TUJUAN Memberi pengetahuan dan keterampilan mahasiswa dalam hal : dasar kimiawi dan teoritis pewarnaan biologis, teknik preparasi smear, serta pewarnaan sederhana dan diferensiasi. II. BAHAN PRAKTIKUM 1. Pseudomonas sp; 2. Bacillus subtilis; 3. Staphylococcus aereus; 4. Kristal violet, iodine, safranin, alkohol, Malachit Green; 5. Akuades. III. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. ALAT Rak Mikroskop Objek Cover Jarum Wadah tabung PRAKTIKUM Tabung; reaksi; Bunsen; cahaya. glass; glass; Tissue; ose; pengering;

IV. LANDASAN TEORI Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain tidak berwarna, bakteri itu juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut, maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itulah pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian mikrobiologi. Adapun macam-macam pewarnaan, antara lain : 1. Pewarnaan Sederhana Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin. 2. Pewarnaan Gram Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D. 3. Pewarnaan Kapsul Pewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel. 4. Pewarnaan Spora Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis. Teknikteknik pewarnaan secara umum, antara lain :

A. Pewarnaan Sederhana Pewarnaan ini digunakan untuk visualisasi bentuk morfologis yang berupa basil, kokus, basil, vibrio dan spiral), dan susunan (rantai, gerombol, berpasangan, dan tetrad). B. Pewarnaan diferensial Pewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam. Selain itu juga digunakan untuk visualisasi struktur yang dibedakan menjadi empat, yaitu pewarna kapsul, pewarna flagel, pewarna spora, dan pewarna inti. V. CARA KERJA A. Pewarnaan Sederhana 1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide; 2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen; 3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass; 4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen; 5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali; 6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering; 7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri; 8. Mendiamkannya selama 1 menit; 9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades; 10. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue kering; 11. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass; 12. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati, 13. Mengamati slide tersebut. B. Pewarnaan Gram 1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide; 2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen; 3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass; 4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen; 5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali; 6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering; 7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri; 8. Mendiamkannya selama 1 menit; 9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades; 10. Meneteskan iodine hingga menutupi permukaan bakteri kemudian mendiamkannya selama kurang lebih 1-2 menit; 11. Membilas biakan tadi dengan air akuades; 12. Meneteskan alkohol 95% ke atas bakteri kemudian mendiamkannya selama 30 detik; 13. Membilasnya dengan air akuades; 14. Meneteskan safranin ke atas bakteri dan mendiamkannya selam kurang lebih 1 menit, kemudian membilasnya dngan air akuades; 15. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue kering;

16. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass; 17. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati, 18. Mengamati slide tersebut. C. Pewarnaan Spora 1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide; 2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen; 3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass; 4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen; 5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali; 6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering; 7. Setelah tampak keputih-putihan pada objek glass tersebut, kemudian merendam dengan malachit green selama 10 menit; 8. Melewatkan objek glass tersebut di atas api bunsen dengan tidak terlalu sering, dan jika pewrana sudah kering, perlu ditambhkan lagi pewarna tersebut (diusahakan selama 10 menit tersebut malachit green tidak kering); 9. Setelah 10 menit, mencuci objek glass dengan akuades hingga warna hilang; 10. Mengeringkan sisa pencucian tado dengan tisue kering; 11. Merendam dengan safranin selama 1 menit; 12. Mencuci kembali dengan akuades; 13. Mengeringkan slide dengan dilewatkan pada api bunsen; 14. Menutup dengan cover glass; 15. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati; 16. Mengamati slide tersebut. VI. HASIL PENGAMATAN No Bakteri Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Pewarnaan spora 1 Bacillus subtilis Strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), susunan bekterinya berantai. Termasuk gram positif. Memiliki endospora. 2 Staphylococcus aureus Berbentuk coccus, susunan bakterinya bergerombol seperti buah anggur. Termasuk gram positif. 3 Pseudomonas putida Berbentuk batang pendek (cocoid), susunan bakterinya tunggal. Termasuk gram negatif. VII. PEMBAHASAN a. Pewarnaan Sederhana 1. Pewarnaan Sederhana pada Bacillus subtilis Pada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus subtilis zat pewarna yang digunakan adalah kristal violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi secara aseptik dan diletakkan langsung pada objek glass kemudian difiksasi agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada objek glass dan tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal yang dilakukan selanjutnya adalah mengamati dalam mikroskop. Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan objek glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacillus yang ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah.

Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar. Kontrol sangatlah penting, meskipun kita sulit untuk mendapatkannya. Akan tetapi lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti. Dari pengamatan mikroskopis diperoleh bentuk morfologi dari bakteri Bacillus subtilis yaitu strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), dan susunan bakterinya adalah berantai. 2. Pewarnaan Sederhana pada Pseudomonas putida Pada pengecatan mikroba jenis Pseudomonas putida dilakukan pengecatan dengan menggunakan zat warna basa kristal violet. Pertama jarum inokulasi disterilkan lalu kemudian mulut tabung reaksi disterilkan juga di api bunsen, kemudian mikroba yang ada di tabung reaksi (media agar miring) diambil dan diletakkan di objek glass, sebelumnya objek glass sudah diberi air sedikit. Kemudian setelah mikroba dan air dicampur, dilakukan metode smear yaitu meratakan mikroba kira-kira membentuk sebuah bentuk koin. Kemudian dilakukan fiksasi yaitu dengan melewatkan smear secara cepat di api bunsen, lalu dikering-anginkan. Setelah melakukan metode smear, selanjutnya adalah metode pengecatan. Objek glass yang sudah di titrasi diberi pewarna kristal violet (selama 60 detik). Kemudian diberi air aquades untuk membersihkan kelebihan warna. Sisasisa air yang ada di objek glass dibersihkan dengan tissue. Terakhir objek glass ditutup dengan cover glass, dan diletakkan di mikroskop cahaya untuk diamati dengan perbesaran 1000 X dengan catatan menggunakan minyak emersi setelah menemukan titik fokus perbesaran 40 X. 3. Pewarnaan sederhana pada Staphylococcus aureus Kaca preparat diberi setetes air dan diberi bakteri Stapylococcus aureus, kemudian dipaskan di atas api bunsen, dari sini akan nampak lapisan putih yang tipis, semitransparan, dan rata yang menunjukkan adanya bakteri. Setelah smear difiksasi, smear kemudian diberi pewarna basa yaitu metilen blue. Dalam pemberian metilen blue ini, diusahakan agar menutupi semua lapisan tipis smear. Pewarnaan dengan menggunakan metilen biru dibutuhkan waktu 2-60 detik, setelah itu dicuci dengan aquades. Dari sini akan nampak lapisan yang sebelumnya berwarna putih tipis dan semitransparan, akan berubah warna menjadi biru transparan. Selanjutnya adalah milangkan sisa aquades dengan menggunakan kertas tissue. Setelah itu dilihat dalam mikroskop dengan perbesaran 1000 X. dalam mikroskop akan nampak bakteri Stapylococcus aereus berwarna biru matang dan bentuk bulat berantai. B. Pewarnaan Gram 1. Pewarnaan gram pada Bacillus subtilis Pada pewarnaan ini digunakan empat pewarna, yaitu Kristal violet sebagai pewarna utama, iodine sebagai pengikat warna utama (mordant), alcohol sebagai dekolorisasi, dan safranin sebagai pewarna tandingan. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil (batang) dan merupakan bakteri gram positif. Ini bisa diketahui saat tahap dekolorisasi. Pada tahap tersebut warna yang dihasilkan sama dengan warna utama, yaitu warna ungu. Ini menunjukkan bahwa pada Bacillus subtilis memiliki dinding yang tebal sehinnga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut yang akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar. Pada Bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit terpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang. Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol. 2. Pewarnaan Gram pada Pseudomonas putida

