1

DOKTORI (PHD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI

BELSŐ SZERVEK EXTRINSZIK ÉS INTRINSZIK IDEGEINEK INGERÜLETÁTVIVŐ ANYAGAI

(FUNKCIONÁLIS BIZONYÍTÉKOK)

Dr. Benkó Rita

Gyógyszertudományok Doktori Iskola Vezetője: Dr. Barthó Loránd, egyetemi tanár

Program: Vegetatív és szenzoros idegek zsigeri működése és

farmakológiája Program- és témavezető: Dr. Barthó Loránd

egyetemi tanár

Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet

Pécs

2006

2

BEVEZETÉS

Mind a belső szervek, mind a kültakaró efferens beidegzése két forrásból származik, ezek: a

vegetatív idegrendszer, valamint a szomatikus rendszer. Mind a kültakaró, mind a zsigerek

tartalmaznak afferens idegeket is. A belső szervekben található idegelemeket többféle módon

osztályozhatjuk. Az egyik fajta osztályozás szerint ezek az idegelemek lehetnek intrinszik

neuronok (amelyeknek a sejttestje és nyúlványrendszere az adott szerven belül helyezkedik

el) és extrinszik idegek, amelyeknek csak a nyúlványai jutnak el a szervhez. A jelen munka a

bélhuzammal és a húgyhólyaggal foglalkozik. Míg a gasztrointesztinális traktus hatalmas

kiterjedésű és komplexitású intrinszik idegrendszert tartalmaz („a bél idegrendszere”, ld.

lejjebb), addig a hólyag falában inkább elszórt idegsejtek képviselik az intrinszik idegeket. Az

extrinszik idegelemek részben vegetatív efferensek (paraszimpatikus preganglionáris, ill.

szimpatikus posztganglionáris rostok), részben zsigeri afferensek, amelyek azonban szintén

képesek lehetnek transzmitterek kibocsátására a periférián.

Langley és később mások megfigyelései és osztályozása alapján az enterális

idegrendszert a szimpatikus és paraszimpatikus rendszerek mellett a vegetatív idegrendszer

harmadik tagjaként tartjuk számon (1994; Wood). Az enterális idegrendszer igen kiterjedt, kb.

107-108 neuront tartalmaz, ami nagyságrendileg a gerincvelői neuronszámhoz hasonlítható. A

tápcsatorna idegi szabályozásában részt vesznek külső idegek is, de ezen neuronok hatásai

többnyire indirekt módon jutnak érvényre az enterális intrinszik neuronok közvetítésével. A

bélhuzam teljes extrinszik idegellátását átvágva a funkciók meglepően kevéssé károsodnak,

ami arra utal, hogy az enterális idegrendszer önmagában is képes a legtöbb funkció

vezérlésére.

Az intrinszik neuronok a bélfal két fő ganglionokat tartalmazó idegi plexusában találhatók

(plexus myentericus és plexus submucosus). Ezen neuronok részint más idegsejteket izgatnak

vagy gátolnak a belőlük felszabaduló transzmitteranyagok segítségével, de jelentős részük a

körkörös és/vagy hosszanti simaizomzatot kontrahálja vagy relaxálja. Ez utóbbiak az enterális

motoneuronok. Az izgató motoneuronok legjelentősebb transzmittere a muszkarin

receptorokon ható acetil-kolin. A muszkarin receptorok blokkolása után is marad a

válaszokban további izgató komponens, amelyért tachykininek (P-anyag, neurokinin A)

tehetők felelőssé. Az enterális gátló neuronok legfontosabb transzmittere a nitrogén-monoxid

(NO), de bizonyítékok vannak még ATP, vazoaktív intesztinális polipeptid (VIP), pituitaer

3

adenilát ciklázt aktiváló polipeptid (PACAP), kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP) és szén-

monoxid (CO) transzmitter szerepére is (Goyal és Hirano, 1996).

A különféle gasztrointesztinális simaizmokban az egyik leginkább bizonyított NANC

gátló transzmitter az NO (ld. Lecci és mtsai, 2002). Az NO neurotranszmitterként játszik

szerepet záróizmok nyitásában, a perisztaltikus reflexben a leszálló gátlásban, valamint a

gyomor relaxációjában. A vékony- és vastagbélben elektromos ingerlés hatására létrejött

NANC relaxációban és a spontán tónus szabályozásában is szerepet tulajdonítanak az NO-nak

számos fajban (ld. Whittle, 1994). Az NO képes izgató válaszokat is kiváltani a

bélrendszerben. Ez bizonyos preparátumokon az idegelemek izgatása révén jön létre (Barthó

és Lefebvre, 1994). Leírtak NO-okozta primer kontrakciót simaizom-támadásponttal is

(Lefebvre és Barthó, 1997).

Az ATP intracelluláris szerepe mellett a sejtek közötti kommunikációban

közreműködve extracelluláris funkciókkal is bír. Az ATP-t felszabadító idegek “purinerg”

elnevezése Burnstocktól származik (1972). Számos bizonyíték gyűlt össze arra vonatkozóan,

hogy az ATP neuromuszkuláris transzmitterként működik a vegetatív idegrendszerben. Az

ATP ko-transzmitterként és neuromodulátorként is szerepet játszik az idegi működésekben

(Burnstock, 1997; Hoyle, 1992). Az extracelluláris ATP receptorainak sok altípusa létezik,

jelenleg a P2X receptoroknak 7, a P2Y receptoroknak 8 altípusa létezik (ld. British J.

Pharmacol.: Guide to Receptors and Channels, 2nd edition, 2006). Az ATP izgató és gátló

hatásokat is mediál: részt vehet az erek simaizmainak NANC összehúzódásában ill.

elernyedésében, a vas deferens izomzatának kontrakciójában, a coecum taenia relaxációjában.

Gasztrointesztinális preparátumokban vannak olyan gátló válaszok is, amelyeket ATP és NO

együtt közvetít (ld. Barthó és mtsai, 1998). Humán szerven eddig még nem találtak erre

bizonyítékot.

Az enterális érző neuronok szintén az intrinszik és extrinszik kategóriákba sorolhatók.

A bélfal saját érző neuronjai érzékelik pl. a feszülést vagy más ingert, az ingerületet pedig

interneuronoknak és ezek közvetítésével motoneuronoknak adják át, amelyek létrehozzák “a

bél törvénye” néven számontartott körkörösizom-összehúzódást az ingertől orálisan és

elernyedést az ingertől análisan (Bayliss és Starling, 1899). A külső érző neuronok a n. vagus-

szal vagy a gerincvelőből érkeznek. A gerincvelői afferenseknek egy speciális csoportját

képezik a kapszaicin-érzékeny neuronok (Szolcsányi, 1984). A kapszaicin a paprika

(Capsicum annuum) csípős anyaga, mely egy specifikus, ioncsatornához kötött receptort

izgat. Ezt az érző idegvégződéseken elhelyezkedő receptort régebben vanilloid VR1

receptornak, ma „transient receptor potential vanilloid type receptor1”-nek (TRPV1) nevezik

4

(ld. Caterina és Julius, 2001; Clapham és mtsai, 2003). Közismert, hogy a kapszaicin a

nyálkahártyákon égő érzést és erythemát okoz. Ha a kapszaicin kötődik a receptorához, a

csatorna megnyílik és az idegvégződés (varicositas) depolarizálódik. Ahhoz, hogy a szer

ingerelje a szenzoros idegek végződéseit (és belőle biológiailag aktív anyagokat szabadítson

fel), nem szükséges a feszültségfüggő gyors Na+-csatornák működése, így a válaszok

rezisztensek tetrodotoxinra (TTX) és rezisztensek a neuronális feszültségfüggő Ca2+-

csatornák blokkolására is.

A kapszaicin-érzékeny primer afferensek érző funkciójuk mellett ún. “helyi efferens” ill.

szisztémás neurohumorális funkciót is ellátnak. Ezek az idegek neuropeptideket (CGRP, P-

anyag, neurokinin A) szabadítanak fel, de felmerült más anyagok szenzoros neurotranszmitter

szerepe is (pl. NO, ATP). A kapszaicin-érzékeny érző neuronok perifériás végződéseikből

felszabaduló biológiailag aktív anyagok változatos szöveti válaszokat hozhatnak létre (pl.

értágulat, az érpermeabilitás fokozódása, simaizom kontrakció, relaxáció) (Jancsó és mtsai,

1967,1968; Szolcsányi, 1984; Barthó és mtsai, 2004). A szenzoros neurotranszmitterek

azonosításában hasznos eszköz a kapszaicin zsigeri hatásainak tanulmányozása. A

kapszaicinnel történő in vitro deszenzitizáció széles körben elterjedt eszközzé vált az izolált

szervi vizsgálatokban.

Az alsó és felső húgyutakat szintén bőségesen beidegzik a kapszaicin-érzékeny primer

afferens neuronok perifériás nyúlványai. Az itt neurotranszmitterként működő CGRP és

tachykininek döntő része ezekből az idegvégződésekből származik (Maggi, 1995; Barthó és

mtsai, 2004). A húgyhólyag kapszaicin-érzékeny motoros válaszait széles körben

tanulmányozták. Ezek a válaszok eltérnek az egyes fajok közt és a vizsgált hólyag régiók

(detrúzor izom, hólyagnyak) közt is. Érdekes és sokat tanulmányozott terület a légutak és a

vaszkuláris rendszer simaizomzatának kapszaicin-érzékeny beidegzése is, ez azonban nem

képezi a jelen munka tárgyát.

5

CÉLKITŰZÉSEK Vizsgálatainkban szerettük volna in vitro, izolált szervi kísérletek segítségével minél jobban

megismerni a zsigeri szervek (gyomor-bélhuzam, urogenitalis traktus) motoros válaszainak

mechanizmusait, hangsúlyt fektetve a kísérleti állatokon kapott eredmények humán

preparátumokkal való összevetésére. Minél többet meg kívántunk tudni szenzoros és más

eredetű NANC transzmitteranyagok részvételéről a zsigeri válaszokban, interakcióikról és

gyógyszeres befolyásolhatóságukról (stimuláció, antagonizmus, moduláció) élettani ill. kóros

állapotokban (pl. kísérletes diabétesz).

A beidegzett simaizom-preparátumok mozgásválaszainak kiváltására kémiai

ingerként a szenzoros izgató kapszaicint vagy az idegek nem-szelektív “tér”-ingerlését

használjuk. Az ingerület-átvivő anyagok azonosításának kritériumai közül “a hatás

azonosságát” előfeltételnek, „az antagonizmus azonosságát” pedig perdöntőnek tekintjük.

Tehát az általunk beadott gyanúba vett transzmitter hatása és specifikus receptoriális

gátolhatósága egyezzen meg az ingerléssel létrehozott válasszal, ill. annak gátolhatóságával.

Utóbbival egyenértékű argumentumként kezeljük bizonyos transzmitterek (NO) szintézisének

gátlását, ill. a genetikailag módosított, génkioltott (KO) állatokon kapott eredményeket.

A kísérleti állatok preparátumain végzett vizsgálatok mellett számos kísérletet

végeztünk humán, operációs anyagból származó készítményeken. A humán szövetek (vékony

és vastagbél, appendix) tanulmányozására egyedülálló lehetőséget nyújt a PTE I. sz. Sebészeti

Klinikával folyó kollaborációnk.

A kísérletek és várható eredményeik alapkutatási jellegűek: közelebb visznek a belső

szervek ép és kóros működésének megértéséhez, ami hosszabb távon potenciálisan hasznos

lehet a diagnosztika és terápia számára. A kolinerg és NANC transzmitter-rendszerek jobb

megismerése más területeken (pl. központi idegrendszer) hasznosítható ismereteket is

eredményezhet. Mivel az érző neuronok központi idegrendszeri végződéseiből, a gerincvelő

hátsó szarvában föltehetően ugyanazok a transzmitterek szabadulnak fel, mint a periférián, így

a zsigeri szervekben nyert adatok relevanciával bírnak a nociceptio/fájdalomcsillapítás

tekintetében is. A ″klasszikus ″ neurotranszmitter-rendszerekre (adrenerg, kolinerg) ható

gyógyszerek ma fontos szereplői terápiás eszköztárunknak. Hasonló felemelkedés előtt állnak

a nem-adrenerg, nem-kolinerg transzmitterekre ható szerek is (sőt közülük a szerotonerg

rendszer már ma is fontos gyógyszerek célpontja). A NANC rendszerek funkciójának

tisztázása (egyebek között farmakológiai eszközökkel) nagyban elősegíti a rájuk ható szerek

kifejlesztését és indikációs területük megtalálását.

6

Kísérleteinkben az alábbi témakörökkel foglalkoztunk:

1. Megvizsgáltuk a kapszaicin hatását és annak mechanizmusát humán bél különböző

szakaszainak körkörös izomzatán, külön hangsúlyt fektetve az NO − guanilát-cikláz rendszer

gátlóinak hatására. Arra is kerestük a választ, vajon a kapszaicin NO-mediált gátló hatása

megfigyelhető-e más fajok (tengerimalac, egér) vastagbél preparátumain is.

2. Vizsgáltuk az endokannabinoid anandamid hatását humán szigmabél preparátumon

és lehetséges interakcióját a colon kapszaicin-érzékeny beidegzésével.

3. Két bélpreparátumon (humán szigmabél körkörös izomzat, patkány vékonybél

hosszanti izomzat-plexus myentericus csík) megvizsgáltuk egy NO-szintáz bénító és

purinoceptor-antagonisták együttes hatását az intrinszik idegek által közvetített NANC

relaxációra.

4. Több preparátumon megvizsgáltuk, vajon a NANC válaszokban szerepet játszik-e

az NO mellett más olyan anyag , amely a cGMP-n keresztül fejti ki hatását.

5. A húgyhólyag beidegzését farmakológiai eszközök segítségével tanulmányoztuk.

Amennyire lehetséges volt, gyógyszeresen szétválasztottuk egymástól a különböző

ingerületátvivők által közvetített válaszokat.

6. In vitro rendszerben megvizsgáltuk a kísérletes diabétesz hatását a patkány

húgyhólyag kapszaicin-érzékeny, kolinerg és “purinerg” idegműködéseire és ugyanezen a

preparátumon a kapszaicin-indukálta választ farmakológiailag jellemeztük.

7

KÍSÉRLETES MUNKA

A nitrogén-monoxid szerepe a kapszaicin által kiváltott mozgásválaszban

különféle fajok bél körkörösizom preparátumain

Bevezetés

A különféle fajok intesztinális preparátumai eltérően reagálnak kapszaicinre. Tengerimalac

ileumon a kapszaicin ideg-közvetítette kontrakciót hoz létre (ld. többek közt Barthó és

Szolcsányi, 1978; Szolcsányi és Barthó, 1978; Barthó és mtsai, 1994, 1999c, 2000).

Ugyanakkor atropin-kezelt, előkontrahált készítményeken a kapszaicin képes relaxációt is

kiváltani (Barthó és mtsai, 1987). A gátló hatásokért a CGRP-t tartják felelősnek (Barthó és

mtsai, 1987; 1991). Humán bél simaizomzaton a kapszaicin gátló hatást vált ki (Maggi és

mtsai, 1988, 1990a,b), amelyért nem a CGRP tehető felelőssé. A kapszaicin-okozta

elernyedés TTX-rezisztens. Funkcionális (immun-neutralizációs) és neurokémiai kísérletek a

VIP ill. valamely rokon peptid részvételét látszanak igazolni a kapszaicin hatásában (Maggi és

mtsai, 1989c, 1990a,b).

A jelen kísérletsorozat célja az volt, hogy megvizsgáljuk a kapszaicin hatását és

hatásmechanizmusát humán szigmabél, egyéb humán gasztrointesztinális készítmények,

továbbá tengerimalac és egér colon körkörös izomzatán, külön hangsúlyt fektetve az NO-

guanilát-cikláz rendszer gátlóinak hatására és a P2 purinoceptorok szerepére. Próbáltunk arra

is választ keresni, hogy az endokannabinoid anandamid képes-e utánozni vagy módosítani a

kapszaicin hatását a humán colonon. Irodalmi adatok szerint ugyanis az anandamid képes

hatást kiváltani a kapszaicin TRPV1 receptorain (ld. Smart és mtsai, 2000), jóllehet főhatásait

kannabinoid receptorokon fejti ki (ld. Szolcsányi, 2000).

