avances moleculares aplicados a la clínica dr. denis landaverde recinos oncólogo médico msc....

Avances Avances moleculares moleculares

aplicados a la aplicados a la clclínicaínicaDr. Denis Landaverde Dr. Denis Landaverde

RecinosRecinos

Oncólogo MédicoOncólogo Médico

Msc. Genética y Biología Msc. Genética y Biología MolecularMolecular

Métodos Diagnóstico Métodos Diagnóstico MolecularesMoleculares

PCRPCR RT-QPCRRT-QPCR FISHFISH MicroarreglosMicroarreglos BioinformáticaBioinformática

Dogma Central de Dogma Central de la Biología la Biología MolecularMolecular

A GU U A G C U A G C

ADN

ARN

Transcripción

T C A T C G A T C GA

T CA A T C G A T C G

A GU U A G C U A G C

ADN

ARNm

Met

U A1

C A U2

Ile

C

Traducción

mensajero

ARNttransfer

Ribosoma

U A G C U A G C

ADN

ARNm

ARNt

Met Ile

A U2

C U3

Asp

G A

T CA A T C G A T C G

A GU

A T C G A T C G

U A G C U A G C

ADN

ARNm

ProteínaMet Ile Asp

T CA

A GU

A T C G A T C G

U

A

GC

U

A

G

C

ADN

ARNm

Degradación

T CA

A

GU

Juang RH (2004) BCbasics

ADN

ADN es reemplazado por el ARN volviéndose el principal material genético

ARN permite la biosíntesis protéica

Versión final del mecanismo genético celular

Procariota Eucariotaproteinas

cap5’ 3’

cola

ARNm maduro

ADN

5’3’proceso

ARNm

ribosomaARNm

proteinas


PCRPCR

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.

PCR

amplificación

DNA

(molecule sencilla)

Muchasmoleculas

Síntesis por DNA polimerasaSíntesis por DNA polimerasa

--A T G C A T G C A T G C * * A T G C A T G C A T G C * *

A C G-T


Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada

5’ 3’


--A T G C A T G C A T G C * *A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T


5’ 3’



A C G T-T A5’ 3’




A C G T-T A C


5’ 3’



A C G T-T A C G


5’ 3’



A C G T-T A C G T


5’ 3’



A C G T-T A C G T A


5’ 3’

Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA

Primer 1 Extensión de la cadena

Cadena original de DNA

¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?


Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)


Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa

Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1

2

1

Ahora tenemos dos copias de la molécula original


Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias


Fusión95°C

Hibridización50-60ºC

Extensión deLa cadena

75ºC

Primer Ciclo

2do Ciclo95ºC

50 - 60ºC75ºC

Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias

Hay 7 componentes Hay 7 componentes esenciales en el proceso esenciales en el proceso

standard de PCRstandard de PCR ADN polimerasa termoestableADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores Oligonucleotidos iniciadores

(“primers”)(“primers”) Desoxiribonucleótidos trifosfatados Desoxiribonucleótidos trifosfatados

(dNTPs)(dNTPs) Cationes divalentesCationes divalentes Buffer (para mantener el pH)Buffer (para mantener el pH) Cationes divalentesCationes divalentes ADN molde (Templado)ADN molde (Templado)

RT-QPCRRT-QPCR

Intrones y Exones en Células Eucariotas

ARNm

ADN

5’ 3’

cap

ColaPoly A

exon exonexonintron intron

ARNmaduro

Procesado

Transcripción

Empalme

promotor

3’ 5’

En el núcleo

Codón inicio Codón terminacion

Al citoplasma

Intron Borrado


El ADNc es transcrito en forma reversa del ARNm

ARNm maduro

Cola poly A5’ 3’

TTTTRetroTranscripción

CCC

3’ 5’

3’5’ 3’GGG

ADN Polimerasa

ARN hidrolisis

5’

3’ 5’

Para amplificar copias de cDNA de RNAPara amplificar copias de cDNA de RNA Es especialmente útil cuando solo se dispone Es especialmente útil cuando solo se dispone

de pequeñas cantidades de RNAde pequeñas cantidades de RNA Frecuentemente usada para amplificar genes Frecuentemente usada para amplificar genes

específicos (como cDNAs) si algo de su específicos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocidasecuencia es conocida

Requiere primer “antisense” y un DNA Requiere primer “antisense” y un DNA polimerasa dependendinte de RNApolimerasa dependendinte de RNA

Puede ser usada para construir bibliotecas de Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNAcDNA

RT-PCR = PCR con RT-PCR = PCR con transcriptasa reversatranscriptasa reversa

RT-PCRRT-PCR

AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’

