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AO-4635 REVISÃO DO ORIGINAL EM INGLÊS – SUZANA GONTIJO
PREPRINT_JULIANA
Chronic treatment with hydroalcoholic extract of Plathymenia reticulata
promotes islet hyperplasia and improves glycemic control in diabetic rats
Tratamento crônico com extrato hidroalcoólico de Plathymenia reticulata
promove hiperplasia de ilhotas e controle glicêmico em ratos diabéticos
Short title: Chronic treatment with hydroalcoholic extract of Plathymenia
reticulata promotes islet hyperplasia and improves glycemic control in diabetic
rats
Fernanda Oliveira Magalhães1, Elizabeth Uber-Bucek1, Patricia Ibler Bernardo
Ceron1, Thiago Fellipe Name1, Humberto Eustáquio Coelho1, Claudio Henrique
Gonçalves Barbosa1, Tatiane Carvalho1, Milton Groppo2
1 Universidade de Uberaba, Uberaba, MG, Brazil.
2 Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
DOI: 10.31744/einstein_journal/2019AO4635
How to cite this article:
Magalhães FO, Uber-Bucek E, Ceron PI, Name TF, Coelho HE, Barbosa CH, et
al. Chronic treatment with hydroalcoholic extract of Plathymenia reticulata
promotes islet hyperplasia and improves glycemic control in diabetic rats.
einstein (São Paulo). 2019;x(x):eAO4635.
http://dx.doi.org/10.31744/einstein_journal/2019AO4635
Corresponding author:
Fernanda Oliveira Magalhães – Avenida Nenê Sabino, 1,801 - Bairro
Universitário - Zip code: 38055-500 – Uberaba, MG, Brazil - Phone: (55 34)
3319-8933 - E-mail: [email protected]
Received on:
Jun 29, 2018
Accepted on:
Apr 8, 2019
Conflict of interest:
none.
ABSTRACT
Objective: To investigate the anti-hyperglycemic effects of Plathymenia
reticulata hydroalcoholic extract and related changes in body weight, lipid profile
and the pancreas. Methods: Diabetes was induced in 75 adult male Wistar rats
via oral gavage of 65 mg/Kg of streptozotocin. Rats were allocated to one of 8
groups, as follows: diabetic and control rats treated with water, diabetic and
control rats treated with 100 mg/Kg or 200 mg/Kg of plant extract, and diabetic
and control rats treated with glyburide. Treatment consisted of oral gavage for
30 days. Blood glucose levels and body weight were measured weekly. Animals
were sacrificed and lipid profile and pancreatic tissue samples analyzed.
Statistical analysis consisted of ANOVA, post-hoc Tukey-Kramer, paired
Student’s t and chi-square tests; the level of significance was set at 5%.
Results: Extract gavage at 100 mg/Kg led to a decrease in blood glucose levels
in diabetic rats in the 2nd, 3rd (198.71±65.27 versus 428.00±15.25) and 4th weeks
(253.29±47.37 versus 443.22±42.72), body weight loss (13.22±5.70 versus
109.60±9.95) and lower cholesterol levels (58.75±3.13 versus 80.11±4.01) in
control rats. Extract gavage at 200 mg/Kg led to a decrease in glucose levels on
the 4th week in diabetic rats, body weight loss in the 2nd, 3rd and 4th weeks in
control rats, and lower cholesterol levels in diabetic and control rats. Islet
hyperplasia (p=0.005) and pancreatic duct dilation (p=0.047) were observed in
diabetic and control rats. Conclusion: Plathymenia extract reduces blood
glucose levels in diabetic rats, and body weight in control rats, and promotes
pancreatic islet hyperplasia in diabetic and control rats.
Keywords: Plathymenia reticulada; Diabetes mellitus; Streptozocin; Islets of
Langerhans; Plant extract; Fabaceae; Pancreas
RESUMO
Objetivo: Avaliar o efeito anti-hiperglicêmico do extrato hidroalcoólico de
Plathymenia, alterações no peso, lipídios e efeito sobre o pâncreas. Métodos:
O diabetes foi induzido pela administração de estreptozotocina 65mg/Kg, em
75 ratos Wistar adultos machos, divididos em 8 grupos diferentes: ratos
diabéticos e controle + água, ratos diabéticos e controle + 100mg/Kg e
200mg/kg de extrato, ratos diabéticos e controle + glibenclamida. O tratamento
foi realizado por gavagem (oral) por 30 dias. Glicose e peso semanalmente. Os
animais foram sacrificados e os lipídios e pâncreas foram analisados. A análise
estatística aplicada: ANOVA, post-hoc Tukey-Kramer, teste t de Student
pareado e teste qui-quadrado, com nível de significância de 5%. Resultados:
O extrato 100mg/Kg promove redução nos níveis de glicose sanguínea em
ratos diabéticos na 2a, 3a (198,71±65,27 versus 428,00±15,25) e 4a semanas
(253,29±47,37 versus 443,22±42,72), perda de peso (13,22±5,70 versus
109,60±9,95) e diminuição do colesterol (58,75±3,13 versus. 80,11±4,01) em
ratos controle. Com extrato de 200mg/Kg houve redução dos níveis de glicose
na 4ª semana, nos ratos diabéticos, peso na 2ª, 3ª e 4ª semanas nos ratos
controle e colesterol nos animais, em ambos os diabéticos e controle. Houve
hiperplasia de ilhotas (p=0,005) e dilatação dos ductos pancreáticos (p=0,047)
em ratos diabéticos e controles. Conclusão: O extrato de Plathymenia reduz
os níveis de glicose em ratos diabéticos, peso em ratos controle e promove
hiperplasia de ilhotas pancreáticas em diabéticos e controles.
