SIFAT BIOLOGI Aspergillus niger PENGHASIL ASAM SITRAT

Disusun oleh :

Nama : 1. Cicilia Bule Rinanda

2. Okvita Musdalifah

3. Ferli Madawvossi

Dosen Pengampu : Ir. Sri Wedhastri, M.S.

JURUSAN MIKROBIOLOGI PERTANIAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA

2014

SIFAT BIOLOGI Aspergillus niger PENGHASIL ASAM SITRAT

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Asam sitrat merupakan suatu asidulan yaitu senyawa kimia yang bersifat asam yang

ditambahkan pada proses pengolahan makanan dengan berbagai tujuan. Asidulan dapat bertindak

sebagai penegas rasa dan warna atau menyelubungi after taste yang tidak disukai. Penambahan

asam dapat menurunkan pH makanan sehingga menghambat pertumbuhan mikroorganisme

pembusuk.

Awalnya asam sitrat diperoleh dalam bentuk kristal melalui proses isolasi dari juice lemon

oleh Scheele pada tahun 1784. Lalu pada tahun 1880 Grimoux dan Adam mensintesis asam sitrat

dari glycerol. Dan pada tahun 1893 Wehmer mengindikasikan bahwa asam sitrat dapat diperoleh

melalui proses fermentasi larutan gula oleh beberapa jenis jamur. Hingga kini proses produksi

komerasial asam sitrat diperoleh melalui proses fermentasi. Asam sitrat biasanya diproduksi

dalam bentuk kristal monohidrat (C6H8O7.H2O), yang tak berwarna, tak berbau dan rasanya

asam. Mudah larut dalam air dingin daripada dalam air panas.

Mikroorganisme yang dapat menghasilkan asam sitrat cukup banyak. Diantara

mikroorganisme tersebut adalah Aspergillus niger, A. wentii, A. civiatus, Penicillium luteum, P.

citrinum, Mucor priformis, Paecilomyces divaricatum, Citromaeces pfefferianus, Candida

guilliermondii, Saccharomaecopsis lipolytica, Trichoderma viridae, Arthrobacter parraffimeus

dan Corynebacterium sp. Di antara mikroorganisme tersebut yang dipakai untuk produksi asam

sitrat adalah Aspergillus niger yang merupakan galur yang paling produktif.

Jamur Aspergillus niger digunakan untuk industri sudah sejak lama. Pada tahun 1919

pembuatan asam sitrat untuk industri sudah menggunakan jamur ini. Hasil sampingan lain yaitu

asam fumarat dan asam glukonit namun memiliki nilai ekonomi yang lebih rendah. Penelitian

terus dilakukan hingga pada tahun 1960, A. niger menjadi sumber pengawetan pada makanan

karena bermanfaat dalam pengemasan buah, pembuatan makanan serta bidang farmasi. Pada

bidang makanan dan minuman digunakan dalam makanan seperti minuman ringan, jus buah,

makanan pencuci mulut, selai, jeli, permen dan anggur. Pada bidang farmasi bermanfaat dalam

penyimpanan darah karena produksi besi serta sitrat. Pada bidang kosmetik dimanfaat sebagai

penghasil anti-oksidan, sedangkan pada industri lain dimanfaatkan sebagai detergen (pembersih),

penyamakan kulit, dan penyangga pH. Enzim yang dihasilkan antara lain pectinase, protease, dan

amyloglukosidase. Amyloglukosidase bermanfaat dalam pemecahan senyawa yang ada di pati

sehingga dapat dibuat menjadi sirup.

Penggunaan utama asam sitrat saat ini adalah sebagai zat pemberi cita rasa dan pengawet

makanan dan minuman, terutama minuman ringan. Kode asam sitrat sebagai zat aditif makanan

(E number) adalah E330. Garam sitrat dengan berbagai jenis logam digunakan untuk

menyediakan logam tersebut (sebagai bentuk biologis) dalam banyak suplemen makanan. Sifat

sitrat sebagai larutan penyangga digunakan sebagai pengendali pH dalam larutan pembersih

dalam rumah tangga dan obat-obatan.