Módszerek

A kísérletekhez hím CD-1 vagy C57BL/6 egereket (20-25 g) és mindkét nemű

tengerimalacokat (420-500 g) használtunk. Az állatok leölése után a megfelelő

colonszakaszokat eltávolítottuk, átmostuk Krebs-oldattal és Petri csészébe helyeztük. A

tengerimalac proximális colonjából kb. 2 mm széles gyűrűt kivágtunk, a mesenterialis

oldalánál felnyitottuk és a nyálkahártyát óvatosan eltávolítottuk (Maggi és mtsai, 1996). Az

egér distalis colon kb. 1,5 cm-es darabját a mesenterialis oldalánál felnyitottuk és körkörös

irányú, 4-tagú cikkcakk preparátumot készítettünk belőle, amelyről a nyálkahártyát nem

8

távolítottuk el. A humán colont, ileumot és appendixet bélcarcinoma miatt eltávolított

bélszakasz marginális, még nem infiltrált részéről kaptuk. A nyálkahártyát eltávolítottuk és az

izomrétegekből körkörös irányú kb. 2 x 20 mm-es preparátumokat készítettünk.

A preparátumokat 5 ml-es, Krebs-oldatot tartalmazó szervfürdőkbe helyeztük (37°C-

on) és folyamatosan oxigenizáltuk 95 % O2 és 5 % CO2 elegyével. A mozgásokat izotóniás

jelátalakító (elmozdulásmérő) segítségével, kompenzográfon regisztráltuk. Tengerimalac és

egér colon esetén 2 mN, humán preparátumok esetén 10 mN feszítést alkalmaztunk. Atropin

(1 µmol/l) és guanetidin (3 µmol/l) végig jelen volt a szervfürdőkben. A kapszaicin-okozta

relaxáció hangsúlyozására szubmaximális, tónusos kontrakciót hoztunk létre 1 µmol/l acetil-

kolin vagy muszkarin segítségével, kivéve humán appendixen és tengerimalac colonon,

melyeknek spazmogének nélkül is magas tónusa volt. A válaszokat izoprenalinnal (8 µmol/l)

kiváltott maximális elernyedés százalékában adtuk meg. A kapszaicint csak egyszer adtuk

minden egyes preparátumnak a tachyphylaxia elkerülése végett.

Eredmények

Minden preparátum esetén előzetes kísérletekben meghatározott, hatásos de nem túl magas

kapszaicin koncentrációt alkalmaztunk a relaxáció kiváltására (humán colon, ileum és

appendix esetén 300 nmol/l, egérnél 1 µmol/l, tengerimalacnál 2 µmol/l kapszaicint

alkalmaztunk).

Humán szigmabélen mind a NOS-gátló L-NOARG (100 µmol/l), mind az ODQ jelű

szolubilis guanilát-cikláz gátló vegyület (1 µmol/l) szignifikánsan csökkentette a kapszaicin-

okozta választ (az L-NOARG kb. 70 %-os, az ODQ kb. 45 %-os gátlást okozott). 5 mmol/l L-

arginin a 20 µmol/l koncentrációban alkalmazott L-NOARG hatását teljesen, a 100 µmol/l-ét

részben visszaállította. Az L-NOARG (100 µmol/l) nem befolyásolta sem az izoprenalin (30-

240 nmol/l), sem a nátrium-nitroprusszid (100-500 nmol/l) félmaximális elernyesztő hatását.

Az L-NOARG mérsékelt (kb. 50 %-os) tónusos kontrakciót okozott (a megelőző 1 µmol/l

acetil-kolin százalékában kifejezve), de az azt követő acetil-kolin kontrakció mértékét ez nem

befolyásolta. Az ODQ (1 µmol/l) 73 %-kal gátolta a nátrium-nitroprusszid (500 nmol/l-1

µmol/l) által kiváltott félmaximális relaxációt. Az ODQ is kontrakciót okozott (kb. 40 % az

acetil-kolinhoz viszonyítva), de ez sem befolyásolta az acetil-kolin-okozta összehúzódást. A

gyors Na+ csatorna blokkoló TTX (1 µmol/l) nem befolyásolta a kapszaicin-okozta

elernyedést.

9

A többi humán preparátumon és az egér colonon a NOS-gátló L-NOARG (100 µmol/l)

szignifikánsan csökkentette a kapszaicin hatását (több mint 70 %-os gátlás humán ileumon és

colon ascendensen, teljes gátlás humán appendixen, kb. 50 %-os gátlás egér colonon). Csak a

tengerimalac colonon nem gátolta az L-NOARG a kapszaicin-okozta relaxációt.

A TTX (1 µmol/l) nem befolyásolta a kapszaicin-okozta relaxációt tengerimalac

colonon és humán preparátumokon, viszont részleges gátlást okozott (kb. 45%) egér colonon.

Egér colonon az L-NOARG és TTX kombinált adása sem okozott nagyobb gátlást, mint a két

szer külön-külön alkalmazva. Ugyanez a kombináció tengerimalac colonon nem befolyásolta

a kapszaicin relaxáló hatását.

Humán szigmabélen a kapszaicin által kiváltott relaxációt nem befolyásolta a P2

purinoceptor antagonista PPADS (50 µmol/l). A PPADS gátolta az α,β-meATP (10-30

µmol/l)-okozta relaxációt (37,6 ± 5,6 % előtte és 15,5 ± 6,2 % utána; p<0,05, n=6).

Az endogén kannabinoid receptor agonista anandamid (1, 10, 100 vagy 300 µmol/l)

nem váltott ki relaxációt az előkontrahált szigmabélen.

Egy külön kísérletsorozatban megvizsgáltuk a kapszaicin (1 µmol/l) hatását vad típusú

és TRPV1 receptor knockout C57BL/6 egereken (Davis és mtsai, 2000). A vad típusú egerek

colonján a kapszaicin hasonló mértékű relaxációt váltott ki, mint CD-1 egereken, viszont a

knockout csoporton minimális elernyedést kaptunk (45,3 ± 5,6 % vad típuson, 5,1 ± 3,3 %

knockout állatokon; p<0,001; n=6 ill. 7).

Megbeszélés

Eredményeink szerint az NO jelentős szerepet játszik a kapszaicin-okozta

elernyedésben humán szigmabél és colon ascendens, humán ileum, humán appendix és egér

colon körkörös izomzatán, tehát a kapszaicin-okozta NO-felszabadulás valószínűleg elterjedt

jelenség. Humán készítményeken mindezidáig nem írtak le olyan zsigeri motoros választ,

melyet a szenzoros idegekből felszabaduló NO közvetítene.

A megfigyelt kapszaicin hatások specifikussága mellett szól a viszonylag alacsony

koncentrációk alkalmazása és a tachyphylaxia jelenléte is, továbbá az, hogy a kapszaicin csak

minimális hatást váltott ki TRPV1 receptor knockout egereken, de jelentős relaxációt okozott

a vad típusú kontroll csoporton. A kísérleteinkben használt L-NOARG ebben a

koncentrációban nem okoz nem-specifikus hatásokat mivel (1) az L-NOARG nem

befolyásolta az alacsony koncentrációjú izoprenalin által kiváltott elernyedést és (2) egyik

szer sem változtatta meg az acetil-kolin által kiváltott összehúzódás mértékét. A kapszaicin-

10

okozta relaxáció mechanizmusa úgy tűnik némileg különböző az egyes preparátumokon. A

gyors Na+ csatorna blokkoló tetrodotoxin szignifikánsan csökkentette a kapszaicin hatását

egér colonon, viszont humán preparátumokon nem okozott gátlást. Számos bizonyíték

található arra nézve, hogy a kapszaicin hatására történő transzmitter felszabadulás az érző

idegvégződésekből TTX-rezisztens folyamat. Egér colon esetén több lehetőség is fennállhat:

(1) a kapszaicin-érzékeny idegvégződések aktiválják az intrinszik enterális neuronokat, így az

NO származhat a kapszaicin-érzékeny extrinszik neuronokból, az enterális neuronokból vagy

mindkettőből; (2) “nitrerg” kapcsolat áll fenn a szenzoros és enterális neuronok közt és az

utóbbi más gátló transzmittereket is tartalmazhat; (3) a kapszaicin a szenzoros

idegvégződések egy részét direkt módon izgatja (TRPV1 receptorokon keresztül) és ezek

aktiválhatnak más további érző idegvégződéseket indirekt úton, axon-reflex közvetítésével

(axon-reflex létrejöttéhez szükséges TTX-érzékeny ingerületvezetés).

Humán szigmabélen kapott eredményeink arra utalnak, hogy PPADS-érzékeny

purinoceptorok nem vesznek részt a kapszaicin-okozta elernyedésben.

A jelen eredmények az NO részvétele ellen szólnak a kapszaicin-okozta relaxációban

tengerimalac colonon, mivel az L-NOARG nem gátolta a kapszaicin-okozta választ.

Kétoldalú kapcsolatot feltételeznek az endokannabinoid anandamid és a kapszaicin-

érzékeny mechanizmusok között. Egyrészről az anandamid stimulálja a TRPV1 kapszaicin

receptorokat (de hasonlóan a kapszaicinhez, hosszú ideig, nagy koncentrációban adva gátolja

is a TRPV1 receptorokat). Másrészt az anandamid gátolhatja a kapszaicin-érzékeny idegek

működését kannabinoid receptorokon keresztül (Smart és mtsai, 2000; Szolcsányi, 2000). Az

első esetben az anandamid utánozza a kapszaicin hatását, míg a másikban gátolja. A jelen

kísérletben (humán szigmabélen) nem kaptunk bizonyítékot az anandamid egyik hatására

sem, széles koncentrációtartomány alkalmazása ellenére. A kapott negatív eredmény

magyarázatául szolgálhat, hogy az anandamid felvétele az érző idegvégződésbe nem

tökéletes, márpedig ez szükséges ahhoz, hogy a szer kifejtse a hatását a TRPV1 kapszaicin

receptorokon (De Petrocellis és mtsai, 2001).

“Nitrerg-purinerg” interakciók humán és patkány bélpreparátumokon

Bevezetés

A gasztrointesztinális simaizomzat NANC válaszait − köztük a nem-szelektív idegingerléssel

kiváltott NANC elernyedést − döntő mértékben a bélfal saját (intrinszik) neuronjai közvetítik,

11

amelyek főleg a plexus myentericusban helyezkednek el és nem érzékenyek kapszaicinre.

Mind az extracelluláris ATP, mind az NO számontartott NANC transzmitterek a gyomor-

bélhuzamban. Az NO-kutatás korai fázisában kifejlesztett specifikus szintézisgátló L-arginin-

analógok óriási lendületet adtak az NO-val kapcsolatos funkcionális kutatásoknak. Ilyen

hasznos szer a “purinerg” ingerületátvitel területén nem áll rendelkezésünkre. A “purinerg”

neurotranszmisszió kiiktatására használható módszer az ATP deszenzibilizáció, az apamin és

a purinoceptor antagonisták (pl. PPADS, suramin) alkalmazása.

A jelen kísérletsorozatok célja az volt, hogy két, jelentős NANC relaxációt mutató

bélpreparátumon (humán colon körkörös izomzat, patkány vékonybél hosszanti izomzat-

plexus myentericus csík) megvizsgáljuk egy NO-szintáz bénító és purinoceptor-antagonisták

együttes hatását, továbbá a guanilát-cikláz bénításának befolyását a NANC elernyedésre. A

megválaszolandó kérdések:

(a) “Purinerg” idegek részt vesznek-e a válasz közvetítésében?

(b) Ha igen, mi a viszonyuk a “nitrerg”-idegek szerepéhez, ill. a kettő együtt a válaszok

egészét megmagyarázza-e?

(c) A “nitrerg” idegek a guanilát-cikláz enzim közvetítésével hatnak-e, ill. részt vesz-e a

válaszban más, a guanilát-ciklázon keresztül ható ingerületátvivő anyag?

Módszerek

Wistar patkányok ileumát (az állatok leölése után) kimetszettük és kb. 3 cm-es darabokból

Paton és Vizi (1969) módszerét követve hosszanti izom-plexus myentericus csík

preparátumokat készítettünk. A preparátumok elkészítéséhez viszonylag nagy testtömegű

patkányok ideálisak, ezért 400-500 g tömegű állatokat használtunk a kísérletekhez.

A humán szigmabél preparátumokat carcinoma miatti bélműtéten átesett páciensek

eltávolított ép bélszakaszaiból készítettük. Körkörös irányú kb. 2 x 20 mm méretű

preparátumokat készítettünk, melyekről a nyálkahártyát lemetszettük.

A készítményeket 5 ml-es szervfürdőkben, 37 °C-os, oxigenizált (95 % O2 + 5% CO2)

Krebs-oldatban függesztettük fel. A mozgásokat izotóniásan regisztráltuk. A patkány ileum

preparátumok esetén 2 mN-os, humán szigmabél estén 10 mN-os feszítést alkalmaztunk.

Az idegeket elektromos téringerléssel (EFS; Paton és Vizi, 1969) aktiváltuk atropin (1 µmol/l)

és guanetidin (3 µmol/l) jelenlétében. Patkány ileum esetén 1 óra inkubációs periódus után a

preparátumokat prosztaglandin F2α-val (0,1 µmol/l) szubmaximálisan előkontraháltuk és

idegingerlést (EFS) vagy valamilyen relaxáló ágenst (ATP, α,β-meATP, adenozin,

12

nitroglicerin, nátrium-nitroprusszid vagy izoprenalin; kontaktus idő 3 perc) alkalmaztunk. Az

EFS paraméterei: amplitúdó 60 V, impulzusszélesség 0,2 ms, 10 Hz-es frekvencia 20 s-ig.

A humán szigmabél preparátumokat a szintén 1 óra inkubációs periódus letelte után

hisztaminnal (5 µmol/l) előkontraháltuk, majd EFS-t vagy valamely relaxáló anyagot

(izoprenalin, α,β-meATP) alkalmaztunk. Az EFS paraméterei: amplitúdó 80 V, impulzus

szélesség 0,1 ms, 1 ill. 10 Hz-es frekvencia 20 s-ig. Ezt követően a fürdőben a folyadékot

lecseréltük és 40 perces inkubációs idő után a folyamatot ismételtük mindkét preparátum

esetén. Az EFS 3 ciklusban ismételhetőnek bizonyult.

Eredmények

Patkány ileum hosszanti izom-plexus myentericus preparátumok

Előkontrahált preparátumokon az EFS gyors relaxációt váltott ki, melyet a TTX (1 µmol/l)

teljesen kivédett. A relaxációs válasz L-NOARG (100 µmol/l) jelenlétében részben

megmaradt (L-NOARG előtt 38,2 ± 3,4 %, utána 25,8 ± 1,9 %, n=13). Apamin (0,3 µmol/l)

önmagában csak mérsékelt (kb. 30 %-os) gátlást okozott. Apamin és L-NOARG kombinált

alkalmazása már kb. 85 %-os gátlást eredményezett.

Az L-NOARG-kezelt preparátumokon mind a suramin (100 µmol/l), mind a PPADS

(50 µmol/l) szinte teljesen kivédte az EFS által kiváltott relaxációt. A PPADS önmagában

csak mérsékelt (kb. 30 %-os) gátlást váltott ki. A PPADS-kezelt preparátumokon az L-

NOARG teljes gátlást eredményezett.

A guanilát-cikláz gátló ODQ (1 µmol/l) nem növelte tovább az L-NOARG (100

µmol/l) gátló hatását az EFS-okozta relaxációra (L-NOARG előtt 40,6 ± 6,4 %, L-NOARG

jelenlétében 29,9 ± 2,7 %, L-NOARG plusz ODQ jelenlétében 29,8 ± 5,6 %, n=7). Az ODQ

(1 µmol/l) 85 %-kal gátolta a nitroglicerin (13 µmol/l) relaxáló hatását.