Transcripción reversa

PCR usando GSP+GSP1

AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’

mRNA(sense)

Primer Antisense:oligo(dT)o

1ra cadena cDNA

GSP1 (sense)

GSP (antisense)

GSP1

GSP

Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

Cariotipo/CitogeneticaCariotipo/Citogenetica

1 2 3 4 5

6 7 8 10 119 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22X Y

Anomalía Citogenética de la LMC: Anomalía Citogenética de la LMC:

el cromosoma Filadelfiael cromosoma Filadelfia

bcr-abl

ablProteína de fusión con actividad

tirosin kinasa

22

bcr

Ph (or 22q-)

99 q+

1

p210Bcr-Abl

p185Bcr-Abl2-11

2-11

Cromosoma 9

c-bcr

Cromosoma 22

c-abl

2-11

Exones

Intronas

Puntos de fractura CML

Puntos de fractura LLA

Translocación (9;22) Estructura del gen bcr-abl

Pasternak G, et al. J Cancer Res Clin Oncol. 1998;124:643-660.Melo JV. Blood. 1996;88:2375-2384.

El Cromosoma Filadelfia El Cromosoma Filadelfia y el Gen y el Gen bcr-ablbcr-abl

Fluorescence in situ Fluorescence in situ HybridizationHybridization

Fluorescence in situ Fluorescence in situ Hybridization (FISH)Hybridization (FISH)

FISH – es FISH – es un proceso en el un proceso en el cual se pintan las cual se pintan las cromosomas o porciones de cromosomas o porciones de los mismos con moléculas los mismos con moléculas flourescentesflourescentes


Identifica anormalidades Identifica anormalidades cromosómicas.cromosómicas.

Ayuda para el análisis de Ayuda para el análisis de aberraciones estructurales, aberraciones estructurales, determinación de ploidías, mapeo determinación de ploidías, mapeo de genes, de genes, etc.etc.


Usado para identificar la Usado para identificar la presencia y localización de una presencia y localización de una resión de AND o ARN con resión de AND o ARN con preservación morfológica de preservación morfológica de preparados de cromosomas en preparados de cromosomas en células fijadas o secciones de células fijadas o secciones de tejido.tejido.

FISH ProFISH Procedimientocedimiento

DesnaturDesnaturalizar los alizar los cromosomascromosomas

HibridaHibridaciónción Marcado FlourescenteMarcado Flourescente ExamiExaminar las láminas en la nar las láminas en la

oscuridad.oscuridad.

FISH ProcedimientoFISH Procedimiento

MicroarreglosMicroarreglos

Los MicroarraysLos Microarrays

Son dispositivos miniaturizados capaces de Son dispositivos miniaturizados capaces de realizar un experimento de hibridacirealizar un experimento de hibridación ón múltiple.múltiple.

En la actualidad, existen microarrays que En la actualidad, existen microarrays que contienen secuencias de todos los genes de un contienen secuencias de todos los genes de un organismo.organismo.

Se emplean para estudiar si existen genes Se emplean para estudiar si existen genes comunes entre muestras, o sobre todo, para comunes entre muestras, o sobre todo, para estudiar la estudiar la expresión expresión de genes globalmente.de genes globalmente.

A continuaciA continuación, veremos una imagen de un ón, veremos una imagen de un microarray.microarray.

Tamaño de un Tamaño de un MicroarrayMicroarray

Un microarray contiene miles de Un microarray contiene miles de puntos, cada uno correspondiente a puntos, cada uno correspondiente a una secuencia especuna secuencia específica para un ífica para un gen, compuesta de unos 25 gen, compuesta de unos 25 nucleótidos.nucleótidos.

Sin embargo, el tamaño del Sin embargo, el tamaño del dispositivo entero es el mismo que el dispositivo entero es el mismo que el de un portaobjetos normal.de un portaobjetos normal.

Muestrade ADN

Cada mancha contiene ADN conocido

Biochip

Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31

ADN complementario hibridizado

Señal aparente

Biochip Basado en Hibridizacion

A microarray analysis machine

An example of red, green and yellow spots.

