2/8/2010

FIZIOLOGIA BACTERIILOR. METABOLISMUL MICROBIAN. NUTRIIA NUTRIIA I RESPIRAIA BACTERIILOR

-

-

Fiziologia bacterian studiaz viaa i bacterian activitile bacteriilor nutriia, respiraia, creterea i multiplicarea, condiiile de cultivare a bacteriilor. Metabolismul bacterian reprezint ansamblul de reacii biochimice care au loc n celula vie. Catabolism reacii chimice de descompunere a substanelor complexe n elemente simple, nsoit de degajarea energiei (metabolism energetic) Anabolism reacii chimice de sintez a substanelor complexe din elemente simple, necesit energie (metabolism constructiv, de sintez)

Particularitile metabolismului bacterian: bacterian: 1. Este un metabolism necompartimentat , toate procesele metabolice se desfoar intr-o singur intrcelul 2. Este foarte flexibil, realizndu-se prin diverse ci realizndumetabolice (bacteriile se adapteaz rapid la condiiile mediului) 3. Este foarte intens (viteza reaciilor este mare) 4. Produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct n calitate de precursori pentru reaciile anabolice (amfibolism) reac n toate reaciile metabolice intervin catalizatori reaciile proteici specifici - enzimele

-

-

-

Enzimele bacteriene. Caractere generale: bacteriene. Substane proteice Active n limite largi de temperaturi (0-65 C) (0i de pH (2-9) (2Specificitate de substrat i de aciune (reacioneaz cu un substrat cataliznd un tip de reacie) Specificitatea este determinat de centrul activ al enzimei, complementar cu receptorul de pe substrat Nu se modific n cursul reaciei

I. II. III. -

Clasificarea en zimelor enz Constitutive (permanente) permanente) Inductive (adaptive), se sintetizeaz n prezena adaptive) substratului (ex.: lactaza) Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n exces a produsului reaciei catalizate prod Dup locul de aciune (exoenzime, endoenzime) endoenzime) Dup tipul reaciei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, oxidotransferaze, liaze, izomeraze, ligaze ) ligaze) Dup impactul asupra ma/o Enzime metabolice Enzime de patogenitate, responsabile de modificri patogenitate, patologice ale esuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza, proteaze, etc.

1.

2.

3.

4.

Importana practic a studierii enzimelor Rol n identificarea i clasificarea bacteriilor (enzimele determin activitatea biochimic specific a bacteriilor) Unele substane chimice, antibiotice interfereaz cu activitatea unor enzime, inhibnd creterea bacteriilor (tratament) Determinarea mecanismelor patogenezei infeciilor (unele enzime sunt responsabile de producerea leziunilor n esutul gazdei) Aplicarea industrial a enzimelor

1

2/8/2010

NUTRIIA BACTERIAN

Nutriia modalitile prin care bacteriile asimileaz din mediu substanele necesare pentru metabolism. Modul (tipul) de nutriie la bacterii este absorbtiv. absorbtiv. Nutrieni substane, soluiile crora pot traversa MCP pentru a fi antrenate n metabolismul celulei. Se obin din alimente prin solvire (sruri minerale, CO2, O2) sau dup o digestie prealabil (proteine, polizaharide, lipide). La bacterii digestia este extracelular (la bacteriile G- n spaiul periplasmic) G-

Nutrienii servesc n calitate de material de construcie i surs de energie pentru sinteza compuilor i meninerea vieii bacteriei. Transportul transmembranar 1. Difuzie simpl (conform gradientului de concentraie, fr utilizarea energiei): O2, CO2, acizi grai, nutrieni liposolubili

2. Difuzie facilitat (conform gradientului de concentraie) permite transportul transmembranar al moleculelor mari prin intermediul proteinelor de transport specifice - permeaze. permeaze. 3. Transport activ (contra gradientului de concentraie, necesit energie). Particip permeazele i alte proteine de transport specifice. Nutrienii nu suport modificri. 4. Translocaie substratul este modificat (ex.: fosforilat) n timpul transportului membranar; necesit energie

Substanele care au ptruns n citoplasm sunt descompuse de ctre enzimele bacteriene conform cilor metabolice proprii fiecrei specii bacteriene (ex.: EmbdenEmbdenMeyerhof, Entner-Doudoroff, ciclul Entnerpentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine energie i precursori care vor fi antrenai n biosintez (anabolism). Excreia metaboliilor difuzie, proteine de transport, liza bacteriei

2

2/8/2010

Necesitile nutritive ale bacteriilor - Necesiti elementare , de baz: C, H, O, N n elementare, cantiti importante; S, P, Fe, Ca, Mg, K n importante; cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo. Mo. Bacteriile prototrofe sunt capabile a-i realiza aintegral sinteza metaboliilor eseniali. - Necesiti specifice. Bacteriile auxotrofe specifice. Bacteriile solicit suplimentar compui organici preformai (factori de cretere), care nu pot fi cretere) sintetizai de bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul de cultur este indispensabil creterii acestor bacterii.

Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon

-

-

-

Bacterii autotrofe utilizeaz CO2 ca unic surs de carbon (nepatogene) Bacterii heterotrofe utilizeaz carbonul din compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli, etc) Bacteriile care utilizeaz materia organic moa moart sunt saprofite (reciclarea materiei organice) Bacteriile Bacteriile parazite (obligate, facultative) triesc pe contul organismelor vii, aducndu-le aducnduprejudicii Bacteriile patogene reprezint parazite care patogene reprezint parazite afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau moarte. moarte.

-

Surse de azot AA sau acizi nucleici Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic Surse de substane minerale: minerale: S - din AA, sulfuri, sulfai; P - din fosfai; fosfai; K, Mg, Ca, Na - din sruri minerale; Zn, Cu, Mn, Mo din ap

Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie Bacterii fototrofe utilizeaz energia solar (fotosint) Bacterii chemotrofe folosesc energia degajat din reaciile chimice de oxido-reducere. Ele necesit un oxidosubstrat donor de hidrogen (e- i H+) i un substrat acceptor de hidrogen. n transfer particip hidrogen. transportori intermediari de electroni (lanul respirator, NAD, NADH, FAD, etc.) - Bacteriile chemolitotrofe donorul de H este o substan anorganic - Bacteriile chemoorganotrofe donorul de H este o substan organic (glucoza, lipide...) Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe

Mecanismele de obinere a energiei la chemoorganotrofe n funcie de acceptorul final de H : Respiraie aerob. Acceptorul final este aerob. oxigenul gazos. Implic lanul respirator de transport al electronilor asociat MCP. Produs final H2O sau H2O2 . Respiraie anaerob. Acceptori finali anaerob. compui anorganici (nitrat, sulfat, S). sulfat, S). Transportul de electroni prin lanul respirator. Produse finale nitritul, amoniacul, sulfura (n prezena O H2O2). prezen

Fermentaie. Fermentaie. Substratul organic este metabolizat fr intervenia unui agent oxidant extern. Const n procese de ox-red oxcare realizeaz numai o oxidare parial a substratului, donorul i acceptorul de H+ fiind substane organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o molecul mai oxidat (ex.: fermentare lactic, fermentare alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc). Fermentaia se poate desfura n prezena O2, dar fr intervenia acestuia.

3

2/8/2010

Conservarea energiei O parte din energia eliberat se pierde sub form de cldur sau poate fi utilizat direct sub form de energie electro-chimic (fpm) la electronivelul MCP (ex.: rotaia flagelilor, transport transmembranar) sau stocat n compui chimici macroergici bogai n energie: ATP (sintetizat prin fosforilare oxidativ sau fosforilare la substrat), fosfoenol-piruvat, substrat), fosfoenolacetilfosfat i acetil-CoA. acetiln procesele de respiraie se elimin mai mult energie dect din fermentaie (n glicoliz dintr-un dintrmol de glucoz - 38 moli ATP, prin fermentaie - 2 glucoz moli ATP, moli ATP). n procese de fermentare se formeaz ATP). deeuri rejetate de ctre celul.

I.

II.

III. IV.

Clasificarea bacteriilor dup sursele de energie i carbon Bacterii fotoautotrofe (energie solar, CO2) Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., subst.org) Bacterii chemoautotrofe Bacterii chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe) chemoorganoheterotrofe)

4

2/8/2010

CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR

-

Creterea mrirea coordonat a masei i volumului structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor de sintez Multiplicarea creterea numrului de celule pe o unitate de suprafa sau de volum Diviziu Diviziune binar nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme) Autoreproducere (virusuri) Spori (micete) Fragmentare (actinomicete)

Ciclul celular procesele care au loc de la formarea celulei pna la urmtoarea celulei p urm diviziune diviziune 1. Faza C replicarea ADN 2. Faza G de laten, segregarea cromozomilor 3. Faza D de diviziune, formarea septului Replicarea ADN depinde de masa critic a celulei, iar separarea cromozomilor i diviziunea intervin n momentul cnd celula atinge o lungime - limit

Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul (perioada) de generaie (TG). Durata TG depinde de specie i de condiiile de cretere (condiii optime vitez maxim)Bacteria Escherichia coli Staphylococcus aureus Vibrio cholerae Mycobacterium tuberculosis TG in (min) 20-40 40 10 120-240 vitro TG in (ore) 5 3-5 2-3 24-48 vivo

5

2/8/2010

Creterea bacteriilor n laborator cultivare. cultivare. Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din medii naturale (prelevate patologice, alimente, ap, etc). Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru: 1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic) 2. Testarea sensibilitii lor fa de antibiotice Testar 3. Obinerea unor produi de biosintez (antibiotice, AA), bioconversie (hormoni steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor, probioticelor...

Pentru cretere bacteriile au nevoie de nutrieni i condiii fizico-chimice adecvate. fizicoCondiiile (principiile) de cultivare - Surs nutritiv adecvat - Surs de energie - Ap - Temperatura potrivit - pH adecvat - Concentraie optim a oxigenului i a CO2 - Presiune osmotic adecvat

Temperatura de cretere Exist temperaturi minime, maxime i optime de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu temperatura optim deosebim: 1. Bacterii psichrofile t optim 10-20 C. 10-20 Cresc i la 0 C. 0 2. Bacterii mezofile optimum 30-37 C 30-37 (limite 15-45 C) 15-45 3. Bacterii termofile optimum 50-60 C 50-60 (pn la 95 C) 95 4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70110 C) 70110

pH

1. 2. 3. 1.

2.

Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) pH 6-7,5 6Bacterii acidofile pH 2-6 (Lactobacillus) 2Bacterii alcalofile pH >8 (Pseudomonas, Vibrio) Presiunea osmotic Bacterii halotolerante (osmotolerante) cresc n concentraii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o patogene Bacterii halofile prefer concentraii mari de NaCl (1-30%) stafilococi, vibrioni (Vibrio (1(V parahaemolyticus) parahaemolyticus)

1. 2.

3.

4.

5.

Oxigenul Bacterii strict aerobe cresc doar n prezena O2. Obin energia prin respiraie aerob Bacterii microaerofile necesit concentraii reduse de O2 i 2-10% CO2. Obin energia prin respiraie 2sau fermentaie (Neisseria, Brucella, Campylobacter) Campylobacter) Bacterii strict anaerobe cresc doar n absena O2. Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie anaerob. Toxicitatea O2 formarea H2O2, a radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi O22- pe care anaerobii nu le pot descompune (absena catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei) Clostridium, Bacteroides Bacterii anaerobe aerotolerante pot crete n prezena O2, obin energia prin fermentaie, posed peroxidaz (Lactobacillus, streptococi) Bacterii facultativ anaerobe cresc n orice condiii, obin energia prin respiraie sau fermentaie

6

2/8/2010

-

Mediile de cultur soluii sau substrate solide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice fiziconecesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru cultivarea (izolarea) bacteriilor, testarea cultivarea sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul culturilor bacteriene. bacteriene. Cerinele fa de mediile de cultur S asigure necesitile nutritive i energetice ale bacteriilor Umiditate optimal pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de (7,2tampon) Potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi oxidorH210) S fie izotonice (0,5% NaCl) S fie sterile i transparente

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR Dup provenien 1. Empirice, naturale. Au la baz produse de naturale. origine animal sau vegetal (snge, ser, lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia etc). Compoziia lor chimic precis nu poate fi controlat 2. Sintetice includ ingrediente chimice pure, chimice compoziia chimic este cunoscut cu exactitate 3. Semisintetice

1.

2.

3.

Dup consisten Medii lichide (bulion) utilizate pentru (bulion) obinerea biomasei bacteriene i a produselor lor (antibiotice, enzime, toxine) Medii solide conin 10-15% gelatin sau 2-3% 102agaragar-agar (polizaharid extras din alge roii, t topire 80-100 C, solidificare 42 C). Placa de 80geloz n cutii Petri este utilizat pentru utilizat izolarea culturilor pure, geloza nclinat (n pure, pant) pentru acumularea culturilor pure Medii semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se agarutilizeaz pentru studierea activitii biochimice sau a mobilitii bacteriilor.

