Cursurile 12-13 Aspecte clinice ale enzimologiei Introducere Daca la inceputul secolului trecut se cunosteau doar o serie de medicamente care proveneau din medicina populara (digitalis - stimulator al inimii, extras din planta numita degetel-rosu, quinine utilizat pentru tratarea malariei, extras din scoarta si radacinile arborelui Cinchona) in ultimii 50-60 de ani interesul pentru enzime a crescut considerabil (atat masurarea activitatii acestora cat si utilizarea enzimelor purificate in scopuri clinice). Inainte de 1940 numai activitati enzimelor hidrolitice (lipaze, amilaze, fosfataze, tripsina si pepsina) erau masurate in scopuri clinice. In zilele noastre mai mult de 25% din munca unui laborator de analize clinice consta in diagnosticarea enzimelor (mai mult de 20 de enzime). Descoperirea in anii 50 a unei corelatii intre activitatea aminotransferazelor si dehidrogenazelor din ser si bolile de inima sau ficat a determinat o accentuare a cercetarilor in aceasta directie. Mai mult, izolarea si purificarea unor enzime a permis utilizarea acestora pentru stabilirea concentratiei optime de substrat (agent terapeutic). Folosirea anticorpilor monoclonali cuplati cu enzimele (purificate in prealabil) a permis imunodetectia unui numar mare de compusi biochimici.

Determinarea activitatilor enzimatice pentru diagnosticarea clinica La masurarea activitatii enzimatice in scopuri de diagnosticare clinica trebuie sa se tina cont de urmatoarele conditii:

a) enzima trebuie sa fie prezenta in sange, urina sau alte tesuri (fluide) accesibile (numai in cazul in care ceea ce trebuie diagnosticat nu poate fi determinat printr-o alta maniera);

b) activitatea enzimei poate fi masurata usor (eventual automatizarea procesului); c) daca exista corelatii dintre nivelul de activitate al enzimelor si starea patologica a

individului; d) enzima sa fie suficient de stabila pentru o eventuala reanaliza.

Serul este in fluid folosit frecvent pentru masurarea activitatii enzimatice a unor enzime. Urina poate fi folosita pentru estimarea concentratiei unor enzime eliberate de rinichi. Enzimele care se gasesc in plasma pot fi divizate in doua categorii:

1. Enzimele specifice plasmei enzime care sunt sintetizate in ficat si sunt eliberate constant in plasma. Ele prezinta interes clinic in situatia in care concentratia lor in plasma este mai scazuta fata de valorile normale. Exemple din aceasta categorie sunt enzimele implicate in coagularea sangelui, lecitin-colesterol-acil-transferaza (LCAT), pseudocolinesteraza, ceruloplasmina, renina

2. Enzimele nespecifice plasmei, care nu prezinta functii fiziologice in plasma. Aceste enzime care nu poseda cofactorul (amilaze, lipaze sau fosfataze si enzimele asociate cu metabolismul celular) se gasesc in plasma in concentratii mult mai mici decat cea din tesuturi.

Ruperea unui tesut sau prezenta unei cantitati prea mari de enzima in interiorul celulei poate fi depistata prin masurarea activitatii enzimatice din ser. In cazul unor boli tesuturile pot deveni inflamate sau necrotice (necroza este moartea unei portiuni dintr-un tesut sau organ). In ultima situatie este posibila o eliberare completa a continutului de

enzime (cu activitate scazuta) din celulele moarte. Inflamarea tesuturilor poate determina o schimbare a permeabilitatii celulelor, astfel incat eliberarea enzimei se face preponderent din citozol si nu din organitele celulare. De exemplu activitati mari ale alanin- si aspartat-aminotransferazelor sunt inregistrate in cazul hepatitelor virale, unde hepatocitele sunt afectate. O reducere a activitatii unor enzime plasmatice poate fi consecinta unor modificari metabolice. Colinesteraza este o enzima plasmatica, produsa de celulele ficatului. In cazul hepatitelor activitatea colinesterazei este redusa fapt care indica imbolnavirea celulelor hepatice.

