Wen Gao, Lifei Ji, Lu Li, Guanwei Cui, Wen Gao, Lifei Ji, Lu Li, Guanwei Cui, Kehua Xu, Ping Li, Bo TangKehua Xu, Ping Li, Bo Tang

Biomaterials 33 (2012) Biomaterials 33 (2012)

Máster de BiomedicinaMáster de Biomedicina

1)1) IntroducciónIntroducción2)2) Materiales y métodosMateriales y métodos3)3) Resultados y discusiónResultados y discusión4)4) ConclusionesConclusiones

1)1) IntroducciónIntroducción2)2) Materiales y métodosMateriales y métodos3)3) Resultados y discusiónResultados y discusión4)4) ConclusionesConclusiones

• Apoptosis: mecanismo fisiológico que mantiene la homeostasis de los organismos Apoptosis: mecanismo fisiológico que mantiene la homeostasis de los organismos multicelulares. multicelulares.

• Su desregulación conduce a varias patologías humanas, entre ellas el cáncer.Su desregulación conduce a varias patologías humanas, entre ellas el cáncer.• La inducción de la apoptosis en células cancerígenas es la estrategia más eficaz contra La inducción de la apoptosis en células cancerígenas es la estrategia más eficaz contra

el cáncer.el cáncer.• Se ha demostrado que ciertas nanoparticulas dañan al DNA y a proteínas, lo que Se ha demostrado que ciertas nanoparticulas dañan al DNA y a proteínas, lo que

conduce a la activación de apoptosis.conduce a la activación de apoptosis.• Una nanoparticula de Fe2O3 de entre 20-40 nm produce radicales hidroxilo altamente Una nanoparticula de Fe2O3 de entre 20-40 nm produce radicales hidroxilo altamente

reactivos (*OH). reactivos (*OH). • El *OH puede conducir a daño celular oxidativo y la apoptosis. El *OH puede conducir a daño celular oxidativo y la apoptosis. • Combinando nanoparticulas de Fe3O4 con Au, potenciamos su efecto, debido a: Combinando nanoparticulas de Fe3O4 con Au, potenciamos su efecto, debido a:

-Mejora la fluorescencia.-Mejora la fluorescencia.

-Interacciona facilmente con los grupos tiol de cisteinas, lo que permite -Interacciona facilmente con los grupos tiol de cisteinas, lo que permite funcionalizar el Au con diversos peptidos específicos.funcionalizar el Au con diversos peptidos específicos.

• En el presente trabajo se van a usar los siguientes peptidos:En el presente trabajo se van a usar los siguientes peptidos:• RGD se dirige a las integrinas RGD se dirige a las integrinas αα vv β β 33 ,altamente expresados en células ,altamente expresados en células

tumorales. tumorales. • DEVD es el sustrato escindible caspasa-3.DEVD es el sustrato escindible caspasa-3.• FITC isotiocianato de fluoresceína.FITC isotiocianato de fluoresceína.

• RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3, en condiciones fisiológicas, no es fluorescente. RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3, en condiciones fisiológicas, no es fluorescente. • RDG localiza a la celula cancerígena, mediante la integrina RDG localiza a la celula cancerígena, mediante la integrina αα vv β β 33, de cáncer de hígado. , de cáncer de hígado. • Una vez dentro provoca la reacción de liberación de los radicales *OH.Una vez dentro provoca la reacción de liberación de los radicales *OH.• Esto activa la apoptosis por estrés oxidativo, y la cascada de caspasas.Esto activa la apoptosis por estrés oxidativo, y la cascada de caspasas.• La caspasa 3 rompe el enlace del DEVD con el FIT durante la apoptosis, apareciendo la La caspasa 3 rompe el enlace del DEVD con el FIT durante la apoptosis, apareciendo la

fluorescencia. Esto permite monitorizar el proceso de apoptosis en tiempo real.fluorescencia. Esto permite monitorizar el proceso de apoptosis en tiempo real.