Az ATP (0,1−500 µmol/l) elernyedést okozott. A szer független adásával (1

preparátumnak 1 beadás) nagyjából harang alakú dózis-hatás görbét kaptunk. A PPADS (50

µmol/l) kb. 60 %-kal gátolta az ATP (1 µmol/l) relaxáló hatását. Az α,β-meATP szintén

koncentráció-függő elernyedést okozott patkány ileumon 1−100 µmol/l-es koncentráció

tartományban. Az α,β-meATP (10 µmol/l) relaxáló hatását a PPADS (50 µmol/l) kivédte. A

PPADS (50 µmol/l) plusz suramin (100 µmol/l) együtt nem befolyásolta az izoprenalin (5−10

nmol/l) által kiváltott félmaximális elernyedést.

13

Humán szigmabél preparátumok

A hisztaminnal előkontrahált humán szigmabélen elektromos téringerléssel NANC relaxációt

váltottunk ki, melyet a TTX (1 µmol/l) mindkét alkalmazott frekvencián (1 és 10 Hz)

kivédett. Az L-NOARG (100 µmol/l) gátolta az idegingerléssel kiváltott NANC relaxációt

humán szigmabélen; 1 Hz-en több mint 40 %-os, 10 Hz-en kb. 50 %-os gátlást okozott. Az L-

NOARG-kezelt preparátumokon a purinoceptor antagonista PPADS (50 µmol/l) plusz

suramin (100 µmol/l) kombinációja jelentős (1 Hz-nél 64 %-os, 10 Hz-nél 54 %-os) gátlást

eredményezett, de ha a két purinoceptor antagonistát külön adtuk a fürdőbe, semmilyen vagy

csak minimális hatást észleltünk.

Kontroll preparátumokon a PPADS plusz suramin kombinált adása nem gátolta az 1

ill. 10 Hz-es idegingerléssel kiváltott NANC relaxációt, míg a purinoceptor antagonisták

jelenlétében ingerelve az L-NOARG majdnem teljesen kivédte az elernyedést (kb. 80 %-os

gátlás 1 Hz-en, 90 %-os gátlás 10 Hz-en). Az α,β-meATP (5 µmol/l) elernyesztő hatását a

PPADS plusz suramin együtt jelentősen gátolta, míg a PPADS önmagában mérsékelt gátlást

okozott. A suramin önmagában nem volt hatással a relaxációra. A purinoceptor antagonisták

kombinációja nem befolyásolta sem az izoprenalinnal (30−200 nmol/l) sem a nifedipinnel (3

µmol/l) kiváltott elernyedést.

A guanilát-cikláz gátló ODQ (3 µmol/l) kb. 30 %-kal gátolta a NANC relaxációt. L-

NOARG-kezelt preparátumokon az ODQ hatástalan volt. Fordított sorrendben alkalmazva,

ODQ kezelés után az L-NOARG enyhe gátló hatást váltott ki a NANC relaxációra.

Megbeszélés

Eredményeink szerint a “nitrerg” és “purinerg” idegek együtt közvetítik az EFS-okozta

relaxációt patkány ileum hosszanti izom-plexus myentericus preparátumon. A P2 purinoceptor

antagonista PPADS ill. suramin gátolta a NANC relaxáció nem “nitrerg” részét, az L-

NOARG pedig kivédte a P2 purinoceptor antagonisták jelenlétében kapott választ. Ez azt is

jelenti, hogy az L-NOARG jelenlétében kiváltott válasz teljesen “purinerg” , míg a PPADS

jelenlétében kiváltott válasz teljesen “nitrerg” természetű.

Smits és Lefebvre (1996) eredményei szerint patkány ileum hosszanti izomzatán az

EFS-kiváltotta elernyedést az ATP tachyphylaxia gátolja, és ez a gátló hatás nem adódik

hozzá a NOS-gátlóval kiváltott gátláshoz. Két P2 purinoceptor antagonista (suramin és

reactive blue 2) nem gátolta az idegingerléssel kiváltott relaxációt NOS gátlóval előzetesen

nem kezelt preparátumokon (Smits és Lefebvre, 1996). Kombinált NOS gátló-purinoceptor

14

antagonista kezelést nem végeztek. Arra a következtetésre jutottak, hogy az ATP-n és NO-n

kívül még legalább egy másik transzmitter is részt vesz a relaxáció közvetítésében. Saját

eredményeink szerint a PPADS szelektíven gátolta az exogén ATP-vel vagy α,β-meATP-vel

kiváltott elernyedést. Eredményeink szerint azonban a purinoceptor antagonisták nem csak L-

NOARG jelenlétében váltottak ki gátló hatást; a PPADS önmagában kb. 30 %-os gátlást

eredményezett, ami nem sokkal marad el az L-NOARG által kifejtett gátlástól (ez utóbbi kb.

40 %). A suramin önmagában szintén részleges gátlást hozott létre. A suramin csökkentette a

prosztaglandin F2α-val kiváltott előkontrakciót (ld. Smits és Lefebvre, 1996 közleményét is),

ezért a továbbiakban csak a PPADS hatását vizsgáltuk. A PPADS specifikusnak bizonyult,

nem befolyásolta sem az előkontrakció mértékét, sem a nátrium-nitroprussziddal vagy

izoprenalinnal kiváltott elernyedést.

Az apamin NANC relaxációra kifejtett erős gátló hatása L-NOARG jelenlétében azt

jelenti, hogy a válasz “nem-nitrerg” része főként apamin-érzékeny K+ csatornák aktivációján

keresztül jön létre. Az apamin-érzékenység mindazonáltal nem azonosítható teljes mértékben

a “purinerg” válasszal, pl. több neuropeptid is képes apamin-érzékeny válasz kiváltására.

Humán szigmabél körkörös izomzatán kapott eredményeink szerint az ATP vagy

valamely rokon vegyület részt vesz az elektromos téringerléssel kiváltott NANC relaxáció

közvetítésében. Ezen a preparátumon is megvizsgáltuk a két P2 purinoceptor antagonistának

(PPADS és suramin) a NANC relaxáció L-NOARG-rezisztens részére kifejtett hatását, de

külön-külön adva csak minimális hatást kaptunk. Meglepetéssel tapasztaltuk, hogy a két

antagonista kombinációja viszont erősen gátolta a NANC relaxációt. Valószínű, hogy a két

antagonista együtt a P2 purinoceptorok szélesebb skáláját gátolja, mint külön-külön

alkalmazva őket. Ha a NOS-gátló nélkül vizsgáltuk a két P2 purinoceptor antagonista NANC

relaxációra kifejtett hatását, akkor a két szer együtt sem okozott gátlást. Mindebből arra

következtettünk, hogy ezen a preparátumon a NOS-gátló L-NOARG és a purinoceptor

antagonisták gátló hatása szupra-additív viszonyban áll egymással.

A másik kérdés, amire kísérleteink során választ kerestünk, hogy vajon a guanilát-

cikláz bénítása ODQ-val befolyásolja-e az L-NOARG-rezisztens NANC relaxációt. Az ODQ

nem okozott további gátló hatást L-NOARG jelenlétében sem humán szigmabélen, sem

patkány ileum preparátumon. Ez arra utal, hogy az idegingerléssel kiváltott NANC

relaxációban az NO-n kívül más szolubilis guanilát-ciklázon keresztül ható transzmitter nem

vesz részt. Az irodalomban már ismert, hogy patkány ileumon az ODQ gátolja az EFS-okozta

elernyedést (Tanovic és mtsai, 2001), ami várható is, mivel a válasz jelentős része NO-

mediált. Humán colonon az ODQ önmagában jelentős de részleges, P2 purinoceptor

15

antagonistákkal kombinálva pedig teljes gátlást hozott létre a NANC válaszon, ami megerősíti

az NO-ATP együtthatást.

A kísérletes diabétesz hatása az elektromos téringerléssel vagy

kapszaicinnel kiváltott kolinerg, “purinerg” és “peptiderg” motoros

válaszokra izolált patkány húgyhólyagon

Bevezetés

Régóta ismert, hogy a “purinerg” neurotranszmisszió szerepet játszik emlősök húgyhólyag-

működésében (ld. Hoyle, 1994; Burnstock, 1997). Más NANC neurotranszmitterek szerepére

is találhatók irodalmi adatok. A kapszaicin atropin-rezisztens kontrakciót vált ki patkány

hólyagon, amely érzékeny előzetes kapszaicin kezelésre és tachykinin receptor

antagonistákra, de TTX-rezisztens (Maggi és mtsai, 1991). Ez arra utal, hogy a kapszaicin

izgatja az érző idegvégződéseket (TTX-rezisztens módon) és tachykinineket szabadít fel,

amelyek kontrahálják a simaizomzatot.

In vitro funkcionális kísérletekben Meini és Maggi (1994) kimutatták tachykinin-

mediált, kapszaicin-érzékeny komponens jelenlétét elektromos téringerléssel kiváltott NANC

kontrakcióban patkány hólyag detrusor izomzatán. A válasz kiváltásához kellően hosszú idejű

téringerlés alkalmazása szükséges. Ugyanezek a szerzők funkcionális bizonyítékot

szolgáltattak P-anyag és neurokinin A részvételére a kapszaicin-okozta kontrakcióban (Meini

és Maggi, 1994).

A diabéteszes neuropátia egyaránt érinti a vegetatív, szomatomotoros és érző idegeket.

A neuropátia egyik megjelenési formája a hólyag diszfunkciója. A kapszaicin-érzékeny

idegek is érintve lehetnek a hólyagműködés károsodása során. Patkány hólyag detrusor

izomzatán ellentmondásos eredmények találhatók arra nézve, hogy a kísérletesen létrehozott

diabétesz hogyan befolyásolja a kapszaicin-okozta kontrakciót. Egyes eredmények csökkenést

mutattak a kapszaicin hatásában diabéteszes patkányok hólyagján (Kamata és mtsai, 1992;

Pinna és mtsai, 1994), míg mások nem találtak eltérést a diabéteszes és kontroll csoport között

(Santicioli és mtsai, 1987; Dahlstrand és mtsai, 1992).

A jelen munka célja az volt, hogy in vitro rendszerben megvizsgáljuk a kísérletes

diabétesz hatását a patkány húgyhólyag kapszaicin-érzékeny, kolinerg és “purinerg”

idegműködéseire. Farmakológiai eszközök segítségével minden eddiginél jobban

elkülönítettük ezeket a komponenseket. A kapszaicin-érzékeny válaszokat kapszaicin vagy

16

hosszú idejű téringerlés alkalmazásával vizsgáltuk. A kapszaicin-létrehozta választ

farmakológiailag jellemeztük. Megvizsgáltuk továbbá, hogy a kapszaicin-érzékeny idegek

képesek-e relaxáció kiváltására ill. képesek-e gátolni a kolinerg vagy “purinerg”

neurotranszmissziót.

Módszerek

Streptozotocin-kezelés

A kísérletek előtt 8 héttel hím Wistar patkányokat streptozotocinnal (50 mg/kg) vagy

oldószerével kezeltünk (a kezelést dr. Pórszász Róbert végezte). Az állatokat standard

körülmények között tartottuk, szabadon fogyasztottak táplálékot és ivóvizet. Nyolc hét

elteltével csak azokat az állatokat használtuk fel a kísérletekhez, amelyeknek vércukor

koncentrációja legalább 13 mmol/l volt, az ez alattiakat kizártuk.

In vitro kísérletek

A streptozotocinnal kezelt, oldószerrel kezelt és kezeletlen hím patkányokat (370-500 g)

tarkóütéssel leöltük és kivéreztettük. A húgyhólyagot eltávolítottuk és sagittalisan félbe

vágtuk, majd két detrusor-preparátumot készítettünk belőle (kb. 20 mm hosszú és 2 mm

széles). A preparátumokat oxigenizált, 37°C-os Krebs-oldatot tartalmazó szervfürdőkben 5

mN-os feszítés mellett felfüggesztettük. Izotóniás jelátalakító segítségével a mozgásokat

kompenzográfon regisztráltuk. Elektromos téringerlést végeztünk, melynek paraméterei a

következők voltak: a négyszögimpulzus amplitúdója 120 V, szélessége 0,1 ms; az ingerlés

frekvenciája 0,1 Hz (“egyes impulzusok”), ill. 1 Hz (30 másodpercig) vagy 10 Hz (40

másodpercig).

A viszonylag szelektív kolinerg válaszok kiváltásakor P2 purinoceptor antagonista

PPADS (50 µmol/l) plusz suramin (100 µmol/l) volt a fürdőben, a “purinerg”

mechanizmusokat pedig atropin (1 µmol/l) jelenlétében vizsgáltuk. Atropin, PPADS és

suramin együttes jelenlétében vizsgáltuk a hosszú idejű téringerléssel (10 Hz 40 s) kiváltott

kapszaicin-érzékeny kontrakciót ill. a kapszaicin hatását (30 nmol/l vagy 1 µmol/l).

Guanetidin (3 µmol/l) végig jelen volt a fürdőben a szimpatikus válaszok kiiktatására.

Eredmények

Elektromos téringerlés purinoceptor antagonisták jelenlétében

Kontroll állatokból készült preparátumokon PPADS (50 µmol/l) + suramin (100 µmol/l)

jelenlétében az egyes impulzusok rövid “twitch”-szerű válaszokat hoztak létre, az 1 Hz 30 s-

17

es ingerlés pedig tónusos kontrakciót okozott (17,2±1,9 ill. 45,9±5,7; n=6). Atropin (1 µmol/l)

szignifikánsan, kb. 70 %-kal csökkentette ezeket a válaszokat. Ugyanilyen körülmények

között a diabéteszes állatok preparátumai hasonló válaszokat adtak (20,7±1,0 ill. 49,2±3,0;

n=8), melyeket az atropin (1 µmol/l) szintén szignifikánsan kb 50 %-kal csökkentett.

Külön kísérletsorozatban megvizsgáltuk a kapszaicin tachyphylaxia (1 µmol/l kapszaicin 40

percre, mosás nélkül) és a TTX hatását a PPADS plusz suramin-kezelt kontroll

preparátumokon. A kapszaicin tachyphylaxia nem okozott eltérést sem az egyes impulzusok,

sem az 1 Hz-es ingerlés amplitúdójában. Az 1 µmol/l TTX teljesen kivédte mindkét

ingerléstípus hatását.

Elektromos téringerlés atropin jelenlétében

A kontroll állatokból atropin (1 µmol/l) jelenlétében kapott válaszok nagysága megközelítően

azonos volt a purinoceptor blokkolók jelenlétében kapott válaszokéval (14,6±1,0 ill. 39,5±4.3;

n=6). A diabéteszes állatokból készített preparátumokon szignifikánsan nagyobb

kontrakciókat kaptunk mindkét frekvenciánál az oldószer kontrollhoz képest (25,7±2,8 ill.

53,3±4.7; n=8). Ettől eltekintve a válaszok alakja hasonló volt. PPADS (50 µmol/l) plusz

suramin (100 µmol/l) megközelítően 50 %-os gátlást eredményezett mindkét vizsgált

csoportban, mindkét alkalmazott frekvencián.

Külön kísérletsorozatban vizsgáltuk kezeletlen kontroll csoporton az emelt dózisban

alkalmazott purinoceptor antagonisták hatását. 100 µmol/l PPADS plusz 200 µmol/l suramin

sem védte ki teljesen az idegingerlésre kapott válaszokat. A TTX (1 µmol/l) a kontrakciókat

teljesen kivédte, míg a kapszaicin tachyphylaxia nem befolyásolta egyik frekvencián kapott

választ sem.

A hosszú időtartamú elektromos téringerlés

Kontroll preparátumokon atropin (1 µmol/l), PPADS (50 µmol/l) plusz suramin (100 µmol/l)

jelenléte esetén a 10 Hz 40 s-os idegingerlés jellegzetes kontrakciós választ eredményezett: a

kezdeti gyors kontrakciót tónusos, lassú válasz követte. TTX (1 µmol/l) 91 %-kal

csökkentette a gyors választ és teljesen kivédte a tónusos komponenst. Kapszaicin előkezelés

(1 µmol/l 40 percre, mosás nélkül) a gyors választ kb. 20 %-kal csökkentette, viszont a

tónusos komponensen jelentősebb (80 % körüli) gátlást eredményezett (oldószerrel kezelt

csoport). Diabéteszes állatok hólyagján kapott eredmények kapszaicin kezelés előtt jelentősen

eltértek a kontroll csoporttól: a tónusos komponens kb. 60 %-kal kisebb volt a kontrollénál,

míg a kezdeti gyors válasz kis mértékben nagyobb. A kapszaicin tachyphylaxia azonos

18

mértékben csökkentette a gyors komponenst, mint az oldószer-kezelt csoporton. A tónusos

válasz gyakorlatilag eltűnt kapszaicin kezelés után (1. táblázat).

