Aspecte Clinice Ale Enzimologiei

Download Aspecte Clinice Ale Enzimologiei

Post on 24-Sep-2015

219 views

Category:

Documents

3 download

Embed Size (px)

DESCRIPTION

medicina

TRANSCRIPT

<ul><li><p> Cursurile 12-13 Aspecte clinice ale enzimologiei Introducere Daca la inceputul secolului trecut se cunosteau doar o serie de medicamente care proveneau din medicina populara (digitalis - stimulator al inimii, extras din planta numita degetel-rosu, quinine utilizat pentru tratarea malariei, extras din scoarta si radacinile arborelui Cinchona) in ultimii 50-60 de ani interesul pentru enzime a crescut considerabil (atat masurarea activitatii acestora cat si utilizarea enzimelor purificate in scopuri clinice). Inainte de 1940 numai activitati enzimelor hidrolitice (lipaze, amilaze, fosfataze, tripsina si pepsina) erau masurate in scopuri clinice. In zilele noastre mai mult de 25% din munca unui laborator de analize clinice consta in diagnosticarea enzimelor (mai mult de 20 de enzime). Descoperirea in anii 50 a unei corelatii intre activitatea aminotransferazelor si dehidrogenazelor din ser si bolile de inima sau ficat a determinat o accentuare a cercetarilor in aceasta directie. Mai mult, izolarea si purificarea unor enzime a permis utilizarea acestora pentru stabilirea concentratiei optime de substrat (agent terapeutic). Folosirea anticorpilor monoclonali cuplati cu enzimele (purificate in prealabil) a permis imunodetectia unui numar mare de compusi biochimici. </p><p>Determinarea activitatilor enzimatice pentru diagnosticarea clinica La masurarea activitatii enzimatice in scopuri de diagnosticare clinica trebuie sa se tina cont de urmatoarele conditii: </p><p>a) enzima trebuie sa fie prezenta in sange, urina sau alte tesuri (fluide) accesibile (numai in cazul in care ceea ce trebuie diagnosticat nu poate fi determinat printr-o alta maniera); </p><p>b) activitatea enzimei poate fi masurata usor (eventual automatizarea procesului); c) daca exista corelatii dintre nivelul de activitate al enzimelor si starea patologica a </p><p>individului; d) enzima sa fie suficient de stabila pentru o eventuala reanaliza. </p><p>Serul este in fluid folosit frecvent pentru masurarea activitatii enzimatice a unor enzime. Urina poate fi folosita pentru estimarea concentratiei unor enzime eliberate de rinichi. Enzimele care se gasesc in plasma pot fi divizate in doua categorii: </p><p>1. Enzimele specifice plasmei enzime care sunt sintetizate in ficat si sunt eliberate constant in plasma. Ele prezinta interes clinic in situatia in care concentratia lor in plasma este mai scazuta fata de valorile normale. Exemple din aceasta categorie sunt enzimele implicate in coagularea sangelui, lecitin-colesterol-acil-transferaza (LCAT), pseudocolinesteraza, ceruloplasmina, renina </p><p>2. Enzimele nespecifice plasmei, care nu prezinta functii fiziologice in plasma. Aceste enzime care nu poseda cofactorul (amilaze, lipaze sau fosfataze si enzimele asociate cu metabolismul celular) se gasesc in plasma in concentratii mult mai mici decat cea din tesuturi. </p><p>Ruperea unui tesut sau prezenta unei cantitati prea mari de enzima in interiorul celulei poate fi depistata prin masurarea activitatii enzimatice din ser. In cazul unor boli tesuturile pot deveni inflamate sau necrotice (necroza este moartea unei portiuni dintr-un tesut sau organ). In ultima situatie este posibila o eliberare completa a continutului de </p></li><li><p>enzime (cu activitate scazuta) din celulele moarte. Inflamarea tesuturilor poate determina o schimbare a permeabilitatii celulelor, astfel incat eliberarea enzimei se face preponderent din citozol si nu din organitele celulare. De exemplu activitati mari ale alanin- si aspartat-aminotransferazelor sunt inregistrate in cazul hepatitelor virale, unde hepatocitele sunt afectate. O reducere a activitatii unor enzime plasmatice poate fi consecinta