B. Tujuan

1. Mengetahui sifat biologi dari Aspergillus niger.

2. Mengetahui cara mengaplikasi Aspergillus niger dalam penghasilan asam sitrat.

II. PEMBAHASAN

A. Klasifikasi dan Deskripsi Aspergillus niger

Klasifikasi Aspergillus niger adalah sebagai berikut :

Domain : Eukaryota

Kingdom : Jamur

Phylum : Ascomycota

Subpylum : Pezizomycotina

Class : Eurotiomycetes

Ordo : Eurotiales

Family : Trichomaceae

Genus : Aspergillus

Species : Aspergillus niger

Ekologi

Aspergillus niger adalah jamur berfilamen haploid dan merupakan mikroorganisme yang

biasanya ditemukan di lingkungan mesofilik umum seperti tanah, sampah, debu, cat, tanaman,

dan lingkungan udara tertutup serta daerah yang mengalami pembusukan. A. niger tidak hanya

jamur xerophilic (cetakan yang tidak memerlukan air bebas untuk pertumbuhan, bisa tumbuh di

lingkungan lembab), tetapi juga merupakan mikroorganisme tahan panas (mampu tumbuh pada

suhu tinggi). Karena properti ini, jamur filamen menunjukkan toleransi yang tinggi terhadap

suhu beku.

Bila ditumbuhkan pada medium buatan secara umum, koloni berwarna putih dan akan

berwarna hitam jika konidia sudah terbentuk. Umumnya, A. niger yang diisolasi melalui kultur

chemostat yang dapat menguji positif atau negatif untuk jamur. A. niger bersifat aerob dan

dipengaruhi suhu, aktivitas air dan pH terhadap pertumbuhan. A. niger dapat tumbuh pada

kisaran suhu 6oC-47oC. Tumbuh optimum pada suhu 35oC-37oC. Kisaran pH pada A. niger cukup

luas yaitu 1,4-9,8 dengan batas aktivitas air untuk pertumbuhan atau nilai Aw 0,88, yang relatif

tinggi dibandingkan dengan spesies Aspergillus lainnya.

Aspergillus niger tergolong jamur yang sifatnya tidak meracun bagi lingkungan sekitar.

Bila kondisi lingkungan tidak sesuai, maka jamur ini akan menghasilkan berbagai metabolit

sekunder tetapi hanya ochratoxin A yang tergolong mikotoksin, berbahaya bagi mikroorganisme

lain.

Metabolisme

Aspergilus niger merupakan jamur dari filum ascomycetes yang berfilamen, mempunyai

hifa berseptat, dan dapat ditemukan melimpah di alam. Koloninya berwarna putih pada Agar

Dekstrosa Kentang (PDA) 25 °C dan berubah menjadi hitam ketika konidia dibentuk. Kepala

konidia dari A. niger berwarna hitam, bulat, cenderung memisah menjadi bagian-bagian yang

lebih longgar seiring dengan bertambahnya umur. A. niger memiliki warna dasar berwarna putih

atau kuning dengan lapisan konidiospora tebal berwarna coklat gelap sampai hitam.

Dalam metabolismenya Aspergillus niger dapat menghasilkan asam sitrat sehinga jamur

ini banyak digunakan sebagai model fermentasi karena jamur ini tidak menghasilkan mikotoksin

sehingga tidak membahayakan. A. niger dapat tumbuh dengan cepat, oleh karena itu A. niger

banyak digunakan secara komersial dalam produksi asam sitrat, asam glukonat, dan pembuatan

berapa enzim seperti amilase, pektinase, amiloglukosidase, dan selulase.

Selain itu, Aspergillus niger juga menghasilkan gallic acid yang merupakan senyawa

fenolik yang biasa digunakan dalam industri farmasi dan juga dapat menjadi substrat untuk

memproduksi senyawa antioksidan dalam industri makanan.

Aspergillus niger dalam pertumbuhannya berhubungan langsung dengan zat makanan

yang terdapat dalam substrat, molekul sederhana yang terdapat disekeliling hifa dapat langsung

diserap sedangkan molekul yang lebih kompleks harus dipecah dahulu sebelum diserap ke dalam

sel, dengan menghasilkan beberapa enzim ekstra seluler seperti protease, amilase, mananase, dan

α-glaktosidase. Bahan organik dari substrat digunakan oleh Aspergillus niger untuk aktivitas

transport molekul, pemeliharaan struktur sel, dan mobilitas sel.

B. Asam Sitrat dan Produksinya

Asam sitrat diproduksi hampir secara eksklusif oleh fermentasi Aspergillus niger karena

hasil dari mikroorganisme ini ekonomis dan pembentukan produk samping yang tidak diinginkan

minimal. The Food and Drug Administration (FDA) telah mendaftar A. niger sebagai sumber

asam sitrat.

