-kinazelor Janus pentru a se fosforila intre ele si a incepe intregul proces descris anterior. In unele cazuri, putem vorbi si de alcatuirea unui trimer .

20. Aquaporinele. Semnificatie si implicatii medicale

Prin membrana celulara, apa poate trece atat prin difuzie simpla, cat si prin difuziune facilitata, intrucat multe celule si-au produs complexe proteice transmembranare destinate transportului pasiv al apei. Aceste complexe proteice transmembranare destinate transportului pasiv al apei poarta denumirea de aquaporine, iar rolul lor este acela de a eficientiza trecerea apei prin membrane, astfel incat, pe de o parte, fenomenele fiziologice sa se petreaca dupa o dinamica adecvata, si, pe de alta parte, la aparitia unor dezechilibre osmotice accidentale, homeostazia celulara sa nu sufere dramatic si sa puna in pericol supravietuirea.Aquaporinele sunt proteine identificate in toate organismele(bacterii, mamifere, plante) si sunt ubicuitare in organismele multicelulare, fiind exprimate in diferite grade in toate tipurile de celule. La om au fost identificate cel putin 13 membri ai familiei proteice ai aquaporinelor.Aquaporinele sunt proteine transmembranare cu masa moleculara de 30 kDa, cu 6 treceri in alfa helix prin bistratul lipidic si cu doua segmente scurte, tot helicoidale, ce marginesc vestibulele citoplasmatic, respectiv extracelular ale canalului organizat de cele sase domenii transmembranare. Capetele amino si carboxi terminale ale lantului polipeptidic se afla pe fata citosolica. In membrane, monomerii astfel organizati transmembranar se asociaza cate patru, formand homotetrameri.In cazul AQP4, homotetramerii se pot asocia intre ei, rezultand retele octogonale.Apa poate trece prin canalele aquaporinelor in ambele sensuri, depinzand de presiunile coloidosmotice existente de cele doua parti ale membranei. Exprimarea adecvata a aquaporinelor in celule este importanta pentru multe fenomene fiziologice: adsorbtia adecvata la nvielul cailor urinare pentru formarea urinei, semnalizare neuronala, motilitate celulara, hidratarea pielii, proliferare celulara, metabolism lipidic(prin implicarea aquagliceroporinelor, aquaporine cu transport dual pentru apa si glicerina).Deficiente in exprimarea aquaporinelor pot induce sau insoti diverse patologii, precum: cataracta, diabet insipid, edem cerebral, obezitate.

21. Semnificatia biologica a eterogenitatii compozitionale, a organizarii asimetrice si comportamentului fluid al membranelorMembranele celulare se caracterizeaza prin eterogenitate compozitionala, bazata pe o mare diversitate de tipuri de molecule(bistrat lipidic, componenta proteica, componenta glucidica).Lipidele din mb pot fi: fosfolipide 70-75% fosfogliceride PC PE PS PI PA fosfosfingozide colesterol 20-25% glicolipide 1-10%Reamintim ca in poz 1 a glicerinei este de obicei esterificat un acid gras saturat(C14,C16,C18), iar in poz 2 se afla unul nesaturat(C18:1, C18:2, C18:3, C20:4) , putand exista multiple combinatii.Proteinele din mb pot fi: periferice(extrinseci) ectoproteine endoproteine integrale(intrinseci) transmembranare ectodomeniu endodomeniu domeniu transmembranar cufundate partial Glucidele pot fi : glicolipide( comp. glucidica pe lipid) glicoproteine(oligozaharid pe proteina) proteoglicani(polizaharid pe proteina) Glc, GalNAc, Gal, GalNAc, Man, Fuc, SAPentru substantierea caracterului eterogen al structurarii membranelor(indus de lipide, amplificat de proteine si structuri glucidice), trebuie sa subliniem ca insiruirea glucidelor in lanturile oligozaharidice nu este aceeasi, diferind intre glicolipide si glicoproteine, dar si intre diversele glicolipide si glicoproteine.Mai mult, legarea monozaharidelor intre ele se poate face-n mai multe moduri, intrucat exista mai multe grupari hidroxil disponibile.Ca semnificatie biologica, eterogenitatea implica prezenta unei multitudini de componente, fapt ce se traduce, la nivel celular, intr-o multitudine de posibilitati de actiune diversitate de functii.