Pada pengamatan genus Pseudomonas dengan menggunakan pewarnaan gram, kami menggunakan bakteri Pseudomonas putida sebagai contoh yang mewakili. Sebelum mewarnai perlu difiksasi di atas api bunsen, pertama kali, koloni bakteri disuspensikan secara tipis di atas akuades. Smear yang tipis memberikan hasil pada gelas objek dan dihomogenkan .Selanjutnya dilanjutkan dengan tehnik pewarnaan. Pertama, menggunakan Gram A yaitu kristal violet, bakteri tampak terwarnai ungu. Fungsi dari gram A adalah sebagai pewarna utama yaitu pewarna yang pertama kali digunakan. Baik bakteri gram positif maupun gram negatif memberikan warna yang sama pada pewarnaan dengan Gram A. Setelah itu, diberikan perlakuan dengan Gram B yaitu iodin. Fungsi dari iodin adalah sebagai mordant atau penguat warna. Kompleks UK-Y dapat terbentuk di dalam sel. Dengan begitu, warna dari kristal violet tetap terjaga. Kemudian dilanjutkan dengan pemberian Gram C yaitu alkohol, yaitu berfungsi sebagai peluntur warna (dekolorisasi) dan dehidrasi sel. Pada saat itu, di dalam dinding sel bakteri Pseudomonas yang tersusun atas selapis sel yang tersusun atas lipid. Lipid tereksitasi dari dinding sel,pori-pori dinding sel bakteri mengembang. Kompleks UK-Y keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna. Terakhir diberi pewarna tandingan yaitu safranin. Pewarna tandingan dapat masuk apabila pewarna utamanya telah keluar dari sel bakteri. Bakteri pseudomonas dapat terwarnai merah. Dari uraian di atas, dapat dilihat bahwa Pseudomonas putida memiliki karateristik mikroskopik sebagai berikut yang diamati di bawah mikroskop cahaya yaitu : Gram-negatif; Berbentuk kokoid (batang pendek); Tidak membentuk spora. 3. Pewarnaan gram pada Staphylococcus aureus Pewarnaan gram bertujuan untuk mengelompokkan bakteri kedalam bakteri negatif dan bakteri positif. Staphylococcus aureus adalah bakteri gram positif, karena bakteri tersebut tetap mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga koloni bakteri tampak berwarna ungu atau biru. Pemberian alkohol berfungsi untuk dekolorisasi bakteri, sehingga menyebabkan zat utama dalam sel muncul, namun pada bakteri Staphylococcus aureus yang termasuk gram positif jadi tidak terdekolorisasi, karena bakteri tersebut memiliki membran plasma tunggal yang di kelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan sisanya berupa molekul lain berupa molekul lain bernama asam teikhuat. Pada proses pewarnaan terakhir adalah dengan pemberian safranin. Proses pewarnaan ini akan menghasilkan bakteri dengan sel yang berwarna ungu tua atau biru, dan kapsul yang berwarna biru terang. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif yang tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter tiap sel 0,8 1,0 m. Bakteri tersebut tumbuh optimum pada suhu 37 dengan waktu pembelahan 0,47/jam. Bakteri tersebut merupakan bakteri virulensi karena menghasilkan kapsul yang tebal untuk melindungi diri dari fagositosis host, selain itu bakteri tersebut merupakan bakteri patogen. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut: 1. Fase yang paling kritis dari prosedur pewarnaan gram adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV- iodine lepas dari sel. Pemberian alkohol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan dekolorisasi yang berlebih sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan alkohol yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. 2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel,

sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. C. Pewarnaan Spora 1. Pewarnaan Spora pada Bacillus subtilis Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, akan tetapi apabila sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya. Bacillus subtilis memiliki endospora, endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan lingkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari saftranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengkiat malachit green dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian. VIII. KESIMPULAN Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa : 1. Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan pengecatan gram, pengecatan sederhana, dan pengecatan spora. 2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna. 3. Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu. 4. Pengecatan spora dilakukan dengan memberi warna pada endospora suatu bakteri. Zat pewarna yang digunakan pertama adalah malachit green. Pengecatan spora digunakan untuk mengetahui spora dengan sel vegatatifnya. 5. Pada preparasi smear, ketebalan smear sangat penting dalam pengamatan di mikroskop. Smear yang baik hanya sekali, jika sudah kering, akan nampak lapisan putih yang tipis. 6.Fiksasi panas adalah teknik yang dilakukan supaya smear bakteri tidak tercuci selama prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikeringanginkan dua-tiga kali pada api bunsen. 7. Pada bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus termasuk dalam gram positif dikarenakan bakteri tersebut berwarna biru atau ungu pada pewarnaan safranin. Sedangkan bakteri Pseudomonas putida termasuk dalam gram negatif dikarenakan bakteri tersebut berwarna merah pada pewarnaan safranin. IX. DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2009.http://www.microbiologybytes.com/video/Pputida.html. Diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:09. Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan. Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi-bakteri.html) diakses pada 29 Oktober 2010 13:28. Jimmo., 2008. http ://Pembuatan PreParAT dannn PengeCaTAnnyA__ BloG Kita.mht ,. diakses

pada tanggal 28 Oktober 2010 20:29. Nurodin, Ade., 2009. http://adenurodin.blogspot.com/2009/12/pembuatan-preparat-bakteripewarnaan.html diakses pada 29 Oktober 2010 13:17. Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. Stanier Roger, Edward Alderberg dan John Ingraham. 1982. Dunia Mikroba 1. Jakarta: Bharata Karya Aksara. X. LAMPIRAN Bacillus subtilis (sederhana)

Bacillus subtilis (gram +)

Staphylococcus aureus (sederhana)

Staphylococcus aureus (gram +)

Pseudomonas putida (sederhana)

Pseudomonas putida (gram -)

Bacillus subtilis (spora)

PURPOSE Give students the knowledge and skills in terms of: basic chemical and biological staining theoretical, smear preparation techniques, and simple staining and differentiation. II. Lab materials A. Pseudomonas sp; 2. Bacillus subtilis; 3. Staphylococcus aereus; 4. Crystal violet, iodine, safranin, alcohol, Malachit Green; 5. Distilled water. III. TOOLS lab A. Tube; 2. Test tube rack; 3. Bunsen; 4. Light microscope. 5. Glass objects; 6. Cover glass; 7. Tissue;

8. Ose needle; 9. Container drying; IV. BASIS OF THEORY See and observe bacteria living in very difficult circumstances, because in addition to colorless, transparent, and the bacteria were also very small. To overcome this, then developed a bacterial cell staining techniques, so the cells can be seen clearly and easily observable. Therefore staining of bacterial cells is one of the most major in microbiology research. The kinds of coloring, among others: A. Simple Staining Simple staining is staining by using only one type of dye in order to determine the morphology and composition of the cell. This staining can use basic dyes in general, among others: crystal violet, metylen blue, carbolic fuchsin, and safranin. 2. Gram staining Gram stain is a stain that is used to classify gram-positive and gram-negative bacteria. Dyes used were: crystal violet as a gram A, iodine as grams B, grams of alcohol as C, as well as gram safranin D. 3. Staining Capsules This staining using two reagents, namely: crystal violet as dekolorisator (main color removal) and Kopper sulfate as counter-adsorbed dyes are experiencing dekolorisasi capsular material. Results coloring is bright blue capsule will contrast with the dark purple color of the cell. 4. Spore staining Staining of spores is using malchit green staining and safranin, which will appear in the results pewarnaanya green in the spores, and the red color in vegetative cells, which in Bacillus subtilis. Staining techniques in general, among others: A. Simple Staining Staining was used to visualize the morphological form of bacillus, coccus, bacillus, vibrio and spiral), and composition (chain, gerombol, in pairs, and tetrads). B. Differential staining Staining was used for separation in the group that is divided into two, namely dyeresistant gram and acid dyes. It is also used for visualization of structures that can be divided into four, namely capsule dyes, dye flagellum, spore color, and dye core. V. HOW TO WORK A. Simple Staining A. Sterilize the glass objects by performing slide preparation; 2. Ose to sterilize the needle is passed on Bunsen flame; 3. Give a drop of distilled water with no conditions should not need to be thick and thin on the object glass; 4. Taking cultures by using a sterile needle ose who have, in one direction, from baewah up. Just one loop only and should not be too far away from the Bunsen flame; 5. Spreading the needle containing the microbial loop is a uniform, just above the puddle of water on a glass object before. After retrieval, re-sterilized loop;