Descritores: Plathymenia reticulata; Diabetes mellitus; Estreptozocina; Ilhotas
pancreáticas; Extratos vegetais; Fabaceae; Pâncreas
INTRODUCTION
Diabetes mellitus, one of the most common chronic diseases, affects more than
245 million people worldwide and is the fourth or fifth leading cause of death in
developing countries. The number of cases amounted to 135 million in 1995,
and 415 million in 2015 globally and is estimated to reach 642 million in 2040,
with two thirds of affected individuals living in developing countries.(1) Brazil saw
a 61,8% increase in diabetes cases over the course of 10 years.(2)
Increased survival of diabetic individuals led to higher odds of chronic
disease-related complications resulting from time of exposure to hyperglycemia.
These complications can be highly debilitating to affected individuals, with
reduced life expectancy and quality of life, not to mention the cost burden on the
health system.(3)
Several plant extracts have been shown to lower blood glucose levels in
animals and the great diversity of chemical compound classes suggests a
variety of underlying modes of action. Despite therapeutic potential in some
cases, in others hypoglycemia may result from toxicity, particularly
hepatotoxicity.(4,5)
Plathymenia reticulata Benth, of the Leguminosae family, is a typical
plant of the Cerrado, rich in phenolic compounds such as tannins and
flavonoids. Hydrolysable tannins have the ability to inhibit the development of
insects, fungi and bacteria.(6) Flavonoids are widely distributed in nature and
have important biological effects, including antimicrobial and cardiovascular
activity.(7)
The plant known by the common name vinhático, a tree belonging to the
genus Plathymenia Benth, has been studied and two species described: P.
reticulata Benth (vinhático of the field) and P. foliolosa Benth (vinhático of the
forest).(8) A third species, P. modest (Speg.) Burk., has been reported and
grows in Argentina, according to Rizzini(9). According to Pius Correa et al.,(10) the
scientific name of P. reticulata Benth is "Chrysoxylon vinhático casar". However,
Antezana,(11) refers to P. reticulata Benth as P. foliolosa Benth.
The chemical characteristics of P. reticulata have been associated with
anti-inflammatory activity(6) and two cassane diterpenes have been described,(12)
as well as antimicrobial activity. ThePr5 fraction has been defined as the
condensed tannin-rich fraction (CTPr), and is a good source of natural inhibitors
of the local inflammation induced by components of a snake venom.(13) Inhibition
of 84.7% of staphylococci by hydroalcoholic P. reticulata extract at 0.625 mg/mL
has been reported.(14) Despite the use of this plant extract to treat diabetes in
popular medicine, its hypoglycemic potential has not been scientifically proven.
OBJECTIVE
To evaluate the anti-hyperglycemic effects of hydroalcoholic Plathymenia
extract and related changes in body weight, lipid profile and the pancreas.
METHODS
This experimental study was approved by the Ethics Committee for Animal
Experimentation (CEEA 002/2011). Seventy-five young adult male Wistar rats
weighing between 180 and 220 g obtained from the University vivarium were
used. Animals were housed in temperature controlled environment (22° to
25°C) and received animal feed and water ad libitum. Animals were submitted
to a 10-day adaptation period, then randomly allocated to different experimental
groups.
Induction of diabetes
Animals were submitted to a 24-hour fasting period, then treated with
intraperitoneal injection of 65 mg/Kg of aqueous streptozotocin solution, which
was previously prepared in 10 mmol/L sodium citrate buffer (pH 4.5).(15,16) Blood
glucose level monitoring was started 7 days after diabetes induction; tests were
performed on blood samples collected from the caudal vein using Accu-check
Performa. Diabetes was defined as body weight loss associated with fasting
blood glucose levels higher than 200 mg/dL.
Plant study
Collection and botanical identification:
Exsiccate samples used for botanical identification and secondary stem inner
bark samples used for pharmacological tests were obtained from a Plathymenia
reticulata Benth specimen (family Leguminosae, subfamily Mimosoideae)
collected in September (bloom time) 2006, at the following geographical
location: 15° 47' 16.65 " S and 48° 33' 26.96 " (Google Earth, 2010), of
Edilândia, Municipality of Cocalzinho - GO/Brasilia, Distrito Federal. The
voucher plant specimen was prepared according to standard herborization
methods(17,18) and stored in the Biology Department Herbarium of Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
(FFCLRP-USP), Department of Biology (SPFR), Ribeirão Preto, São Paulo,
registration number 13120 SPFR, collector name and number M. Groppo 2073.
(b)
Plant extract preparation:
Plant extracts were obtained from previously selected and fragmented inner
bark samples using alcohol solution (70ºC, room temperature). The extract was
dried in steam drying then resuspended in distilled water at 100 and 200 mg of
plant/Kg of animal (??)/mL concentration for pharmacological test purposes.
Pharmacognostic control of plant material and plant extract:
Tests were performed according to the Brazilian Pharmacopoeia (4th edition),(19)
and Simões et al.(20) Pharmacognostic control consisted of the following tests:
ash content, acid ash content, moisture content, total volatile and ethanol
extractable substances, lipid and resin content, extract density and pH
determination, plant and plant extract dry matter content, physicochemical and
colorimetric confirmation of chemical groups (saponins, phenols, tannins and
flavonoids) according to references provided.
Treatment of animals
Animals in this study were allocated to one of 8 groups, as follows: diabetic and
non-diabetic animals treated with oral gavage of 100 mg/kg (D100 and C100) or
200 mg/kg (D200 and C200) of hydroalcoholic plant extract, or 600 mcg/Kg of
glyburide (DG and CG), or not treated (CD and CC – oral gavage of water).
Plant extract or water (controls) were given for 30 days.
Blood glucose and body weight measurement
Blood glucose was measured weekly from blood samples collected from the
caudal vein using Accu-check Performa, following overnight fasting of at least
12 hours. Body weight was measured and recorded prior to the above
described procedure.