Pe langa eterogenitate compozitionala, membranele celulare se caracterizeaza prin aranjare asimetrica, conferita chiar de structura de baza, bistratul lipidic, la nivelul caruia foita externa cotnine preponderent anumite tipuri de lipide, iar foita interna, altele. Asimetria este sporita de proteinele ce completeaza organizarea membranelor, cele adsorbite pe fata externa fiind diferite de cele de pe fata interna, in timp ce proteinele cufundate in structura lipidica de baza expun portiuni diferite ale lantului polipeptidic de o parte sau de cealalata a bistratului. Pe de alta parte, componenta glucidica a mb se gaseste numai la suprafata acestora, crescand caracterul asimetric al organizarii lor.Ca semnificatie biologica, asimetria mb celulare ofera posibilitatea derularii de fenomene fizico-bio-chimice diferite pe fiecare din cele doua fete. Astfel, intre acestea putem asista la o disjungere sau, dimpotriva, la o solidaritate de actiune, in functie de contextul "biosocial" in care se gaseste celula la un moment dat.

Diversitatea de molecule care organizeaza membranele celulare prezinta o permanenta dinamicitate, ceea ce le confera un comportament fluid. Mai mult, miscarea componentelor lipidice si proteice se realizeaza numai in planul membranei, fara rasturnari ale moleculelor care sa permita trecerea lipidelor dintr-o foita a bistratului in cealalta, sau proteinelor sa isi treaca portiunile expuse la exterior catre interior, sau invers. Aceste restrictii de mobilitate determina caracterul fluid manifestat bidimensional al membranelor.Lipidele membranare executa urmatoarele tipuri de miscari: Intramoleculare(pe care lipidele le realizeaza in raport cu propria lor axa si greutate) de rotatie(109 rotatii/s) de flexie a cozilor hidrofobe(108 rotatii/s) Intermoleculare de translatie(miscari ale lipidelor in planul membranei, unele pe langa altele- 107/s schimbari de directie) flip-flop(miscari de trecere a lipidelor dintr-o foita a bistratului in cealalta, au o frecventa foarte mica, practic nula, cu exceptia cazului membranei R.E)Manifestarea bidimensionala a fluiditatii bistratului lipidic da mb celulare caracter de structura cu proprietati mezomorfe, asemeni cristalelor lichide. Acest comportament mezomorf este accentuat si de capacitatea lipidelor de a organiza microdomenii bogate-n sfingolipide, colesterol si anumite proteine membranare=plute lipidice.Modulatori ai fluiditatii:1. Fizici : temperatura (d.p) si presiunea(i.p)2. Chimici intrinseci : acizi grasi nesaturati(d.p) si colesterol (i.p)-->provoaca rigidizare3. Chimice extrinseci (pot fi fiziologici, patologici sau terapeutici)Fluiditatea mai este modulata si de componentele proteice si de glicocalix.Miscarea bidimensionala asigura mentinerea asimetriei din organizarea membranei. Semnificatia biologica a permanentei miscari a componentelor biochimice in membrana este aceea ce permite acestora sa se asocieze intr-o diversitate de modalitati, pentru a indeplini o multitudine de activitati.