1. táblázat. A kapszaicin tachyphylaxia hatása a 10 Hz 40 s-os idegingerléssel kiváltott kontrakcióra patkány hólyag detrusor izomzatán. A válasz gyors és tónusos komponensét külön értékeltük. Átlag ± SEM. * − szignifikáns eltérés a kontroll válaszhoz képest (Wilcoxon teszt); # − szignifikáns eltérés az oldószerrel kezelt és diabéteszes csoport között (Mann-Whitney teszt). n: elemszám.

Kontroll 10 Hz 40 s

Kapszaicin tachyphylaxia (1 µmol/l)

n

Oldószerrel kezelt csoport

gyors 26,1 ± 4,0 19,7 ± 2,7* 12

tónusos 25,2 ± 4,5 4,7 ± 1,6* 12

Diabéteszes csoport

gyors 40,3 ± 3,2# 31,4 ± 4,0*# 12

tónusos 10,4 ± 2,5# 1,3 ± 0,9* 12

A kapszaicin-okozta kontrakció

Atropin (1 µmol/l), PPADS (50 µmol/l) + suramin (100 µmol/l) jelenlétében vizsgáltuk a

kapszaicin-okozta kontrakciót oldószerrel kezelt és diabéteszes állatok hólyagján. 30 nmol/l

és 1 µmol/l kapszaicint alkalmaztunk kumulatívan 3-3 percre. A diabéteszes csoportban kb.

20 %-kal kisebb válaszokat kaptunk mindkét vizsgált koncentráció esetén. Statisztikailag

szignifikáns különbséget csak 1 µmol/l kapszaicin esetén kaptunk. Az előzetes kapszaicin

tachyphylaxia teljesen kivédte a 30 nmol/l és 1 µmol/l kapszaicin kontraháló hatását. Utóbbi

egyaránt igaz kezeletlen, oldószerrel kezelt és diabéteszes állatokra.

Külön kezeletlen állatcsoporton megvizsgáltuk a kapszaicin-okozta kontrakció

farmakológiáját. A szub-maximális (300 nmol/l) kapszaicin-okozta izgató választ sem a TTX

(1 µmol/l), sem 1 µmol/l TTX plusz ω-konotoxin GVIA (500 nmol/l) nem befolyásolta. A

tachykinin receptor antagonista SR 140 333 (200 nmol/l; NK1 receptor blokkoló) ill. SR 48

968 (200 nmol/l; NK2 receptor blokkoló) külön-külön adva nem okozott szignifikáns gátlást.

A két antagonista együttes adása viszont erősen gátolta a kapszaicinnel kiváltott kontrakciót

(kb. 80 %-os gátlás).

A kapszaicin nem relaxálja a hólyagot

Megvizsgáltuk annak a lehetőségét, hogy a kapszaicin esetleg gátló hatásokat is kiválthat a

“purinerg” ill. kolinerg neurotranszmisszióra, amit azonban az izgató hatás maszkíroz. 1

µmol/l kapszaicint adtunk 2 perccel az elektromos ingerlések előtt (egyes impulzusok és 1 Hz

19

30 s-os ingerlés; PPADS + suramin ill. atropin jelenlétében). A kapszaicin nem okozott

eltérést az ingerlésre kapott válaszokban a megelőző kontroll válaszokhoz képest. Acetil-

kolinnal (1 µmol/l) előkontrahált preparátumokon az 1 µmol/l kapszaicin nem váltott ki

relaxációt. Ezeket a kísérleteket kezeletlen állatcsoporton végeztük és mindvégig jelen volt a

két tachykinin antagonista, hogy a kapszaicin kontraháló hatását kivédjük.

A P2 purinoceptor antagonisták hatása az ATP-okozta kontrakcióra hólyagon

Megvizsgáltuk a PPADS (50 µmol/l) + suramin (100 µmol/l) hatását az ATP-vel kiváltott

kontrakcióra. Különböző ATP-koncentrációkat alkalmaztunk, de minden preparátum esetén

csak egy adott ATP-koncentrációt vizsgáltunk. Az antagonisták minden vizsgált

koncentrációnál (1-100 µmol/l) erős gátlást fejtettek ki az ATP-okozta kontrakcióra.

Megbeszélés

A jelen kísérletsorozatban kísérletet tettünk arra, hogy farmakológiai eszközökkel

elkülönítsük a patkány hólyag válaszainak kolinerg, “purinerg” és “peptiderg” összetevőit.

PPADS és suramin jelenlétében kiváltott egyes impulzusokat és az 1 Hz-es idegingerlésre

kapott válaszokat az atropin erősen (több mint 50 %-ig) gátolta, ez a válasz tehát jelentős

mértékben kolinerg. A megmaradó válasz eredete eddig ismeretlen. Úgy tűnik, hogy a

kolinerg (és az ismeretlen) neuronok relatíve érzéketlenek a kísérletes diabétesz károsító

hatására, mivel a diabéteszes állatok hólyagján kapott válaszok nem tértek el az oldószerrel

kezelt csoporttól.

Az atropin jelenlétében kapott válaszok szignifikánsan gátolhatók PPADS és suramin

kombinációjával, ami a válaszok részben “purinerg” természetét bizonyítja. Eredményeink

szerint a PPADS plusz suramin erősen (valószínűleg nem kompetitív módon) gátolta az

exogén ATP hatását. A P2 purinoceptor antagonisták gátló hatása az ATP-re nézve erősebb

volt, mint az elektromos téringerlés esetén. Mindebből valószínűnek tűnik, hogy az atropin és

a purinoceptor antagonisták jelenlétében megmaradó válasz nem “purinerg” természetű, bár a

PPADS- és suramin-érzéketlen purinoceptorok szerepe sem zárható ki teljesen.

Az irodalomban ismert, hogy patkány húgyhólyagon a kapszaicin kontraháló hatását

tachykininek közvetítik (Maggi és mtsai, 1991). Ezt mi is alátámasztottuk receptor altípus-

specifikus antagonisták, az SR 140 333 (NK1 receptor blokkoló) és SR 48 968 (NK2 receptor

blokkoló) segítségével. A tachykinin NK1 és NK2 receptorok tehát szupra-additív

(potencírozó) módon működnek közre a kapszaicin által kiváltott válaszban. Mivel a

kapszaicin-kiváltotta kontrakció rezisztens TTX-re, valószínűtlen, hogy a tachykininek

neuronális izgató hatást váltanának ki, hacsak nem az idegek terminális, TTX-rezisztens

20

részét aktiválják. Az utóbbi feltevést valószínűtlenné teszi, hogy a válasz érzéketlen volt ω-

konotoxin GVIA adására, mely az N-típusú Ca2+ csatornák blokkolója.

Az 1 µmol/l-es kapszaicin előkezelés (tachyphylaxia kiváltása) erőteljesen gátolta a 10

Hz 40 s-os elektromos téringerlés hatását, viszont a kolinerg ill. “purinerg” (egyes

impulzusok és 1 Hz) válaszokra nem volt befolyása. Nem találtunk bizonyítékot a kapszaicin

rövid távú relaxáló hatására patkány hólyagon, még akkor sem, ha a kontraháló hatásokat

kivédtük tachykinin antagonisták segítségével. Ez meglepő, mert számos simaizom-

készítményen mind izgató, mind gátló kapszaicin-hatások kiválthatók.

Diabéteszes állatok hólyagján a kapszaicin-érzékeny hosszú idejű téringerlés (10 Hz

40 s) hatása jelentősen kisebb volt, mint a kontroll csoporton, míg a kapszaicin-okozta

válaszok csak kis mértékben csökkentek. Mindezek valószínűleg arra utalnak, hogy diabétesz

hatására a kapszaicin-érzékeny idegek és nem a simaizom károsodik. Ezen idegekből történő

transzmitter kiáramlás elektromos ingerlés hatására valószínűleg sokkal összetettebb

folyamat, mint kapszaicin hatására.

A DOLGOZATBAN BEMUTATOTT ÚJ EREDMÉNYEK

ÖSSZEFOGLALÁSA

Kutatásaink az ember és laboratóriumi állatok zsigeri szerveinek mozgásait szabályozó

mechanizmusok felderítésére és befolyásolására irányultak. Eredményeink rávilágítanak arra

a tényre, hogy a kapszaicin hatásában bélen nagy species-különbségek vannak: míg

tengerimalacban főleg tachykinin-mediált izgató hatást találunk, addig humán bélen gátló

hatás dominál, amelyet nem az ismert szenzoros transzmitter, a cAMP-n keresztül ható

kalcitonin gén-rokon peptid (ld. Maggi, 1995), hanem − legalábbis részben − a nitrogén-

monoxid közvetít.

Kimutattuk, hogy a szenzoros izgató kapszaicin NO közvetítésével okoz elernyedést

humán szigmabél, felszálló vastagbél és appendix körkörös izomzatán. A vékonybéllel

kapcsolatban is hasonló eredményekre jutottunk. Eszerint az, hogy a szenzoros izgató

kapszaicin NO-mediált gátló választ vált ki, meglehetősen általános jelenség az emberi

bélhuzamban. A válasz nem érzékeny az idegi vezetést gátló tetrodotoxinra, tehát nem

valószínű, hogy az NO enterális neuronokból származna, amelyeket szenzoros

21

idegvégződések aktiválnak; fölvetődik annak lehetősége, hogy az NO magukból a

kapszaicin-érzékeny érző idegvégződésekből szabadul fel. Ennek lehető tisztázására

tervezzük, hogy neuronális NOS-gátlók hatását is vizsgáljuk a későbbiekben (a jelen

kísérletekhez NG-nitro-L-arginint használtunk, amely nem differenciál a NOS izoenzimek

között).

Rágcsáló béltraktusán végzett kísérleteink is alátámasztják az NO szenzoros

neurotranszmitter szerepét. Egér vastagbélből készült körkörös „cikkcakk” készítményen a

kapszaicin elernyedést okoz, amely részlegesen érzékeny mind az NO szintézis, mind az

idegvezetés bénítására. Az NO a tengerimalac colonon viszont nem játszik szerepet a

kapszaicin-okozta válaszban.

A vegetatív idegrendszerben meglehetősen általános a ko-transzmisszió jelensége,

melyet jelen kísérletekben is kimutattunk. Elektromos téringerléssel kiváltott NANC

elernyedés mechanizmusát vizsgáltuk humán szigmabél körkörös izomzatán. Kimutattuk,

hogy a válaszban nemcsak a már ismert NO, hanem P2 purinoceptor agonista (valószínűleg

ATP) is részt vesz, de szerepe csak akkor válik nyilvánvalóvá, ha NOS-gátló is jelen van a

rendszerben. Feltehetően szupra-additív (potencírozó) viszony van a két transzmitter közt

ezen a szerven. A P2 purinoceptorok gátlására használt antagonista-keverék (PPADS plusz

suramin) jól és specifikusan gátolta az exogén purinoceptor-izgató α,β-meATP elernyesztő

hatását.

Patkány izolált szervi készítményeken kimutattuk, hogy a vékonybél elektromos

idegingerléssel kiváltott válaszait NO és ATP-szerű anyag együtt közvetíti. Ezen a

preparátumon bebizonyítottuk, hogy nincs olyan összetevője a válasznak, amely harmadik

NANC mediátor (pl. CO vagy neuropeptid) felszabadulásával volna magyarázható. A P2

purinoceptorok bénítását itt is specifikus antagonista (PPADS) segítségével végeztük.

Mindkét fent említett preparátumon megvizsgáltuk a guanilát-cikláz gátló ODQ jelű

vegyület hatását olyan körülmények közt, hogy a NOS-t előzőleg bénítottuk. Az ODQ nem

okozott további gátló hatást L-NOARG jelenlétében sem humán szigmabélen, sem patkány

ileum preparátumon. Ez arra utal, hogy az idegingerléssel kiváltott NANC relaxációban az

NO-n kívül más szolubilis guanilát-ciklázon keresztül ható transzmitter (pl. CO) nem vesz

részt.

Patkány hólyagon kimutattuk, hogy a kapszaicin izgató hatását tachykinin NK1 és NK2

receptor antagonisták kombinációjával lehet gátolni, továbbá hogy a kísérletes diabétesz

kizárólag a kapszaicin-érzékeny válaszokat gátolta. A kapszaicinre nem érzékeny zsigeri

idegekkel kapcsolatban megállapítottuk, hogy kolinerg-, ill. purinoceptor-antagonisták és

22

kapszaicin-deszenzibilizáció segítségével a hólyagizomzatra ható vegetatív kolinerg, ill.

„purinerg” hatások egymástól farmakológiailag jelentősen elkülöníthetők és befolyásolásuk

külön-külön tanulmányozható.

A várakozással ellentétben eddig nem találtunk bizonyítékot arra, hogy az

endokannabinoid anandamid humán bél-preparátumokon kapszaicin-szerű hatásokat fejtene

ki.

23

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Őszinte köszönetemet fejezem ki dr. Barthó Loránd egyetemi tanár úrnak, témavezetőmnek,

aki bevezetett a tudományos kutatómunka világába és mindvégig magas szintű szakmai

tanácsaival irányította PhD munkámat. Köszönettel tartozom munkatársaimnak, dr. Lázár

Zsófiának, dr. Undi Saroltának és dr. Wolf Mátyásnak a kísérletes munkában nyújtott baráti

segítségükért, ill. volt kollégámnak ifj. dr. Lénárd Lászlónak, aki a kísérletes módszerek

elsajátításában segítségemre volt. Köszönettel tartozom előbírálóimnak, dr. Mózsik Gyula

egyetemi tanár úrnak és dr. Király Ágnes egyetemi docensnek, hogy hasznos tanácsaikkal

segítették az értekezésem végleges formájának kialakítását. Végül, de nem utolsó sorban,

köszönöm szüleimnek, hogy mindvégig támogattak tanulmányaim és munkám során.

24

IRODALOM

Barthó L, Benkó R, Patacchini R, Pethő G, Holzer-Petsche U, Holzer P, Lázár Z, Undi S, Illényi L, Antal A,

Horváth ÖP, 2004. Effects of capsaicin on visceral smooth muscle: a valuable tool for sensory neurotransmitter identification. Eur. J. Pharmacol. 500: 143-157.

Barthó L, Kóczán G, Holzer P, Maggi CA, Szolcsányi J, 1991. Antagonism of the effects of calcitonin gene-related peptide and of capsaicin on the guinea-pig isolated ileum by human alpha-calcitonin gene-related peptide(8-37). Neurosci. Lett. 129: 156-159.

Barthó L, Lázár Zs, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, 2000. Evidence for the involvement of ATP, but not of VIP/PACAP or nitric oxide, in the excitatory effect of capsaicin in the small intestine. Eur. J. Pharmacol. 392: 183-188.

Barthó L, Lefebvre R, 1994. Nitric oxide induces acetylcholine-mediated contractions in the guinea-pig small intestine. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 350: 582-584.

Barthó L, Lénárd LJr, Patacchini R, Halmai V, Wilhelm M, Holzer P, Maggi CA, 1999. Tachykinin receptors are involved in the "local efferent" motor response to capsaicin in the guinea-pig small intestine and oesophagus. Neuroscience 90: 221-228.

Barthó L, Lénárd LJr, Szigeti R, 1998. Nitric oxide and ATP co-mediate the NANC relaxant response in the guinea-pig taenia caeci. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 358: 496-499.

Barthó L, Pethő G, Antal A, Holzer P, Szolcsányi J, 1987. Two types of relaxation due to capsaicin in the guinea-pig ileum. Neurosci. Lett. 81:146-150.

Barthó L, Szolcsányi J, 1978. The site of action of capsaicin on the guinea-pig isolated ileum. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 305: 75-81.