Animal sacrifice
On the thirtieth and last day of treatment, animals (63) were subjected to a 12-
hour fasting period, then anesthetized with intraperitoneal sodium thiopental
(50 mg/kg). Abdominal and thoracic organs were removed en block and blood
collected via cardiac or inferior vena cava puncture using a 10-ml syringe and
25 x 8 gauge needle. Blood samples were transferred to dry tubes and spun
down at 4,500 rpm for 15 minutes. The serum was then transferred to a second
tube for determination of HDL-cholesterol, total cholesterol and triglyceride
levels using commercial kits (LABTEST). Tests were performed at the
biochemistry section of the Clinical Analysis Laboratory of the Universidade de
Uberaba.
Pathological examination
Thoracic and abdominal organ samples were preserved in 10% formalin and
sent to the Animal Pathology Laboratory of Hospital Veterinário de Uberaba,
State of Minas Gerais, Brazil, for slide preparation. Samples were cut to obtain
fragments of pancreas measuring approximately 1 cm3. Fragments were fixed in
10% formalin and sent to the Histology Laboratory of Universidade de Uberaba.
Samples used for slide preparation were dehydrated in increasing alcohol
concentrations (up to 100%), then bleached in xylene solution and embedded in
paraffin. Sections (6 micrometer) were cut using a microtome. Samples were
rehydrated, stained with hematoxylin-eosin (HE), dehydrated, cleared, covered
with resin and protected by a coverslip.
Statistical Analysis
Data were entered into SPSS 14.0 data base. Results were expressed as
mean±SEM (standard error of the mean). The analyses among the groups were
performed using analysis of variance (ANOVA) of a track and the Tukey-
Kramer multiple comparisons test (post-hoc). Intragroup analyses were
performed using the paired Student's t test. Pathological findings were
submitted to the chi-square or the Fischer test as necessary. The level of
significance was set at = 5%.
RESULTS
As shown in Table 1, there was a significant decrease in blood glucose levels in
diabetic animals treated with 100 mg/Kg hydroalcoholic extract (D100)
compared to non-treated diabetic animals (DC) in the 2nd (DC 374.78±32.77
versus D100 246.22±45.33 mg/dl; p=0.039), 3rd (DC 428.00±15.25 versus D100
198.71±65.27 mg/dl; p=0.005) and 4th (DC 443.22±42.72 versus D100
253.29±47.37 mg/dl; p=0.021) weeks of treatment. Treatment with 200 mg/Kg
of hydroalcoholic extract (D200) also led to a significant reduction of blood
glucose levels in diabetic animals (DC 443.22±42.72 versus D200
201.00±66.97 mg/dl; p=0.013), but only after 4 weeks of treatment. The
average change in blood glucose levels during the experiment (i.e., the
difference between final and baseline glycemia) was significantly lower in the
D200 compared to the control group (- 243.50±92.66 mg/dl and 87.77±64.01
mg/dl respectively; p=0.012) (Table 1).
Table 1. Analysis of blood glucose levels, body weight, and lipids in diabetic animals
treated with 100 (D100) or 200 mg/Kg (D200) of hydroalcoholic extract or glyburide
(DG) for 4 weeks, compared to controls (CD).
CD D100 D200 DG p value
Blood glucose
Baseline 355.44±25.83
(n=9)
322.90±14.09 (n=10)
464.00±22.49** (n=8) 294.56±24.07 (n=9)
0.009
1st Week 319.00±43.85
(n=9)
239.50±29.27 (n=10)
444.38±23.73 (n=8) 339.29±43.29 (n=7)
0.362
2nd Week 374.78±32.77 (n=9)
246.22±45.33* (n=9)
345.83±18.11 (n=6) 466.14±17.02 (n=7)
0.039
3rd Week 428.00±15.25 (n=9)
198.71±65.27** (n=9)
426.00±9.73 (n=5)
403.71±60.56 (n=7)
0.005
4th week 443.22±42.72 (n=9)
253.29±47.37* (n=9)
201.00±66.97** (n=4)
472.67±32.31 (n=6)
0.021; 0.013
Blood glucose variation
87.77±64.01 (n=9)
- 73.28±45.13 (n=9)
- 243.50±92.66** (n=4)
199.16±52.84 (n=6)
0.012
Body weight
Baseline 188.44± 7.59 210.60±8.11 185.00±2.84 (n=8) 191.11±4.96 0.086
(n=9) (n=10) (n=9)
1st Week 193.88±8.19 (n=9)
198.00±9.45 (n=10)
167.63±5.30 (n=8) 198.63±10.42
(n=8)
0.189
2nd Week 213.78±11.42 (n=9)
191.56±11.61 (n=9)
165.17±3.04* (n=6)
210.14±14.19 (n=7)
0.037
3rd Week 205.44±15.28 (n=9)
182.88±12.43 (n=8)
164.00±3.67 (n=5) 211.50±18.15 (n=6)
0.156
4th week 207.56±14.71 (n=9)
196.14±14.51 (n=7)
165.40±3.84 (n=5) 197.83±19.80 (n=6)
0.322
Body weight variation
19.11±11.63 (n=9)
-10.28±7.71 (n=7)
-19.40±6.73 (n=5) 9.66±13.93 (n=6)
0.080
LIPIDS
Total cholesterol
84.22±7.26 (n=9)
62.28±2.93* (n=7)
52.40±5.83** (n=5)
87.40±5.76 (n=5)
0.053; 0.008
HDL cholesterol
44.33±4.70 (n=9)
19.86±3.33** (n=7)
21.60±4.24** (n=5) 40.33±5.23 (n=5)
0.002; 0.011
LDL cholesterol
32.78±4.01 (n=9)
33.57±4.18 (n=7)
23.80±1.83 (n=5) 38.40±5.57 (n=5)
0.219
Triglycerides 34.89±6.31 (n=9)
46.43±4.29 (n=7)
34.00±4.92 (n=5) 50.60±22.62 (n=5)
0.599
Results expressed as mean and standard error of the mean. (ANOVA, post-hoc: Tukey). *p<0.05; **p<0.01.