Enzime indicator si specificitatea lor pentru diverse organe Organul/celula Enzima Specificitatea Cai biliare Leucin-amino-peptidaza

-Glutamil-transpeptidaza 5-nucleotidaza Fosfataza alcalina Ceruloplasmina

+++ +++ +++ ++ ++

Eritrocite Fosfataza acida totala Lactat dehidrogenaza totala Glutamat-oxalacetat-transaminaza

++ + +

Ficat Ornitin-carbamil-transferaza Colinesteraza -Glutamil-transpeptidaza Glutamat-piruvat-transaminaza Glutamat-oxalacetat-transaminaza Lactat dehidrogenaza totala Aldolaza

+++ +++ +++ ++ + + +

Glande salivare Amilaza ++ Muschi cardiac 2-Hidroxi-butiril dehidrogenaza

Creatin kinaza Lactat dehidrogenaza totala Glutamat-oxalacetat-transaminaze

++ ++ + +

Muschi scheletici Creatin kinaza Aldolaza Lactat dehidrogenaza totala Glutamat-oxalacetat-transaminaze Glutamat-piruvat-transaminaza

++ + + + +

Oase Fosfataza alcalina ++ Pancreas Lipaza

Amilaza Glutamat-oxalat-trasaminaza Leucin-amino-peptidaza

+++ ++ + +

Prostata Fosfataza acida +++ Stomac Pepsinogen +++

Adaptare din: Klinische Chemie: Theorie, Praxis, Interpretation. Colombo, .J P. und Tichterich, R.

Enzimele nespecifice plasmei pot fi divizate in doua subgrupe: A. Enzime de secretie provin din glandele exocrine si pancreas, sunt secretate si

actioneaza la nivelul tubului digestiv. Cele mai cunoscute enzime din aceasta categorie sunt: amilaza, lipaza, tripsina, pepsinogenul. In ciuda faptului ca secretia lor este ridicata aceste enzime sunt rapid eliminate prin canalele excretoare, in tractul gastrointestinal, bila, urina avand o concentratie scazuta si constanta. In situatia in care o cale de excretie

este blocata, sau daca eliberarea in lichidul extracelular este brusc accelerata, sau rata de producere este crescuta, concentratia acestor enzime in plasma creste semnificativ.

B. Enzime celulare actioneaza in celulele din care provin, unde apar in concentratie ridicata. Daca membrana celulara este intacta, aceste enzime sunt absente sau in cantitati infime in lichidul extracelular si plasma. Prezenta lor in plasma poate fi pusa pe seama proceselor de uzura si diviziune celulara, sau de perturbare a proceselor energetice (scaderea ATP din celule influenteaza permeabilitatea membranei celulare la cresterea efortului muscular se constata o crestere moderata a creatin kinazei, CK). Dupa ce enzimele celulare au trecut in plasma, activitatea lor scade rapid, avand timp de injumatatire de cateva ore. De exemplu aspartat aminotransferaza (AST) isi pierde jumatate din activitate in circa 50 de ore. Scaderea activitatii plasmatice a enzimelor poate fi datorata unuia din umatoarele mecanisme:

- modificarile structurale ale enzimelor la trecerea prin membranele celulare (gruparile SH din CK sufera un proces de oxidare);

- enzimele cu masa moleculara mica (-amilaza) se elimina pe cale urinara, iar fosfataza alcalina pe cale biliara;

- majoritatea enzimelor sunt indepartate din plasma printr-un proces de captare in macrofage (celule albe ce capteaza particule din mediul inconjurator).