Bayliss WM, Starling EH, 1899. The movements and innervation of the small intestine. J. Physiol. 24: 99-143. Burnstock G, 1972. Purinergic nerves. Pharmacol Rev. 24: 509-560. Burnstock G, 1997. The past, present and future of purine nucleotides as signalling molecules. Neuropharmacol.

36: 1127-1139. Caterina MJ, Julius D, 2001. The vanilloid receptor: a molecular gateway to the pain pathway. Ann. Rev.

Neurosci. 24: 487-517. Clapham DE, Montell C, Schultz G, Julius D, 2003. International Union of Pharmacology. XLIII. Compendium

of voltage-gated ion channels: transient receptor potential channels. Pharmacol. Rev. 55: 591-596. Dahlstrand C, Dahlström A, Ahlman H, Jonsson O, Lundstam S, Norlén L, Pettersson S, 1992. Effect of

substance P on detrusor muscle in rats with diabetic cystopathy. Br. J. Urol. 70: 390-394. Davis JB, Gray J, Gunthorpe MJ, Hatcher JP, Davey PT, Overend P, Harries MH, Latcham J, Clapham C,

Atkinson K, Hughes SA, Rance K, Grau E, Harper AJ, Pugh PL, Rogers DC, Bingham S, Randall A, Sheardown SA, 2000. Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature 405: 183-187.

De Petrocellis L, Bisogno T, Maccarrone M, Davis JB, Finazzi-Agro A, DiMarzo V, 2001. The activity of anandamide at vanilloid VR1 receptors requires facilitated transport across the cell membrane and is limited by intracellular metabolism. J. Biol. Chem. 276: 12856-12863.

Goyal RK, Hirano I, 1996. The enteric nervous system. New England J. Med. 334: 1106-1115. Hoyle CH, 1992. Transmission: purines. In: Autonomic Neuroeffector Mechanisms, ed. Burnstock G, Hoyle CH;

Harwood Academic Publishers, Chur, 1992, pp. 367-407. Hoyle CH, 1994. Non-adrenergic, non-cholinergic control of the urinary bladder. World J. Urol. 12: 233-244. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J, 1967. Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention

by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br. J. Pharmacol. Chemother. 31: 138-151. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J, 1968. The role of sensory nerve endings in neurogenic inflammation

induced in human skin and in the eye and paw of the rat. Br. J. Pharmacol. Chemother. 33: 32-41. Kamata K, Inoue K, Kasuya Y, 1992. Changes in contractile responses of the urinary bladder to substance P in

streptozotocin-induced diabetic rats. Gen. Pharmacol. 24: 547-553. Lecci A, Santicioli P, Maggi CA, 2002. Pharmacology of transmission to gastrointestinal muscle. Curr. Op.

Pharmacol. 2: 630-641. Lefebvre RA, Barthó L, 1997. Mechanism of the nitric oxide-induced contraction in the rat isolated small

intestine. Br. J. Pharmacol. 120: 975-981. Maggi CA, 1995. Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-transmitters released from

peripheral endings of sensory nerves. Prog. Neurobiol. 45: 1-98. Maggi CA, Giuliani S, Santicioli P, Patacchini R, Said SI, Theodorsson E, Turini D, Barbanti G, Giachetti A,

Meli A, 1990a. Direct evidence for the involvement of vasoactive intestinal polypeptide in the motor response of the human isolated ileum to capsaicin. Eur. J. Pharmacol. 185: 169-178.

25

Maggi CA, Giuliani S, Zagorodnyuk V, 1996. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the circular muscle of guinea-pig colon: role as inhibitory transmitter and mechanisms of relaxation. Regulatory Peptides 61: 27-36.

Maggi CA, Patacchini R, Santicioli P, Giuliani S, 1991. Tachykinin antagonists and capsaicin-induced contraction of the rat isolated urinary bladder: evidence for tachykinin-mediated cotransmission. Br. J. Pharmacol. 103: 1535-1541.

Maggi CA, Santicioli P, Del Bianco E, Geppetti P, Barbanti G, Turini D, Meli A, 1989. Release of VIP- but not CGRP-like immunoreactivity by capsaicin from the human isolated small intestine. Neurosci. Lett. 98: 317-320.

Maggi CA, Theodorsson E, Santicioli P, Patacchini R, Barbanti G, Turini D, Renzi D, Giachetti A, 1990b. Motor response of the human isolated colon to capsaicin and its relationship to release of vasoactive intestinal polypeptide. Neuroscience 39: 833-841.

Meini S, Maggi CA, 1994. Evidence for a capsaicin-sensitive, tachykinin-mediated, component in the NANC contraction of the rat urinary bladder to nerve stimulation. Br. J. Pharmacol. 112: 1123-1131.

Paton WDM, Vizi ES, 1969. The inhibitory action of noradrenaline and adrenaline on acetylcholine output by guinea-pig ileum longitudinal muscle strip. Br. J. Pharmacol. 35: 10-20.

Pinna C, Bolego C, Puglisi L, 1994. Effect of substance P and capsaicin on urinary bladder of diabetic rats and the role of the epithelium. Eur. J. Pharmacol. 271: 151-158.

Santicioli P, Gamse R, Maggi CA, Meli A, 1987. Cystometric changes in the early phase of streptozotocin-induced diabetes in rats: evidence for sensory changes not correlated to diabetic neuropathy. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 335: 580-587.

Smart D, Gunthorpe MJ, Jerman JC, Nasir S, Gray J, Muir AI, Chambers JK, Randall AD, Davis JB, 2000. The endogenous lipid anandamide is a full agonist at the human vanilloid receptor (hVR1). Br. J. Pharmacol. 129: 227-230.

Smits GJM, Lefebvre RA, 1996. ATP and nitric oxide: inhibitory NANC neurotransmitters in the longitudinal muscle-myenteric plexus preparation of the rat ileum, Br. J. Pharmacol. 118: 695-703.

Szolcsányi J, 1984. Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensory-efferent function. In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation, ed. Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F; Akadémiai Kiadó, Budapest, 1984, pp. 27-56.

Szolcsányi J, 2000. Anandamide and the question of its functional role for activation of capsaicin receptors. Trends Pharmacol. Sci. 21: 203-204.

Szolcsányi J, Barthó L, 1978. New type of nerve-mediated cholinergic contractions of the guinea-pig small intestine and its selective blockade by capsaicin. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 305: 83-90.

Tanovic A, Jimenez M, Fernandez E, 2001. Actions of NO donors and endogenous nitrergic transmitter on the longitudinal muscle of rat ileum in vitro: mechanisms involved. Life Sci. 69: 1143-1154.

Whittle BJ, 1994. Nitric oxide in gastrointestinal physiology and pathology. In: Johnson, L.R. (Ed.) Physiology of the Gastrointestinal Tract, 3rd ed. Raven Press, New York, pp. 267-294.

Wood JD, 1994. Physiology of the enteric nervous system. In: Johnson, L.R. (Ed.) Physiology of the Gastrointestinal Tract, 3rd ed. Raven Press, New York, pp. 423-475.

26

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, 2002, Nitric oxide is involved in the

relaxant effect of capsaicin in the human sigmoid colon circular muscle. Naunyn-

Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 366: 496-500. IF: 2,6

Benkó R Lázár Z, Pórszász R, Somogyi G, Barthó L, 2003, Effect of experimental diabetes on

cholinergic, purinergic and peptidergic motor responses of the isolated rat bladder to

electrical field stimulation or capsaicin. Eur. J. Pharmacol. 478: 73-80. IF: 2,4

Benkó R, Lázár Z, Undi S, Illényi L, Antal A, Horváth ÖP, Rumbus Z, Wolf M, Maggi CA,

Barthó L, 2004, Inhibition of nitric oxide synthesis blocks the inhibitory response to

capsaicin in intestinal circular muscle preparations from different species. Life Sci. 76:

2773-2782. IF: 2,2

Barthó L, Benkó R, Patacchini R, Pethő G, Holzer-Petsche U, Holzer P, Lázár Z, Undi S,

Illényi L, Antal A, Horváth ÖP, 2004, Effects of capsaicin on visceral smooth muscle:

a valuable tool for sensory neurotransmitter identification. Eur. J. Pharmacol. 500:

143-157. IF: 2,4

Benkó R, Undi S, Wolf M, Magyar K, Tóvölgyi Z, Rumbus Z, Barthó L, 2006, P2

purinoceptors account for the non-nitrergic NANC relaxation in the rat ileum.

Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 4: 319-324. IF: 2,1

Közlésre való előkészítés alatt:

Benkó R, Undi S, Wolf M, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Horváth ÖP, Antal A, Magyar K,

Tóvölgyi Z, Barthó L, 2006. P2 purinoceptor antagonists inhibit the NANC relaxation

of the human colon in vitro. Neuroscience.

A JELÖLT EGYÉB KÖZLEMÉNYEI Lénárd L Jr, Lázár Z, Benkó R, Szigeti R, Báthori Z, Tóth GK, Penke B, Barthó L, 2000,

Inhibitory effect of PACAP(6-38) on relaxations induced by PACAP, VIP and non-

adrenergic, non-cholinergic nerve stimulation in the guinea-pig taenia caeci. Naunyn-

Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 361: 492-497. IF: 2,9

Barthó L, Lázár Z, Lénárd L Jr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, 2000,

Evidence for the involvement of ATP, but not of VIP/PACAP or nitric oxide, in the

excitatory effect of capsaicin in the small intestine. Eur. J. Pharmacol. 392: 183-188.

IF: 2,2

27

Rózsai B, Lázár Z, Benkó R, Barthó L, 2001, Inhibition of the NANC relaxation of the

guinea-pig proximal colon longitudinal muscle by the purinoceptor antagonist PPADS,

inhibition of nitric oxide synthase, but not by a PACAP/VIP antagonist. Pharmacol.

Res. 43: 83-87. IF: 0,9

Lázár Z, Shahbazian A, Benkó R, Tóth G, Penke B, Barthó L, Holzer P, 2001, PACAP(6-38)

inhibits the effects of vasoactive intestinal polypeptide, but not PACAP, on the small

intestinal circular muscle. Eur. J. Pharmacol. 431: 259-264. IF: 2,2

Lázár Z, Benkó R, Bölcskei K, Rumbus Z, Wolf M, Holzer P, Maggi CA, Barthó L, 2003,

Actions of endothelin and corticotropin releasing factor in the guinea-pig ileum: no

evidence for an interaction with capsaicin-sensitive neurons. Neuropeptides 37: 220-

232. IF: 2,2

Benkó R, Undi S, Wolf M, Barthó L, 2005, Effects of acute administration of and

tachyphylaxis to α,β-methylene ATP in the guinea-pig small intestine. Basic &

Clinical Pharmacology & Toxicology 97: 369-373. IF: 1,5

Barthó L, Undi S, Benkó R, Wolf M, 2005, Ideg-simaizom transzmitterek a gyomor-

bélhuzamban: A motilitászavarok lehetséges háttere. Praxis 14 (12): 14-19.

Barthó L, Undi S, Benkó R, Wolf M, Lázár Z, Lénárd L Jr, Maggi CA, 2006, Multiple motor

effects of ATP and their inhibition by PPADS in the small intestine of the guinea-pig.

Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 98: 488-495. IF: 1,5

Undi S, Benkó R, Wolf M, Illényi L, Horváth ÖP, Antal A, Csontos Z, Vereczkei A, Barthó

L, 2006, Purinergic nerves mediate the non-nitrergic relaxation of the human ileum in

response to electrical field stimulation. Brain Res. Bulletin (in press). IF: 2,5

28

Kongresszusi szereplések Lénárd LJr, Barthó L, Benkó R, Báthori Z, Tóth G, Penke B, PACAP-antagonista gátolja a nem-adrenerg, nem-

kolinerg elernyedést a coecumban. MITT vándorgyűlés, Harkány, 1999. jan. 27-30. [Abstract:

Neurobiology 7: 349-350, 1999]

Barthó L, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, PACAP antagonist inhibits non-adrenergic, non-cholinergic

(NANC) relaxation in the guinea-pig taenia caeci. Neuropeptides - Ferrara 1999 (9th Annual Meeting of

the European Neurpeptide Club, Ferrara, Italy, 12-15 May, 1999. [Abstract: Regul. Pept. 80:146, 1999]

Barthó L, Lénárd L Jr, Szigeti R, Benkó R, Báthori Z, Tóth G, Penke B, Nitric oxide, ATP and pituitary

adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) mediate the relaxant response of the guinea-pig

taenia caeci. Second European Congress of Pharmacology, July 3-7, 1999, Budapest, Hungary.

[Abstract: Fundam. Clin. Pharmacol. 13/Suppl. 1, 1999, 77s]

Lázár Z, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, Barthó L, Evidence for the

participation of P2 purinoceptors in the excitatory effect of capsaicin in the small intestine. The 6th

European Congress of Pharmaceutical Sciences, September 16-19, 2000, Budapest, Hungary.

[Abstract: Eur. J. Pharmaceutical Sci. 11/Suppl. 1, 2000, S113]

Barthó L, Lázár Z, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, P2 purinoceptors, but not

vasoactive intestinal polypeptide/pituitary adenylate cyclase activating polypeptide or nitric oxide, play

a role in the excitatory effect of capsaicin on myenteric neurons. Hung. Physiol. Soc./Br. Physiol. Soc.

Meeting, Budapest, 27-29 May, 2000. [Abstract: J. Physiol. Lond. 526 P, 167 P.]

Lázár Z, Benkó R, Barthó L, Nem nitrerg, nem VIP-erg gátló válasz légcsőben. Magyar Idegtudományi Társaság

(MITT) VIII. Konferenciája, Szeged, 2001. január 24-27.

Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, A kapszaicin mozgató hatása humán vastagbélen. A Magyar

Élettani Társaság (MÉT) kongresszusa, Szeged, 2001. június 6-8.

Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, Motor effects of capsaicin in the human colon. 7th Meeting

of the Austrian Neuroscience Association, Seggau/Leibnitz, Styria, Austria, 2-5 September, 2001.

Lázár Z, Shahbazian A, Benkó R, Tóth G, Penke B, Barthó L, Holzer P, PACAP(6-38) inhibits the effects of

VIP, but not PACAP, on the small intestinal circular muscle. 7th Meeting of the Austrian Neuroscience

Association, Seggau/Leibnitz, Styria, Austria, 2-5 September, 2001.

Benkó R, Lázár Z, Pórszász R, Barthó L, Csökkent zsigeri kapszaicin-érzékeny válaszok streptozotocin-

diabéteszes patkányban. A Magyar Diabetes Társaság XVI. Kongresszusa, Debrecen, 2002. május 30-

június 2. [Abstract: Diabetologia Hungarica 10, Suppl. 1, 10. old., 2002]

Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, Kapszaicin-érzékeny idegek lokális efferens hatásai humán

colonon. A Magyar Gasztroenterológiai Társaság 44. Nagygyűlése, Balatonaliga, 2002 június 4-8.

(Motilitási Szekció, június 6.)

Benkó R, Lázár Z, Undi S, Rumbus Z, Wolf M, Barthó L, A nitrogén-monoxid szerepe a kapszaicin hatásában

különböző fajok bél körkörös izomzatán. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) kongresszusa, Debrecen,

2004. június 7-9.

Benkó R, Undi S, Wolf M, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Barthó L, Nitrerg-purinerg interakciók tengerimalac-,

patkány- és humán izolált bélen. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) kongresszusa, Budapest, 2005.

29

június 2-4. [Extended abstract: Nitrergic-purinergic interactions in the guinea-pig, rat, and human

intestine. Acta Physiol. Hung. 92 (3-4): 244-245.]

Barthó L, Benkó R, Undi S, Pethő G, Sensory neurotransmitters and modulators: the basis of analgesic research.

1st BBBB Conference on Pharmaceutical Sciences, Siófok, Hungary, September 26-28, 2005.

Undi S, Benkó R, Wolf M, Magyar K, Barthó L: A guanilát-cikláz gátló ODQ hatása az elektromos

téringerléssel kiváltott simaizom-válaszokra és a perisztaltikus reflexre. A Magyar Experimentális

Farmakológia Tavaszi Szimpóziuma, Budapest, 2005. június 6-7. [Abstract: Inflammopharmacology

13: (5-6) 572-573.]