22. Proteinele G heterotrimericeSunt proteine atasate versantului intern al bistratului lipidic, alcatuite din 3 subunitati : alfa, beta si gama. Se gasesc cuplate cu receptori -proteine transmembranare-, subunitatea alfa urmand a functiona drept mesager prim in diverse tipuri de semnalizare mediate pe calea proteinelor G heterotrimerice.Receptorii cuplati cu proteine G heterotrimerice sunt proteine transmembranare multipas tip I cu 7 treceri prin planul membranei, cu ectodomeniu mare, structurand situl de legare a ligandului, si cu endodomeniu continand situl de interactiune cu proteinele G heterotrimerice, cat si locuri de fosforilare necesare desensibilizarii. Succint, mecanismul de actiune al acestor receptori implica urmatoarele etape:4. Legarea ligandului si activarea receptorului5. Interactiunea receptorului activat cu proteinele G heterotrimerice si activarea acestora prin eliberarea GDP, legarea GTP si disocierea trimerului in subunitate alfa plus heterodimer beta-gama6. Transmiterea semnalului la efectorul din aval (activand sau inhiband adenilat-ciclaza)Receptorii cuplati cu proteine G heterotrimerice au mecanisme diferite, actionand asupra unor efectori diferiti si inducand raspunsuri diferite in functie de tipul de proteina G heterotrimerica asociata.Au fost identificate mai multe tipuri de proteine G heterotrimerice: Gs, Gi, Gq(activeaza fosfolipaza C-Beta),G0,proteine G olfactorii (activeaza adenilat ciclaza in neuronii olfactorii, proteine Gt(transducine).Ca mecanism: legarea ligandului pe ectodomeniul receptorului cuplat cu proteina G heterotrimerica determina modificari conformationale ce se transmit proteinei G, a carei subunitate alfa, initial continand GDP, inlocuieste intreaga molecula de GDP cu, una de GTP din citosol. Odata inlocuit GDP cu GTP, subunitatea alfa se detaseaza de complexul receptor-proteina G heterotrimerica si se ataseaza unei proteine efector, avand deci rol de mesager prim. Tipurile de proteine efector sunt variate, si depind de tipul de ligand, tipul de receptor , si mai ales de tipul de proteina G heterotrimerica asociata. Mesagerul prim , adica, subunitate alfa cu GTP, poate determina din partea efectorului, in functie de tipul ligandului, un raspuns inhibat sau excitat. Dupa terminarea rolului de mesager prim, subunitatea alfa hidrolizeaza GTP-ul inapoi la GDP, se dezataseaza de efector, si se reataseaza proteinei G heterotrimerice de care apartine.Un exemplu de receptor ce functioneaza cuplat cu proteine G heterotrimerice ar fi cel al receptorilor adrenergici. Adrenalina este ligandul, se leaga la receptor-> modificari conformationale-> fosforilarea GDP la GTP , detasarea subunitatii alfa, care se leaga de efectorul ADENILAT CICLAZA ,o enzima proteica ce catalizeaza reactia de formare a mesagerului secund AMP ciclic, din ATP.Hormonii care activeaza adenilat ciclaza sunt reprezentati de glucagon, adrenalina(prin receptorii beta1 si beta2), ACTH, parathormon , acestia legandu-se de receptorii legati de proteine G heterotrimerice de tip stimulator.Hormonii care inhiba adenilat ciclaza sunt adrenalina(legata prin receptori alfa2) si somatostatina.Presupunand o activare a adenilat ciclazei A , aceasta va sintetiza AMP ciclic, mesager secund ce va migra mai departe si va interactiona cu o alta proteina, numita protein-kinaza A. Toate protein-kinaza au o structura ce contine un cap si 2 cozi. Fiecare coada are cate o subunitate reglatoare si cate o subunitate catalitica.Atata timp cat subunitatea reglatoare si cea catalitica sunt amandoua anexate cozii, protein-kinaza A este inactiva.In schimb, la interactiunea cu AMP ciclic, subunitatile catalitice disociaza in citosol, ele fiind responsabile de efectele adrenalinei, in acest caz.Regulatori negativi ai proteinelor G 1) Presupunand o proteina G heterotrimerica ramasa activa in mod anormal, ramasa deci fara subunitate alfa pentru o perioada mare de timp, si deci aflata in plin proces de semnalizare, rezulta ca , receptorul va avea atasate doar subunitatile beta si gama. Acestea, in lipsa subunitatii alfa, ataseaza o alta proteina numita beta-adrenergic receptor kinase(BARK), care va fosforila proteina G.Regiunile fosforilate anterior de BARK vor atrage alte proteine, numite BETA-ARRESTINS , care vor trage intreg complexul receptor-subunitati beta-gama in interiorul celulei, astfel inactivandu-l, prin scoaterea din contact cu moleculele ligand, care se gasesc in afara celulei.2) Un alt regulator negativ este proteina fosfodiesteraza, care are o abordare ceva mai putin radicala decat beta-arrestins, contracarand practic actiunea adenilat ciclazei, adica, transformand AMPciclic, aflat in cantitati mari in celula in urma activitatii prelungite a lantului de semnalizare pornti de la proteina G, inapoi in AMP aciclic.Cofeina este un inhibitor al fosfodiesterazei, ducand deci la prezenta in organism a cantitati crescute de AMP-ciclic, lucru ce confera senzatia specifica de energie.http://www.youtube.com/watch?v=3RHQ2Kol1achttp://www.youtube.com/watch?v=2bbBrpgeheY

23.Modalitati generice de reglare a activitatii unui canal ionic membranarIn functie de mecanismul prin care este controlat regimul de deschidere a lor, canalele ionice se pot imparti in trei categorii:1. Canale ionice operate electric(prin voltaj), adica prin modificarea potentialului de membrana. Acestea sunt inchise atunci cand potentialul membranei este cel normal(adica 50-70 mV, cu minus pe partea citosolica), si se deschis atunci cand potentialul de repaus al membranei se modifica.2.Canale ionice operate chimic(prin liganzi), adica, se deschid atunci cand leaga un compus chimic(ligandul) care schimba conformatia proteinei. Ligandul se poate lega in ectodomeniul proteinei care structureaza canalul fiind ligand extracelular, sau, pentru alte tipuri de canale, la endodomeniu(ligand intracelular=citosolic).3.Canale ionice controlate mecanic, adica, a caror stare deschisa/inchisa este dependenta de exercitarea unor tensiuni mecanice asupra membranei.