Viteza cu care enzimele patrund din celule in lichidul interstitial si de acolo in plasma si limfa, precum si viteza de injumatatire difera de la o enzima la alta. Acest lucru prezinta importanta clinica pentru cunoasterea intervalului de timp la care trebuie recoltate probele de sange. De exemplu, activitatea AST-ului creste la 4-8 ore de la producerea infarctului miocardic si revine la valoarea normala dupa 3-6 zile. LDH-azele patrund mai greu in torentul circulator, avand valori ridicate dupa 8-12 ore (se mentin 3-6 zile). Pentru scopurile diagnostice se recomanda cuantificarea acelor enzime care au o concentratie mai mare in celula, specificitate pentru anumite organe si a caror determinari de activitate sunt usor de efectuat. In realitate, se cunosc putine enzime care sunt specifice in totalitate pentru un anumit tesut (fosfataza acida in prostata, acetil colin esteraza in eritrocite). Majoritatea enzimelor exista sub forma izoenzimelor, fapt care determina modificari ale activitatii enzimatice in diferitele tesuturi. Din acest motiv, pentru fiecare organ trebuie cunoscut acel set de enzime caracteristice, intrucat unele dintre acestea nu au specificitate absoluta pentru un anumit organ. In majoritatea cazurilor in ser apar mai multe enzime, izoenzimele, care au aceeasi activitate catalitica dar secventa diferita (deoarece sunt codate de gene diferite). Cel mai adesea organe diferite sintetizeaza diferite izoenzime: in inima se afla preponderent o izoenzima CKMB (a creatinin kinazei) pe cand o alta forma izoforma (CKMM) este localizat indeosebi in muschi. Din acest motiv determinarea izoenzimelor joaca un rol deosebit in diagnoza, permitand identificarea organului bolnav. In clinica, determinarea izoenzimelor creatin kinazei si lactat dehidrogenazei este un indicator al bolilor de inima sau muschi, in timp ce fosfataza alcalina este un indicator al bolilor ficatului, cailor biliare, oaselor sau in depistarea tumorilor.

Masurarea activitatii enzimatice Pentru masurarea activitatii enzimatice a unor enzime din ser trebuie sa avem in

vedere reactia chimica mediata de aceste proteine.Viteza de reactie este o masura a

c = Al

Activitatea enzimatica = modificaritimp

= cmin

= Amin l

Activitatea pe litru ser Volumul total din cuvaVolumul de enzima

= Amin l

reactiei enzimatice. Pentru fiecare test enzimatic este necesar un control riguros al unor anumiti parametri (pH, temperatura, prezenta unor ioni metalici-Ca2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ sau a unor compusi tiolici respectiv a unei concentratii optime de substrat), care sunt specifici pentru fiecare enzima. Majoritatea testelor enzimatice se efectueaza la concentratii ale substratului care sa permita saturarea enzimei. Viteza maxima, vmax , este o masura a cantitatii de enzima. Unitatea de masura pentru activitatea enzimatica este U. 1U este cantitatea de enzima care in conditii optime experimentale transforma 1 mol de substrat pe minut. Pentru ser activitatea enzimatica este exprimata in U/L. O alta unitate de masura pentru activitatea enzimatica este katalul. 1Katal reprezinta activitatea catalitica echivalenta cu transformarea unui mol de substrat pe secunda. 1U/L = 16.67 nKat/L (nKat = 10-9 mol/s)

Determinarea activitatii catalitice se face cu ajutorul unui test optic. Modificarea concentratiei substratului in decursul reactiei enzimatice poate fi determinata pe baza modificarii absorbantei. Prin intermediul legii Lambert-Beer poate fi calculata concentratia:

unde: A - absorbanta; - coeficient molar de extinctie; l lungimea cuvei; c concentratia.

In diagnosticarea clinica activitatea enzimatica din ser se exprima in U/L si se calculeaza astfel.

Pentru calcularea activitatii enzimatice este necesara cunoasterea volumului cuvei respectiv al probei si lungimea de unda la care absoarbe un compus (format sau consumat in decursul reactiei enzimatice). Dat fiind faptul ca volumul cuvei este 1 mL expresia de sus trebuie inmultita cu factorul 1000.

Activitatea enzimatica se poate calcula si in mol min-1 L-1. In comparatie cu metodele bazate pe absorbtie (inclusiv turbidimetrice)

determinarile fluorimetrice prezinta o sensibilitate crescuta (cu circa doua ordine de magnitudine), dar aceste metode sunt mult mai delicate (datorita posibilelor interferente; necesita reactivi cu puritate deosebita). Limitarea metodelor fluorimetrice este data in special de numarul relativ mic de compusi mici (fluorofori) care prezinta fenomenul de emisie. In conformitate cu teoria, in momentul in care o molecula absoarbe fotoni, unul dintre electronii acesteia trece pe un nivel energetic superior (stare excitata). La revenirea in starea fundamentala molecula emite lumina. Datorita pierderilor de energie, lumina emisa are intotdeauna lungimea de unda mai mare decat aceea a luminii excitate.