Wolf M., Undi S, Benkó R, Magyar K, Tóvölgyi Z, Barthó L, Egy guanilát-cikláz gátló vegyület hatása az

elektromos téringerléssel kiváltott simaizom-válaszokra és a perisztaltikus reflexre. A Magyar Élettani

Társaság (MÉT) LXX. Vándorgyűlése, Szeged, 2006. június 7-9.

Undi S, Wolf M, Benkó R, Illényi L, Cseke L, Kassai M, Vereczkei A, Horváth ÖP, Antal A, Barthó L, Purinerg

gátló válasz humán ileumon. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) LXX. Vándorgyűlése, Szeged, 2006.

június 7-9.

Undi S, Wolf M, Benkó R, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Antal A, Horváth ÖP, Barthó L, P2 purinoceptor

antagonisták gátló hatása human colon NANC relaxációjára in vitro. A Magyar Experimentális

Farmakológia Szimpóziuma, Pécs, 2006.június 3.

Benkó R, Undi S, Wolf M, Magyar K, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Horváth ÖP, Antal A, Barthó L, NO and

ATP co-mediate the non-adrenergic, non-cholinergic (NANC) relaxation in the human colon and rat

ileum. 15th World Congress of Pharmacology, IUPHAR, Peking, 2006. július 2-7. [Abstract: Acta

Pharmacologica Sinica, 2006, Suppl. 1: P 110.]

Undi S, Benkó R, Wolf M, Lázár Z, Lénárd L Jr., Maggi CA, Barthó L, Effects of ATP and alpha, beta-

methylene ATP (ABMA) and their inhibition by PPADS in the non-stimulated and field-stimulated

guinea-pig ileum. 15th World Congress of Pharmacology, IUPHAR, Peking, 2006. július 2-7.

[Abstract: Acta Pharmacologica Sinica, 2006, Suppl. 1: P 111.]

1

PHD THESIS

TRANSMITTERS OF EXTRINSIC AND INTRINSIC NERVES OF VISCERAL ORGANS

(FUNCTIONAL EVIDENCE)

Rita Benkó MD

PhD School: Drug Research Leader: Prof. Loránd Barthó

PhD program: Function and pharmacology of autonomic and

sensory neurons Leader: Prof. Loránd Barthó

Department of Pharmacology and Pharmacotherapy Faculty of Medicine, University of Pécs

Pécs

2006

2

INTRODUCTION Efferent nerves of the skin, mucous membranes and viscera originate from two sources, i.e.,

from the autonomic and the somatic nervous systems. These tissues and organs also contain

afferent nerves. Nerves within viscera can be classified in different ways. They can be divided

into intrinsic neurons (i.e., those with cell bodies and processes within the given organ) and

extrinsic ones (that send axons to the given organ).

The present work deals with the functional innervation of the intestinal tract and the

urinary bladder. While the gastrointestinal (GI) tract contains a massive intrinsic nervous

system of considerable complexity (i.e., the enteric nervous system, ENS), comparatively few

and scattered intrinsic nerves can be found in the wall of the bladder. Extrinsic visceral

neurons can be either autonomic efferents (parasympathetic praeganglionic, sympathetic

postganglionic fibres) or afferents (which, however, may also be able to release transmitters at

the periphery).

Autonomic nervous system can be devided into sympathetic, parasympathetic and

enteric systems (ENS) (Wood, 1994). The ENS contains approximately as many neurons as

the spinal cord (i.e., 107-108 neurons). These intrinsic neurons regulate many GI functions.

Extrinsic nerves modulate GI function mainly by influencing intrinsic neurons. Most parts of

the intestinal tract are able to function without extrinsic influences.

Intrinsic neurons take place in the ganglionated plexuses of the gut wall (i.e., the

myenteric and submucous plexuses). These neurons can influence other neurons and/or

smooth muscle cells and other effector tissues (enteric neurons). The most important

neurotransmitter of enteric excitatory motoneurons is acetylcholin that acts on muscarinic

receptors and thereby contracts circular and/or longitudinal muscles of the gut. When

muscarinic receptors are blocked (e.g., by atropine), nerve stimulation is still able to evoke

excitatory responses that are mediated by tachykinins (substance P, neurokinin A).

Inhibitory motoneurons of the gut wall release nitric-oxide (NO) as the main

transmitter, but this is evidenced for the mediator role of ATP, vasoactive intestinal

polypeptide (VIP), pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP), calcitonin

gene related peptide (CGRP) and carbon-monoxide (CO) as well (Goyal and Hirano, 1996).

NO plays a transmitter role in the opening of sphincters, in the peristaltic reflex

(descending inhibition), as well as the receptive relaxation of the stomach. NO plays a role in

the non-adrenergic, non-cholinergic (NANC) relaxation in response to electrical stimulation,

as well as in the regulation of spontaneous tone (see Whittle, 1994). NO is also able to elicit

3

excitatory responses in the intestine. Some preparations are contracted by NO via a

stimulation of intrinsic neurons, while in other preparations NO causes primary contraction on

the smooth muscle directly (Barthó and Lefebvre, 1994; Lefebvre and Barthó, 1997).

Extracellular ATP can play a neurotransmitter role („purinergic nerves”; Burnstock,

1972). Moreover, ATP may also play a cotransmitter and modulator role in the nervous

system (Burnstock, 1997; Hoyle, 1992). Receptors of ATP have many types, i.e., P2X

receptors (currently with 7 subtypes) and P2Y receptors (currently with 8 subtypes; see British

J. Pharmacol.: Guide to Receptors and Channels, 2nd edition, 2006). ATP can mediate both

excitatory and inhibitory responses; it probably participates in contracting or relaxing vascular

smooth muscle, contracting the vas deferens, relaxing GI smooth muscle. Some inhibitory

responses of GI preparations are co-mediated by ATP and NO (see Barthó et al., 1998). To

date, there has been no evidence for such an interplay in the human GI system.

Sensory neurons of the gut can also be classified as intrinsic and extrinsic. Intrinsic

sensory neurons are activated by stretch and other stimuli; they activate interneurons that in

turn stimulate enteric motoneurons. These latter mediate the contraction orally and relaxation

anally to the stimulus, called „the law of intestine” (Bayliss and Starling, 1899).

Extrinsic sensory neurons originate from the vagus nerve or the spinal cord. A special

subgroup of spinal afferents is capsaicin-sensitive neurons (Szolcsányi, 1984). Capsaicin is

the pungent substance in paprika (Capsicum annuum). It stimulates a specific, ion channel-

bound receptor (TRPV1). Opening of this channel causes membrane depolarisation in the

sensory nerve ending (or varicosity). This, besides afferent activation, causes a release of

biologically active substances from these nerve endings, in a manner not dependent on

voltage-activated (tetrodotoxin-sensitive) Na+-channels or neuronal voltage-dependent Ca2+-

channels. Biologically active substances released from capsaicin-sensitive afferents include

neuropeptides (CGRP, substance P, neurokinin A) and possibly other substances (ATP, NO).

All this evokes a variety of tissue responses (e.g., vasodilatation, increase in vascular

permeability, smooth muscle contraction or relaxation) (Jancsó et al., 1967, 1968; Szolcsányi,

1984; Barthó et al., 2004).

The urogenital system is also innervated by capsaicin-sensitive afferents. CGRP and

tachykinins release in these organs mostly originates from sensory neurones (Maggi, 1995;

Barthó et al., 2004). Sensory neuron-mediated responses show inter-species variations and

also differ as to different regions of, e.g., the bladder (detrusor muscle, bladder neck). The

present work will not deal with capsaicin-sensitive responses of the airways and blood

vessels, though this is also a highly interesting and well-studied area.

4

AIMS

We planned in vitro experiments to get a better insight into the motor responses of visceral

organs (GI system, urogenital tract). An important aspect was also the comparison of data

obtained on animal preparations with human tissues (obtained from the Department of

Surgery). We have been interested in the possible roles of sensory and other NANC

transmitters in visceral responses in health and disease, interactions of these substances and

possible drug effects upon them (stimulation, antagonism, modulation).

To elicit motor responses of innervated smooth muscle preparations we used the

sensory stimulant capsaicin, as well as non-selective „field” stimulation of intramural nerves.

We have taken the „identity of effect” as an important criterion, but the „identity of specific

antagonism” as the most decisive argument in the identification of a transmitter. In other

words, the effect, but first of all, specific inhibition of the exogenous putative transmitter and

the stimulation-evoked responses has to be largely similar. Also a specific inhibition of

synthesis (NO) or using of genetically modified animals can be regarded as ways of specific

inhibition.

Our work is basic research; it helps to understand the function of viscera in health and

disease; on the long term, our results can be useful for clinical diagnosis and therapy.

Moreover, some conclusions as to the peripheral neurotransmitter systems may have

relevance for the central nervous system as well. First of all, primary sensory neurons most

probably release the same substances from their peripheral and central endings. Since

transmitter identification is easier in viscera than in the spinal cord, the conclusion drawn

from such experiments may have implications for nociception and antinociception as well.

Specific aims of the experiments

1. We tested the effects of capsaicin and their mechanisms in circular muscles of various

segments of the human intestine, with special emphasis on the NO-guanylate cyclase

system. We also tested different species of laboratory animals for a presence of NO-

mediated effects of capsaicin.

2. The action of the endocannabinoid anandamide on the human gut has also been tested,

with special attention to its possible interaction with TRPV1 receptor.

5

3. A possible interaction between the NO and purinoceptor-mediated systems have been

examined on the rat ileum longitudinal and the human colon circular strips in the

mechanism of electrical field stimulation-evoked relaxation.

4. The hypothesis that, along with NO, other guanylate cyclase-stimulating transmitter

(e.g. CO) can be involved in the NANC relaxant responses has been examined on

several GI preparations.

5. Functional innervation of the urinary bladder has been examined by pharmacological

means; we tried to separate cholinergic, purinergic and (sensory) peptidergic

responses by using specific drugs.

6. The effect of experimental diabetes on these responses has been studied and the effect

of capsaicin has been pharmacologically characterised.

EXPERIMENTAL

Role of NO in the motor effects of capsaicin in intestinal circular muscle

preparations of various species

Introduction

Capsaicin shows multiple motor effects on GI preparations. In the guinea-pig ileum, both the

neurally-mediated contraction and a relaxant response have been detected (see among others

Barthó and Szolcsányi, 1978; Szolcsányi and Barthó, 1978; Barthó et al., 1994, 1999, 2000).

The latter may be mediated by CGRP (Barthó et al., 1987; 1991). Capsaicin evokes relaxation

on human gut preparations (Maggi et al., 1988, 1990a,b). CGRP is not involved in this

tetrodotoxin-resistant response. A possible role of a VIP-like peptide has been proposed

(Maggi et al.,1989, 1990a,b).

The aim of the present study was to examine the effects and mechanisms of action of

capsaicin on the circular muscle of the human sigmoid colon, other human GI preparations

and on the colon of the mouse and guinea-pig, with special reference to the NO-guanylate-

cyclase and the purinergic systems. We also tested if the endocannabinoid anandamide is able

to mimic or modify the effect of capsaicin on the human colon, since anandamide has been

reported to activate TRPV1 receptors (Smart et al., 2000), besides stimulating cannabinoid

receptors (Szolcsányi, 2000).

6

Methods

Guinea-pig proximal colon strips (mucosa-denuded), mouse distal colon zig-zag preparations,

circular (mucosa-denuded) strips of human ileum, appendix, ascending and sigmoid colon

were studied in conventional organ bath experiments, using oxygenised Krebs solution.

Movements were recorded isotonically. Human appendix and guinea-pig colon preparations

had a high spontaneous tone; the other preparations were moderately pre-contracted. NANC

conditions were maintained by atropine and the adrenergic blocking drug guanethidine.

Responses are expressed as % of the maximal relaxation due to isoprenalin. Capsaicin was

given only once to each preparation.

Results

In the human sigmoid colon, both the NO synthesis inhibitor L-NOARG (100 µM) and the

guanylate cyclase inhibitor ODQ (1 µM) strongly and specifically inhibited the effect of

capsaicin. The inhibitory action of L-NOARG was reversed by L-arginine (5 mM). ODQ

prevented the relaxation in response to the NO donor sodium nitroprusside (500 nM-1 µM).

Tetrodotoxin was ineffective against capsaicin.

L-NOARG also inhibited the relaxant effect of capsaicin on the human ileal, appendix

and ascending colonic circular muscle, as well as on the mouse colon, but not on the guinea-

pig colon. The effect of capsaicin was partly inhibited on the mouse colon, but not on the rest

of preparations. The P2 purinoceptor antagonist PPADS (50 µM) did not influence the effect

of capsaicin. PPADS inhibited relaxation induced by the P2 purinoceptor agonist α,β-

methylene ATP (10-30 µM). The endogen cannabinoid receptor agonist anandamide (1-300

µM) failed to relax the human colon. The colon of TRPV1 „knockout” mice (Davis et

al.,2000) failed to respond to capsaicin.

Discussion

Our data show for the first time that NO is an important mediator of the capsaicin-induced

relaxation in the human ileal, appendix and colonic circular mucle, as well as the mouse, but

not the guinea-pig colon. A partial inhibitory action of tetrodotoxin on the capsaicin-induced

response in the mouse colon might indicate an involvement of intrinsic neurones and/or a

sensory axon reflex mechanism. On the other hand, PPADS-sensitive purinoceptors are

unlikely to participate in the effect of capsaicin in the human colon.

7

Capsaicin-sensitive and endocannabinoid mechanisms may have complex interactions.

Anandamide has been shown to stimulate TRPV1 receptors (and upon prolonged exposure

can also inhibit these receptors). On the other hand, activation of cannabinoid receptor has an

inhibitory action on capsaicin-sensitive afferents (see Smart et al., 2000; Szolcsányi, 2000). In

our experiment on the human colon, anandamide failed to show any effect. A possible

explanation for this may be that the entry of anandamide into sensory neurons is not

sufficiently quick to compensate for its elimination (anandamide acts at the intracellular part

of the TRPV1 receptor; De Petrocellis et al., 2001).

Nitrergic-purinergic interactions on human and rat intestinal preparations

Introduction

NANC responses due to electrical field stimulation are predominantly mediated by intrinsic

neurons situated in the myenteric plexus; these nerves are insensitive to capsaicin. Both

extracellular ATP and NO are respected neurotransmitters in the GI tract. NO-mediated

mechanisms can be inhibited by a blockade of the NO synthase. For inhibiting purinergic

transmission receptor antagonists, ATP desensitisation and, with some reservations, the K+-

channel blocker apamin can be used.

The aim of the present experiment was to assess the combined effectiveness of NO synthase

inhibition and P2 purinoceptor antagonism. The effect of guanylate cyclase inhibition has also

been tested on the NANC relaxation. The questions to be answered were as follows.

(a) Do purinergic nerves participate in the NANC relaxation?

(b) If yes, what is their functional relation to nitrergic mechanisms? Can a combined

inhibition of these mechanisms fully account for the NANC response?

(c) Do nitrergic nerves act via an activation of the guanylate cyclase also involved in the

NANC relaxation?

Methods

Myenteric plexus-longitudinal muscle strips of the rat ileum were prepared with the method of

Paton and Vizi (1969). Human colonic tissue was obtained and circular strips were prepared

as described above. Organ bath experiments with electrical field stimulation were conducted

and movements were recorded isotonically. Rat preparations were precontracted with

8

prostaglandin F2α and human strips with histamine. NANC relaxations were tetrodotoxin-

sensitive in both preparation.

Results

Rat ileal strip

NANC relaxation to stimulation was reduced by L-NOARG (from 38 to 26 % relaxation,

p<0,05). Apamin alone caused a reduction by one third, while L-NOARG plus apamin caused

a nearly full inhibition. L-NOARG plus the purinoceptor antagonists PPADS (50 µM) or

suramin (100 µM) practically abolished the NANC relaxation. PPADS alone caused a

moderate inhibition. Subsequent administration of L-NOARG caused full inhibition.

The inhibition of guanylate cyclase with ODQ (1 µM) failed to add to the reduction of

the NANC response by L-NOARG. ODQ strongly inhibited the relaxant effect of

nitroglycerin (13 µM). PPADS (50 µM) strongly and specifically inhibited relaxation induced

by ATP (1 µM) or α,β-methylene ATP (10 µM).