Activarea canalelor respecta un mecanism ciclic, care asigura inactivarea lor chiar in conditiile care au determinat scaderea, deoarece pot prezenta trei stari: starea inchisa, de repaus, in absenta stimulului starea deschisa, care permite trecerea ionilor, dupa aparitia stimulului starea inactiva, inchisa la prezenta prelungita a stimulului Aceasta trecere intr-o stare refractara a canalelor ionice asigura mentinerea homeostaziei ionice intracelulare in conditiile de persistenta a semnalelor, refacerea potentialului membranar, desprinderea ligandului, si, eventual, metabolizarea sa, cu revenirea celulei la starea bazala=starea de neexcitatie, astfel incat sa devina sensibila la o noua stimulare.Exista si canale ionice ce functioneaza doar atata vreme cat sunt fosforilate. De asemenea, activitatea canalelor ionice poate fi blocata reversibil sau ireversibil de substante inhibitoare(pot fi medicamente) sau chiar de substante toxice, folosite de armata sau in atacuri teroriste.

24. Transportul activ: clasificare, exempleTransportul activ reprezinta transportul prin membrana de molecule mici si/sau ioni impotriva gradientelor de concentratie.Transportul activ este realizat de biostructuri proteice, cu consum de energie, provenita din scindarea unor molecule macroergice(de regula ATP), biostructuri proteice ce poarta denumirea de pompe.Exemple:Pompa de Na+/K+, numita de Na+/K+ ATP-aza: structura complexa dpdv biochimic tetramer(2 sub mari alfa catalitice si transportoare si 2 sub mici beta, cu rol reglator, necesare penru impachetarea conformationala corecta a subunitatilor alfa in reticulul endoplasmic, in momentele biosintezei, asamblarii in membrana si maturarii) uneori poate prezenta si subunitate gama, cu 7 izoforme si rol in modularea activitatii pompei, se exprima special la nivelul rinicihiului, avand rol in adaptarea si supravietuirea celulara in conditii hipertone apartine tipului P de ATP-aze, alaturi de pompa protonica si cea de Ca mai exista si tipul V(vacuolar) , E si F de ATP-aze, ultimele 2 avand rol in semnalizare, si nu in transport ciclul de pompare are 7 etape si duce la expulzarea a 3 ioni de Na+ si introducerea a 2 ioni de K+ in celula, pe baza unor modificari de conformatie intre doua forme: E1 cu acidul aspartic din situl catalitic nefosforilat si E2 cu acidul aspartic fosforilatEtapele ciclului de pompare sunt:1. Legarea a 3 ioni de Na pe endodomeniul subunitatii alfa a pompei2. Legarea ATP pe endodomeniul subunitatii alfa a pompei3. Fosforilarea unui radical aspartat prin scindarea ATP la ADP=> consumul energetic necesar activitatii pompei, si schimbarea conformatiei proteinei care duce la expunerea celor trei ioni de Na pe ectodomeniul subunitatii alfa4. Disocierea si expulzarea in exterior a ionilor Na+ si legarea pe ectodomeniul subunitatii alfa a doi ioni de K+5. Schimbarea conformatiei subunitatii alfa si hidrolizarea aspartilfosfatului6. Internalizarea si expunerea ionilor K pe endodomeniul subunitatii alfa7. Disocierea ionilor K si eliberarea lor in citosol cu inchiderea unui ciclu de pomparePompa Na+/K+ este electrogenica, adica, prin eliminarea a 3 ioni de Na+ si introducerea a numai 2 ioni de K+, contribuie la realizarea si/sau mentinerea potentialului membranar.

Transportorii ABC ( ATP-Binding Casette)Semnificatia fiziologica si medicala a lor rezida din faptul ca acesti transportori induc rezistenta multipla la medicamente, fiind capabili sa elimine medicamentele din celula. Permit adaptare si rezistenta la antibiotice, iar celulelor canceroase rezistenta la tratamente.Transporta o mare varietate de substante(ioni, glucide, AA, vitamine, lipide, antibiotice, medicamente, oligozaharide si chiar proteine de masa moleculara mare).Transportorii ABC se impart in: sisteme importatoare mici(fiecare element de organizare structurala e asigurat de un alt polipeptid) sisteme importatoare mari(organizarea implica doua subunitati proteice identice=homodimer, sau diferite=heterodimer) sisteme exportatoare organizate ca dimeri sau monomeriLa om sunt identificate aproape 50 tipuri de transportori ABC.Elemente ale organizarii transportorilor ABC:-domenii transmembranare-domenii legare nucleotide-domenii legare solut