Asam sitrat merupakan hasil metabolisme yang dihasillkan melalui fermentasi. Asam sitrat

akan muncul jika beberapa nutrisi muncul tidak hanya saat konsentrasi tinggi (gula, keasaman,

oksigen terlarut) tapi juga pada level optimal (metal, nitrogen, dan fosfat).

Asam sitrat merupakan asam organik yang larut dalam air dengan cita rasa yang

menyenangkan dan  banyak digunakan dalam industri pangan. Kebutuhan dunia akan asam sitrat

terus meningkat dari tahun ke tahun dan produksi asam sitrat tiap tahun meningkat 2 – 3%.

Hingga sampai tahun 1920, semua asam sitrat dihasilkan dari lemon dan jus jeruk. Namun kini

asam sitrat juga dapat dihasilkan melalui fermentasi menggunakan mikroorganisme Aspergillus

niger, yaitu jamur yang digunakan secara komersial pertama kali pada tahun 1923. Guna

memenuhi permintaan yang terus meningkat, maka efisiensi proses fermentasi terus dipelajari.

Pengukuran kesetimbangan massa dipelajari agar dpat ditentukan banyaknya substrat yang

digunakan dan jumlah produk yang dihasilkan.

Dalam proses produksi asam sitrat yang sampai saat ini lazim digunakan, biakan jamur

Aspergillus niger diberi sukrosa agar membentuk asam sitrat. Setelah jamur disaring dari larutan

yang dihasilkan, asam sitrat diisolasi dengan cara mengendapkannya dengan kalsium hidroksida

membentuk garam kalsium sitrat. Asam sitrat di-regenerasi-kan dari kalsium sitrat dengan

penambahan asam sulfat.

Cara lain pengisolasian asam sitrat dari hasil fermentasi adalah dengan ekstraksi

menggunakan larutan hidrokarbon senyawa basa organik trilaurilamina yang diikuti dengan re-

ekstraksi dari larutan organik tersebut dengan air.

Proses fermentasi asam sitrat terdiri dari dua tahap. Pertama fase pertumbuhan miselium

dan kedua fase fermentasi pembentukan produk. Keduanya dikarakteristikkan oleh laju

penyerapan karbohidrat. Pada fase pertama digunakan untuk pembentukan miselium dan pada

tahap kedua karbohidrat diubah menjadi asam sitrat.

Faktor-faktor yang mempengaruhi produksi  asam sitrat secara fermentasi

Selain mikrobia sebagai komponen utama dalam fermentasi, faktor-faktor pendukung yang

perlu diperhatikan adalah komposisi nutrisi media, Mangan dan logam lainnya, pH, kondisi

lingkungan, tipe dan konsentrasi gula, pengaruh senyawa pengkhelat terhadap ion logam,

ammonium nitrat dan aerasi.

1.    Mikrobia

Saat ini produksi asam sitrat secara komersial menggunakan mutan Aspergillus niger.

Untuk meningkatkan kemampuan produksi sering dilakukan proses mutasi. Mutasi yang umum

dilakukan adalah dengan iradiasi ultraviolet (1,6 X 102 J/m2/dt) dan nitrosamine (100 mg/ml)

selama 5 – 45 menit. Kultur dipelihara dalam medium PDA.

2.    Komposisi Nutrisi Media

Media fermentasi untuk biosintesis asam sitrat terdiri dari substrat yang dibutuhkan untuk

pertumbuhan mikroorganisme, terutama terdiri dari substrat yang dibutuhkan untuk pertumbuhan

mikroorgaisme terutama sumber karbon, nitrogen dan fosfor. Selain itu air dan udara dapat pula

dimasukkan sebagai substrat fermentasi.

a. Sumber Karbon

Media yang sering digunakan sebagai sumber karbon adalah berbagai karbohidrat dan

limbah selulosa, inulin, kurma, molase tebu (digunakan dalam fermentasi kultur cair teraduk),

whey kedelai, whey keju, sukrosa, glukosa, fruktosa, metanol.

Whey dari industri pengolahan susu sering digunakan sebagai medium dasar. Whey

dapat ditambah sukrosa, glukosa atau fruktosa sekitar 5 – 10 % (b/v). Jika ditambah methanol

berkisar 1 – 5 %.  Riboflavin dapat ditambahkan sebesar 10 – 50 mg/L.