Dup compoziia chimic (complexitate) i destinaie A. Medii uzuale (universale, simple) 1. Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% NaCl) 2. Bulion peptonat BP (extract apos din carne + 1% pepton+0,5% NaCl) 3. Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar) 2agar4. Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin) 10Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivare Sterilizarea prin autoclavare: 120 C, 20 min

B. Medii complexe I. Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, (buliongelozgeloz-snge streptococi, neisserii; ser neisserii; coagulat corinebacterii, etc) corinebacterii, II. Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice fizicoparticulare care stimuleaz creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza salin (geloza stafilococi, stafilococi, geloza alcalin - vibrioni, mediul vibrioni, Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)

7

2/8/2010

Mediile de mbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru mbogirea florei patogene i inhibarea florei de asociaie dintrdintrun prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale). fecale). Etap Etap premergtoare nsmnrii pe medii selective. - Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit ) - Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) Salmonella - Bulion cu selenit Shigella, Salmonella - Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholerae (pH= - Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) Kitt-Tarr pentru anaerobi

III. Medii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenialdiferenierea speciilor bacteriene n baza activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere) oxido-reducere Sunt construite dup urmtoarea schem: Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate) Medii DD pentru izolarea culturii pure Studierea proprietilor zaharolitice Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na) Na) Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen) Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant) Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe lactozoroii Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin) albastruLevin)

Studierea proprietilor de oxido-reducere oxidoMediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella (colonii (colonii negre reducerea sulfitului n sulfura de Bi)

8

2/8/2010

Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de (gelozK) pentru Corynebacterium diphtheriae (colonii negre) Studierea proprietilor lipolitice Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei

Studierea proprietilor hemolitice GelozaGeloza-snge (geloza+5-15% snge (geloza+5defibrinat) n cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o zon clar

Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H 2S) Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree Indicatorul Andrede fucsin+NaOH Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n galben. n pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), n apreciaz lactoza/zaharoza coloancoloan-glucoza (fermentare). Producerea H2S nnegrirea mediului nn

Medii DD pentru identificarea final final a culturii pure - irul pestri Hiss (lichid sau semi-solid) un ir semi-solid) de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i indicator. Aprecierea dup modificarea culorii (acid - A) i apariia bulelor de gaz (acid i gaz - AG) - Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatori IV. Medii speciale pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, (Finn, LoewensteinLoewenstein-Jensen pentru agenii tuberculozei, tuberculozei, Sabouraud fungi) fungi)

V. Medii de transport destinate transportrii sau stocrii unui material (prelevat), care va fi examinat ulterior. Menine n via bacteriile, fr a favoriza multiplicarea lor. - Mediul cu glicerin 30% - Soluie tampon-fosfat tampon- Soluie NaCl 3% - Mediul Cary-Blair Cary- Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) pentru anaerobi, neisserii, etc

9

2/8/2010

Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic de material ce conine bacterii (inoculum) se (inoculum) ntroduce ntr-un mediu de cultur ntr(nsmnare, inoculare), care ulterior va fi inoculare), incubat n termostat (pentru asigurarea temperaturii optime). n timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile (18-24- ore..) cresc i se divid, formnd o cultur bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu). intr- mediu). M.tuberculosis 3-5 sptmni V.cholerae 6-12 ore

Cultur pur format din bacterii de aceeai specie (indispensabil identificrii) Cultur mixt compus din bacterii de specii diferite Tulpin populaie microbian constituit din descendenii unei singure izolri n cultur pur, care va fi studiat ulterior. Clon populaie care rezult din multiplicarea unei singure celule

Manifestarea creterii i multiplicrii bacteriilor n mediu lichid - Turbiditate uniform - Formarea unei pelicule la suprafaa mediului (vibrioni, yersinia) - Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe perei (streptococi, Bacillus anthracis) anthracis)

n mediu solid formarea coloniilor Colonie o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o singur celul sau dintrun grup de celule (UFC - unitate formatoare de colonii) pe suprafaa unui colonii) mediu solid Fiecare specie bacterian formeaz colonii specifice (caracter util n identificare)

Caracteristica coloniilor Dimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1(0,1(12mm), mari (2-3mm) (2Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, etc Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat, etc Form punctiform, circular, filamentoas, neregulat Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc Densitate opac, transparent, etc Consisten cremoas, untoas, uscat, mucoid

Tipurile de colonii Colonii S (smouth) rotunde, netede, umede, lucioase Colonii R (rough) margini neregulate, suprafaa uscat, rugoas

10

2/8/2010

Caracterele de cultur ale bacteriilor reprezint exigenele nutritive (medii, temperatur, pH, aerare, etc), timpul apariiei apariiei culturii i manifestarea creterii pe medii lichide i solide

Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi

n funcie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting: - Culturi discontinue/periodice - Culturi continue - Culturi sincrone Culturile discontinue se obin la cultivarea bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul microbiologic

Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue I. Faza de lag faza de adaptare la condiiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc n dimensiuni, dar nu se divid. Durata este variabil (2-4 ore); depinde de starea (2bacteriei, condiiile mediului, etc II. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu vitez maximal constant, curba evolueaz exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la ageni antimicrobieni (culturi utile pentru testarea (culturi sensibilitii la antibiotice). Durata 8-10 ore

III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic scade treptat, numrul celulelor vii rmne constant mai multe ore. Cauza consumarea nutrienilor, acumularea metaboliilor toxici. Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la agenii antimicrobieni scade. agenii Durata 10-12 ore 10IV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor progresiv

11

2/8/2010

EXAMENUL BACTERIOLOGICCultura Cultura continu se realizeaz cnd mediul de cultur este continuu rennoit i mbogit cu oxigen cu evacuarea unei cantiti de cultur. Se realizeaz n chemostate sau turbidostate, cultura turbidostate, aflnduaflndu-se permanent n faza exponenial. Se utilizeaz n microbiologia industrial. n intestin culturi continue. Culturi sincrone culturi n care bacteriile se divid n acelai timp Examenul bacteriologic const n inocularea xamenul bacteriologic const inocularea (nsmnarea) prelevatelor pe medii de preleva medii cultur cultur pentru izolarea culturilor pure de culturilor bacterii (tulpinilor) care vor fi ulterior identificate, testate identificate, testate la sensibilitate vis-a-vis visde antibiotice, eventual conservate. antibiotice, eventua conservate. Examenul bacteriologic const din cteva xamenul bacteriologic etape succesive, de la prelevarea succesive, prelevarea (recoltarea) probelor biologice pn la biologice remiterea rezultatelor. remiterea rezultatelor.

-

Faza pre-analitic (responsabilitatea medicului) prePrescrierea investigaiei (n funcie de datele examenului clinic i paraclinic). n ordonan se fixeaz identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestrile patologice, locul, data apariiei, alte date: imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc. antibiotice, Prelevarea probelor Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare ale agentului patogen) i momentul prelevrii

Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni: pacieni: - Secreii rino-faringiene, bronice rino- Sput - Puroi - Exsudate, transsudate - Snge - LCR - Urin, secreii genitale - Mase fecale, bil, suc duodenal - Bioptate, punctate - Material cadaveric, etc cadave ic,

Materiale de examinat din mediul extern : extern: - Ap - Alimente - Sol - Aer - Lavaje - Vectori, etc

Modul de prelevare (recoltare) - n recipiente sterile - Respectnd regulile de autoprotecie - La debutul bolii - Pn la administrarea antibioticelor - Cantitate suficient Transportarea - Imediat sau utiliznd medii de transport, cu respectarea respectarea condiiilor speciale dup necesitate - n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...) - n fia de nsoire s fie indicat identitatea pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevrii, scopul investigaiei, .a.)

12

2/8/2010

-

-

-

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBE Prelevatul este supus examenului releva este supus examenului macroscopic modificarea aspectului, macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, mirosului, etc) - orientare n diagnostic Dup necesitate, probele sunt supuse pregtirii pentru investigaie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc) Examinarea microscopic (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, BurriZiehlBurriHinss Hinss...) prezena mi/o, forma, cantitatea, G+/-. G+/

I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE Scopul izolrii - de a obine o cultur pur dintrob cultur pur dintrun melanj de celule bacteriene sau dintr-un melanj sau dintrprodus patologic produs patologic. O colonie separat constituie o cultur pur. cultur pur Tehnici utilizate: ehnici 1. Prin epuizarea inoculului pe suprafaa gelozei epuizarea din cutia Petri (nsmnare n striuri paralele, striuri paralele, nsmnare n cadrane, etalarea consecutiv ns adrane etalarea consecutiv pe trei cutii). trei cutii). 2. Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n geloz topit i rcit la 50 C (10-1, 10-2,...), 50 apoi turnate n cutii Petri sau eprubete. Incubare n termostat la 37 C, 18-24 h (n funcie 37 18de TG).