unor modificari metabolice. Colinesteraza este o enzima plasmatica, produsa de celulele ficatului. In cazul hepatitelor activitatea colinesterazei este redusa fapt care indica imbolnavirea celulelor hepatice. </p><p>Enzime indicator si specificitatea lor pentru diverse organe Organul/celula Enzima Specificitatea Cai biliare Leucin-amino-peptidaza </p><p>-Glutamil-transpeptidaza 5-nucleotidaza Fosfataza alcalina Ceruloplasmina </p><p>+++ +++ +++ ++ ++ </p><p>Eritrocite Fosfataza acida totala Lactat dehidrogenaza totala Glutamat-oxalacetat-transaminaza </p><p>++ + + </p><p>Ficat Ornitin-carbamil-transferaza Colinesteraza -Glutamil-transpeptidaza Glutamat-piruvat-transaminaza Glutamat-oxalacetat-transaminaza Lactat dehidrogenaza totala Aldolaza </p><p>+++ +++ +++ ++ + + + </p><p>Glande salivare Amilaza ++ Muschi cardiac 2-Hidroxi-butiril dehidrogenaza </p><p>Creatin kinaza Lactat dehidrogenaza totala Glutamat-oxalacetat-transaminaze </p><p>++ ++ + + </p><p>Muschi scheletici Creatin kinaza Aldolaza Lactat dehidrogenaza totala Glutamat-oxalacetat-transaminaze Glutamat-piruvat-transaminaza </p><p>++ + + + + </p><p>Oase Fosfataza alcalina ++ Pancreas Lipaza </p><p>Amilaza Glutamat-oxalat-trasaminaza Leucin-amino-peptidaza </p><p>+++ ++ + + </p><p>Prostata Fosfataza acida +++ Stomac Pepsinogen +++ </p><p> Adaptare din: Klinische Chemie: Theorie, Praxis, Interpretation. Colombo, .J P. und Tichterich, R. </p><p>Enzimele nespecifice plasmei pot fi divizate in doua subgrupe: A. Enzime de secretie provin din glandele exocrine si pancreas, sunt secretate si </p><p>actioneaza la nivelul tubului digestiv. Cele mai cunoscute enzime din aceasta categorie sunt: amilaza, lipaza, tripsina, pepsinogenul. In ciuda faptului ca secretia lor este ridicata aceste enzime sunt rapid eliminate prin canalele excretoare, in tractul gastrointestinal, bila, urina avand o concentratie scazuta si constanta. In situatia in care o cale de excretie </p></li><li><p>este blocata, sau daca eliberarea in lichidul extracelular este brusc accelerata, sau rata de producere este crescuta, concentratia acestor enzime in plasma creste semnificativ. </p><p>B. Enzime celulare actioneaza in celulele din care provin, unde apar in concentratie ridicata. Daca membrana celulara este intacta, aceste enzime sunt absente sau in cantitati infime in lichidul extracelular si plasma. Prezenta lor in plasma poate fi pusa pe seama proceselor de uzura si diviziune celulara, sau de perturbare a proceselor energetice (scaderea ATP din celule influenteaza permeabilitatea membranei celulare la cresterea efortului muscular se constata o crestere moderata a creatin kinazei, CK). Dupa ce enzimele celulare au trecut in plasma, activitatea lor scade rapid, avand timp de injumatatire de cateva ore. De exemplu aspartat aminotransferaza (AST) isi pierde jumatate din activitate in circa 50 de ore. Scaderea activitatii plasmatice a enzimelor poate fi datorata unuia din umatoarele mecanisme: </p><p>- modificarile structurale ale enzimelor la trecerea prin membranele celulare (gruparile SH din CK sufera un proces de oxidare); </p><p>- enzimele cu masa moleculara mica (-amilaza) se elimina pe cale urinara, iar fosfataza alcalina pe cale biliara; </p><p>- majoritatea enzimelor sunt indepartate din plasma printr-un proces de captare in macrofage (celule albe ce capteaza particule din mediul inconjurator). </p><p>Viteza cu care enzimele patrund din celule in lichidul interstitial si de acolo in plasma si limfa, precum si viteza de injumatatire difera de la o enzima la alta. Acest lucru prezinta importanta clinica pentru cunoasterea intervalului de timp la care trebuie recoltate probele de sange. De exemplu, activitatea AST-ului creste la 4-8 ore de la producerea infarctului miocardic si revine la valoarea normala dupa 3-6 zile. LDH-azele patrund mai greu in torentul circulator, avand valori ridicate dupa 