Variations observed within diabetic animal groups revealed reduction in
blood glucose levels compared to baseline in the first week of treatment in
animals receiving 100 mg/Kg (t=3.254, p=0.010). In animals treated with 200
mg/Kg, blood glucose levels decreased in the second compared to the first
(t=2.609, p=0.048) and in the fourth compared to the third (t=2.815; p=0.067)
week of treatment. Blood glucose levels did not decrease in animals treated
with glyburide or water (controls) (Figure 1).
Intragroup analysis: paired Student's t test * p<0.05; ** p<0.01.
TRADUÇÃO DA FIGURA:
Basal – Baseline
Semana – Week
Figure 1. Blood glucose levels in diabetic animals treated with hydroalcoholic
Plathymenia reticulata extract at doses of 100 mg/Kg (D100) or 200 mg/Kg (D200),
glybenclamide (DG) or water (DC)
Data presented in Table 2 show that treatment of non-diabetic rats with
100 mg/Kg hydroalcoholic extract (C100) led to a significant decrease in blood
glucose levels in these animals compared to controls in the 1st (CC 93.60±2.68
versus C100 81.20±1.94mg/dl; p=0.006), 2nd (CC 102.60±2.31 versus C100
80.80±4.84 mg/dl; p=0.014) and 4th (CC 93.10±3.61 versus C100
74.33±1.31 mg/dl; p=0.001) week of treatment. Treatment with 200 mg/Kg of
hydroalcoholic extract (C200) led to a significant reduction in blood glucose
levels in the 4th week (CC 93.10±3.61 versus C200 74.83±8.41 mg/dl; p=0.055)
(Table 2).
Table 2. Analysis blood glucose levels, body weight, and lipids in non-diabetic animals
treated with 100 (D100) or 200 mg/Kg (D200) of hydroalcoholic extract or glyburide
(GC) for 4 weeks, compared to controls (CC).
CC C100 C200 GC p value
Blood
glucose
Baseline 89.40±3.32
(n=10)
83.80±1.81
(n=10)
94.67±3.42
(n=9)
104.38±4.16**
(n=8)
< 0.001
1st week 93.60±2.68
(n=10)
81.20±1.94*
(n=10)
90.00±5.47
(n=9)
95.88±2.61
(n=8)
0.006
2nd week 102.60±2.31
(n=10)
80.80±4.84*
(n=10)
101.14±8.41
(n=6)
88.86±8.46
(n=8)
0.014
3rd week 94.40±4.03
(n=10)
88.56±3.39
(n=9)
84.57±2.88
(n=6)
98.25±5.40
(n=8)
0.149
4th week 93.10±3.61
(n=10)
74.33±1.31*
(n=9)
74.83±8.41*
(n=6)
100.50±4.23 (n
= 8)
0.001;
0.055
Blood
glucose
variation
3.7±6.35
(n=10)
- 8.89±1.89
(n=9)
- 17.00±9.92
(n=6)
- 3.87±6.18
(n=8)
0.154
Body
weight
Baseline 201.20±7.25
(n=10)
317.20±5.76**
(n=10)
207.25±5.52
(n=9)
195.00 ±3.45
(n=8)
< 0.001
1st week 232.60±11.07
(n=10)
316.30±8.39**
(n=10)
195.25±18.86
(n=9)
201.00±5.82
(n=8)
< 0.001
2nd week 273.20±9.21
(n=10)
293.60±12.69
(n=10)
225.17±9.42*
(n=6)
241.88±5.04
(n=8)
0.018
3rd week 292.60±10.36
(n=10)
318.11±11.21
(n=9)
242.83±7.23*
(n=6)
270.88±3.60
(n=8)
0.003
4th week 310.80±11.00
(n=10)
330.11±7.65
(n=9)
241.60±12.60**
(n=6)
287.13±4.54
(n=8)
< 0.001
Body weight
variation
109.60±9.95
(n=10)
13.22±5.70**
(n=9)
29.00±9.08**
(n=6)
92.12±3.32
(n=8)
<
0.001;
< 0.001
Lipids
Total
cholesterol
80.11±4.01
(n=9)
58.75±3.13**
(n=8)
64.83±2.84*
(n=6)
83.43±4.02
(n=7)
0.001;
0.037
HDL
cholesterol
37.60±3.75
(n=9)
20.86±1.33**
(n=8)
31.33±3.66
(n=6)
50.17 ±2.94*
(n=7)
0.004;
0.053
LDL
cholesterol
27.33±4.65
(n=9)
30.25±2.18
(n=8)
23.00±3.59
(n=6)
24.83±4.78
(n=7)
0.623
Triglyceride
s
75.89±10.00
(n=9)
52.62±3.92
(n=8)
51.33±3.65
(n=6)
45.00±4.01*
(n=7)
0.013
Results express as mean and standard error of the mean. (ANOVA, post-hoc: Tukey). *p<0.05; **p<0.01.
Variations observed within non-diabetic animal groups revealed reduction
in blood glucose levels in animals treated with 100 mg/Kg of extract in the first
week compared to baseline (t=2.594, p=0.029) and in the fourth compared to
the third week (t=3.690, p=0.006) (Figure 2).
Intragroup analysis: paired Student's t test * p<0.05; ** p<0.01.
TRADUÇÃO DA FIGURA:
Basal – Baseline
Semana – Week
Figure 2. Blood glucose levels in non-diabetic animals treated with
hydroalcoholic Plathymenia reticulata extract at doses of 100 mg/Kg (C100) or
200 mg/Kg (C200), glybenclamide (CG) or water (CC)
Effects on body weight gain were also evaluated. Treatment with 100
mg/Kg (D100) or 200 mg/Kg (D200) of hydroalcoholic extract did not promote
significant weight gain in diabetic animals, except in the 2nd week in those
receiving 200 mg/Kg of extract (DC 213.78±11.42 versus D200 165.17±3.04;
p=0.037). There was no significant body weight variation (final minus initial body
weight) in diabetic animals (Table 1). In contrast, natural weight gain was
significantly lower in non-diabetic animals treated with 200 mg/Kg of
hydroalcoholic extract (C200) in the 2nd (CC 273.20±9.21 versus C200
225.17±9.42 g; p=0.018), 3rd (CC 292.60±10.36 versus C200 242.83±7.23 g;
p=0.003) and 4th (CC 310.80±11.00 versus C200 241.60±12.60 g; p<0.001)
week of treatment. Total body weight gain did not differ significantly between
groups treated with 100 or 200 mg/Kg of extract (CC 109.60±9.95 versus C100
13.22±5.70 versus C200 29.00±9.08 g; p<0.001) (Table 2).