BioinformáticaBioinformática

BioinformáticaBioinformáticaDefinición intuitivaDefinición intuitiva

Conjunto de herramientas Conjunto de herramientas informáticainformáticas que sugieren s que sugieren

soluciones a problemas soluciones a problemas biobiológicoslógicos

BioinformáticaBioinformática es la aplicación de es la aplicación de los ordenadores y los métodos los ordenadores y los métodos informáticos en el análisis de datos informáticos en el análisis de datos experimentales y simulación de los experimentales y simulación de los sistemas biológicossistemas biológicos

Una definición mucho más global es:Una definición mucho más global es: Bioinformática es la aplicación del Bioinformática es la aplicación del

desarrollo de la computación y las desarrollo de la computación y las matemáticas que permite la matemáticas que permite la administración, análisis y comprensión de administración, análisis y comprensión de datos para resolver preguntas biológicas. datos para resolver preguntas biológicas. (con conexiones a medi-, quimio-, neuro-, (con conexiones a medi-, quimio-, neuro-, etc. informática). Modificado de: Center etc. informática). Modificado de: Center for Research on Innovation and for Research on Innovation and Competition (Harvey & Mc. Meekin, Competition (Harvey & Mc. Meekin, 2002). 2002).

Bases de datosBases de datos Existen Existen basesbases de datos primarias, que de datos primarias, que

contienen información directa de la contienen información directa de la secuencia, estructura o patrón de expresión secuencia, estructura o patrón de expresión de de ADNADN o o proteínaproteína, y secundarias, que , y secundarias, que contienen datos e hipótesis derivados del contienen datos e hipótesis derivados del análisis de las bases de datos primarias, análisis de las bases de datos primarias, como mutaciones, relaciones evolutivas, como mutaciones, relaciones evolutivas, agrupación por familias o funciones, agrupación por familias o funciones, implicación en enfermedades, etc.implicación en enfermedades, etc.

De De nucleótidosnucleótidos

La colaboración de las tres bases de datos más importantes hace posible La colaboración de las tres bases de datos más importantes hace posible acceder a casi toda la información de secuencias de acceder a casi toda la información de secuencias de ADNADN desde desde cualquiera de sus tres sedes:cualquiera de sus tres sedes:

EMBL-BANKEMBL-BANK en el Instituto europeo de Bioinformática ( en el Instituto europeo de Bioinformática (EBIEBI) ) Enlace externo: Enlace externo: EMBL-BANKEMBL-BANK

DNA Data Bank of JapanDNA Data Bank of Japan ( (DDBJDDBJ) en el Centro de Información Biológica () en el Centro de Información Biológica (CIBCIB) )

Enlace externo: Enlace externo: DDBJDDBJ GenBankGenBank en el Centro Nacional de Información Biotecnológica ( en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBINCBI) )

Enlace externo: Enlace externo: GenBankGenBank EntrezEntrez NucleotideNucleotide Si bien son mantenidas por distintos organismos en distintos paises, Si bien son mantenidas por distintos organismos en distintos paises,

existe una coordinación entre las distintas bases. Una secuencia enviada a existe una coordinación entre las distintas bases. Una secuencia enviada a cualquiera de las bases se verá reflejada en las otras dos en cualquiera de las bases se verá reflejada en las otras dos en aproximadamente una semana, ya que esa es la frecuencia de aproximadamente una semana, ya que esa es la frecuencia de actualización entre las distintas bases genéticas. Por este motivo es actualización entre las distintas bases genéticas. Por este motivo es indistinto que base se use para enviar nuevas secuencias, aunque indistinto que base se use para enviar nuevas secuencias, aunque normalmente los europeos utilizan normalmente los europeos utilizan EMBL-BANKEMBL-BANK y los americanos y los americanos GenBankGenBank..

De De proteínasproteínas Bases de datos de secuencias de Bases de datos de secuencias de aminoácidosaminoácidos.. SwissprotSwissprot contiene secuencias anotadas o comentadas, es decir, cada contiene secuencias anotadas o comentadas, es decir, cada

secuencia ha sido revisada, documentada y enlazada a otras bases de secuencia ha sido revisada, documentada y enlazada a otras bases de datos. datos.

Enlace externo: Enlace externo: SwissprotSwissprot en el EBI en el EBI, , SwissprotSwissprot en en ExpasyExpasy TrEMBLTrEMBL por por Translation of EMBL Nucleotide Sequence DatabaseTranslation of EMBL Nucleotide Sequence Database incluye incluye

la traducción de todas las secuencias codificantes derivadas del (la traducción de todas las secuencias codificantes derivadas del (EMBL-BANKEMBL-BANK) y que todavía no han podido ser anotadas en ) y que todavía no han podido ser anotadas en SwissprotSwissprot. .

Enlace externo: Enlace externo: TrEMBLTrEMBL PIRPIR por por Protein Information ResourceProtein Information Resource está dividida en cuatro sub-bases está dividida en cuatro sub-bases

que tienen un nivel de anotación decreciente. que tienen un nivel de anotación decreciente. Enlace externo: Enlace externo: PIRPIR

ENZYMEENZYME enlaza la clasificación de actividades enyimáticas completa a las enlaza la clasificación de actividades enyimáticas completa a las secuencias de secuencias de SwissprotSwissprot. .