8-12 ore (se mentin 3-6 zile). Pentru scopurile diagnostice se recomanda cuantificarea acelor enzime care au o concentratie mai mare in celula, specificitate pentru anumite organe si a caror determinari de activitate sunt usor de efectuat. In realitate, se cunosc putine enzime care sunt specifice in totalitate pentru un anumit tesut (fosfataza acida in prostata, acetil colin esteraza in eritrocite). Majoritatea enzimelor exista sub forma izoenzimelor, fapt care determina modificari ale activitatii enzimatice in diferitele tesuturi. Din acest motiv, pentru fiecare organ trebuie cunoscut acel set de enzime caracteristice, intrucat unele dintre acestea nu au specificitate absoluta pentru un anumit organ. In majoritatea cazurilor in ser apar mai multe enzime, izoenzimele, care au aceeasi activitate catalitica dar secventa diferita (deoarece sunt codate de gene diferite). Cel mai adesea organe diferite sintetizeaza diferite izoenzime: in inima se afla preponderent o izoenzima CKMB (a creatinin kinazei) pe cand o alta forma izoforma (CKMM) este localizat indeosebi in muschi. Din acest motiv determinarea izoenzimelor joaca un rol deosebit in diagnoza, permitand identificarea organului bolnav. In clinica, determinarea izoenzimelor creatin kinazei si lactat dehidrogenazei este un indicator al bolilor de inima sau muschi, in timp ce fosfataza alcalina este un indicator al bolilor ficatului, cailor biliare, oaselor sau in depistarea tumorilor. </p><p> Masurarea activitatii enzimatice Pentru masurarea activitatii enzimatice a unor enzime din ser trebuie sa avem in </p><p>vedere reactia chimica mediata de aceste proteine.Viteza de reactie este o masura a </p></li><li><p>c = Al </p><p>Activitatea enzimatica = modificaritimp</p><p>= cmin</p><p>= Amin l </p><p>Activitatea pe litru ser Volumul total din cuvaVolumul de enzima</p><p>= Amin l </p><p>reactiei enzimatice. Pentru fiecare test enzimatic este necesar un control riguros al unor anumiti parametri (pH, temperatura, prezenta unor ioni metalici-Ca2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ sau a unor compusi tiolici respectiv a unei concentratii optime de substrat), care sunt specifici pentru fiecare enzima. Majoritatea testelor enzimatice se efectueaza la concentratii ale substratului care sa permita saturarea enzimei. Viteza maxima, vmax , este o masura a cantitatii de enzima. Unitatea de masura pentru activitatea enzimatica este U. 1U este cantitatea de enzima care in conditii optime experimentale transforma 1 mol de substrat pe minut. Pentru ser activitatea enzimatica este exprimata in U/L. O alta unitate de masura pentru activitatea enzimatica este katalul. 1Katal reprezinta activitatea catalitica echivalenta cu transformarea unui mol de substrat pe secunda. 1U/L = 16.67 nKat/L (nKat = 10-9 mol/s) </p><p>Determinarea activitatii catalitice se face cu ajutorul unui test optic. Modificarea concentratiei substratului in decursul reactiei enzimatice poate fi determinata pe baza modificarii absorbantei. Prin intermediul legii Lambert-Beer poate fi calculata concentratia: </p><p>unde: A - absorbanta; - coeficient molar de extinctie; l lungimea cuvei; c concentratia. </p><p> In diagnosticarea clinica activitatea enzimatica din ser se exprima in U/L si se calculeaza astfel. </p><p>Pentru calcularea activitatii enzimatice este necesara cunoasterea volumului cuvei respectiv al probei si lungimea de unda la care absoarbe un compus (format sau consumat in decursul reactiei enzimatice). Dat fiind faptul ca volumul cuvei este 1 mL expresia de sus trebuie inmultita cu factorul 1000. </p><p>Activitatea enzimatica se poate calcula si in mol min-1 L-1. In comparatie cu metodele bazate pe absorbtie (inclusiv turbidimetrice) </p><p>determinarile fluorimetrice prezinta o sensibilitate crescuta (cu circa doua ordine de magnitudine), dar aceste metode sunt mult mai delicate (datorita posibilelor