13

2/8/2010

Metode speciale de izolare n culturi pure: - A bacteriilor sporulate: nclzirea prealabil a prelevatului 80 C 20 min 80 - A bacteriilor acido-rezistente: tratarea prealabil acidocu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar cu o baz - A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene: mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd medii de mbogire - A bacteriilor cu virulen nalt i pretenioase la cultivare: inocularea la animalele de laborator animalele sensibile

III etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE

II etap ACUMULAREA CULTURII PURE - Examinarea macroscopic a coloniilor crescute (form, culoare, dimensiuni, etc) - Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte, confirmarea puritii culturii - Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n pant (nclinat) pentru acumularea culturii pure - Termostat, 37 C, 18-24 ore 37 18-

Verificarea puritii culturii (frotiu Gram) Identificarea culturii pure const n evidenierea unor caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include ntr-o ntrfamilie, gen, specie, variant Se studiaz caracterele: Morfologice Tinctoriale De cultur Biochimice Antigenice (seroidentificarea) De patogenitate Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea) (fagoSensibilitatea la antibiotice-

14

2/8/2010

1. 2. -

-

STUDIEREA ACTIVITII BIOCHIMICE A BACTERIILOR Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea laptelui, etc) laptelui, etc) Activitatea proteolitic Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc) laptelui, etc) Evidenierea enzimelor ce intervin n degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze, desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele finale ale descompunerii AA: H2S, NH3, indol, etc etc

Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fer de culoare neagr n mediile multitest Kligler, Olkeniki, etc; plasarea unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu acetat de Pb deasupra BP n care crete cultura studiat (formarea sulfurii de Pb nnegrete hrtia) Depistarea indolului (produs al hidrolizei triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu acid oxalic. n prezena indolului indicatorul oxalic. vireaz n roz. Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de turnesol se coloreaz n albastru.

Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2) (cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat apariia bulelor de gaz)

Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% formarea unui halou opac n jurul coloniilor

Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei din lanul respirator) Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin (benzi sau (tetra)metil-parafenilenrondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc) Oxidarea reactivului culoare violet-neagr violetOxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas OxidazoOxidazo- : Enterobacteriaceae

Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1% halou opac n 1% jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai) Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-10% - zon clar n geloz5jurul coloniei Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc fosfatazei, Probele sunt incubate la 37 C, 18-24 h 37 18-

Identificarea rapid Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spaiu, material) Sistemul API o galerie din plastic format din numeroase alveole care conin fiecare un mediu deshidratat diferit (glucide, AA, etc). etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacterian testat i incubate. incubate. Ulterior la necesitate se adaug reactive pentru detectarea metaboliilor particulari. particulari. Lectura conform unui cod de cifre sau computerizat

15

2/8/2010

IV etap EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA ELIBERAREA RSPUNSULUI - Compararea rezultatelor obinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a gsi asemnri. - Exemplu de rspuns: Din proba examinat a fost izolat tulpina de Corynebacterium diphtheriae, biovar diphtheriae, gravis, gravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la .....

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene) Condiia principal cultivare n absena oxigenului 1. Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi (Kitt-Tarr regenerat - 100 C, 20 min, rcit, acoperit cu 100 vazelin; vazelin; nsmnarea n geloz n coloan) 2. Crearea condiiilor de anaerobioz Metoda fizic utilizarea anaerostatului Metoda chimic n exicator se ntroduc substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz); utilizarea gas-pachetelor gas Metoda biologic Fortner cultivarea concomitent a aerobilor i anaerobilor

Recoltarea cu precauie, evitnd contactul cu aerul (n seringi, utiliznd medii speciale) I etap MBOGIREA ANAEROBILOR - nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat Kitt-Tar - nclzirea unui tub la 80 C, 20 min 80 distrugerea florei nesporogene - Incubarea la 37 C, 24-48 h (va avea loc 37 24nmulirea anaerobilor)

16

2/8/2010

-

-

II etap - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI Studierea caracterelor de cultur tulburarea mediului, descompunerea bucilor de ficat, etc Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (nsmnarea a 0,1 ml din mediul K-T pe 3 cutii cu geloz-snge glucozat gelozconsecutiv). Incubarea n anaerostat/exicator/gas anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h 24-

Metoda Weinberg diluii succesive ale culturii n geloz glucozat lichefiat i aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise ermetic. Incubarea n termostat, 24 h III etap - ACUMULAREA CULTURII PURE - Studierea macroscopic a coloniilor - Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte - Repicarea n mediul K-T regenerat pentru Kacumularea culturii pure - Incubarea n termostat, 24 h-

-

IV etap - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI Verificarea puritii culturii pure (frotiu Gram) Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiiilor de anaerobioz) V etap - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA I ELIBERAREA RSPUNSULUI

17