Treatment of diabetic animals with 100 mg/kg of extract significantly
reduced total (DC 84.22±7.26 versus D100 62.28±2.93 mg/dl; p=0.053) and
HDL (DC 44.33±4.70 versus D100 19.86±3.33 mg/dl; p=0.002) cholesterol
levels (Table 1). Total (CC 80.11±4.01 versus C100 58.75±3.13 mg/dl; p=0.01)
and HDL (CC 37.60±3.75 versus C100 20.86±1.33 mg/dl; p=0.005) cholesterol
levels decreased in non-diabetic animals (Table 2).
The treatment with 200 mg/Kg of extract led to a significant decrease in
total cholesterol levels in both diabetic (DC 84.22±7.26 versus D200
52.40±5.83 mg/dl; p=0.008) and non-diabetic (CC 80.11±4.01, n=9 versus C200
64.83±2.84 mg/dl; p=0.037) rats, and to lower HDL cholesterol levels (DC
44.33±4.70 versus D200 21.60±4.24 mg/dl; p=0.011) in diabetic rats (Table 2).
Histopathological analysis of the pancreas revealed lack of significant
differences with respect to hemorrhage, hydropic degeneration, hyperemia and
presence of pancreatic cysts. Significant islet hyperplasia (X2=20.384, p=0.005)
(Figure 3) and pancreatic duct dilation (X2=14.232, p=0.047) were observed in
D200 and C100 groups (Table 3).
Figure 3. Hyperplastic islets of Langerhans in diabetic animals treated
with Plathymenia
Table 3. Percentage of pathological changes found in the pancreas of diabetic animals
treated with hydroalcoholic Plathymenia extract and controls
CC DC C100 C200 D100 D200 GD GC p value*
Pancreas
No changes 28.6 28.6 71.4 28.6 42.9 50.0 42.9 28.6 0.755
Islet hemorrhage
0 0 0 0 0 0 0 0
Pancreatic hemorrhage
0 0 0 0 0 0 0 0
Hydropic degeneration
0 42.9 0 14.3 0 0 28.6 14.3 0.13
Hyperemia 0 0 0 0 14.3 33.3 0 0 0.08
Pancreatic cysts
14.3 0 0 57.1 57.1 33.3 47.9 14.3 0.06
Islet hyperplasia
42.9 0 28.6 0 0 33.3 0 71.4 0.005
Pancreatic duct dilation
0 28.6 0 0 0 0 0 0 0.047
* chi-square test.
DISCUSSION
Plathymenia reticulata is a protein- and enzyme-rich plant growing in the
Brazilian cerrado.(21) The antimicrobial activity of the hydroalcoholic extract from
this plant against Gram-positive bacteria (Streptococcus mutans and
Staphylococcus sp.) has been demonstrated in vitro.(14) Crude hydroalcoholic
extracts (hot and cold) have been shown to have anti-inflammatory activity,
decreasing leukocyte migration in carrageenan-induced peritonitis in mice.
Crude hydroalcoholic extracts also induced anti-edematous activity against
carrageenan-induced paw edema, showed antiproliferative activity against lung,
ovary and melanoma tumor cells, and inhibited nociception in acetic acid-
induced pain tests, with a similar profile to indomethacin.(7)
Antifungal activity of the alcoholic extract (made from Brazilian cachaça)
has been recently reported.(22) Also, the hexane, dichloromethane, ethyl acetic
fractions of ethanolic Plathymenia reticulata extract were able to inhibit B.
jararacussu poison toxicity, possibly via a tannin-mediated effect.(23)
Anti-hyperglycemic effects of Plathymenia reticulata extract have not
been reported to date. However, this study introduces a prospective novel
treatment for diabetes mellitus, with potential pancreatic protection, and a new
disease prevention strategy, supported by the ability of the extract to promote
weight loss and islet hyperplasia in non-diabetic animals.
The mode of action of the plant in this study translated into significant
anti-hyperglycemic effects, leading to blood glucose level decrease in diabetic
and non-diabetic rats; this decrease was significant in non-diabetic animals,
albeit with no clinical manifestations (hypoglycemia). Pancreas-protective
effects (i.e., pancreatic islet hyperplasia) were also observed. Hypoglycemic
effects may reflect the ability of the plant extract to promote beta cell
neogenesis, as the presence of islet hyperplasia and pancreatic duct dilation
suggests, or restore beta cell dedifferentiation, a process through which
dedifferentiated cells revert to progenitor-like cells expressing Neurogenin3,
Oct4, Nanog, and L-Myc. Some diabetes medications in the market are able to
promote beta cell neogenesis or restore dedifferentiation.(24,25)
The hypoglycemic effect occurred early in animals treated with
100 mg/kg (on the second week) and late in those treated with 200 mg/kg, and
may have been due to hormesis - a dose-response relationship phenomenon
characterized by low-dose stimulation and high-dose inhibition. This concept
introduces a changing perception that the fundamental nature of the dose
response is neither linear nor threshold, but U-shaped, changing the concept
and conduct of toxicological and risk assessment.(26)
Beta cell dysfunction plays a key role in the onset and progression of
type 2 diabetes. Among acquired factors, lipotoxicity and glucotoxicity may be of
of particular relevance to cell damage. More recently, a predominant role of
inflammation in beta cell dysfunction in type 2 diabetes has been proposed.(27)
Hence, the plant studied may be indicated for both, type 1 and type 2 diabetes
mellitus.