25. Pompe - ATP-aze: clasificare, exemple Pompa de Na+/K+, numita de Na+/K+ ATP-aza: structura complexa dpdv biochimic tetramer(2 sub mari alfa catalitice si transportoare si 2 sub mici beta, cu rol reglator, necesare penru impachetarea conformationala corecta a subunitatilor alfa in reticulul endoplasmic, in momentele biosintezei, asamblarii in membrana si maturarii) uneori poate prezenta si subunitate gama, cu 7 izoforme si rol in modularea activitatii pompei, se exprima special la nivelul rinicihiului, avand rol in adaptarea si supravietuirea celulara in conditii hipertone apartine tipului P de ATP-aze, alaturi de pompa protonica si cea de Ca , si cea H+/K+ ciclul de pompare are 7 etape si duce la expulzarea a 3 ioni de Na+ si introducerea a 2 ioni de K+ in celula, pe baza unor modificari de conformatie intre doua forme: E1 cu acidul aspartic din situl catalitic nefosforilat si E2 cu acidul aspartic fosforilatEtapele ciclului de pompare sunt:8. Legarea a 3 ioni de Na pe endodomeniul subunitatii alfa a pompei9. Legarea ATP pe endodomeniul subunitatii alfa a pompei10. Fosforilarea unui radical aspartat prin scindarea ATP la ADP=> consumul energetic necesar activitatii pompei, si schimbarea conformatiei proteinei care duce la expunerea celor trei ioni de Na pe ectodomeniul subunitatii alfa11. Disocierea si expulzarea in exterior a ionilor Na+ si legarea pe ectodomeniul subunitatii alfa a doi ioni de K+12. Schimbarea conformatiei subunitatii alfa si hidrolizarea aspartilfosfatului13. Internalizarea si expunerea ionilor K pe endodomeniul subunitatii alfa14. Disocierea ionilor K si eliberarea lor in citosol cu inchiderea unui ciclu de pomparePompa Na+/K+ este electrogenica, adica, prin eliminarea a 3 ioni de Na+ si introducerea a numai 2 ioni de K+, contribuie la realizarea si/sau mentinerea potentialului membranar.

La nivelul endomembranelor a fost evidentiat si tipul V de ATPaze(ATPaze de tip vacuolar), care pompeaza protoni in endosomi sau lizosomi. Organizarea acestora este ceva mai elaborata, avand nevoie de cel putin 11 subunitati ca sa isi indeplineasca functia, ceea ce duce la formarea unor complexe proteice de aprox 1000 kDa.La nivelul celulelor eucariote mai exista si tipurile F si E de ATP-aze, insa acestea nu au rol in transport, ci in semnalizarea celulara.

26. Mecanismul semnalizarii transmembranare via receptori cu activitate tirozin-kinazica

Receptorii pentru liganzi hidrofili sunt cei mai numerosi, dintre ei facand parte si categoria receptorilor cu activitate tirozin-kinazica. Receptorii cu activitate tirozin-kinazica se caracterizeaza printr-o mare diversitate structurala acoperind semnalizarea celulara prin cea mai mare parte a factorilor de crestere cunoscuti. Primul identificat a fost receptorul la facotrul de crestere epidermal (EGF).De regula, receptorii cu activitate tirozin-kinazica sunt proteine transmembranare unipas, tip I, care exista ca monomeri in stare libera(exceptie fiind receptorul pt insulina, care e in stare de dimeri, uniti prin punte sulfurica), iar dupa interactiunea cu ligandul dimerizeaza. Domeniul transmembranar e structurat in alfa-helix. O trasatura comuna la nivelul portiunii citosolice este reprezentata de o zona cu activitate tirozin-kinazica. Ectodomeniul contine capatul N-terminal si este glicozilat.Mecanismul de principiu prin care acesti receptori functioneaza ar putea fi sintetizat prin :1. Legarea ligandului, ce produce activarea domeniului catalitic de la nivelul portiunii citoplasmatice, cat si dimerizarea receptorilor datorita modificarilor conformationale pe care le induce 2. Activarea si dimerizarea realizeaza conditiile unor autofosforilari incrucisate la multiple tirozine ale domeniilor citosolice ale receptorului3. Atragerea si interactiunea cu efectori ce contin domenii SH24. Activarea efectorilor legati prin SH2Exemple de efectori care respecta mecanismul de mai sus:1.Fosfolipaza C-gama, cu 2 domenii SH2, iar dupa activare, declanseaza cascada fosfoinozitidelor(la fel ca si in cazul receptorilor cuplati cu proteine G heterotrimerice)2. Fosfatidilinozitol 3'-kinaza (PI3K), tot cu 2 domenii SH2, contribuie dupa activare la formarea unor derivati de fosfatidilinozitoli 3.Proteine care activeaza GTP-azele mici = GAP (GTP-ase-activating protein) Proteinele GAP sunt proteine monomerice cu o masa moleculara in jur de 25 kDa care au proprietatea de a lega GTP pe care il hidrolizeaza . Proteinele GAP sunt activate cat timp contin GTP si se inactiveaza dupa hidroliza sa. Datorita acestei capacitati de a trece ciclic din din stare activa in stare inactiva sunt cunoscute si sub numele de comutatori moleculari.Cand nu este nevoie de fucntia lor, proteinele GAP se gasesc in citosol complexate cu o proteina inhibitoare numita inhibitor de disociere a guanozin-nucleotidului=GDI. Unul din rolurile proteinelor GAP este acela de a participa la controlul corectitudinii traficului structurilor membranare in celula(de ex traficul dintre reticulul endoplasmic si aparatul Golgi).