Molase yang digunakan untuk substrat fermentasi biasanya mengandung air 20%, gula

62 %, non-gula 10 % dan garam an-organik (abu) 8 %. Abu mengandung ion-ion seperti Mg,

Mn, Al, Fe dan Zn dalam jumlah yang bervariasi. Karena kandungan gula cukup tinggi maka

perlu diencerkan sehingga mengandung gula 25%. Larutan molase kemudian ditambah H2SO4

1N sebanyak 35 ml/L dan direbus selama ½ jam kemudian didinginkan, dinetralkan dengan

air kapur (CaO) dan dijernihkan semalam. Cairan supernatan yang jernih diencerkan hingga

kadar gula mencapai 15%. Selama fermentasi 144 jam dihasilkan asam sitrat sekitar 85 g/l,

berat sel kering 20 g/l dan gula yang dikonsumsi 91 g/l.

b. Sumber Nitrogen

Nitrogen juga mempengaruhi pembentukan asam sitrat karena nitrogen tidak hanya

penting untuk laju metabolit dalam sel tetapi juga bagi pembentukan protein sel. Jumlah

produksi asam sitrat mencapai maksimum jika konsentrasi ammonium nitrat sebesar 0,2%.

Peningkatan konsentrasi justru menurunkan jumlah asam yang dihasilkan dan jamur tumbuh

menyebar.

c. Sumber Fosfor

Sumber fosfat yang digunakan adalah trikalsium fosfat.

d. Konsentrasi ion Ferosianida

Konsentrasi ferosianida berpengaruh terhadap produksi asam sitrat. Penambahan

ferosianida dilakukan 24 jam setelah inokulasi sebanyak 200 ppm. Jumlah sel yang dihasilkan

berkurang dengan naiknya jumlah ferosianida.

e. Vitamin

Vitamin yang sering ditambahkan adalah riboflavin. 

3.    Proses Fermentasi

a. Fermentor

Dalam percobaan skala laboratorium sebaiknya digunakan Erlenmeyer 500 ml yang

diisi 100 ml medium. Masing-masing Erlenmeyer diinokulasi dengan suspensi spora dan

diinkubasi selama 20 hari pada suhu 300C. Fermentor stainless stell berkapasitas 15 liter diisi

medium 9 liter untuk pembuatan asam sitrat. 

b. Persiapan Kultur

Jika digunakan kultur stok Aspergillus niger maka kultur harus direaktivasi dan

dikultivasi dengan cara goresan pada petridish menggunakan medium padat PDA (Potato

Dextrose Agar) yang telah diasamkan dengan asam tartrate 10% dan diinkubasi selama 5 hari

pada suhu 250C. Konidia yang dibentuk kemudian dicuci dua kali dengan air destilat steril.

Suspensi konidia yang akan digunakan sebagai inokulum dalam proses fermentasi harus

mengandung 108 spora/ml.

Untuk menumbuhkan konidia Aspergillus digunakan medium molase 100 ml (gula

15%, pH 6,0) dalam Erlenmeyer 1 liter yang berisi glass beads dan telah disterilkan. 1 ml

suspensi konidia dari agar miring dipindahkan secara aseptis, kemudian diinkubasi pada 300 +

10C dalam inkubator dengan kecepatan gojogan 200 rpm selama 24 jam.

c. Jumlah Inokulum

Jumlah inokulum yang digunakan juga merupakan faktor yang penting untuk

diperhatikan. Jumlah inokulum sebesar 1% cukup baik untuk fermentasi dalam fermentor

teraduk.

d. Fermentasi

Inokulum yang telah dibuat dimaukkan dalam fermentor produksi sebanyak 5% (v/v).

inkubasi dilakukan pada suhu 300 + 10C selama 144 jam. Kecepatan agitasi adalah 200 rpm

dengan laju aerasi 1,0 – 4,0 vvm. Untuk mengendalikan terbentuknya buih secara berkala

dilakukan penambahan minyak silikom steril.

e. Waktu Fermentasi

Waktu fermentasi yang maksimum untuk fermentasi asam sitrat tergantung kondisi

fermentasi dan organism yang digunakan. Penggunaan A. niger dengan substrat molase

embutuhkan waktu 144 jam setelah inokulasi. 

f. Suhu

Suhu medium fermentasi merupakan salah satu faktor yang penting dalam produksi

asam sitrat. Suhu 300C adalah suhu yang paling baik. Jika suhu medium rendah, aktivitas

enzim jug rendah sehingga mempengaruhi produksi asam tetapi jika suhu meningkat di atas

300C, biosintesis asam sitrat akan menurun dan terjadi akumulasi produk samping seperti

asam oksalat.

g. pH

Pengaturan pH penting bagi keberhasilan proses fermentasi. Untuk fermentasi asam

sitrat pH optimum adalah 6,0. Penurunan pH menyebabkan produksi asam sitrat berkurang.