6. Miss the glass object containing the microbe in Bunsen flame until dry; 7. Dripping with crystal violet to cover the surface of the bacteria; 8. Silence for 1 minute; 9. Crystal violet dye rinse with distilled water; 10. Distilled water to remove the waste water by using dry tissue; 11. Closing the bacteria by using a cover glass; 12. Oil gave emersi above the cover glass objects we shall see, 13. Observe the slide. B. Gram staining A. Sterilize the glass objects by performing slide preparation; 2. Ose to sterilize the needle is passed on Bunsen flame; 3. Give a drop of distilled water with no conditions should not need to be thick and thin on the object glass; 4. Taking cultures by using a sterile needle ose who have, in one direction, from baewah up. Just one loop only and should not be too far away from the Bunsen flame; 5. Spreading the needle containing the microbial loop is a uniform, just above the puddle of water on a glass object before. After retrieval, re-sterilized loop; 6. Miss the glass object containing the microbe in Bunsen flame until dry; 7. Dripping with crystal violet to cover the surface of the bacteria; 8. Silence for 1 minute; 9. Crystal violet dye rinse with distilled water; 10. Drops of iodine to the surface of the bacteria and then silence for about 1-2 minutes; 11. Cultures were rinsed with water distilled water; 12. Drops of alcohol into the top 95% of bacteria and then silence for 30 seconds; 13. Distilled water rinse it with water; 14. Safranin dripping onto the bacteria and submarine silence about 1 minute, then rinse water * with distilled water; 15. Distilled water to remove the waste water by using dry tissue; 16. Closing the bacteria by using a cover glass; 17. Oil gave emersi above the cover glass objects we shall see, 18. Observe the slide. C. Spore staining A. Sterilize the glass objects by performing slide preparation; 2. Ose to sterilize the needle is passed on Bunsen flame; 3. Give a drop of distilled water with no conditions should not need to be thick and thin on the object glass; 4. Taking cultures by using a sterile needle ose who have, in one direction, from baewah up. Just one loop only and should not be too far away from the Bunsen flame; 5. Spreading the needle containing the microbial loop is a uniform, just above the puddle of water on a glass object before. After retrieval, re-sterilized loop; 6. Miss the glass object containing the microbe in Bunsen flame until dry; 7. Having looked whitish object on the glass, then soak with green malachit for 10 minutes;

8. The glass objects passing over a Bunsen flame is not too often, and if pewrana is dry, the dye should ditambhkan again (try for 10 minutes malachit green is not dry); 9. After 10 minutes, washed with distilled water until the glass object color is lost; 10. Dry the rest of the tisue Tado dry cleaning; 11. Soaking with safranin for 1 minute; 12. Wash again with distilled water; 13. Dry the slide with a Bunsen flame is passed on; 14. Closes with a cover glass; 15. Oil gave emersi above the cover glass objects we shall see; 16. Observe the slide. VI. RESULTS OF OBSERVATIONS No staining Simple bacteria spores Gram Staining Bacillus subtilis Strukutr a rod-shaped morphology (bacil), bekterinya chain arrangement. Including gram-positive. Have endospores. 2 Staphylococcus aureus Coccus-shaped, the composition of the bacteria clustered like grapes. Including gram-positive. 3 short rod-shaped Pseudomonas putida (cocoid), the composition of single bacteria. Including gram negative. VII. DISCUSSION a. Simple Staining A. Simple staining in Bacillus subtilis In the bacterium Bacillus subtilis simple coloring dyes used were crystal violet. Pure cultures taken from the test tubes aseptically and placed directly on the object glass then fixed to the bacterial proteins terkoagulasi and can stick to the glass object and opt out when rinsed with distilled water leached. The next thing to do is observe in the microscope. Bacterial cell is very small and thin-thick layer of water between the cover glass and glass objects can still accommodate some of the bacillus bacteria that are stacked vertically, meaning thick cell can still be used to swim up and down. Do not assume that the image seen in the microscope is a flat image. Control is very important, although it is difficult to get it. But better if the bacteria can be seen in comparison with other known bacteria with a definite shape. Obtained from microscopic observation of the morphology of the bacterium Bacillus subtilis is a rodshaped morphology strukutr (bacil), and the composition of bacteria is a chain. 2. Simple staining in Pseudomonas putida In the painting of microbial species Pseudomonas putida painting done by using the crystal violet dye base. The first inoculation of sterilized needles and sterilized test tubes and then the mouth is also in the Bunsen flame, then the microbes that exist in the test tube (medium to oblique) were taken and placed in glass objects, glass objects previously been given a little water. Then after the microbes and water are mixed, do the smear method of microbial leveling roughly forming a coin shape. Fixation is then performed by passing rapidly smear the Bunsen flame, and then dried aired. After doing the smear method, the next is a method of painting. Glass objects

that have been in the titration of colored crystal violet (for 60 seconds). Then given distilled water to clean the excess water colors. Remnants of the water in glass objects cleaned with a tissue. Last object glass covered with a cover glass, and placed in a light microscope to be observed with a magnification of X 1000 with a record of using oil emersi after finding a focal point of magnification 40 X. 3. Simple staining in Staphylococcus aureus Glass preparations were given a drop of water and given Stapylococcus aureus bacteria, and then fitted over the Bunsen flame, from here you will see a thin layer of white, semitransparent, and the average which indicates the presence of bacteria. After the smears were fixed, then smear the colored alkaline methylene blue. Administration of methylene blue in this, endeavored to cover all smear a thin layer. Using methylene blue staining takes 2-60 seconds, then washed with distilled water. From this it would appear that the previous layer of thin white and semitransparent, will change color to blue transparent. Next is the rest of distilled water milangkan using tissue paper. After that seen in the microscope with a magnification of 1000 X. the microscope will appear blue aereus Stapylococcus bacteria mature and form a chain round. B. Gram staining A. Gram stain on Bacillus subtilis In the four dye staining is used, the dye crystal violet as primary, primary colors as a binder iodine (mordant), alcohol as dekolorisasi, and safranin as a counter dye. On observations using the microscope appear-shaped bacillus Bacillus subtilis (Rod) and a gram-positive bacteria. It can be known as dekolorisasi stage. At this stage the resulting color with the primary colors, the color purple. This suggests that the Bacillus subtilis have a thick wall sehinnga when bacteria are dehydrated, shrink pores which ultimately led to the primary colors can not get out. On Bacillus subtilis, a little colony clustered separately even form a long chain. Bacillus subtilis is a gram-positive bacteria are rod-shaped, and are often found naturally in soil and vegetation. Bacillus subtilis has evolved to be able to live even under harsh conditions and faster to get protection against stress situations such as low pH conditions (acid), alkaline, osmotic, or oxidative conditions, and heat or ethanol. 2. Gram staining in Pseudomonas putida In the genus Pseudomonas observation using gram staining, we used the bacterium Pseudomonas putida as a representative example. Need to be fixed before the coloring on the Bunsen flame, first, bacterial colonies were suspended in distilled water thin on top. Thin smear results and homogenized in a glass object. Then proceed with the staining technique. First, using the crystal violet Gram A, the bacteria appear purple stain. A gram is a function of the main colorant is a dye that was first used. Both gram positive and gram negative gives the same color with Gram stain A. After that, given B is treated with Gram iodine. Function of iodine is as a mordant or color amplifier. UK-Y complex can be formed within the cell. That way, the color of crystal violet is maintained. Then proceed with the provision of Gram C is alcohol, which serves as a laxative color (dekolorisasi) and cell dehydration. At that

time, in the Pseudomonas bacterial cell wall composed of a layer of cells composed of lipid. Lipid excited states of the cell wall, the pores of the bacterial cell wall expands. UK-Y complexes out of cells so that cells become colorless. Last given a match for the safranin dye. Dyes can match the main entrance when the dye has come out of the bacterial cell. Pseudomonas bacteria can be stained red. From the above description, it can be seen that the Pseudomonas putida has the following characteristics were observed microscopically under light microscopy as follows: Gram-negative; Shaped kokoid (short rods); Does not form spores. 3. Gram stain of Staphylococcus aureus on Staining gram aims to classify bacteria into negative bacteria and positive bacteria. Staphylococcus aureus is a gram-positive bacteria, because bacteria still retain the crystal violet dye during gram staining process, so that colonies of bacteria appear purple or blue. Provision of alcohol serves to dekolorisasi bacteria, thus causing a major substance in the cell appears, but the bacterium Staphylococcus aureus, including gram positive terdekolorisasi so, because the bacteria have a single plasma membrane surrounded by a thick cell wall peptidoglycan of the rest of the other molecule in the form of other molecules teikhuat named acid. At last the coloring process is the provision of safranin. This coloring process will result in bacteria with cells dark purple or blue, and light blue capsules. Staphylococcus aureus is a gram-positive bacteria that do not produce spores and are not motile, generally grow in pairs or in groups, each cell with a diameter of 0.8 to 1.0 m. The optimum growing bacteria at 37 with the cleavage of 0.47 / h. The bacteria is a bacterial virulence because it produces a thick capsule to protect themselves from host phagocytosis, but it is a bacterial pathogen bacteria. Things that need to be considered in the gram stain are as follows: A. The most critical phase of the gram staining procedure is dekolorisasi stage CViodine resulting in escape from the cell. Giving alcohol to excess that would not cause excessive dekolorisasi so the cell looks like a gram positive gram negative. But also not to be too little in the hatching of alcohol will not dissolve the CV-iodine perfectly so that cells such as gram positive gram negative. 2. Preparation of gram stain is best to use a young culture that no longer than 24 hours. Age culture will affect the ability of cells to absorb the primary colors (CV), particularly in gram-positive. It will probably appear gram variable that is one type of cell, some purple and red in part because of the influence of age. C. Spore staining A. Staining the Bacillus subtilis Spores Endosopora not easily stained with dyes in general, but when once stained, the dye will be difficult to lose. This is the basis of the general method of staining spores. In the Schaeffer-Fulton method that is widely used in painting endospores, endospores stained with malachite green by the first heating process. This solution is a strong dye that can penetrate into the endospores. After treatment of malachite green, cell cultures were washed with water and covered with paint safranin. This technique will