1)1) IntroducciónIntroducción

2)2) Materiales y métodosMateriales y métodos3)3) Resultados y discusiónResultados y discusión4)4) ConclusionesConclusiones

Preparación de Au-Fe2O3 soluble en aguaPreparación de Au-Fe2O3 soluble en agua•Las nanoparticulas de Au se preparan a partir de Las nanoparticulas de Au se preparan a partir de HAuCl4, calentándolo en 1-HAuCl4, calentándolo en 1-octadeceno.octadeceno.•Se añade a las nanoparticulas de Au el Fe (OL)3 formando las nanoparticulas Se añade a las nanoparticulas de Au el Fe (OL)3 formando las nanoparticulas de Au-Fe3O4. de Au-Fe3O4. •Se lava con hexano y etanol (1:2).Se lava con hexano y etanol (1:2).•Se repite el lavado con citrato sódico 50 mM. Se repite el lavado con citrato sódico 50 mM. •Se secan, se centrifugan y se lavan 3 veces con agua desionizada.Se secan, se centrifugan y se lavan 3 veces con agua desionizada.

Preparación de RGD / FITC-DEVD Au-Fe2O3Preparación de RGD / FITC-DEVD Au-Fe2O3•Se inmovilizan los peptidos sobre la superficie del Au, añadiendolos sobre la Se inmovilizan los peptidos sobre la superficie del Au, añadiendolos sobre la disolución de Au-Fe3O4. disolución de Au-Fe3O4. •Se deja reaccionar durante 48 h. Se deja reaccionar durante 48 h. •El exceso de RGD y FITC-DEVD se eliminaron por centrifugación a 12000 El exceso de RGD y FITC-DEVD se eliminaron por centrifugación a 12000 rpm durante 15 min. rpm durante 15 min. •Las partículas se lavan con agua desionizada 3 veces.Las partículas se lavan con agua desionizada 3 veces.•Se redispersan en PBS (50 mM, pH 7,4).Se redispersan en PBS (50 mM, pH 7,4).

CaracterizaciónCaracterización•Microscopía electrónica de transmisión (TEM). Microscopía electrónica de transmisión (TEM). •Difracción de rayos X (DRX).Difracción de rayos X (DRX).•Espectroscopía IR por TF con Reflectancia Total Atenuada (ATR-FTIR).Espectroscopía IR por TF con Reflectancia Total Atenuada (ATR-FTIR).

1)1) IntroducciónIntroducción2)2) Materiales y métodosMateriales y métodos

3)3) Resultados y discusiónResultados y discusión4)4) ConclusionesConclusiones

Caracterización de RGD / FITC-DEVD Au-Fe2O3 Caracterización de RGD / FITC-DEVD Au-Fe2O3

•La imagen TEM mostró particulas monodispersas de La imagen TEM mostró particulas monodispersas de

AuFe2O3 de 8 nm y 20 nm.AuFe2O3 de 8 nm y 20 nm.

•La composición se confirma por DRX. La composición se confirma por DRX.

•La conjugación con los péptidos se confirma por IRLa conjugación con los péptidos se confirma por IR.

Se estudió la estabilidad de RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 bajo diversas condiciones Se estudió la estabilidad de RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 bajo diversas condiciones fisiológicas a 37º C:fisiológicas a 37º C:•En PBS (azul)En PBS (azul)•En un buffer con las mismas condiciones que la reacción de la caspasa (rojo)En un buffer con las mismas condiciones que la reacción de la caspasa (rojo)•En un medio de cultivo (verde)En un medio de cultivo (verde)

Viabilidad de la RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 para catalizar la Viabilidad de la RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 para catalizar la formación de *OH y la obtención de las imágenes de la apoptosisformación de *OH y la obtención de las imágenes de la apoptosis•Mediante una sonda fluorescente se determina la formación de *OH. Mediante una sonda fluorescente se determina la formación de *OH. •RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 muestra aproximadamente un 9% más de intensidad de RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 muestra aproximadamente un 9% más de intensidad de fluorescencia que Fe2O3. fluorescencia que Fe2O3. •RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 exhiben actividad catalítica mucho más alto que las RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 exhiben actividad catalítica mucho más alto que las nanoparticulas de Fe2O3. nanoparticulas de Fe2O3.