interferente; necesita reactivi cu puritate deosebita). Limitarea metodelor fluorimetrice este data in special de numarul relativ mic de compusi mici (fluorofori) care prezinta fenomenul de emisie. In conformitate cu teoria, in momentul in care o molecula absoarbe fotoni, unul dintre electronii acesteia trece pe un nivel energetic superior (stare excitata). La revenirea in starea fundamentala molecula emite lumina. Datorita pierderilor de energie, lumina emisa are intotdeauna lungimea de unda mai mare decat aceea a luminii excitate. </p><p>Dintre compusii naturali si metaboliti doar cativa (flavinele, triptofanul-respectiv proteinele in care este prezent acest aminoacid) prezinta emisie detectabila. Acizii nucleici, nucleozidele, nucleotidele (AMP, ATP) sau NAD(P) nu prezinta emisie, dar </p></li><li><p>formele cofactorilor redusi (NAD(P)H) emit lumina. Din acest motiv unele teste enzimatice pentru dehidrogenaze pot fi efectuate pe baza acestor proprietati. Alaturi de compusii mentionati, un numar restrans de metaboliti (acidul antranilic, acizii biliari sau proteina fluorescenta) prezinta emisie semnificativa. Pentru a utiliza aceasta metoda pentru o serie mai larga de aplicatii se folosesc cromofori artificiali (fluoresceina, etc). </p><p>O particularitate a fluorescentei este aceea ca intensitatea si maximul picului de emisie al unei molecule depinde de polaritatea mediului in care aceasta se afla. Astfel, dupa legarea covalenta sau necovalenta a altor componente (de exemplu substrat) sau a enzimei, spectrele de fluorescenta pot avea profile diferite. Un exemplu il constituie umbeliferona (7-hidroxi-cumarina) care prin atasarea la lipide sau carbohidrati (cu rol de substrat) poate fi utilizata la determinari enzimatice in care scindarea substratului poate fi vizualizata fluorimetric. De asemenea, masuratorile fluorimetrice pot servi la studiul modificarii conformatiilor enzimei dupa legarea substratului (ligandului). </p><p> Principalele enzime plasmatice cu valoare diagnostica Lactat dehidrogenaza (LDH) Se gaseste in cantitati mari in muschiul striat, ficat, miocard, rinichi si in </p><p>ganglionii limfatici si in cantitati mai reduse in pancreas, eritrocite si plamani. Lactat dehidrogenaza exista intr-o varietate de combinatii posibile a celor 2 subunitati si : 4, 3, 22, 3 si 4). Cele cinci izoenzime ale LDHazei sunt repartizate diferit in tesuturi. Daca LDH-1 predomina in muschiul cardiac, LDH-5 are o pondere mai mare in ficat si muschii scheletici. Valoarea diagnostica specifica este data de modificarile izoenzimatice. Astfel, cresteri ale LDH-1 si LDH-2 sugereaza existenta unui infarct miocardic sau a unei anemii, iar LDH-4 si LDH-5 in leziunile hepatice si procesele neoplazice (care apar in proliferarea anormala a celulelor-tumori). Determinarea activitatii LDH se bazeaza pe transformarea NADH in NAD+ in prezenta substratului (piruvat). Viteza de oxidare a NADH este proportionala cu activitatea LDH. Distributia izoenzimelor poate fi analizata prin electroforeza (LDH, fosfataza alcalina, creatin kinaza), specificitatea substratului (fosfataza acida), stabilitatea termica (LDH = lactat dehidrogenaza; formele LDH-4 si LDH-5 sunt mult mai stabile termic), inhibitie (piruvatul inhiba LDH-1 mai puternic decat LDH-5 ). Izoenzimele LDH pot fi separate din ser prin electroforeza pe folii de acetat de celuloza, in gel de amidon, agar, poliacrilamida si pot fi vizualizate printr-o reactie de culoare. In plus, anticorpii </p></li><li><p>monoclonali (vezi technica Western Blot) pot fi utilizati la detectia izoenzimelor. De exemplu, se pot obtine unii markeri (indicatori) tumorali pentru fosfataza acida (din prostata), fosfataza alcalina (din placenta) sau deoxinucleotid transferaza. </p><p>Masurarea activitatii enzimatice nu constituie o evidenta suficienta pentru diagnosticarea bolilor si de aceea aceasta se fa...</p></li></ul>