Dintre compusii naturali si metaboliti doar cativa (flavinele, triptofanul-respectiv proteinele in care este prezent acest aminoacid) prezinta emisie detectabila. Acizii nucleici, nucleozidele, nucleotidele (AMP, ATP) sau NAD(P) nu prezinta emisie, dar

formele cofactorilor redusi (NAD(P)H) emit lumina. Din acest motiv unele teste enzimatice pentru dehidrogenaze pot fi efectuate pe baza acestor proprietati. Alaturi de compusii mentionati, un numar restrans de metaboliti (acidul antranilic, acizii biliari sau proteina fluorescenta) prezinta emisie semnificativa. Pentru a utiliza aceasta metoda pentru o serie mai larga de aplicatii se folosesc cromofori artificiali (fluoresceina, etc).

O particularitate a fluorescentei este aceea ca intensitatea si maximul picului de emisie al unei molecule depinde de polaritatea mediului in care aceasta se afla. Astfel, dupa legarea covalenta sau necovalenta a altor componente (de exemplu substrat) sau a enzimei, spectrele de fluorescenta pot avea profile diferite. Un exemplu il constituie umbeliferona (7-hidroxi-cumarina) care prin atasarea la lipide sau carbohidrati (cu rol de substrat) poate fi utilizata la determinari enzimatice in care scindarea substratului poate fi vizualizata fluorimetric. De asemenea, masuratorile fluorimetrice pot servi la studiul modificarii conformatiilor enzimei dupa legarea substratului (ligandului).

Principalele enzime plasmatice cu valoare diagnostica Lactat dehidrogenaza (LDH) Se gaseste in cantitati mari in muschiul striat, ficat, miocard, rinichi si in

ganglionii limfatici si in cantitati mai reduse in pancreas, eritrocite si plamani. Lactat dehidrogenaza exista intr-o varietate de combinatii posibile a celor 2 subunitati si : 4, 3, 22, 3 si 4). Cele cinci izoenzime ale LDHazei sunt repartizate diferit in tesuturi. Daca LDH-1 predomina in muschiul cardiac, LDH-5 are o pondere mai mare in ficat si muschii scheletici. Valoarea diagnostica specifica este data de modificarile izoenzimatice. Astfel, cresteri ale LDH-1 si LDH-2 sugereaza existenta unui infarct miocardic sau a unei anemii, iar LDH-4 si LDH-5 in leziunile hepatice si procesele neoplazice (care apar in proliferarea anormala a celulelor-tumori). Determinarea activitatii LDH se bazeaza pe transformarea NADH in NAD+ in prezenta substratului (piruvat). Viteza de oxidare a NADH este proportionala cu activitatea LDH. Distributia izoenzimelor poate fi analizata prin electroforeza (LDH, fosfataza alcalina, creatin kinaza), specificitatea substratului (fosfataza acida), stabilitatea termica (LDH = lactat dehidrogenaza; formele LDH-4 si LDH-5 sunt mult mai stabile termic), inhibitie (piruvatul inhiba LDH-1 mai puternic decat LDH-5 ). Izoenzimele LDH pot fi separate din ser prin electroforeza pe folii de acetat de celuloza, in gel de amidon, agar, poliacrilamida si pot fi vizualizate printr-o reactie de culoare. In plus, anticorpii

monoclonali (vezi technica Western Blot) pot fi utilizati la detectia izoenzimelor. De exemplu, se pot obtine unii markeri (indicatori) tumorali pentru fosfataza acida (din prostata), fosfataza alcalina (din placenta) sau deoxinucleotid transferaza.

Masurarea activitatii enzimatice nu constituie o evidenta suficienta pentru diagnosticarea bolilor si de aceea aceasta se face impreuna cu stabilirea unor simptome sau a altor tipuri de analize.

Enzimologia clinica in diagnosticarea diferitelor bolilor Enzimele cele mai utilizate in diagnosticarea bolilor de ficat sunt aspartat

aminotransferaza (din ser), alanin aminotransferaza, fosfataza alcalina si -glutamil-transferaza. Uneori sunt masurate si activitatile (sau modalitatea in care sunt repartizate izoenzimele) lactat sau izocitrat dehidrogenazelor.

Aminotransferazele care catalizeaza urmatoarea reactie sunt analizate prin cuplarea cu reactiile malat sau lactat dehidrogenazei, reactii in care are loc oxidarea NADH la NAD+ (observata la 340 nm):

Piruvatul rezultat din reactia enzimatica poate fi dozat colorimetric in mediu alcalin cu 2,4-dinitrofenilhidrazina cu formarea hidrazidei corespunzatoare.