The role of mitochondrial dysfunction on beta cell injury (i.e., beta cell
apoptosis resulting from production of reactive oxygen species (ROS) in
response to metabolic stress) has been reported in type 2 diabetes (28) and
animals with type 2 diabetes (29). Other recent reports based on autopsy
specimens suggested amyloid deposits in pancreatic islets contribute to
decreased beta cell mass in patients with type 2 diabetes,.(30) Animal
experiments in monkeys (nonhuman model primate) also showed correlations
with alpha cell hyperplasia, leading to insulin deficiency, hyperglucagonemia
and insulin resistance.(31)
Body weight loss in non-diabetic rats treated with 200 mg/Kg or 100
mg/Kg suggests additional effects on obesity control. Weight loss may have
reflected reduced food intake or impaired food absorption in response to plant
extract tannins.(23) Studies analyzing food and water intake in these animals are
being conducted to unveil the mechanisms underlying anti-obesity effects.
Similar hormesis effect can observed in body weight variation in non-
diabetic animals, which had lower weight gain when treated with the 100 mg/kg,
followed by treatment with 200 mg/kg.(26) Initial body weight differences between
animals lead to the use of body weight variation (initial weight minus final
weight) as a parameter in this study.
Positive effect on total cholesterol levels were observed; however, HDL
cholesterol levels decreased. HDL cholesterol carries cholesterol to the liver,
where it is picked up by SR-B1 receptors, contributing to vascular bed
protection against atherogenesis via mechanisms such as removal of oxidized
LDL, inhibition of adhesion molecule and monocyte fixation to the endothelium
and stimulation of nitric oxide release.(32)
Lower total cholesterol levels are beneficial for the population at large
and for diabetic individuals in particular. However, HDL cholesterol reduction
may increase cardiovascular risks, an undesirable effect for diabetics.
The experimental model of diabetes induced by high streptozotocin
doses is a useful tool for investigation of several aspects of type 1 diabetes.(33)
In this study, oral gavage of hydroalcoholic Plathymenia reticulata Benth extract
led to a significant drop in blood glucose levels and promoted islet hyperplasia
in treated animals. These findings may be the first step towards development a
novel oral drug for treatment of type 1 and possibly to type 2 diabetes.
CONCLUSION
Further studies are warranted to unveil the mechanisms underlying extract
effects, investigate extract toxicity and single out the compound responsible for
the effects described. This study may raise prospects of new therapies for type
1 or type 2 diabetes, based on hypoglycemic effects and beta cell preservation
or, more importantly, lead to the identification of a compound capable of
preventing the onset of type 2 diabetes in susceptible individuals via pancreatic
protection and weight loss. Beneficial effects described may reflect the ability of
the plant extract to promote beta cell neogenesis or restore beta cell
dedifferentiation.
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank Deborah Hallal Jorge for revising the original manuscript in English.
This study was supported by Universidade de Uberaba.
AUTHORS’ INFORMATION
Magalhães FO: http://orcid.org/0000-0002-0581-4279
Uber-Bucek E: http://orcid.org/0000-0001-5163-4116
Ceron PI: http://orcid.org/0000-0003-4359-6548
Name TF: http://orcid.org/0000-0001-5446-6007
Coelho HE: http://orcid.org/0000-0001-5961-3985
Barbosa CH: http://orcid.org/0000-0001-6977-4459
Carvalho T: http://orcid.org/0000-0002-3053-7242
Groppo M: http://orcid.org/0000-0003-2932-7798
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AO-4635 TRADUÇÃO PARA PORTUGUÊS – SUZANA GONTIJO
PREPRINT_JULIANA
Tratamento crônico com extrato hidroalcoólico de Plathymenia reticulata
promove hiperplasia de ilhotas e controle glicêmico em ratos diabéticos
Chronic treatment with hydroalcoholic extract of Plathymenia reticulata
promotes islet hyperplasia and improve glycemic control in diabetic rats
Título curto: Tratamento crônico com extrato hidroalcoólico de Plathymenia
reticulata promove hiperplasia de ilhotas e controle glicêmico em ratos
diabéticos
Fernanda Oliveira Magalhães1, Elizabeth Uber-Bucek1, Patricia Ibler Bernardo
Ceron1, Thiago Fellipe Name1, Humberto Eustáquio Coelho1, Claudio Henrique
Gonçalves Barbosa1, Tatiane Carvalho1, Milton Groppo2
1 Universidade de Uberaba, Uberaba, MG, Brasil.
2 Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil.
DOI: 10.31744/einstein_journal/2019AO4635
Como citar este artigo:
Magalhães FO, Uber-Bucek E, Ceron PI, Name TF, Coelho HE, Barbosa CH, et
al. Chronic treatment with hydroalcoholic extract of Plathymenia reticulata
promotes islet hyperplasia and improves glycemic control in diabetic rats.
einstein (São Paulo). 2019;x(x):eAO4635.
http://dx.doi.org/10.31744/einstein_journal/2019AO4635
Autor correspondente:
Fernanda Oliveira Magalhães – Avenida Nenê Sabino, 1,801 - Bairro
Universitário - CEP: 38055-500 – Uberaba, MG, Brasil - Tel: (55 34) 3319-8933
- E-mail: [email protected]
Data de submissão:
29/06/2018
Data de aceite:
08/04/2019
Conflito de interesse:
não há.
ABSTRACT
Objective: To investigate the anti-hyperglycemic effects of Plathymenia
reticulata hydroalcoholic extract and related changes in body weight, lipid profile
and the pancreas. Methods: Diabetes was induced in 75 adult male Wistar rats
via oral gavage of 65 mg/Kg of streptozotocin. Rats were allocated to one of 8
groups, as follows: diabetic and control rats treated with water, diabetic and
control rats treated with 100 mg/Kg or 200 mg/Kg of plant extract, and diabetic
and control rats treated with glyburide. Treatment consisted of oral gavage for
30 days. Blood glucose levels and body weight were measured weekly. Animals
were sacrificed and lipid profile and pancreatic tissue samples analyzed.