27. Endocitoza mediata de receptori- definitie si semnificatie functionala In functie de caracteristicile materialelor preluate de celula, endocitoza se imparte in: Fagocitoza ( cand sunt endocitate materiale particulate) Pinocitoza (cand sunt endocitate substante solubilizate in fluidul extracelular)Pinocitoza este divers din punct de vedere al mecanismelor prin care se realizeaza. O prima forma este pinocitoza constitutiva, ce presupune preluarea in vezicule de endocitoza a unor volume de lichid extracelular cu tot ceea ce contine acesta.Pinocitoza mediata de receptori, numita uzual endocitoza mediata de receptori, este un termen introdus in 1976 de Goldstein si Brown, preocupati de metabolizarea LDL (low-density-lipoprotein).Prin acest proces, sunt internalizate de catre celula liganzi care mai intai sunt recunoscuti si legati de receptori specifici de pe suprafata celulei. Dupa interactiunea ligand-receptor, complexele receptor-ligand sutn adunate in adancituri ale membranei tapetate pe fata interna cu un complex de endoproteine a carui componenta de baza este clatrina. Aceste microdomenii adancite sunt denumite structuri cu invelis si ele se formeaza permanent , aglomerand fie receptorii in asteptarea liganzilor, fie complexele ligand-receptor, dupa formare. Pe masura ce receptorii expusi la suprafata celulelor sau complexele ligand-receptor se aglomereaza in microdomeniul corespunzator al membranei, in invelisul de clatrina se formeaza adancitura membranei, care creste pana la definitivarea formei sale sferice si desprinderea de membrana la nivelul careia s-a format, sub forma unei vezicule cu invelis. Deci, rolul clatrinei este acela de a aglomera complexele ligand-receptor in zona membranara destinata endocitarii si de a controla adancirea microdomeniului membranar, care devine structura cu invelis, si formarea veziculei cu invelis. Acest rol are la baza capacitatea clatrinei de a se asambla in trimeri numiti trischelioni, care mai departe pot forma ochiuri hexagonale si pentagonale , ducand la formarea veziculei propriu-zise. Trimerizarea clatrinei la trischelioni si inretelarea acestora se realizeaza prin participarea unor molecule proteice ajutatoare= proteine adaptor (AP).Invelisul de clatrina al veziculelor de endocitoza mediata se dezasambleaza imediat dupa desprinderea veziculei de membrana celulara, devenind endosom, care se transforma adesea in lizosom prin fuzionarea cu organitul preexistent in celula.Deci, acest tip de transport cu membrana este unul concentrativ, spre deosebire de pinocitoza constitutiva. Ligandul este introdus in celula la o concentratie mai mare decat cea in care el se afla in mediu, intrucat este acumulat si concentrat la nvielul structurii de invelis prin complexele receptor-ligand. Destinatia materialului endocitat depinde de tipul de substanta. LDL se elibereaza in endozom si este directionat catre lizozomi, in timp ce receptorul este reciclat la suprafata cellei pentru un nou ciclu de endocitoza.