Cele doua amino-transferaze sunt enzime care participa la metabolismul din interiorul celulelor hepatice dar apar in cantitati reduse in miocard , musculatura striata sau rinichi. Aceste enzime sunt eliberate din ficat cand unele celule devin necrotice (de exemplu in hepatite toxice sau ciroza) si pot fi monitorizate in ser in decursul timpului pentru a urmari evolutia bolii.

Aspartat aminotransferaza (AST) se gaseste in proportie de 60% in citoplasma si 40% in mitocondrii. Cresterea moderata (de pana la 10 ori) a concentratiei enzimei poate fi asociata cu hepatita cronica sau medicamentoasa, ciroza sau icter si unori cu miocardii sau distrofii musculare. Cresteri semnificative (concentratii de 10-100 ori mai mari decat valorile normale) pot fi observate in cazul infarctului miocardic.

Cresteri relevante (de 10-100 ori) ale concentratiei alanil aminotransferazei (ALT) sugereaza existenta unei hepatite virale acute sau a unei necroze toxice a ficatului. Cresteri moderate indica aceleasi patologii cu cele date de AST.

Fosfataza alcalina Fosfataza alcalina este o enzima care poseda un domeniu membranar care este

frecvent intalnita in tesuturi si organe. Distributia relativa a acestei enzime in organe este urmatoarea placenta > rinichi > oase > ficat , rinichi si splina. Enzima este o glico-proteina, care poate exista in diferite forme glicozilate, si are doi ioni de zinc pe molecula. Mai mult, alaturi de aceste forme enzima poate fi prezenta prin intermediul formelor izoforme. In serul uman fosfataza alcalina se afla sub forma unui amestec de izoenzime care provin din urmatoarele surse: intestin, oase, placenta (apare in ser numai in decursul ultimelor luni de sarcina) sau formele hepatobiliare. In scopuri diagnostice se analizeaza aceste izoenzime (cu exceptia formelor hepatobiliare) prin electroforeza. Modificarile patologice ale acestei enzime pot fi folosite la diagnosticarea bolilor de ficat (in special a hepatitelor prin masurarea raportului activitate fosfataza alcalina/activitate

alanin amino-transferaza), a unor afectiuni osoase (rahitism, osteomalacie), cancerelor (pulmonare in care incidenta izoenzimei placentare este ridicata-izoenzima Regan), boala Hodkin, sindromul Fanconi, boli ale intestinului sau infectii bacteriene abdominale. Prin inactivare (incalzire la 65 C, sau prin denaturare cu uree) izoenzima din placenta ramane stabila, in timp ce celelalte forme sunt inactivate. Aceasta izoenzima poate apare in special in cazul diferitelor tumori. Fosfataza alcalina catalizeaza reactia de clivare a fosfatului din esterii fosforici la pH alcalin:

p-Nitrofenil fosfatul este un substrat cromogenic pentru majoritatea fosfatazelor (alcalina, acida, fosfatazele tirozinei sau serinei/treoninei). Reactia conduce la p-nitrofenol, care este un produs galben usor masurabil la 405 nm la un spectrofotometru. pHul optim al enzimei de provenienta bacteriana este 8, iar pentru acelea extrase din mamifere este mai ridicat (9-10). In plus reactia poate fi utilizata si in tehnica ELISA in care fosfataza alcalina este conjugata cu cel de-al doilea anticorp.

-Glutamil-traspeptidaza (GGT) -Glutamil-traspeptidaza este o glicoproteina (are 20% zaharuri). Enzima poate fi