Statistical analysis consisted of ANOVA, post-hoc Tukey-Kramer, paired
Student’s t and chi-square tests; the level of significance was set at 5%.
Results: Extract gavage at 100 mg/Kg led to a decrease in blood glucose levels
in diabetic rats in the 2nd, 3rd (198.71±65.27 versus 428.00±15.25) and 4th weeks
(253.29±47.37 versus 443.22±42.72), body weight loss (13.22±5.70 versus
109.60±9.95) and lower cholesterol levels (58.75±3.13 versus 80.11±4.01) in
control rats. Extract gavage at 200 mg/Kg led to a decrease in glucose levels on
the 4th week in diabetic rats, body weight loss in the 2nd, 3rd and 4th weeks in
control rats, and lower cholesterol levels in diabetic and control rats. Islet
hyperplasia (p=0.005) and pancreatic duct dilation (p=0.047) were observed in
diabetic and control rats. Conclusion: Plathymenia extract reduces blood
glucose levels in diabetic rats, and body weight in control rats, and promotes
pancreatic islet hyperplasia in diabetic and control rats.
Keywords: Plathymenia reticulada; Diabetes mellitus; Streptozocin; Islets of
Langerhans; Plant extract; Fabaceae; Pancreas
RESUMO
Objetivo: Avaliar o efeito anti-hiperglicêmico do extrato hidroalcoólico de
Plathymenia, alterações no peso, lipídios e efeito sobre o pâncreas. Métodos:
O diabetes foi induzido pela administração de estreptozotocina 65 mg/Kg, em
75 ratos Wistar adultos machos, divididos em 8 grupos diferentes: ratos
diabéticos e controle + água, ratos diabéticos e controle + 100 mg/Kg ou
200 mg/kg de extrato, ratos diabéticos e controle + gliburida. O tratamento foi
realizado por gavagem (oral) por 30 dias. Glicose e peso semanalmente. Os
animais foram sacrificados e amostras de lipídios e pâncreas foram analisadas.
A análise estatística incluiu ANOVA, post-hoc Tukey-Kramer, teste t de Student
pareado, e teste do qui-quadrado, com nível de significância de 5%.
Resultados: O extrato 100 mg/Kg promove redução nos níveis de glicose
sanguínea em ratos diabéticos na 2a, 3a (198,71±65,27 x 428,00±15,25) e 4a
semanas (253,29±47,37 x 443,22±42,72), perda de peso (13,22±5,70 x
109,60±9,95) e diminuição do colesterol (58,75±3,13 x 80,11±4,01) em ratos
controle. Com extrato de 200 mg/Kg houve redução dos níveis de glicose na 4ª
semana, nos ratos diabéticos, de peso na 2ª, 3ª e 4ª semanas nos ratos
controle, e de colesterol nos animais diabéticos e controle. Houve hiperplasia
de ilhotas (p=0,005) e dilatação dos ductos pancreáticos (p=0,047) em ratos
diabéticos e controles. Conclusão: O extrato de Plathymenia reduz os níveis
de glicose em ratos diabéticos, peso em ratos controle, e promove hiperplasia
de ilhotas pancreáticas em diabéticos e controles.
Descritores: Plathymenia reticulata; Diabetes mellitus; Estreptozocina; Ilhotas
pancreáticas; Extratos vegetais; Fabaceae; Pâncreas
INTRODUÇÃO
Diabetes mellitus, uma das doenças crônicas mais comuns no mundo, afeta
mais de 245 milhões de pessoas e representa a quarta ou quinta principal
causa de óbito em países em desenvolvimento. O número mundial de casos de
diabetes melittus chegou a 135 milhões em 1995, e 415 milhões em 2015,
devendo atingir 642 milhões em 2040, sendo dois terços dos afetados
residentes de países em desenvolvimento.(1) No Brasil, houve um aumento de
61,8% no número de casos diagnosticados ao longo de 10 anos.(2)
O aumento da sobrevida dos indivíduos diabéticos trouxe um maior risco
de complicações crônicas associadas ao tempo de exposição à hiperglicemia.
Tais complicações podem ser debilitantes para os indivíduos afetados,
comprometendo a longevidade e a qualidade de vida, além de onerar o sistema
de saúde.(3)
Sabe-se que diversos extratos vegetais são capazes de reduzir os níveis
sanguíneos de glicose em animais e a grande diversidade de classes de
compostos químicos sugere o envolvimento de diversos modos de ação.
Apesar do potencial valor terapêutico de algumas dessas substâncias em
alguns casos, em outros a hipoglicemia pode ser um efeito colateral da
toxicidade, principalmente da hepatotoxicidade.(4,5)
Plathymenia reticulata Benth, da família Leguminosae, é uma planta
típica do Cerrado rica em compostos fenólicos, como taninos e flavonoides. Os
taninos hidrolisáveis são capazes de inibir o desenvolvimento de insetos,
fungos e bactérias.(6) Os flavonoides são substâncias abundantes na natureza e
sua importância deriva de efeitos biológicos, como atividade antimicrobiana e
cardiovascular.(7)
A planta popularmente conhecida como vinhático, uma árvore
pertencente ao gênero Plathymenia Benth, foi estudada e duas espécies foram
descritas: P. reticulata Benth (vinhático do campo) e P. foliolosa Benth
(vinhático da floresta).(8) Existe ainda uma terceira espécie, P. modest (Speg.)
Burk., que cresce na Argentina, segundo Rizzini(9). Segundo Pius Correa et al.
(10), o sinônimo científico de P. reticulata Benth é "Chrysoxylon vinhático casar".