produce a green color on the endospores and pink vegetative cell on. Bacillus subtilis has endospores, endospores are more durable even in extreme environmental conditions such as dry, hot, or toxic chemicals. In addition, the endospores are also more resistant to staining. Once successfully colored, spores are very difficult to remove the dye so that when given the color of saftranin remain green because the spores are green and hard mengkiat malachit binding color given later. VIII. CONCLUSION Based on experiments carried out it can be concluded that: A. Staining of microorganisms can be done gram staining, simple staining, and painting of the spores. 2. Simple staining is used to see the shape and structure of bacterial cells by using a single type of dye such as safranin or crystal violet, while gram stain used to distinguish between Gram (+) and gram (-) with more than one dye. 3. Gram-negative bacteria in the coloration technique will produce a red color and gram-positive bacteria will produce a purple color. 4. Painting is done by giving the color of the spores in a bacterial endospores. The first dye used is malachit green. Painting is used to determine spore spores with vegatatifnya cells. 5. On smear preparation, smear thickness is very important in the observation in the microscope. Smear is good only once, if it is dry, you will see a thin white coating. 6.Fiksasi heat is conducted in order to smear technique bacteria are not washed away during the staining procedure. Heat fixation by passing rapidly carried a dried smearaired two or three times in the Bunsen flame. 7. In the bacterium Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus, including the grampositive bacteria due to the blue or purple in safranin staining. While the bacteria Pseudomonas putida, including the gram-negative bacteria are colored red due to safranin staining. IX. REFERENCES Anonymous. 2009.http :/ / www.microbiologybytes.com / video / Pputida.html. Accessed on October 28, 2010 20:09. Dwidjoseputro, D., 1989. Fundamentals of Microbiology. New York: Oxford University Press. Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasibakteri.html), accessed on October 29, 2010 13:28. Jimmo., 2008. http :/ / Making preparations dannn PengeCaTAnnyA__ Kita.mht BloG. accessed on October 28, 2010 20:29. Nurodin, Ade., 2009. http://adenurodin.blogspot.com/2009/12/pembuatan-preparatbakteri-pewarnaan.html accessed on October 29, 2010 13:17. Schlegel, Hans. Of 1994. General Microbiology Sixth Edition. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Roger Stanier, Edward Alderberg and John Ingraham. Of 1982. 1 Microbial World. New

York: Literacy Work Bharata.

Your browser must support javascript. 3 / 26

v

BAB I PENDAHULUAN http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/ 1.1 Latar Belakang Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram. 1.2 Perumusan Masalah Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap keberlangsungan pewarnaan pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari ketiga spesimen, serta bagaimana teknik pengecatan 1.3 Tujuan

Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri, mempelajari bentukbentuk dan struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimia di dalam prosedur tersebut BAB II TINJAUAN PUSTAKA Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008). Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu: 1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora Gambar Struktur Dasar Bakteri Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif (Edukasi, 2008). Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008). Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 2535 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006). Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level

pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Praktikum Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora dilaksanakan pada hari Rabu 24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang. 3.2 Cara Kerja 3.2.1 Pewarnaan Bakteri Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri 3.2.2 Pewarnaan Endospora Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas air mendidih sampai muncul uap air (10 menit) dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop dengan perbesaran. BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Analisis Prosedur Pewarnaan Bakteri an Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat bakteri untuk 8 kelompok yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk kedelapa bakteri tersebut dan termasuk dalam bakteri gram positif atau negatif dan letak endosporanya. Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat

kemudian ditetesi dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram C selama 1 menit, dan gram D selama 30 detik. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan, kecuali setelah pewarnaan gram B preparat dicuci dengan gram C kemudian dikeringanginkan. Hal ini dilakukan karena gram C mengandung alkohol yang bertujuan untuk melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B mengandung garam iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat primer yang diserap bakteri, dilakukan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target, dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000). Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah. Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat. Kemudian preparat digenangi malakit hijau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas dan dipanaskan sampai menggepul. Preparat dipanaskan di atas penangas air mendidih sampai timbul uap air (10 menit) bertujuan membantu warna menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan bertujuan menghilangkan malakit hijau dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaaan dengan safrani (1-2 menit) bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian dicuci dengan air mengalir agar warna safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat kering. 4.2 Data Hasil Penelitian No. Nama dan Gambar Karakteristik Gram 1. Staphlococcus aereus 2. Bacillus subtilis 3. Escherichia coli

4.3 Analisis Hasil Pewarnaan bakteri dilakukan pada isolat staphylococcus aereus adalah gram positif yang berbentuk kokus atau lingkaran sterik dengan diameter sel mencapai 1m, koloninya berbentuk seperti buah anggur (Textbook, 2008). Pada bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit erpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang (hasil pengamatan). Pada Eschericia coli, koloninya tersusun rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora, pada saat diwarnai menunujukkan warna merah. 1.Staphylococcus aureus. Gambar. Staphylococcus aerreus Staphylococcus aereus pada pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga termasuk bakteri gram positif. Bakteri ini berbentuk basil. Koloninya tersususn berjajar seperti rantai memenjang. Jenis ini memiliki endospora yang terletak pada sentral. Staphylacoccus aereus adalah gram positif yang berbentuk kokus atau lingkaran seperti sterik dengan diameter sel mencapai 1 m, dan koloninya seperti buah anggur. Perananya adalah dapat menghasilkan racun sebagai penyebab sindrom trauma yang diderita oleh pria, wanita dan anak-anak. Sindrom racun trauma tersebut berupa kejang, pingsan, turunnnya tekanan darah (Textbook, 2008). Klasifikasi Staphylococcus aureus. Kingdom : Bakteri Filum : Firmicutes Kelas : Cocci Famili : Staphylococcaaceae Genus : Staphylacoccus Spesies : Staphylacoccus aereus (it is, 2008) 2.Bacillus subtilis Gambar Pengamatan Bacillus subtilis (1000 x) Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil (batang) dan merupakan bakteri gram positif. Jenis ini memiliki endospora yang letaknya di tengah. Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram-positif (Perez 2000). Bakteri ini tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan polimer dari sugars dan asam amino. Peptidoglycan yang yang ditemukan di bakteri yang dikenal sebagai murein. Sel membentuk tembok penghalang antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk mempertahankan bentuk sel dan withstanding sel yang tinggi internal tekanan turgor (Schaechter 2006). Habitat endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang kekurangan nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation. Contohnya polymyxin, difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat menurunkan Polymers seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan penyumbang penting kepada siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi apabila terkontaminasi, dapat menyebabkan pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau (Schaechter 2006). Klasifikasi Bacillus subtilis. Kingdom : Bakteri Filum : Firmicutes Kelas : Bacilli

Order : Bacillales Famili : Bacillaceae Genus : Bacillus Spesies : Bacillus subtilis (itis, 2008) 3.Escherichia coli Gambar 5. Pengamatan Escherichia coli. (1000 x) Berdasarkan hasil pengamatan bakteri Eschericia coli. Berbentuk basil (batang) yang pendek. Bakteri tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah. Koloninya tersusun seperti rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora. Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Klasifikasi Escherichia coli. Kingdom : Bakteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gamma Proteobacteria Order : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Escheriachia Spesies : E. coli (itis, 2008) 4.Pewarnaaan endospora Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat, yang terdiri dari cross-linked keratin. Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi, lokasi, dan ukuran endospora. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel, dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya (Ncbi, 2008). Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki penngertian letak el vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupunkecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletk di subterminal (Ncbi, 2008). Hasil pengamatan pada endospora Bacillus subtilis berbeda dengan literatur karena terdapat kesalahan pengamatan dan pengidentifikasian. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah (Edukasi, 2008) : Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.

Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja) Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan. Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan biakan bakteri dengan aquades, kemudian difiksasi. Pewarnaan struktur sel bakteri dilakukan dengan cat gram A, gram B, gram C, dan gram D. pewarnaan endospora dengan menggunakan malakit. Bentuk sel bakteri yang ditemukan adalah basil (Bacillus subtilis., Escherichia coli., Staphylococcus aereus), dan kokus (tidak ada). Bakteri yang termasuk gram positif adalah Bacillus subtillis. dan gram negartif Eschericia coli dan Staphylococcus aereus. Lama pewarnaan dan langkah-langkah urutan pewarnaan harus diperhatikan. Etanol terhindin adap bakteri dapat menyebabkan tereksistasinya lapisan lipid sehingga memperbesar daya serap atau permiabilitas dinding sel gram negatif. Jadi kompleks ungu kristal iodium yang telah memasuki dinding sel selama langkah awal dalam proses pewarnaan dapat tereksistasi. Karena itu organisme gram negatif pewarnaan kehilangan warna tersebut, disebabkan kandungan lipidnya yang lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan etanol. 5.2 Saran Sebaiknya pada saat praktikum benar-benar diperhatikan prosedur pewarnaan terutama pada lama waktu dan urutan pewarnaan agar tidak terjadi kesalahan dan warna yang terlalu tebal. Pada saat pengembalian isolat juga diperhatikan apakah isolat tersebut benar-benar sudah diangkat sehingga preparat apusan yang dihasilkan baik.

CHAPTER I INTRODUCTION 1.1 Background Bacteria have several forms of the bacilli (rod), cocci, and spirilum. Rod-shaped bacteria and cocci were divided into several types. In the form of a single basil basil divisions namely, diplobasil, and tripobasil. While the cocci divided monokokus (single box-shaped bacteria), Diplococcus, staphylococcus up (looks like a grape. Specials on spirul only divided by 2 is half-curved and curved. Bacteria can also be distinguished by gram staining technique. Gram staining technique that can produce red and purple. Gram-negative bacteria is characterized by positive staining purple while red (Textbook, 2008). It aims to give color to the bacteria in turn can be easily identified. In addition, there endospore which can be colored. Endospores are organisms that formed under conditions of stress from lack of nutrients, which are likely to persist in the environment until conditions become better (NCBI, 2008). Gram staining technique must match procedure because it can lead to misidentification of data is gram positive or gram negative, so it is necessary lab work is done in order to know the way the mechanism of gram staining.

1.2 Formulation of Problem Formulation of the problem is what are the factors that influence the sustainability of coloring in bacteria and endospores, how the characteristics of the three specimens, as well as how the techniques of painting 1.3 Objectives Practicum goal is to study the structure of the bacterial cell staining process, studying the forms and structures of the bacterial cell and understand the importance of each step in the staining procedure and understand the chemical reactions inside the procedure CHAPTER II REVIEW REFERENCES The method of painting was first discovered by Christian gram in 1884. With this method, the bacteria can be grouped into two, namely gram positive and gram negative based on the reaction or the nature of the bacteria on the paint. Or the nature of the reaction is determined by the composition of the bacterial cell wall so that the painting could not be performed on gram microorganisms that do not have cell walls such as Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008). Bacterial structure is divided into two, namely: A. The basic structure (owned by almost all types of bacteria) Include: cell wall, plasma membrane, cytoplasm, ribosomes, DNA, and storage granules 2. Additional structure (owned by a certain type of bacteria) Include capsules, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, gas vacuole and endospores Basic Structure of Bacteria image Gram Positive Bacteria picture and Gram Negative Bacteria (Education, 2008). Staphylococcus are Gram-positive bacteria are spherical. These bacteria colonize some berbentu such as fruit and grapes. In 1884, Rosenbach explained there are two types of staphylococci colors are: yellow Staphylococcus aureus and Staphylococcus albus white. Karakterististik owned several of which Staphylococcus aureus hemolytic on blood agar, catalase-positive and oxidase-negative, can grow at temperatures ranging from 15 to 45 degrees and the environment at high concentrations of NaCl up to 15 percent and produce the enzyme coagulase. In addition, usually S. Aureus is a pathogen such as boils, styes and furunculosis some infections (pneumonia, mastitis, phlebitis, meningitis, osteomyelitis and endocarditis urinary tract and cause food poisoning is by melepakan enterotoxins into food to become toxic to melepasan superantigens into the blood flow (Kenneath, 2008). Bacillus subtilis is a gram-positive bacteria are rod-shaped, and are often found naturally in soil and vegetation. Bacillus subtilis grown in different mesophilic temperature ranges from 25-35 degrees Celsius. Bacillus subtilis has evolved to be

able to live even under harsh conditions and faster to get protection against stress situations such as low pH conditions (acid), alkaline, osmotic, or oxidative conditions, and heat or ethanol memilikin bacterium is only one DNA molecule contains a set of sets of chromosomes. Sized DNA BP 4214814 (4.2 Mbp) (TIGR CMR). 4.100 protein coding genes. Some advantages of this bacterium is able to secrete large amounts of antibiotics out of cells (Scetzer, 2006). According Kenneath year (2008), Escherichia coli, including the family Enterobacteraceae which includes gram negative and rod-shaped Fermentative. E. coli live in large numbers in the human gut, which helps the human digestive system and protect it from bacterial pathogens. However, the new strain of E.coli is a dangerous pathogen that causes diarrheal disease and syndrome, diarrhea and hemolytic uremic advanced (hus). Mengguntungkan role is to provide an experimental waste water, an indicator of the level of water pollution as well as the detection of human pathogens in the stool caused by Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore is an organism that is formed under conditions of stress from lack of nutrients, which are likely to persist in the environment until conditions become better (NCBI, 2008). Bacteria can also be distinguished by gram staining technique. Gram staining technique that can produce red and purple. Gram-negative bacteria is characterized by positive staining purple while red (Textbook, 2008). CHAPTER III METHODS 3.1 Time and Place Practicum "Staining Cells (Bacteria and Fungi) and stain and Endospore" held on Wednesday, September 24th, 2008 at 13:00 to 16:00 pm at the Laboratory of Microbiology, Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, UB, Malang. 3.2 How it Works 3.2.1 Staining Bacteria Object glass and cover glass cleaned with alcohol 70% and then drops with sterile distilled water. Then the smears made from cultures and suspended oblique until a homogeneous sample, and then fixed on a Bunsen flame. Smears of bacteria that have become soaked gram A for 1 min, washed denan running water, and dried. Then poured g B for 1 min, washed with water, and dried. Then poured gram D for 30 seconds, washed with water, and dried. Then observed with a microscope with a magnification of 1000 x, and note the shape and color of the bacterial cell 3.2.2 Endospore Staining Object glass and cover glass cleaned with alcohol 70% and then drops with sterile distilled water. Then the smears made from cultures and suspended oblique until a homogeneous sample, and then fixed on a Bunsen flame. Bacterial smear was flooded with green dye and then heated preparations malakit above boiling water bath until the water vapor (10 min) and taken not to dry dye. Then washed with water, dried, stained with safranin (1-2 minutes) and then washed with water and