Human sigmoid colon

NANC relaxation in response to electrical field stimulation (1 or 10 Hz) was reduced to its

half by L-NOARG (100 µM). A further strong inhibition was produced by an addition of

PPADS (50 µM) plus suramin (100 µM), but either PPADS or suramin alone ( in the presence

of L-NOARG) was without effect. Likewise, a combination of PPADS and suramin was

ineffective in the absence of L-NOARG. The guanylate cyclase inhibitor ODQ (3 µM)

reduced the NANC relaxation in the absence, but not in the presence of L-NOARG.

PPADS plus suramin strongly, while PPADS (but not suramin) moderately inhibited

the relaxant effect of α,β-methylene ATP (5 µM). PPADS plus suramin failed to influence

relaxations evoked by the adrenergic β-receptor agonist isoprenaline or the Ca2+-channel

blocker nifedipine.

Discussion

Purinergic and nitrergic nerves co-mediate the NANC relaxation in the rat longitudinal and

human colonic circular muscle. Our study has been the first to investigate the combined

effects of NO synthase inhibition and purinoceptor antagonism. These data show that the two

mechanisms together can account for practically the entire NANC relaxation, while Smits and

Lefebvre (1996), using ATP desensitisation, concluded that a third transmitter (which is not

9

CO) is also involved. The apamin-sensitive (L-NOARG-resistant) component of the response

may be identical with the purinergic one. Apamin, however, can also inhibit the effects of

other relaxants (e.g., neuropeptides).

P2 purinoceptors seem to be involved in the NANC relaxation of the human colon as

well, however, their interaction with the nitrergic mechanisms seems to be more complex.

First, a combination of PPADS and suramin was necessary to inhibit the non-nitrergic

response. We believe that this combination covers a wider scale of purinoceptors than either

drug alone. Second, even in combination these drugs failed to reduce the NANC relaxation in

the absence of L-NOARG, i.e., a non-additive relationship exists between the two systems.

The guanylate cyclase inhibitor ODQ reduced the NANC response in both the rat

(Tanovic et al., 2001) and human preparations, but failed to add to the inhibitory action of the

NO synthase inhibitor L-NOARG. This seems to indicate that (a) NO acts via the guanylate

cyclase and (b) we do not have to assume a mediating role of any other stimulant of the

guanylate cyclase (e.g., CO) in the NANC relaxation.

Effect of experimental diabetes on purinergic, cholinergic and peptidergic

motor responses evoked in the rat urinary bladder by electrical field

stimulation and capsaicin

Introduction

Purinergic neurotransmission has long been known to play a role in bladder functions in

mammals (see Hoyle, 1994; Burnstock, 1997). There are data on other neurotransmitters as

well. Capsaicin causes atropine-resistant contraction in the rat bladder; this is inhibited by

previous capsaicin treatment or tachykinin antagonists, but not by tetrodotoxin (Maggi et al.,

1991). This shows that capsaicin releases, in a tetrodotoxin-insensitive manner, tachykinins

from sensory nerve endings and thereby causes contraction of the rat bladder smooth muscle.

By applying long-term electrical stimulation Meini and Maggi (1994) demonstrated a

capsaicin-sensitive tonic contraction in the bladder detrusor muscle.

Diabetic neuropathy encounters autonomic, somatomotor and sensory neurons. A

possible manifestation of neuropathy is bladder dysfunction. Data of the literature are

contradictory as to the effects of experimental diabetes on the effect of capsaicin on the

10

bladder. Both reduced (Kamata et al., 1992; Pinna et al., 1994) and unchanged responses to

capsaicin have been described (Santicioli et al., 1987; Dahlstrand et al., 1992).

The aim of the present study was to investigate the effect of experimental diabetes on

cholinergic, purinergic and capsaicin-sensitive responses of the rat bladder. Better than any

other study, we separated these kinds of responses from each other by pharmacological

means. Capsaicin-sensitive responses were evoked by capsaicin administration or by long-

term electrical stimulation. Moreover, it was tested whether capsaicin is able to elicit

relaxation in precontracted preparation or to inhibit cholinergic or purinergic

neurotransmission.

Methods

Streptozotocin treatment

Male Wistar rats were given streptozotocin (50 mg/kg) or its solvent, 8 weeks before the

experiments. Animals with blood glucose below 13 mM were excluded.

Isolated bladder

Two detrusor preparations were made up from each animal. Movements were recorded

isotonically. Electrical field stimulation (120 V, 0.1 ms, single pulses or 1 Hz for 30 s, or 10

Hz for 40 s) was applied. PPADS (50 µM) plus suramin (100 µM) was administered to inhibit

purinergic (thus isolate cholinergic) responses and atropine (1 µM) for studying purinergic

responses. Capsaicin-sensitive responses were studied in the presence of atropine and

purinoceptor antagonists. Guanethidine (3 µM) was present throughout for an inhibition of

sympathetic responses.

Results

Electrical stimulation in the presence of purinoceptor antagonists

Preparations from solvent-treated animals exhibited „twitch” response to single shocks and

tonic contraction to 1 Hz stimulation (17 and 46 % of the maximal contraction, respectively).

Atropine (1 µM) reduced these responses to less than their half. Quite similar results were

obtained on the bladders of diabetic rats.

On solvent-treated animals, capsaicin tachyphylaxis failed to influence the effects of

electrical field stimulation, indicating that they were mediated by capsaicin-insensitive nerves.

Responses were blocked by tetrodotoxin (1 µM).

11

Electrical stimulation in the presence of atropine

Preparations from solvent-treated animals showed twitch responses (approximately 15 and 40

%, with single shocks and 1 Hz stimulation, respectively). Significantly higher responses were

obtained in bladders from diabetic rats (26 and 53 %, respectively). PPADS plus suramin

caused approximately 50 % inhibition in both the control and diabetic group. Capsaicin

tachyphylaxis was ineffective on this type of contraction as well.

Long-term electrical stimulation

In the solvent group and in the presence of atropine and PPADS plus suramin, 10 Hz

stimulation for 40 s resulted in an initial, quick, followed by a smaller, sustained contraction.

Tetrodotoxin (1 µM) practically abolished both phases of this response. Capsaicin

tachyphylaxis (1 µM for 40 min, without rinsing) slightly decreased the quick and strongly

inhibited the tonic phase of the response.

In bladders of diabetic animals the tonic component of the response to electrical

stimulation was less than half of the controls (while the initial one was slightly enhanced).

Capsaicin tachyphylaxis further reduced the tonic component (practically to zero).

Table 1

Effect of capsaicin tachyphylaxis to contractions evoked by sustained electrical stimulation (10 Hz for 40 s) on the rat bladder detrusor preparation. Fast and slower (tonic) phases of the response were distinguished. Mean ± S.E.M. *-Significant difference from the control response (Wilcoxon’s signed rank test); #-significantly different from the solvent-treated group (Mann-Whitney test); n denotes the number of preparations.

Control 10 Hz 40 s

Capsaicin tachyphylaxis (1 µM)

n

Solvent-treated group

quick 26.1 ± 4.0 19.7 ± 2.7* 12

sustained 25.2 ± 4.5 4.7 ± 1.6* 12

Diabetic group

quick 40.3 ± 3.2# 31.4 ± 4.0*# 12

sustained 10.4 ± 2.5# 1.3 ± 0.9* 12

Capsaicin-induced contraction

30 nM and 1 µM capsaicin was administered in a cumulative fashion, each for 3 min.

Atropine (1 µM), PPADS (50 µM) and suramin (100 µM) was present throughout the

12

experiments. Responses to capsaicin were approximately 20 % smaller in the diabetic than in

the solvent treated group. The difference proved statistically significant at 1 µM of capsaicin.

Capsaicin pretreatment abolished the contractile effect of capsaicin (30 nM or 1 µM), both in

the solvent-treated and in the diabetic group.

Pharmacological sensitivity of the capsaicin-induced contraction was studied in a

separate group of untreated animals. The excitatory response to capsaicin (300 nM) was not

influenced by tetrodotoxin (1 µM) or a combination by tetrodotoxin (1 µM) plus ω-conotoxin

GVIA (an inhibitor on neuronal Ca2+ channels; 500 nM). Neither the tachykinin NK1 receptor

antagonist SR 140 333 (200 nM), nor the tachykinin NK2 receptor antagonist SR 48 968 (200

nM) had any inhibitory effect on the capsaicin-induced contraction. By contrast, a

combination of the two tachykinin antagonists strongly (by approximately 80 %) inhibited the

effect of capsaicin.

Capsaicin fails to relax the bladder

We examined the possibility of a relaxant effect of capsaicin that is normally masked by the

contractile one. Preparations were treated with tachykinin antagonists plus atropin or

purinoceptor antagonists. Capsaicin (1 µM, 2 min before stimulation) failed to infuence

responses to single electrical shocks or 1 Hz stimulation. In preparations treated with

tachykinin antagonists only and precontracted with acetylcholin (1 µM) capsaicin (1 µM) did

not evoke any relaxant response.

Effect of purinoceptor antagonists on the contractile action of ATP in the rat bladder

A combination of PPADS (50 µM) and suramin (100 µM) strongly inhibited the contractile

effect of exogenous ATP (1-100 µM).

Discussion

As far as it was possible, the cholinergic, purinergic and capsaicin-sensitive neuronal

responses of the bladder were separated by pharmacological means. The nature of the

„remaining” responses in the presence of atropine and purinoceptor antagonists remains

obscure. Cholinergic and purinergic responses (as well as the „remaining” contraction) seem

to be relatively insensitive to experimental diabetes (purinergic responses have in fact

increased).

Early observations of Maggi et al. (1991) on the tachykininergic mediation of the

contractile response of capsaicin on the rat bladder were confirmed in the present experiments

with the aid of receptor sutype-specific tachykinin receptor antagonists (SR 140 333 and SR

13

48 968). Since neither of these substances was effective on its own, a supra-additive

collaboration between NK1 and NK2 receptors has to be presumed. We did not find evidence

for any kind of acute inhibitory effect of capsaicin on the smooth muscle tone or on

cholinergic or purinergic responses.

A selective strong inhibition of the tonic capsaicin-sensitive contraction in diabetic

rats makes it likely that diabetes damages capsaicin-sensitive neurons rather than smooth

muscle cells.

14

SUMMARY OF THE NEW RESULTS

Our results concerning the mechanisms of visceral motor responses revealed substantial

species differences; while in the guinea-pig intestine mainly tachykinin-mediated excitation

and CGRP-mediated inhibition is found (see Barthó et al., 2004), an NO-mediated relaxant

response has been found in the human intestinal circular muscle and in the mouse colon. The

lack of effect of tetrodotoxin on the response to capsaicin in human preparations makes an

involvement of intrinsic nitrergic neurons unlikely; the possibility that NO originates from the

sensory neurons themselves can be raised but has not been proven yet. To this end, we plan to

test inhibitors of neuronal NO synthase.

Co-transmission is an increasingly recognised phenomenon in the peripheral as well as

in the central nervous system. In nearly all of our findings co-transmission is likely to play a

role; purinergic and nitrergic mechanisms (in an apparently additive manner) in the rat ileal

NANC relaxation, the same (but a clearly non-additive manner) in the human colonic NANC

relaxation; purinergic and cholinergic mechanisms in autonomic responses of the rat bladder;

finally, tachykinin NK1 and NK2 receptor-mediated (hence, probably involving the two

preferential endogenous agonist ligands, substance P and neurokinin A) in the response to

capsaicin, likewise in the rat bladder.

With a sequential use of the NO synthase inhibitor L-NOARG and the guanylate

cyclase inhibitor ODQ we proved a mediating role of this enzyme in the „nitrergic” responses

of intestinal preparations, but we did not find any evidence for parallel involvement of another

guanylate cyclase stimulating transmitter (e.g., CO).

We have demonstrated a fairly selective damaging effect of experimental diabetes on

the capsaicin-sensitive neurons supplying the rat urinary bladder.

ACKNOWLEDGEMENTS

I express my sincere thanks to Prof. Loránd Barthó, leader of our laboratory research activity;

colleagues and coworkers, Drs. Zsófia Lázár, Sarolta Undi and Mátyás Wolf; László Lénárd

Jr. for introducing me to some experimental designs; Prof. Gyula Mózsik and Dr. Ágnes

Király for critically reading the first version of this work. My parents lent me continuous

moral support.

15

REFERENCES

Barthó L, Benkó R, Patacchini R, Pethő G, Holzer-Petsche U, Holzer P, Lázár Z, Undi S, Illényi L, Antal A,

Horváth ÖP, 2004. Effects of capsaicin on visceral smooth muscle: a valuable tool for sensory neurotransmitter identification. Eur. J. Pharmacol. 500: 143-157.

Barthó L, Kóczán G, Holzer P, Maggi CA, Szolcsányi J, 1991. Antagonism of the effects of calcitonin gene-related peptide and of capsaicin on the guinea-pig isolated ileum by human alpha-calcitonin gene-related peptide(8-37). Neurosci. Lett. 129: 156-159.

Barthó L, Lázár Zs, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, 2000. Evidence for the involvement of ATP, but not of VIP/PACAP or nitric oxide, in the excitatory effect of capsaicin in the small intestine. Eur. J. Pharmacol. 392: 183-188.

Barthó L, Lefebvre R, 1994. Nitric oxide induces acetylcholine-mediated contractions in the guinea-pig small intestine. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 350: 582-584.

Barthó L, Lénárd LJr, Patacchini R, Halmai V, Wilhelm M, Holzer P, Maggi CA, 1999. Tachykinin receptors are involved in the "local efferent" motor response to capsaicin in the guinea-pig small intestine and oesophagus. Neuroscience 90: 221-228.

Barthó L, Lénárd LJr, Szigeti R, 1998. Nitric oxide and ATP co-mediate the NANC relaxant response in the guinea-pig taenia caeci. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 358: 496-499.

Barthó L, Pethő G, Antal A, Holzer P, Szolcsányi J, 1987. Two types of relaxation due to capsaicin in the guinea-pig ileum. Neurosci. Lett. 81:146-150.

Barthó L, Szolcsányi J, 1978. The site of action of capsaicin on the guinea-pig isolated ileum. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 305: 75-81.

Bayliss WM, Starling EH, 1899. The movements and innervation of the small intestine. J. Physiol. 24: 99-143. Burnstock G, 1972. Purinergic nerves. Pharmacol Rev. 24: 509-560. Burnstock G, 1997. The past, present and future of purine nucleotides as signalling molecules. Neuropharmacol.

36: 1127-1139. Caterina MJ, Julius D, 2001. The vanilloid receptor: a molecular gateway to the pain pathway. Ann. Rev.

Neurosci. 24: 487-517. Clapham DE, Montell C, Schultz G, Julius D, 2003. International Union of Pharmacology. XLIII. Compendium

of voltage-gated ion channels: transient receptor potential channels. Pharmacol. Rev. 55: 591-596. Dahlstrand C, Dahlström A, Ahlman H, Jonsson O, Lundstam S, Norlén L, Pettersson S, 1992. Effect of

substance P on detrusor muscle in rats with diabetic cystopathy. Br. J. Urol. 70: 390-394. Davis JB, Gray J, Gunthorpe MJ, Hatcher JP, Davey PT, Overend P, Harries MH, Latcham J, Clapham C,

Atkinson K, Hughes SA, Rance K, Grau E, Harper AJ, Pugh PL, Rogers DC, Bingham S, Randall A, Sheardown SA, 2000. Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature 405: 183-187.

De Petrocellis L, Bisogno T, Maccarrone M, Davis JB, Finazzi-Agro A, DiMarzo V, 2001. The activity of anandamide at vanilloid VR1 receptors requires facilitated transport across the cell membrane and is limited by intracellular metabolism. J. Biol. Chem. 276: 12856-12863.