Hal ini disebabkan pada pH rendah ion ferosinida lebih toksik bagi pertumbuhan miselium.

Pada pH yang tinggi terjadi akumulasi asam oksalat.

Proses fermentasinya:

Larutan gula dari berbagai sumber telah digunakan sebagai bahan baku untuk pembuatan

asam sitrat dalam skala industri, tetapi sukrosa dan glukosa tetap merupakan bahan baku yang

paling mudaj dan paling baik kemudian diikuti oleh maltosa dan molase (tetes).

Mekanisme pembentukan asam sitrat seperti dinyatakan dengan siklus Krebs atau siklus

asam trikarboksilat, yaitu bahwa asam piruvat yang diperoleh dari glukosa menghasilkan Acetil

CoA yang berkondensasi dengan asam oxalo-asetat yang telah terbentuk dalam siklus

menghasilkan asam sitrat.

Asam sitrat merupakan senyawa antara pada siklus krebs. Lintasan reaksi karbolik yang

mendahului pembentukan asam sitrat ini diantaranya adalah lintasan glikolisis (Embden-

Meyerhof Parnas) dan lintasan Entner Doudoroff yang menyediakan senyawa antara asam

piruvat yang merupakan senyawa kunci dalam metabolisme sel. Sebagian besar (80%) dari

glukosa diubah menjadi piruvat melalui lintasan glikolisis. Piruvat akan mengalami

dekarboksilasi dan berkaitan dengan koenzim A membentuk asetil KoA dan selanjutnya masuk

ke dalam siklus krebs dengan bantuan enzim piruvat karboksilase yang mengubah piruvat

menjadi oksaloasetat.

Pada Aspergillus niger fosfoenol piruvat dapat diubah langsung menjadi oksaloasetat

(tanpa melalui piruvat) oleh enzim fosfenol piruvat karboksilase. Reaksi tersebut membutuhkan

ATP sebagai sumber energi, Mg2+ atau Mn2+ dan K+ atau NH4+.

Apabila sumber karbon bukan glukosa, tapi misalnya asam asetat atau senyawa alifatik

berantai panjang (C-9, C-23), maka isositrat liase terinduksi sehingga isositrat diubah menjadi

malat oleh malat sintesa. Rangkaian reaksi melalui glioksilat. Bila glukosa ditambahkan maka

siklus tersebut terhambat.

Diduga bahwa terjadinya akumulasi asam sitrat ini adalah sebagai akibat dari adanya

kekurangan enzim disebabkan kurangnya unsur-unsur nutrisi. Kekurangan-kekurangan nitrogen,

fosfat, mangan, besi dan seng adalah unsur-unsur yang sering disebut-sebut. Apabila kadar

logamnya tinggi, maka untuk mengurai biasanya tetes diolah terlebih dahulu, yaitu dengan

penambahan Kalium ferrosianida atau dengan cara pertukaran ion. Media untuk produksi asam

sitrat harus menyediakan semua kebutuhan zat gizi mikroorganisme, yaitu meliputi sumber

karbon, nitrogen dan mineral.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2011. Aspergillus spp. pathogen safety data sheet-infectious substances. <

http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/aspergillus-spp-eng.php>. Diakses pada

tanggal 26 Maret 2014.

Olempska-Beer, Z. 2008. Asparaginase from Aspergillus niger expressed in A. niger chemical

and technical assesment (CTA). P: 1-7.

Papagianni, M. 2007. Advances in citric acids fermentation by Aspergillus niger: biochemical

aspects, membrane transport, and modeling. Biotechnology Advances. 25: 244-263.

Schuster, E., N. Dunn-Coleman, J. C. Frisvad, and P. W. M. van Dijick. 2002. A review-On the

safety of Aspergillus niger. Applied Microbiol Biotechnol. 59: 426-435.

Skema pembentukan asam sitrat