dried again. Then observed the presence or absence of spores in the cell (shape, location, size of vegetative cells) using a microscope with magnification. CHAPTER IV RESULTS AND DISCUSSION 4.1 Analysis Procedures Bacterial Endospore staining performed using an 8 to 8 groups of bacterial isolates that aims to identify the bacteria kedelapa form and included in the gram-positive or negative, and the location endosporanya. Coloring process is done by clearing the object glass and cover glass with 70% alcohol for sterilization to avoid contamination. Then etched with sterile distilled water to put the bacteria and smear preparations are made for easy tilting of the cultures were observed and were fixed. Suspended until a homogeneous sample so that bacteria can be spread on a glass object and does not accumulate. Then fixed on a Bunsen flame which aims to kill bacteria rapidly by not changing the shape and structure of bacteria, the bacteria attach over the object glass and increasing salinity properties of the dye (Tortora, 2002). The process of staining bacteria by bacterial smears that have been made and then drops by a gram for 1 minute, g B for 1 minute, gram C for 1 min, and g D for 30 seconds. After the coloring treatment, preparations are always washed with running water and dried, except after staining gram B preparations were washed with gram C then dried. This is done because it contains alcohol C gram that aims to release the previous paint. A Gram-containing crystal violet is a purple colored primer paint that will color the bacteria, staining was performed 1 minute so that it can be attached to a perfect paint on the walls of bacteria. Gram of salt contains iodine B is a function attaching mordan paint or paint primer is absorbed fixate the bacteria, carried out for 1 minute so that the color of the binding of bacteria to become stronger. Grams of C contain alcohol so it does not function to fade the color and paint before, carried out for 1 minute so that the paint can be washed out completely and there is nothing left. Gram safranin so that D contains a red colored paint that is secondary or contrast color serves to provide non-target bacteria, carried out for 30 seconds so that bacteria can stain the paint has faded (Heritage, 2000). Washing with water is so that the paint can disappear completely and not left, the color of dried intended to be attached to the bacteria and dry so that when dyed again color not previously mixed with a new color. Then viewed under a microscope with a magnification of 1000 in order to observe the shape and color of the bacterial cell. Gram-positive bacteria will be colored purple, while gram-negative bacteria will be colored red. The process of staining endospores performed after fixation and after smear preparations are made. Then preparations were under malakit green that serves as the primary dye used to stain the heat fixation and heated to menggepul. Mixture is heated above the boiling water bath until steam arises (10 minutes) aims to help the color penetrate the guarded walls of endospores and do not let the dye dry. Then washed with water and dried green malakit aimed at eliminating all the cells of endospores. Pewarnaaan with safrani (1-2 minutes) is intended as a counterstain is used to stain the color of the cell other than endospores (Prescot, 2002). Then

washed with running water for safranin color fastness and color that dried fast drying. 4.2 Data Research No. Name and Pictures Characteristics Gram A. Staphlococcus aereus 2. Bacillus subtilis 3. Escherichia coli 4.3 Analysis of Results Staining performed on isolates of staphylococcus bacteria are gram positive aereus coccus-shaped or circular steric cells reach 1m in diameter, shaped like grapes colonies (Textbook, 2008). On bacillus subtilis, a little colony clustered erpisah separated even form a long chain (observations). On Escherichia coli, colonies composed of elongated chain. On bacterial endospores is not found, at menunujukkan colored red. 1.Staphylococcus aureus. Image. Staphylococcus aerreus Staphylococcus aereus on gram stain purple are known to include gram-positive bacteria. This bacteria-shaped bacillus. Chain-like colonies tersususn lined memenjang. This type have endospores that lie in the central. Staphylacoccus aereus is shaped gram-positive cocci such as steric or circle with a diameter of cell is 1 m, and colonies such as grapes. Perananya is able to produce toxins as a cause of trauma syndrome suffered by men, women and children. Trauma syndrome toxin in the form of seizures, fainting, reduction in blood pressure (Textbook, 2008). Classification of Staphylococcus aureus. Kingdom: Bacteria Phyla: Firmicutes Class: cocci Family: Staphylococcaaceae Genus: Staphylacoccus Species: Staphylacoccus aereus (it is, 2008) 2.Bacillus subtilis

Observation of Bacillus subtilis image (1000 x) On observations using the microscope appear-shaped Bacillus subtilis bacillus (rod) and a gram-positive bacteria. This type has endospores are located in the middle. Bacillus subtilis is a rod-shaped bacteria that are Gram-positive (Perez 2000). These bacteria are composed of peptidoglycan, which is a polymer of sugars and amino acids. Peptidoglycan is found in a bacterium known as murein. Cells form a barrier between the environment and the bacterial cells are useful for maintaining cell shape and cell withstanding high internal turgor pressure (Schaechter 2006). Habitat is soil bacterial endospores. Microbes in the form of spores that lack of nutrition. These organisms can produce antibiotic during sporulation. For example polymyxin, difficidin, subtilin, and mycobacillin. Many of these microbes can degrade Bacillus Polymers such as proteins, starch, and pectin, so the bacteria is an important contributor to the carbon and nitrogen cycle. However, if contaminated, can cause decay. Based on the staining of vegetative cells obtained rosy color and the color is green endosporanya (Schaechter 2006). Classification of Bacillus subtilis. Kingdom: Bacteria Phyla: Firmicutes Class: bacilli Order: Bacillales Family: Bacillaceae Genus: Bacillus Species: Bacillus subtilis (itis, 2008) 3.Escherichia coli Figure 5. Observation of Escherichia coli. (1000 x) Based on the observation of the bacteria Escherichia coli. Shaped bacilli (rod) is short. The bacteria at the time showed marked in red. Colonies made up as elongated chains. On bacterial endospores was not found. According Kenneath year (2008), Escherichia coli, including the family Enterobacteraceae which includes gram negative and rod-shaped Fermentative. E. coli live in large numbers in the human gut, which helps the human digestive system and protect it from bacterial pathogens. However, the new strain of E.coli is a dangerous pathogen that causes diarrheal disease and syndrome, diarrhea and hemolytic uremic advanced (hus). Mengguntungkan role is to provide an experimental waste water, an indicator of the level of water pollution as well as the detection of human pathogens in the stool caused by Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Classification of Escherichia coli. Kingdom: Bacteria Phyla: Proteobacteria Class: Gamma Proteobacteria Order: Enterobacteriales Family: Enterobacteriaceae

Genus: Escheriachia Species: E. coli (itis, 2008) 4.Pewarnaaan endospores Endospores-resistant components have a strong chemical agents on the spore coat, which consists of cross-linked keratin. Identification can be done by looking at the morphology, location, and size of endospores. Some endospores have a diameter larger than the cell, where the cell will appear at the location endosporanya menggembang (NCBI, 2008). Location of endospores that differ among bacterial species can be used for identification. Between the main types of terminal, subterminal and central. Central type or location of the center is a vegetative cell that is located right in the middle. Type the location of the terminal has penngertian vegetative el between the tip and the edge of the vegetative cell. Type subterminal mean location between the center and edge endosporanya of vegetative cells. Endospores can ataupunkecil larger than vegetative cells are composed of layers made of keratin protein. These spores have a high resistance to staining, the staining procedure is by heating the green malakit. Endospores is a method of survival is not intended for reproduction. For example Bacillus subtilis has a terletk endospores in subterminal (NCBI, 2008). Observations on Bacillus subtilis endospores in contrast to the literature because there are errors of observation and identification. There are several factors that affect the staining of bacteria, namely fixation, laxative color, substrate, and the intensification of the use of dye staining the cover. Principles that should always be remembered and obeyed the (Education, 2008): Always sterilize the loop, will be used during and after use. Place the loop in place, do not put in any place (eg on a table) Do not hold the eye (the tip) ose by hand. Try not to talk much at work CHAPTER V CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS 5.1 Conclusion The technique of making smear preparations (preparations) can be performed with bacterial cultures mensuspesikan with distilled water, then fixed. Staining bacterial cell structure made with paint gram A, g B, g C, and D. grams staining endospores using malakit. Bacterial cell shape is found bacilli (Bacillus subtilis., Escherichia coli., Staphylococcus aereus), and cocci (no). Which include gram-positive bacteria is Bacillus subtillis. and gram negartif Escherichia coli and Staphylococcus aereus. Long staining and staining sequence steps must be considered. Ethanol can cause bacterial adap terhindin tereksistasinya lipid layer or increasing the absorptive capacity of gram-negative cell wall permeability. So the crystal violet iodine complex has entered the cell wall during the initial step in the coloring process can tereksistasi. Therefore, gram-negative organisms stain colors are lost, due to lower lipidnya content, grampositive bacterial cell walls become dehydrated during treatment with ethanol. 5.2 Advice

At the lab should be properly addressed staining procedure, especially on a long time and the order of staining to avoid mistakes and colors that are too thick. At the time of return of isolates also note whether these isolates had completely removed so that the resulting good smear preparations.