Esta mejora es posible que se deba al efectoEsta mejora es posible que se deba al efecto

de polarización y a la transferencia de de polarización y a la transferencia de

electrones entre el Au y el Fe.electrones entre el Au y el Fe.

Viabilidad de la RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 para catalizar la Viabilidad de la RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 para catalizar la formación de *OH y la obtención de imágenes de la apoptosisformación de *OH y la obtención de imágenes de la apoptosisSe prueba la capacidad de RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 para la detección de caspasa-3.Se prueba la capacidad de RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 para la detección de caspasa-3.•Sin caspasa-3, el complejo es muy estables Sin caspasa-3, el complejo es muy estables

(negro).(negro).•Al añadir la caspasa-3, aumenta aprox. 5,6 Al añadir la caspasa-3, aumenta aprox. 5,6

veces en la intensidad de la fluorescenciaveces en la intensidad de la fluorescencia

(rojo).(rojo).•Al añadir al control (azul) el inhibidor de caspasa, Al añadir al control (azul) el inhibidor de caspasa,

se bloquea el aumento de la fluorescencia.se bloquea el aumento de la fluorescencia.

Existe una relación proporcional entre las señales de fluorescencia y las concentraciones Existe una relación proporcional entre las señales de fluorescencia y las concentraciones de la caspasa-3. de la caspasa-3.

Seguimiento de la apoptosis en tiempo realSeguimiento de la apoptosis en tiempo real•Se estudia la citotoxicidad en la linea celular HepG2 (rojo) y Se estudia la citotoxicidad en la linea celular HepG2 (rojo) y

en HL7702 (negro). en HL7702 (negro).

Para probar que la generación de OH es el desencadenante Para probar que la generación de OH es el desencadenante de la apoptosis, se utilizó de la apoptosis, se utilizó TEMPO-BDP para caracterizar la nueva generación de *OH inducida por las TEMPO-BDP para caracterizar la nueva generación de *OH inducida por las nanoparticulas en:nanoparticulas en:

-HepG2 (rojo)-HepG2 (rojo)

-HL7702 (negro)-HL7702 (negro)

La intensidad es un 70% mayor en las células HepG2 debido a que poseen la integrina La intensidad es un 70% mayor en las células HepG2 debido a que poseen la integrina

αα vv β β 3.3.

Seguimiento de la apoptosis en tiempo real Seguimiento de la apoptosis en tiempo real

Las células HepG2 fueron incubadas con TEMPO-DPB para visualizar el *OH generado. Las células HepG2 fueron incubadas con TEMPO-DPB para visualizar el *OH generado.

1)1) IntroducciónIntroducción2)2) Materiales y métodosMateriales y métodos3)3) Resultados y discusiónResultados y discusión

4)4) ConclusionesConclusiones

• Se ha informado sobre el uso de nanoparticulas de Au-Fe2O3 en la Se ha informado sobre el uso de nanoparticulas de Au-Fe2O3 en la inducción de la apoptosis a células específicas cancerígenas, y la inducción de la apoptosis a células específicas cancerígenas, y la imagen en tiempo real del proceso de apoptosis.imagen en tiempo real del proceso de apoptosis.

• El Au potencia las propiedades ópticas y catalíticas de las El Au potencia las propiedades ópticas y catalíticas de las nanoparticulas de Fe3O4 (Debido a un efecto de polarización). nanoparticulas de Fe3O4 (Debido a un efecto de polarización).

• Conjugado con los péptidos RGD y FITC-DEVD, se puede visualizar Conjugado con los péptidos RGD y FITC-DEVD, se puede visualizar el proceso de la apoptosis inducida por *OH in vitro. el proceso de la apoptosis inducida por *OH in vitro.

• La funcionalización superficial las nanoparticuas de Au-Fe2O3 La funcionalización superficial las nanoparticuas de Au-Fe2O3 puede servir como una plataforma multifuncional para el puede servir como una plataforma multifuncional para el tratamiento y diagnóstico del cáncer.tratamiento y diagnóstico del cáncer.