glicozilata in diverse maniere si este raspandita in diverse organisme: plamani, pancreas, ficat, glandele mamare, ficat, intestin, plamani, splina, creier, inima, glanda tiroida si maduva spinarii. Activitatea maxima la om se manifesta in tubulii proximali si in nefroni (unitate functionala a rinichiului), precum si in epiteliul caii biliare intrahepatice. Enzima apare in tesuturile umane atat in stare libera cat si in stare legata (la suprafata celulei). Forma solubila se regaseste in ser sau in urina. In forma legata enzima transfera un rest glutamil de pe glutation pe un aminoacid, care se gaseste pe suprafata exterioara a plasmei membranare. Glutamil-aminoacidul este trecut prin membrana dupa care restul glutamil este indepartat cu ajutorul -glutamil-ciclotransferazei si este transformat in 5-oxoprolina. In acest mod aminoacizii pot fi transportati in celula. O crestere a activitatii acestei enzime in ser poate sugera boli de ficat, pancreas sau a cailor biliare. De asemenea, in cazul hepatitelor acute (A si B) se constata o creste a concentratiei -glutamil-traspeptidazei, dar nu mai mare decat cea a transaminazelor. In cazul hepatitelor cronice alcoolice valorile concentratiilor cresc vertiginos (de pana la 10 ori). In cazul pancreatitelor acute valorile concentratiilor enzimei sunt ridicate pentru un timp mai scurt. Cuantificarea acestei enzime din plasma poate permite o diferentiere dintre bolile de ficat si cele ale oaselor (in aceasta situatie valorile concentratiei -glutamil-traspeptidazei raman neschimbate).

Colinesterazele

Colinesterazele sunt enzime larg raspandite atat tesuturi cat si in plasma sau alte fluide din corp. In functie de specificitatea lor pentru substrat si de susceptibilitatea pentru anumiti inhibitori se disting doua clase de colinesteraze: acetil-colinesteraza (ACE) si butilil-colinesteraza (BCE sau pseudocolinesteraza). ACE hidrolizeaza acetil-colina mai rapid comparativ cu alti colinesteri si are activitate mai mica pentru butiril-colina. Dimpotriva, BCE actioneaza preferential asupra substratului butiril-colina, dar hidrolizeaza si acetilcolina. Distributia celor doua enzime in tesuturi este diferita: ACE este abundenta in creier, muschi si membrana eritrocitara, in timp ce BCE are activitate mare in ficat, intestin, inima, rinichi si plamani. Multe mamifere (om, cal, soarece) prezinta o activitate mare a BCE in plasma, in timp ce la sobolani activitatea acestei enzime este mai redusa comparativ cu BCE. ACE si BCE prezinta 65% din secventa polipeptidica similara si situsuri catalitice asemanatoare . Principala functie a ACE este hidroliza rapida a neurotransmitatorului acetilcolina la nivelul sinapselor colinergice si este una dintre cele mai rapide enzime cunoscute.

Pseudocolinesteraza serica (BCE) este o enzima secretata activ in plasma indeosebi de catre ficat. Scaderea concentratiei acestei enzime poate fi asociata cu

insuficiente hepatice (hepatite, ciroze), in intoxicatiile cu compusi organofosforici sau in cazul unor pacienti cu denutritie proteica grava. Cresteri ale concentratiei acestei enzime apar in cazul sindromului nefrotic, in perioada de vindecare a unei hepatite, precum si la obezi si diabetici. Activitatea enzimei (si implicit cantitatea acesteia) se poate determina prin cuplarea reactiei enzimatice cu o reactie colorimetrica. In decursul reactiei enzimatice enzima accelereaza reactia de hidroliza a butiril-tiocolinei la tiocolina. Produsul rezultat reactioneaza cu DNTB (acid 5, 5-ditiobis-2-nitrobenzoic) conducand la un produs galben:

BCE este o enzima care are un rol important in detoxifiere. Din acest motiv BCE are importanta farmaceutica si toxicologica deoarece hidrolizeaza medicamentele de tip esteric si capteaza neuroinhibitorii organofosforici inainte de a atinge tinta sinaptica.

Evidentierea sau monitorizarea infarctului miocardic constituie un exemplu al aplicarii metodelor enzimatice in stabilirea bolilor de inima. In infartul miocardic artera coronariana este obstructionata, fapt care conduce la distrugerea ireversibila sau la necroza tesutului inimii. Enzimele (creatin kinaza, aspartat aminotransferaza si lactat dehidrogenaza) sunt eliberate din tesuturile necrotice in plasma.

Creatinfosfo kinaza (CK), enzima care nu este intalnita in ficat (vezi aspartat aminotransferaza si lactat dehidrogenaza), poate fi utilizata in diferentierea dintre bolile de inima si cel de ficat. Enzima poate exista sub forma a trei izoenzime: CK/MM de origine musculara si miocardica, CK/BB localizata in tesutul cerebral si CK/MB provenita doar din miocard. Nivelul izoenzimelor creatin kinazei (din muschii scheletici sau muschii cardiaci) pot indica distrugerea tesutului inimii din diferiti pacienti.