Exista si o alta forma de pinocitoza mediata de receptori=potocitoza, ce serveste endocitarii moleculelor mici. Dupa legarea moleculelor mici, acestea sunt sechestrate in caveola care permit trecerea acestora direct in citoplasma prin anumite canale din membrana caveolara.Pinocitoza, in general, se clasifica in: dependenta de clatrina independenta de clatrina dependenta de caveolina independenta de caveolina

28. Definiti urmatoarele notiuni: co-transport;simport;antiportIn functie de numarul tipurilor de substante transportate simultan, difuzia facilitata poate fi clasificata in: transport uniport(este transportata o singura entitate chimica) transport cuplat=co-transport(sunt transportate simultan doua sau mai multe entitati chimice) transport simport(toate substantele sunt transportate in acelasi sens) transport antiport(cel putin una din substante merge-n sens opus celorlalte)

Ca exemplu de transport simport, amintim co-transportorul de sodiu/glucoza (SGLT1) din membrana apicala a enterocitelor. Acest transportor foloseste disiparea gradientului De na pentru a transporta glucoza din lumenul intestinal in citosolul enterocitelor impotriva gradientului de concentratie a glucidului. Un astfel de transportor mai este numit si transport activ secundar, deoarece se bazeaza practic pe energia consumata anterior de celula pentru mentinerea gradientului de Na+. SGLT1 este o proteina transmembranara multipas cu 14 treceri in alfa-helix prin planul membranei, din care trecerile 10-14 au fost dovedite ca structurand calea de trecere a glucozei. Ambele capete ale lantului polipeptidic sunt in ectodomeniu. La om, SGLT1 face parte dintr-o familie de co-transportori sodiu/glucoza ce numara 11 membri.Ca exemplu de transport antiport, amintim canalul de schimb anionic HCO3- / Cl- din mb eritrocitara, cunoscut si drept banda 3/ AE1 (Anion Exchanger 1).

29. Clasificarea jonctiunilora) Jonctiuni simplea. spatii intercelulareb. jonctiuni simple digitiformec. jonctiuni simple denticulareb) Jonctiuni speciale jonctiuni stranse = Zonula Occludens De ancorare= de atasarei. pe filamente de actina:1. jonctiuni celula-celula = Zonula Adherens2. jonctiuni celula-substrat = Jonctiunea focalaii. pe filamente intermediare:1. jonctiuni celula-celula =Desmozom = Macula Adherens2. jonctiuni celula-matrice = Hemidesmozom jonctiuni de comunicatie( Nexus GAP) complexe jonctionale c) Jonctiuni cu specificitate de tesut: - discuri intercalare(pt muschiul cardiac, prezente in miocardocite) -sinapsele(pt sistemul nervos)30. Jonctiunea de comunicatie Nexus GAPAre aspect de macula si este o jonctiune intercelulara, de comunicare, ce prezinta canal.Cele doua membrane celulare sunt situate la o distanta de 2nm => se opune transportului in spatiul extracelular.Contine conexoni(pot fi peste 100). Conexonii sunt niste prisme hexagonale, formate din 6 subunitati de conexina(o proteina integrala, multipas). O astfel de prisma are lungimea cat plasmalema si prezinta central un canal hidrofil, ce poate avea 0,2 nm.Conexonul din plasmalema 1 comunica prin canalul hidrofil cu conexonul din plasmalema 2. Canalul transmembranar format de proteine solidarizeaza celulele intre ele, insa functia principala a jonctiunilor GAP este de a oferi canale de trecere pentru molecule mici(mai putin de 1000 Da: AA, AMPc, ioni, hormoni etc.), permitandu-le sa treaca din citoplasma unei celule in citoplasma celulei vecine.Canalul este inchis in conditiile in care o celula este agresata si moare(concentratia de Ca inchide canalul).Localizarea jonctiunilor GAP poate fi fie sub desmozomul in spot, fie in portiunile verticale ale discurilor intercalare.Astfel, prin aceste jonciuni trec ioni deci curent electric eveniment important n evitarea ntrzierilor la nivelul sinapselorFuncii:a. se gsesc n sinapsele electrice i au un rol important pentru funcionarea acestora fiind de 10.000 de ori mai permeabile pentru ionii metalici dect restul sinapselor.b. comunicrile intercelulare prin jonciuni GAP au un rol important n embriogenez (n perioada de organogenez).