BAB I PENDAHULUAN A. Latar belakang Di alam terdapat banyak mikroorganisme yang hidup. Mikroorganisme yang terdapat di alam tersebut terdapat dalam bentuk kumpulan massa sel/ koloni. Untuk mempelajari suatu jenis koloni dan sifat mikroorganisme tersebut, kita memerlukan teknik pembiakan mikroorganisme terlebih dahulu. Setelah di biakan, kita perlu menghitung atau menentukan banyaknya mikroba untuk mengetahui seberapa jauh sampel itu tercemar oleh mikroba. Selain menghitung angka kuman, kita perlu mengetahui perbedaan antara bakteri gram negatif dengan bakteri gram positif. Karena bakteri adalah mikroba uniseluler yang bersifat transparan dan tidak berwarna yang sulit dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya, kira perlu melakukan teknik pewarnaan bakteri terlebih dahulu untuk mengetahui struktur dan morfologi bakteri tersebut. B. Tujuan Praktikan dapat menghitung jumlah bakteri yang tumbuh dari sampel praktik yang sebelumnya. Selain dapat menghitung angka bakteri yang tumbuh, praktikan juga dapat

mengetahui cara-cara teknik pewarnaan bakteri dan dapat membedakan bakteri gram negatif dengan bakteri gram positif yang dilihat di bawah mikroskop. BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Perhitungan angka kuman Menentukan banyaknya mikroba dalam suatu bahan dilakukan untuk mengetahui sampai seberapa jauh bahan itu tercemar oleh mikroba. Dengan mengetahui jumlah mikroba, maka dapat diketahui kualitas mikribiologi dari bahan tersebut. Jumlah mikroba dapat dihitung dengan beberapa cara, namun secara garis besar dibedakan menjadi: 1. Cara langsung Hasil perhitungan secara langsung menunjukkan seluruh jumlah mikroba yang masih hidup maupun yang sudah mati. Caranya: a. Pembuatan preparat sederhana yang diwarnai b. Menggunakan ruang hitung 2. Cara tidak langsung Hasil perhitungan akan menunjukkan jumlah mikroba yang masih hidup saja. Caranya: a. c. Menghitung total jumlah mikroba Memperkirakan jumlah terkecil mikroba yang ada Cara ini dapat digunakan untuk bahan padat maupun cair. Khusus untuk bahan padat maka sebelum dilakukan perhitungan bahan itu perlu dilakukan pelarutan atau dibuat suspensi, dengan memperhitungkan faktor pengencerannya. Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah: a. Satu koloni dihitung 1 koloni b. Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni b. Cara pengenceran d. Cara kekeruhan

c. e. f.

Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni Koloni yang lebih besar dari setengah cawan tidak dihitung Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni. Standar perhitungan Jumlah koloni = jumlah koloni X 1/faktor pengenceran.

d. Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni

a.

Cawan yang dipilih adalah yang mengandung jumlah koloni 30-300 koloni belakang koma. Jika angka ketiga lebih besar dari 5 maka harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua.

b. Hasil yang dilaporkan terdiri dari 2 angka yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua di

c.

Jika semua pengenceran menghasilkan angka kurang dari 30 koloni, maka hanya koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 koloni dikalikan dengan faktor pengenceran tetapi jumlah sebenarnya harus dicantumkan dengan tanda kurung.

d.

Jika semua pengenceran menghasilkan angka lebih dari 300 koloni maka hanya koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 koloni dikalikan dengan faktor pengenceran tetapi jumah sebenarnya harus dicantumkan dengan tanda kurung.

e.

Jika semua pengenceran menghasilkan angka 30-300 koloni maka harus dibuat perbandingan. Jika perbandingannya < 2 maka yang dilaporkan adalah rata-rata pengenceran tetapi jika perbandingannya > 2 maka yang dilaporkan adalah pengenceran terendah.

f.

Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, maka data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut meskipun salah satu dari cawan duplo tidak memenuhi syarat 30-300 koloni.

B. Bakteri Bakteri adalah kelompok terbanyak dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil dan kebanyakan adalah uniseluler dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Ciri-ciri bakteri: a. Dinding sel tersusun atas mukopolisakarida dan peptidoglikan. Peptidoglikan terdiri atas polimer besar yang terbuat dari N-asetil glukosamin dan N-asetil muramat, yang saling berikatan silang dengan ikatan kovalen. Berdasarkan pewarnaan gram, bakteri dapat dibedakan menjadi bakteri gram positif dengan bakteri gram negatif.

Perbedaan bakteri gram positif dengan bakteri gram negatif karakteristik Dinding sel Gram positif Gram negatif Homogen dan tebal (20-80 nm)Peptidoglikan (2-7 nm)

serta sebagian besar tersusundiantara membran dalam dan dari peptidoglikan. Polisakaridaluar serta adanya membran luar lain dan asam teikoat dapat ikut(7-8 nm tebalnya) yang terdiri menyusun dinding sel. Bentuk sel Bulat, batang atau filamen. dari lipid, protein, dan lipopolisakarida. Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seperti tanda koma, heliks atau filamen. Beberapa mempunyai Reproduksi Metabolisme Motilitas Pembelahan biner. Kemoorganoheteretrof. kapsul. Pembelahan selubung biner, atau

kadang-

kadang pertunasan. Fototrof, kemolitoautotrof, atau

kemoorganoheterotrof. Kebanyakan non motil, bilaMotil atau non motil, bentuk motil tipe flagelnya tidak adalahflagela dapat bervariasi-polar, lopotrikus, petritrikus. memilikiDapat memiliki phili, fimbriae, membentuk

petritrikus. Anggota tubuh Biasanya (apendase) Endospora

apendase. tangkai. Beberapa grup dapat membentukTidak dapat endospora. endospora.

b. Sel bakteri dapat mensekresikan lendir ke permukaan dinding selnya. Lendir yang terakumulasi di permukaan terluar dinding sel akan membentuk kapsul. Kapsul ini berfungsi untuk mempertahankan diri dari kondisi lingkungan yang buruk. Bakteri yang berkapsul lebih sering menimbulkan penyakit dibandingkan dengan bakteri yang tidak berkapsul. c. Membran sitoplasma meliputi 8-10% dari bobot kering sel dan tersusun atas fosfolipida dan protein. Fungsi utama membran sitoplasma adalah sebagai alat transpor elektron dan proton yang dibebaskan pada waktu oksidasi bahan makanan dan sebagai alat pengatur pengangkutan senyawa yang memasuki dan meninggalkan sel.

d. Sitoplasma dikelilingi oleh membran sitoplasma, dan tersusun atas 80% air, asam nukleat, protein, karbohidrat, lemak, dan ion anorganik serta kromatofora. Di dalam sitoplasma terdapat ribosomribosom kecil. Selain itu terdapat RNA dan DNA. Terdapat pula DNA tertentu yang diselubungi protein sehingga membentuk genofor sirkuler. e. f. Pada kondisi yang tidak menguntungkan bakteri dapat membentuk endospora yang berfungsi melindungi bakteri dari panas dan gangguan alam. Bakteri ada yang bergerak dengan flagela dan ada yang bergerak tanpa flagela. Bakteri tanpa flagela bergerak dengan cara berguling. Setiap sel bakteri memiliki jumlah flagela yang berbeda. Berdasarkan jumlah dan letak flagela, bakteri dibedakan menjadi 4, yaitu: Bakteri monotrik, yaitu bakteri yang mempunyai satu flagela pada salah satu ujung selnya. Bakteri amfitrik, yaitu bakteri yang pada kedua ujung selnya mempunyai satu flagela. Bakteri lofotrik, yaitu bakteri yang pada salah satu ujung selnya memiliki seberkas flagela. Bakteri peritrik, yaitu bakteri yang pada seluruh tubuhnya terdapat flagela. Bentuk dan ukuran bakteri Dengan menggunakan mikroskop yang dilengkapi lensa okuler mikrometer dan objektif mikrometer, ukuran bakteri dapat diketahui. Ukuran bakteri dinyatakan dalam satuan mikron. Panjang bakteri umumnya berkisar 0,1 0,2 mikron. Bentuk bakteri sangat barvariasi, tetapi secara umum ada 3 tipe, yaitu: 1. Bentuk batang/silindris (basil) 2. Bentuk bulat (kokus) 3. Bentuk spiral (spirilium) Variasi bentuk bakteri atau koloni bakteri dipengaruhi oleh arah pembelahan, umur, dan syarat pertumbuhan tertentu, misalnya makanan, suhu, dan keadaan yang tidak menguntungkan bagi bakteri. a. Bentuk batang (silindris) Bakteri bentuk batang dibedakan atas bentuk-bentuk sebagai berikut. 1. Basil tunggal, berupa batang tunggal 2. Diplobasil, berbentuk batang bergandengan dua-dua 3. Streptobasil, berupa batang bergandengan seperti rantai. b. Bentuk bulat

Bakteri berbentuk bulat (kokus = sferis/tidak bulat betul) dibagi menjadi bentul-bentuk sebagai berikut: 1. Monokokus; berbentuk bulat satu-satu 2. Diplokokus; bentuknya bulat bergandengan dua-dua 3. Streptokokus; memiliki bentuk bulat bergandengan seperti rantai, sebagai hasil pembelahan sel ke satu atau dua arah dalam satu garis 4. Tetrakokus; berbentuk bulat terdiri dari 4 sel yang tersusun dalam bentuk bujur sangkar sebagai hasil pembelahan sel ke dua arah. 5. Sarkina; bentuknya bulat, terdiri dari 8 sel yang sersusun dalam bentuk kubus sebagai hasil pembelahan sel ke tiga arah. 6. Stafilokokus; berbentuk bulat tersusun seperti kelompok buah anggur sebagai hasil pembelahan sel ke segala arah. c. a. c. Bentuk spiral Bakteri berbentuk spiral dibagi menjadi: Koma (vibrio); berbentuk lengkung kurang dari setengah lingkaran. Spiroseta; berupa spiral yang halus dan lentur. b. Spiral; berupa lengkung lebih dari setengah lingkaran.