Aceasta enzima catalizeaza formarea ATPului din creatin fosfat si ADP, inactivandu-se foarte repede prin oxidarea gruparilor SH. In serul, din plasma sanatoasa, activitatea creatin kinazei (CKMM) scade cu 94-98%. Aceste enzime trebuie mai intai activate timp de cateva minute prin adaugarea unor compusi tiolici (ditiotreitol sau N-acetil-cisteina).

Cresterea concentratiei ale CK/MB pot indica un risc ridicat pentru un infarct miocardic pe cand cresterea concentratiei CK/BB pot indica existenta unui traumatism cerebral sau a unui accident cerebral vascular. Cantitatea de enzima poate fi determinata prin dozarea colorimetrica a fosfatului cu albastru de molibden sau prin intermediul unor reactii enzimatice cuplate.

-Amilaza este o enzima care hidrolizeaza legatura 1,4--glicozidica din amiloza si amilopectina. La oameni enzima se afla intr-o varietate de tesuturi, dar concentratiile cele mai mari se afla in pancreas si glandele salivare. La oamenii sanatosi activitati reduse ale amilazei sunt inregistrate in ser sau urina. Cresterea pronuntata a activitatii amilazei (de 20-30 de ori) se intalneste in cazul pancreatitelor acute (hemoragice). In acest caz concentratia amilazei din ser creste in prima zi dupa care scade in zilele urmatoare. Activitatea amilazei din urina poate creste moderat in cazul unor inflamatii ale glandelor salivare, ulcerului perforat, administrarii de narcotice.

Lipaza pancreatica degradeaza trigliceridele in digliceride, in monogliceride si ulterior sunt transformate in glicerina si acizi grasi. In pancreatita acuta activitatea lipazei se mentine mai mult timp decat a amilazei. Activitatea enzimei se poate determina prin metoda turbidimetrica (citirea la 400 nm bazata pe conversia trigliceridelor la mono- sau digliceride mai solubile) sau prin metode colorimetrice.

Fosfataza acida este o enzima cu specificitate scazuta a carei substrate (fiziolo-gice) nu sunt cunoscute si care are o activitate optima la pH 4,0-5,5. Enzima se intalneste in cantitati mari prostata si in cantitati mult mai mici in ficat, splina, rinichi, eritrocite,

trombocite si glandele endocrine. Fractiunea prostatica a fosfatazei acide este inhibata de L-tartrat ceea ce permite dozarea diferentiata a acestei fractiuni in scopul depistarii carcinomului prostatei. In schimb, formaldehida inhiba izoenzimele eritrocitare si trombocitare. Aproximativ o treime din cantitatea de fosfataza acida provine din prostata. Cresterea valorilor fosfatazei trombocitare indica posibilitatea existeintei unei embolii pulmonare, trombocitozelor. Stabilitatea enzimei este redusa si de aceea activitatea sa trebuie masurata la putin timp dupa colectarea probelor de ser. In laborator cantitatea de fosfataza alcalina se poate estima prin reactia de hidroliza a p-nitrofenil-fosfatului in mediu acid, sau prin mobilitate electroforetica.

Detectia si semnificatia unor deficiente enzimatice Erorile genetice care au uneori drept consecinta o activitate enzimatica precara

sunt cunoscute, desi frecveta acestor erori este sub 0,01%. De exemplu, fenil-cetonuria este cauzata de lipsa unei enzime, fenil-alanil 4- monooxigenaza, care catalizeaza una din etapele din metabolismul fenil-alaninei.

In cazul unui individ normal fenil-alanina este produsa din degradarea proteinelor sau asimilata in decursul alimentatiei si este scindata la acidul homogentisic (dupa ce este transformata in tirozina). In lipsa monooxigenazei scindarea fenilalaninei se face prin intermediul unei cai metabolice secundare (via acidul fenil-piruvic). Fenilcetonuria este asociata cu retardarea mentala. Tulburarile mentale pot fi prevenite daca pacientii urmeaza o dieta in care cantitatile de fenilalanina sunt reduse substantial (paine cu continut redus de proteine, cereale si produse vegetale). Majoritatea tarilor au un program de depistare la nastere a cazurilor de fenilcetonurie.