Goyal RK, Hirano I, 1996. The enteric nervous system. New England J. Med. 334: 1106-1115. Hoyle CH, 1992. Transmission: purines. In: Autonomic Neuroeffector Mechanisms, ed. Burnstock G, Hoyle CH;

Harwood Academic Publishers, Chur, 1992, pp. 367-407. Hoyle CH, 1994. Non-adrenergic, non-cholinergic control of the urinary bladder. World J. Urol. 12: 233-244. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J, 1967. Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention

by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br. J. Pharmacol. Chemother. 31: 138-151. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J, 1968. The role of sensory nerve endings in neurogenic inflammation

induced in human skin and in the eye and paw of the rat. Br. J. Pharmacol. Chemother. 33: 32-41. Kamata K, Inoue K, Kasuya Y, 1992. Changes in contractile responses of the urinary bladder to substance P in

streptozotocin-induced diabetic rats. Gen. Pharmacol. 24: 547-553. Lecci A, Santicioli P, Maggi CA, 2002. Pharmacology of transmission to gastrointestinal muscle. Curr. Op.

Pharmacol. 2: 630-641. Lefebvre RA, Barthó L, 1997. Mechanism of the nitric oxide-induced contraction in the rat isolated small

intestine. Br. J. Pharmacol. 120: 975-981. Maggi CA, 1995. Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-transmitters released from

peripheral endings of sensory nerves. Prog. Neurobiol. 45: 1-98. Maggi CA, Giuliani S, Santicioli P, Patacchini R, Said SI, Theodorsson E, Turini D, Barbanti G, Giachetti A,

Meli A, 1990a. Direct evidence for the involvement of vasoactive intestinal polypeptide in the motor response of the human isolated ileum to capsaicin. Eur. J. Pharmacol. 185: 169-178.

16

Maggi CA, Giuliani S, Zagorodnyuk V, 1996. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the circular muscle of guinea-pig colon: role as inhibitory transmitter and mechanisms of relaxation. Regulatory Peptides 61: 27-36.

Maggi CA, Patacchini R, Santicioli P, Giuliani S, 1991. Tachykinin antagonists and capsaicin-induced contraction of the rat isolated urinary bladder: evidence for tachykinin-mediated cotransmission. Br. J. Pharmacol. 103: 1535-1541.

Maggi CA, Santicioli P, Del Bianco E, Geppetti P, Barbanti G, Turini D, Meli A, 1989. Release of VIP- but not CGRP-like immunoreactivity by capsaicin from the human isolated small intestine. Neurosci. Lett. 98: 317-320.

Maggi CA, Theodorsson E, Santicioli P, Patacchini R, Barbanti G, Turini D, Renzi D, Giachetti A, 1990b. Motor response of the human isolated colon to capsaicin and its relationship to release of vasoactive intestinal polypeptide. Neuroscience 39: 833-841.

Meini S, Maggi CA, 1994. Evidence for a capsaicin-sensitive, tachykinin-mediated, component in the NANC contraction of the rat urinary bladder to nerve stimulation. Br. J. Pharmacol. 112: 1123-1131.

Paton WDM, Vizi ES, 1969. The inhibitory action of noradrenaline and adrenaline on acetylcholine output by guinea-pig ileum longitudinal muscle strip. Br. J. Pharmacol. 35: 10-20.

Pinna C, Bolego C, Puglisi L, 1994. Effect of substance P and capsaicin on urinary bladder of diabetic rats and the role of the epithelium. Eur. J. Pharmacol. 271: 151-158.

Santicioli P, Gamse R, Maggi CA, Meli A, 1987. Cystometric changes in the early phase of streptozotocin-induced diabetes in rats: evidence for sensory changes not correlated to diabetic neuropathy. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 335: 580-587.

Smart D, Gunthorpe MJ, Jerman JC, Nasir S, Gray J, Muir AI, Chambers JK, Randall AD, Davis JB, 2000. The endogenous lipid anandamide is a full agonist at the human vanilloid receptor (hVR1). Br. J. Pharmacol. 129: 227-230.

Smits GJM, Lefebvre RA, 1996. ATP and nitric oxide: inhibitory NANC neurotransmitters in the longitudinal muscle-myenteric plexus preparation of the rat ileum, Br. J. Pharmacol. 118: 695-703.

Szolcsányi J, 1984. Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensory-efferent function. In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation, ed. Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F; Akadémiai Kiadó, Budapest, 1984, pp. 27-56.

Szolcsányi J, 2000. Anandamide and the question of its functional role for activation of capsaicin receptors. Trends Pharmacol. Sci. 21: 203-204.

Szolcsányi J, Barthó L, 1978. New type of nerve-mediated cholinergic contractions of the guinea-pig small intestine and its selective blockade by capsaicin. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 305: 83-90.

Tanovic A, Jimenez M, Fernandez E, 2001. Actions of NO donors and endogenous nitrergic transmitter on the longitudinal muscle of rat ileum in vitro: mechanisms involved. Life Sci. 69: 1143-1154.

Whittle BJ, 1994. Nitric oxide in gastrointestinal physiology and pathology. In: Johnson, L.R. (Ed.) Physiology of the Gastrointestinal Tract, 3rd ed. Raven Press, New York, pp. 267-294.

Wood JD, 1994. Physiology of the enteric nervous system. In: Johnson, L.R. (Ed.) Physiology of the Gastrointestinal Tract, 3rd ed. Raven Press, New York, pp. 423-475.

17

PUBLICATIONS INCLUDED IN THIS THESIS

Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, 2002, Nitric oxide is involved in the

relaxant effect of capsaicin in the human sigmoid colon circular muscle. Naunyn-

Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 366: 496-500. IF: 2,6

Benkó R Lázár Z, Pórszász R, Somogyi G, Barthó L, 2003, Effect of experimental diabetes on

cholinergic, purinergic and peptidergic motor responses of the isolated rat bladder to

electrical field stimulation or capsaicin. Eur. J. Pharmacol. 478: 73-80. IF: 2,4

Benkó R, Lázár Z, Undi S, Illényi L, Antal A, Horváth ÖP, Rumbus Z, Wolf M, Maggi CA,

Barthó L, 2004, Inhibition of nitric oxide synthesis blocks the inhibitory response to

capsaicin in intestinal circular muscle preparations from different species. Life Sci. 76:

2773-2782. IF: 2,2

Barthó L, Benkó R, Patacchini R, Pethő G, Holzer-Petsche U, Holzer P, Lázár Z, Undi S,

Illényi L, Antal A, Horváth ÖP, 2004, Effects of capsaicin on visceral smooth muscle:

a valuable tool for sensory neurotransmitter identification. Eur. J. Pharmacol. 500:

143-157. IF: 2,4

Benkó R, Undi S, Wolf M, Magyar K, Tóvölgyi Z, Rumbus Z, Barthó L, 2006, P2

purinoceptors account for the non-nitrergic NANC relaxation in the rat ileum.

Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 4: 319-324. IF: 2,1

Under preparation for publication:

Benkó R, Undi S, Wolf M, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Horváth ÖP, Antal A, Magyar K,

Tóvölgyi Z, Barthó L, 2006. P2 purinoceptor antagonists inhibit the NANC relaxation

of the human colon in vitro. Neuroscience.

OTHER PUBLICATIONS Lénárd L Jr, Lázár Z, Benkó R, Szigeti R, Báthori Z, Tóth GK, Penke B, Barthó L, 2000,

Inhibitory effect of PACAP(6-38) on relaxations induced by PACAP, VIP and non-

adrenergic, non-cholinergic nerve stimulation in the guinea-pig taenia caeci. Naunyn-

Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 361: 492-497. IF: 2,9

Barthó L, Lázár Z, Lénárd L Jr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, 2000,

Evidence for the involvement of ATP, but not of VIP/PACAP or nitric oxide, in the

excitatory effect of capsaicin in the small intestine. Eur. J. Pharmacol. 392: 183-188.

IF: 2,2

18

Rózsai B, Lázár Z, Benkó R, Barthó L, 2001, Inhibition of the NANC relaxation of the

guinea-pig proximal colon longitudinal muscle by the purinoceptor antagonist PPADS,

inhibition of nitric oxide synthase, but not by a PACAP/VIP antagonist. Pharmacol.

Res. 43: 83-87. IF: 0,9

Lázár Z, Shahbazian A, Benkó R, Tóth G, Penke B, Barthó L, Holzer P, 2001, PACAP(6-38)

inhibits the effects of vasoactive intestinal polypeptide, but not PACAP, on the small

intestinal circular muscle. Eur. J. Pharmacol. 431: 259-264. IF: 2,2

Lázár Z, Benkó R, Bölcskei K, Rumbus Z, Wolf M, Holzer P, Maggi CA, Barthó L, 2003,

Actions of endothelin and corticotropin releasing factor in the guinea-pig ileum: no

evidence for an interaction with capsaicin-sensitive neurons. Neuropeptides 37: 220-

232. IF: 2,2

Benkó R, Undi S, Wolf M, Barthó L, 2005, Effects of acute administration of and

tachyphylaxis to α,β-methylene ATP in the guinea-pig small intestine. Basic &

Clinical Pharmacology & Toxicology 97: 369-373. IF: 1,5

Barthó L, Undi S, Benkó R, Wolf M, 2005, Ideg-simaizom transzmitterek a gyomor-

bélhuzamban: A motilitászavarok lehetséges háttere. Praxis 14 (12): 14-19.

Barthó L, Undi S, Benkó R, Wolf M, Lázár Z, Lénárd L Jr, Maggi CA, 2006, Multiple motor

effects of ATP and their inhibition by PPADS in the small intestine of the guinea-pig.

Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 98: 488-495. IF: 1,5

Undi S, Benkó R, Wolf M, Illényi L, Horváth ÖP, Antal A, Csontos Z, Vereczkei A, Barthó

L, 2006, Purinergic nerves mediate the non-nitrergic relaxation of the human ileum in

response to electrical field stimulation. Brain Res. Bulletin (in press). IF: 2,5

PRESENTATIONS AT MEETINGS

Lénárd LJr, Barthó L, Benkó R, Báthori Z, Tóth G, Penke B, PACAP-antagonista gátolja a nem-adrenerg, nem-

kolinerg elernyedést a coecumban. MITT vándorgyűlés, Harkány, 1999. jan. 27-30. [Abstract:

Neurobiology 7: 349-350, 1999]

Barthó L, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, PACAP antagonist inhibits non-adrenergic, non-cholinergic

(NANC) relaxation in the guinea-pig taenia caeci. Neuropeptides - Ferrara 1999 (9th Annual Meeting of

the European Neurpeptide Club, Ferrara, Italy, 12-15 May, 1999. [Abstract: Regul. Pept. 80:146, 1999]

Barthó L, Lénárd L Jr, Szigeti R, Benkó R, Báthori Z, Tóth G, Penke B, Nitric oxide, ATP and pituitary

adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) mediate the relaxant response of the guinea-pig

taenia caeci. Second European Congress of Pharmacology, July 3-7, 1999, Budapest, Hungary.

[Abstract: Fundam. Clin. Pharmacol. 13/Suppl. 1, 1999, 77s]

19

Lázár Z, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, Barthó L, Evidence for the

participation of P2 purinoceptors in the excitatory effect of capsaicin in the small intestine. The 6th

European Congress of Pharmaceutical Sciences, September 16-19, 2000, Budapest, Hungary.

[Abstract: Eur. J. Pharmaceutical Sci. 11/Suppl. 1, 2000, S113]

Barthó L, Lázár Z, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, P2 purinoceptors, but not

vasoactive intestinal polypeptide/pituitary adenylate cyclase activating polypeptide or nitric oxide, play

a role in the excitatory effect of capsaicin on myenteric neurons. Hung. Physiol. Soc./Br. Physiol. Soc.

Meeting, Budapest, 27-29 May, 2000. [Abstract: J. Physiol. Lond. 526 P, 167 P.]

Lázár Z, Benkó R, Barthó L, Nem nitrerg, nem VIP-erg gátló válasz légcsőben. Magyar Idegtudományi Társaság

(MITT) VIII. Konferenciája, Szeged, 2001. január 24-27.

Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, A kapszaicin mozgató hatása humán vastagbélen. A Magyar

Élettani Társaság (MÉT) kongresszusa, Szeged, 2001. június 6-8.

Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, Motor effects of capsaicin in the human colon. 7th Meeting

of the Austrian Neuroscience Association, Seggau/Leibnitz, Styria, Austria, 2-5 September, 2001.

Lázár Z, Shahbazian A, Benkó R, Tóth G, Penke B, Barthó L, Holzer P, PACAP(6-38) inhibits the effects of

VIP, but not PACAP, on the small intestinal circular muscle. 7th Meeting of the Austrian Neuroscience

Association, Seggau/Leibnitz, Styria, Austria, 2-5 September, 2001.

Benkó R, Lázár Z, Pórszász R, Barthó L, Csökkent zsigeri kapszaicin-érzékeny válaszok streptozotocin-

diabéteszes patkányban. A Magyar Diabetes Társaság XVI. Kongresszusa, Debrecen, 2002. május 30-

június 2. [Abstract: Diabetologia Hungarica 10, Suppl. 1, 10. old., 2002]

Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, Kapszaicin-érzékeny idegek lokális efferens hatásai humán

colonon. A Magyar Gasztroenterológiai Társaság 44. Nagygyűlése, Balatonaliga, 2002 június 4-8.

(Motilitási Szekció, június 6.)

Benkó R, Lázár Z, Undi S, Rumbus Z, Wolf M, Barthó L, A nitrogén-monoxid szerepe a kapszaicin hatásában

különböző fajok bél körkörös izomzatán. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) kongresszusa, Debrecen,

2004. június 7-9.

Benkó R, Undi S, Wolf M, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Barthó L, Nitrerg-purinerg interakciók tengerimalac-,

patkány- és humán izolált bélen. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) kongresszusa, Budapest, 2005.

június 2-4. [Extended abstract: Nitrergic-purinergic interactions in the guinea-pig, rat, and human

intestine. Acta Physiol. Hung. 92 (3-4): 244-245.]

Barthó L, Benkó R, Undi S, Pethő G, Sensory neurotransmitters and modulators: the basis of analgesic research.

1st BBBB Conference on Pharmaceutical Sciences, Siófok, Hungary, September 26-28, 2005.

Undi S, Benkó R, Wolf M, Magyar K, Barthó L: A guanilát-cikláz gátló ODQ hatása az elektromos

téringerléssel kiváltott simaizom-válaszokra és a perisztaltikus reflexre. A Magyar Experimentális

Farmakológia Tavaszi Szimpóziuma, Budapest, 2005. június 6-7. [Abstract: Inflammopharmacology

13: (5-6) 572-573.]

Wolf M., Undi S, Benkó R, Magyar K, Tóvölgyi Z, Barthó L, Egy guanilát-cikláz gátló vegyület hatása az

elektromos téringerléssel kiváltott simaizom-válaszokra és a perisztaltikus reflexre. A Magyar Élettani

Társaság (MÉT) LXX. Vándorgyűlése, Szeged, 2006. június 7-9.

20

Undi S, Wolf M, Benkó R, Illényi L, Cseke L, Kassai M, Vereczkei A, Horváth ÖP, Antal A, Barthó L, Purinerg

gátló válasz humán ileumon. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) LXX. Vándorgyűlése, Szeged, 2006.

június 7-9.

Undi S, Wolf M, Benkó R, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Antal A, Horváth ÖP, Barthó L, P2 purinoceptor

antagonisták gátló hatása human colon NANC relaxációjára in vitro. A Magyar Experimentális

Farmakológia Szimpóziuma, Pécs, 2006.június 3.

Benkó R, Undi S, Wolf M, Magyar K, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Horváth ÖP, Antal A, Barthó L, NO and

ATP co-mediate the non-adrenergic, non-cholinergic (NANC) relaxation in the human colon and rat

ileum. 15th World Congress of Pharmacology, IUPHAR, Peking, 2006. július 2-7. [Abstract: Acta

Pharmacologica Sinica, 2006, Suppl. 1: P 110.]

Undi S, Benkó R, Wolf M, Lázár Z, Lénárd L Jr., Maggi CA, Barthó L, Effects of ATP and alpha, beta-

methylene ATP (ABMA) and their inhibition by PPADS in the non-stimulated and field-stimulated

guinea-pig ileum. 15th World Congress of Pharmacology, IUPHAR, Peking, 2006. július 2-7.

[Abstract: Acta Pharmacologica Sinica, 2006, Suppl. 1: P 111.]