C. Pewarnaan bakteri Bakteri adalah mikroba uniseluler bersifat transparan dan tidak berwarna, sehingga sulit dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya karena tidak mengabsorbsi ataupun membiaskan cahaya. Teknik pewarnaan merupakan cara yang banyak dilakukan untuk melihat struktur dan morfologi bakteri. Sel bakteri mengandung bermacam-macam senyawa kimia antara lain, lipida, asam nukleat, dan protein. Zat-zat itu akan bereaksi dengan zat warna asam atau basa dengan hasil kenampakan yang berbeda. Penggunaan satu macam zat warna untuk pewarnaan bakteri sering tidak menghasilkan pengamatan yang baik, olah karena itu umumnya bakteri diwarnai dengan menggunakan lebih dari satu zat warna. Sebelum diberi zat warna, sel bakteri perlu difiksasi yaitu mematikan sel pada preparat ulas tanpa mengakibatkan perubahan bentuk dan struktur yang ada di dalam sel. Selain di

fiksasi, maka afinitas sel terhadap zat warna menjadi meningkat sehingga zat warna lebih kuat melekat pada sel. Pewarnaan bakteri ada beberapa cara yang dapat dikelompokkan: 1. Pewarnaan sederhana a. Pewarnaan langsung b. Pewarnaan tidak langsung 2. Pewarnaan diferensial a. Pewarnaan gram b. Pewarnaan acid-fast 3. Pewarnaan struktur sel a. c. Pewarnaan endospora Pewarnaan kapsul Pewarnaan gram Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. BAB III METODE PRAKTIKUM b. Pewarnaan flagelia

1. Praktikum perhitungan angka kuman A. Alat dan bahan Cawan petri steril Tabung reaksi Pipet volume Vortex Lampu bunsen Tanah Aquadest steril Medium petri PCA Kapas Inkubator Kertas yellow page

B. Cara kerja 1. Timbang tanah seberat 1 gram 2. Tanah seberat 1 gram dimasukkan ke dalam aquadest steril 9 ml (tabung pengenceran 10-1) secara aseptis dan divortex, lalu ambil 1 ml larutan masukkan dalam aqudest steril (pengenceran 10-2) dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-7 3. Dari masing-masing tiga pengenceran terakhir (10-5, 10-6, 10-7) diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium cawan petri 4. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam 5. Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut 6. Hitung jumlah mikroba pada masing-masing petri tersebut. 2. Praktikum pewarnaan gram A. Adapun alat yang digunakan adalah: Jarum ose Objek glass Lampu bunsen Mikroskop

B. Bahan yang digunakan adalah biakan kuman Staphylococcus aereus dan Pseudomonas aeruginosa C. Zat warna yang digunakan adalah: Karbol kristal ungu 0,5% (gram A) Cairan iodin (gram B) Alkohol aceton (gram C) Safranin (gram D)

D. Cara kerja: 1. Buatlah preparat ulas bakteri biakan murni 2. Tambahkan gram A 1 tetes, diamkan 5 menit lalu cuci dan keringkan 3. Tambahkan gram B 1 tetes, diamkan 1 menit lalu cuci dan keringkan 4. Tambahkan gram C 1 tetes, diamkan 1 menit lalu cuci dan keringkan 5. Tambahkan gram D 1 tetes, diamkan 1 menit lalu cuci dan keringkan 6. Amati di bawah mikroskop. BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil perhitungan angka kuman 10-5 9 Perhitungan: 10-6 35 10-7 29 SPC (standar plate count) 3,5 x 107 CFU

Jumlah koloni = jumlah koloni x 1/faktor pengenceran = 35 x 1/10-6 = 3,5 x 101 x 10-6 = 3,5 x 107 CFU Pembahasan: Pada hasil pengamatan praktikum yang memenuhi angka untuk dilaporkan adalah pada cawan petri 10-6 dengan hasil jumlah koloni adalah 3,5 x 10-7 CFU. B. Hasil pewarnaan gram Pengamatan Nama bakteri Gram positif Staphylococcus aureus Gram negatif Pseudomonas aeruginosa

Bentuk sel Warna sel Pembahasan:

Bulat tetapi menggumpal ungu

Basil dan terdapat flagel Merah

Staphylococcus aereus pada pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga termasuk bakteri gram positif. Bakteri ini koloninya berjajar seperti rantai memanjang. Memiliki endospora yang terletak pada sentral. Staphylococcus aureus (S. aureus) adalah bakteri gram positif yang menghasilkan pigmen kuning, bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkanspora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 m. S. aureus tumbuh dengan optimum pada suhu 37oC dengan waktu pembelahan 0,47 jam. S.aureus merupakan mikroflora normal manusia. Bakteri ini biasanya terdapat pada saluran pernafasan atas dan kulit. Keberadaan S. aureus pada saluran pernafasan atas dan kulit pada individu jarang menyebabkan penyakit, individu sehat biasanya hanya berperan sebagai karier. Infeksi serius akan terjadi ketika resistensi inang melemah karena adanya perubahan hormon; adanya penyakit, luka, atau perlakuan menggunakan steroid atau obat lain yang mempengaruhi imunitas sehingga terjadi pelemahan inang. Pseudomonas aeruginosa pada pewarnaan gram diketahui berwarna merah sehingga termasuk gram negatif. Bakteri ini mempunyai flagela polar sehingga bakteri ini bersifat motil berukuran 0,5 1,0 mikro meter. BAB V PENUTUP Kesimpulan 1. Perhitungan angka kuman bertujuan untuk mengetahui seberapa jauh bahan tercemar oleh mikroba. 2. Kandungan mikroba pada suatu bahan menunjukkan kualitas mikrobiologi serta tingkat kelayakan suatu bahan untuk dikonsumsi. 3. 4. Teknik pewarnaan merupakan cara yang banyak dipergunakan untuk melihat struktur dan morfologi bakteri. Perbedaan bakteri gram negatif dengan bakteri gram positif yang paling spesifik terletak pada dinding selnya.

DAFTAR PUSTAKA Pelczar. M.J & E.C.S Chan. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit Universitas Indonesia, Jakarta, 1989 Kurikulum 2004 Standar kompetensi. Mata pelajaran biologi Sekolah Menengah Atas dan Madrasah Aliyah. Departemen Pendidikan Nasional, Jakarta Anonim, 2010. http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram Anonim, 2010. http://id.wikipedia.org/wiki/Gram-negatif Anonim, 2010. http://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri Anonim, 2010. http://id.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus

CHAPTER I INTRODUCTION A. Background In nature there are many microorganisms that live. Microorganisms found in nature in the form of the mass of cells / colony. To learn a colony type and nature of these microorganisms, we need a prior microorganism breeding techniques. Once in culture, we need to calculate or determine the number of microbes to know how far the sample is contaminated by microbes. In addition to calculating the number germs, we need to know the difference between gram negative bacteria with gram positive bacteria. Because bacteria are microbes that are Unicellular colorless transparent and difficult to be seen using a light microscope, some need to do the first bacterial staining technique to determine the structure and morphology of these bacteria. B. Purpose Praktikan can count the number of bacteria that grow in a sample of previous practice. In addition to calculating the number of bacteria that grow, praktikan also know how to staining technique that distinguishes the bacteria and gram negative bacteria with gram positive bacteria as seen under a microscope. CHAPTER II LITERATURE REVIEW A. Calculation of bacterial numbers Determine the microbes in a number of items to find out how far the material is contaminated by microbes. By knowing the number of microbes, it is unknown mikribiologi quality of the materia