Enlace externo: Enlace externo: ENZYMEENZYME PROSITEPROSITE contiene información sobre la estructura secundaria de contiene información sobre la estructura secundaria de

proteínas, familias, dominios, etc. proteínas, familias, dominios, etc. Enlace externo: Enlace externo: PROSITEPROSITE

INTERPROINTERPRO integra la información de diversas bases de datos de integra la información de diversas bases de datos de estructura secundaria como PROSITE, proporcionando enlaces a otras estructura secundaria como PROSITE, proporcionando enlaces a otras bases de datos e información más extensa. bases de datos e información más extensa.

Enlace externo: INTERPRO Enlace externo: INTERPRO PDBPDB por por Protein Data BankProtein Data Bank es la base de datos de estructura terciaria 3-D es la base de datos de estructura terciaria 3-D

de proteínas que han sido cristalizadas. de proteínas que han sido cristalizadas. Enlace externo: PDBEnlace externo: PDB

COX-2 ADA

XOFKBP

De genomasDe genomas EnsemblEnsembl integra genomas eucariotas grandes, integra genomas eucariotas grandes,

por el momemto contiene genoma humano, por el momemto contiene genoma humano, ratón, rata, fugu, zebrafish, mosquito, ratón, rata, fugu, zebrafish, mosquito, Drosophila, Drosophila, C. elegansC. elegans, y , y C. briggsaeC. briggsae. . Enlace externo: Ensembl Enlace externo: Ensembl

Genomes serverGenomes server y y TIGRTIGR son portales con son portales con información o enlaces de todos los genomas información o enlaces de todos los genomas secuenciados por el momento, desde virus a secuenciados por el momento, desde virus a humanos. humanos. Enlace externo: Genome Server Enlace externo: Genome Server Enlace externo: TIGR Enlace externo: TIGR

WormbaseWormbase es el portal del genoma de gusano es el portal del genoma de gusano C. C. eleganselegans. . Enlace externo: Wormbase Enlace externo: Wormbase

FlybaseFlybase es el portal de la mosca del vinagre es el portal de la mosca del vinagre Drosophila melanogasterDrosophila melanogaster. . Enlace externo: FlybaseEnlace externo: Flybase

FEBRUARY 2001:

Consorcio Público

Celera Genomics NOVIEMBRE 2001 :

Ohio State University

Secuencia DNA Secuencia Proteína

Estructura 3DReconocimiento Molecular

Identificación genes

Comparación de secuenciasPredicción funcional, 3D

Mecánica clásicaDinámica MolecularDocking

Para recordarPara recordar

La bioinformática “sugiere” soluciones. La La bioinformática “sugiere” soluciones. La comprobación experimental es necesaria.comprobación experimental es necesaria.

La bioinformática puede “ahorrar La bioinformática puede “ahorrar trabajo”, comprobando teorías trabajo”, comprobando teorías in silicoin silico

La bioinformática permite hacer La bioinformática permite hacer experimentos imposibles.experimentos imposibles.

Aplicación en OncologíaAplicación en Oncología

PCR: p53, cmyc, PTEN, PCR: p53, cmyc, PTEN, QPCR: LMC, LLAQPCR: LMC, LLA Secuenciación: búsqueda de Secuenciación: búsqueda de

mutaciones Genes BRCA1 y BRCA2mutaciones Genes BRCA1 y BRCA2 FISH: Her2, Myc, EGFR, P53FISH: Her2, Myc, EGFR, P53 Microarreglos: Mamaprint aprobado Microarreglos: Mamaprint aprobado

por FDApor FDA

Sigamos Sigamos adelante…..adelante…..

GraciasGracias

BibliografíaBibliografía

www.agendia.comwww.agendia.com ASCO Educational Book ISSN ASCO Educational Book ISSN

15488748 43rd Annual Meeting June 15488748 43rd Annual Meeting June 1-5, 2007 Chicago.1-5, 2007 Chicago.

Molecular Biology of The Cell, Albert Molecular Biology of The Cell, Albert et al, Fourth edition. 2002. Garland et al, Fourth edition. 2002. Garland ScienceScience

Molecular and Cellular Biology. Molecular and Cellular Biology. Lodish et al. 5th Whfreeman. 2005.Lodish et al. 5th Whfreeman. 2005.

avances moleculares aplicados a la clínica dr. denis landaverde recinos oncólogo médico msc....

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