31. Complexe jonctionaleSunt prezente in celulele epiteliale . Contin urmatoarele jonctiuni, in urmatoarea ordine:1. Zonula Occludens2. Zonula Adherens3. Macula Adherens*In abordarea acestui subiect, se va descrie fiecare dintre cele 3 jonctiuni componente ( vezi urmatoarele subiecte, unde sunt abordate individual ). 32. Discul intercalarDiscurile intercalare sunt jonctiuni cu specificitate de tesut. Au aspectul unor scari.Portiunile verticale prezinta jonctiuni GAP, iar in portiunile orizontale se intalnesc:filamente intermediare de desmina, macula Adherens si zonula Adherens.*In abordarea acestui subiect, se vor descrie mai departe fiecare dintre jonctiunile mentionate mai sus ( vezi urmatoarele subiecte, unde sunt abordate individual).

33.Jonctiunea stransa= Zonula OccludensFace parte din categoria jonctiunilor speciale. Este o jonctiune intercelulara. Se mai numeste si jonctiune pentalaminata, heptalaminata, sau Zonula Occludens.Se numeste Zonula pentru ca are aspect de banda sau de panglica, respectiv, Occludens pentru ca ocluzioneaza total sau partial spatiul extracelular. Acest tip de jonctiune este impermeabila pentru macromolecule, lasand sa treaca doar molecule mici, de tipul ionilor.Componente OBLIGATORIU : cele doua membrane celulare , care se pot aseza fie la 2 nm una fata de cealalta(in acest caz , jonctiunea se numeste heptalaminata), fie isi pot suprapune straturile externe proteice, excluzand astfel spatiul extracelular ( in acest caz, jonctiunea se numeste pentalaminata) Siruri de "proteine gemene" = Occludine : sunt proteine integrale, care se asaza cate doua fata in fata => o structura de fermoar pe frontul extracelular ; In grosimea membranei, proteinele gemene realizeaza o retea cu ochiuri mai mult sau mai putin regulate. Cu cat sunt mai regulate, cu atat jonctiunea este mai putin extensibila, mai rigida. Daca ochiurile sunt largi si neregulate, jonctiunea este foarte flexibila; Componenta citoscheletica = microfilamentele de actina , aici ancorandu-se proteinele gemene Inele de fuziune, alcatuite din fosfolipide ale foitei externe, ce participa si ele la ocluzionarea spatiului extracelular

34. Jonctiuni de atasare pe microfilamente de actina - clasificare, descriereIlustreaza categoria jonctiunilor speciale de ancorare. Cele doua tipuri de jonctiuni de atasare pe microfilamente de actina sunt : Zonula Adherens (jonctiune de tip celula-celula) Jonctiunea focala( jonctiune de tip celula-substrat) Inainte de a le descrie pe fiecare in parte, sa stabilim un schelet structural comun, pe baza caruia vom descrie toate jonctiunile de atasare ( atat cele pe microfilamente de actina, cat si cele pe filamente intermediare, abordate in subiectul urmator) :In general, jonctiunile de atasare prezinta o organizare structurala comuna:1. Cele doua mb atasate / mb atasata la substrat , aflate la o distanta cuprinsa intre 15-30 nm , aceasta fiind o distanta relativ mare, ce nu afecteaza transportul de markeri in spatiul extracelular2. Proteina transmembranara linker, ce va stabili pe frontul extracelular legaturi homofilice/heterofilice ( in functie de tipul de proteina) , iar pe frontul intracelular se va atasa la 3. Complexul proteic de atasare la citoschelet, care leaga proteina linker la 4. Elementul de citoschelet ( reprezentat fie de microfilamente de actina, fie de filamente intermediare, in fucntie de tipul de jonctiune de atasare)Revenind putin la proteinele transmembranare linker, acestea pot fi dintre urmatoarele: Selectine ( stabilesc legaturi HETEROFILICE) Integrine( ... HETEROFILICE) Imunoglobuline( HETEROFILICE) Cadherine ( HOMOFILICE) Jonctiunile de atasare pot fi tranzitorii/definitive. Un exemplu de jonctiune tranzitorie sunt jonctiunile stabilite intre leucocite si endoteliul vascular, in procesul de diapedeza.

Sa trecem acum la rezolvarea efectiva a subiectului. Zonula Adherens1. Cele doua membrane atasate la o distanta de 15 nm2. Proteina transmembranara linker= Cadherina ( Ca 2+ dependenta), ce realizeaza legaturi HOMOFILICE pe frontul extracelular 3. Complex proteic de atasare la citoschelet reprezentat in acest caz de alfa, beta si gama catenine4. Elementul de citoschelet e reprezentat de o bandeleta de microfilamente de actina Zonula Adherens se intalneste in portiunile orizontale ale discurilor intercalare, alaturi de Macula Adherens si de filamentele intermediare de desmina.

Jonctiunea focala 1. Mb celulara atasata la substrat = FIBRONECTINA , situate la 15 nm distanta2. Protein