Entretanto, para Antezana(11) P. reticulata Benth seria P. foliolosa Benth.
As características químicas de P. reticulata foram associadas à atividade
anti-inflamatória;(6) além disso, dois diterpenos cassânicos foram descritos,(12)
assim como a atividade antimicrobiana. A fração ThePr5 foi definida como a
fração rica em taninos condensados (CTPr), e constitui uma boa fonte de
inibidores naturais da inflamação local induzida por veneno de serpente.(13) A
inibição de 84,7 % dos estafilococos pelo extrato hidroalcoólico de P. reticulata
na concentração de 0,625 mg/mL foi relatada .(14) Apesar do emprego desse
extrato vegetal no tratamento do diabetes na medicina popular, seu potencial
hipoglicemiante não foi comprovado cientificamente.
OBJETIVO
Avaliar o efeito anti-hiperglicêmico do extrato hidroalcoólico de Plathymenia e
alterações de peso corporal, perfil lipídico e pancreáticas relacionadas.
MÉTODOS
Este estudo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal (CEEA 002/2011). Foram utilizados 75 ratos machos
adultos jovens da linhagem Wistar, pesando entre 180 e 220 g e provenientes
do biotério da Universidade. Os animais foram mantidos em ambiente com
temperatura controlada (22° a 25°C) e receberam ração e água à vontade.
Após um período de adaptação de 10 dias, os animais foram alocados
aleatoriamente em diferentes grupos experimentais.
Indução do diabetes
Após jejum de 24 horas, os animais receberam 65 mg/Kg de uma solução
aquosa de estreptozotocina pela via intraperitoneal, que foi previamente
preparada com 10 mmol/L de tampão de citrato de sódio (pH 4,5).(15,16) O
monitoramento dos níveis glicêmicos teve início 7 dias após a indução do
diabetes, por meio de amostras sanguíneas coletadas da veia caudal com
Accu-check Performa. O diabetes foi definido como a perda de peso associada
à glicemia de jejum superior a 200 mg/dL.
Estudo da Planta
Coleção e identificação botânica:
As amostras empregadas no preparo de exsicatas destinadas à identificação
botânica e das entrecascas do caule secundário destinadas aos testes
farmacológicos foram obtidas de um espécime de Plathymenia reticulata Benth
(família Leguminosae, subfamília Mimosoideae), coletadas no mês de
setembro (mês de floração) de 2006, na seguinte localização geográfica: 15°
47' 16,65 " S e 48° 33' 26.96" (Google Earth, 2010), distrito de Edilândia,
Município de Cocalzinho - GO/Brasília, Distrito Federal. O espécime-
testemunha foi preparado de acordo com métodos padrão de herborização(17,18)
e armazenado no herbário do Departamento de Biologia da Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
(FFCLRP-USP), departamento de Biologia (SPFR), número de registro 13120
SPFR, coletor e número M. Groppo 2073.(b)
Preparo do extrato vegetal:
Os extratos foram preparados a partir de entrecascas previamente
selecionadas e fragmentadas, por meio de extração com solução alcoólica
(70ºC, temperatura ambiente). O extrato foi seco a vapor e resuspendido em
água destilada nas concentrações de 100 e 200 mg de vegetal/mL para fins de
testes farmacológicos.
Controle farmacognóstico do material vegetal e respectivo extrato:
Os testes foram realizados de acordo com a 4a edição da Farmacopeia
Brasileira(19) e com Simões et al.(20) O controle farmacognóstico consistiu dos
seguintes testes: teor de cinzas, acidez das cinzas, teor de umidade,
substâncias voláteis totais, teor de substâncias passíveis de extração por
etanol, teor de lipídeos e resinas, determinação da densidade e pH dos
extratos, teor de matéria seca do extrato e da planta medicinal e confirmação
da presença de grupos químicos (saponinas, fenois, taninos e flavonoides) por
meio de reações físico-químicas e colorimétricas, segundo descrições
constantes nas referências bibliográficas.
Tratamento dos animais
Os animais utilizados no estudo foram distribuídos em 8 grupos: animais
diabéticos e não-diabéticos tratados com extrato hidroalcoólico na dose de 100
mg/kg (D100 e C100) ou 200 mg/kg (D200 e C200), ou gliburida na dose de
600 mcg/Kg (DG e CG) e animais diabéticos e não-diabéticos não tratados (CD
e CC – administração oral de água). A administração de extrato vegetal ou
água (controles) foi mantida por 30 dias.
Dosagem de glicose sanguínea e aferição do peso corporal
As dosagens de glicose sanguínea foram realizadas semanalmente por meio
de amostras coletadas da veia caudal com Accu-check Performa, após jejum
mínimo de 12 horas. O peso corporal foi aferido e registrado antes do
procedimento descrito.
Sacrifício dos animais
No trigésimo e último dia de tratamento, todos os animais (63) foram
submetidos a jejum de 12 hora e então anestesiados com tiopental sódico
(50 mg/kg) pela via intraperitoneal. Os órgãos abdominais e torácicos foram
removidos em bloco e o sangue coletado por punção cardíaca ou da veia cava
inferior com seringa de 10 ml e agulha calibre 25 x 8. As amostras de sangue
foram transferidas para tubos secos e então centrifugadas a 4.500 rpm por 15
minutos. Após a centrifugação, o soro foi transferido para outro tubo para
dosagem de colesterol HDL, colesterol total e triglicérides por meio de kits
comerciais (LABTEST). Os testes foram realizados no setor de bioquímica do
Laboratório de Análises Clínicas da Universidade de Uberaba.
Anatomopatológico
As amostras de órgãos torácicos e abdominais foram preservadas em
formalina a 10% e enviadas para o Laboratório de Patologia Animal do Hospital
Veterinário de Uberaba, MG, Brasil, para fins de confecção das lâminas. As
amostras foram cortadas para obter fragmentos de pâncreas de
aproximadamente 1 cm3. Após o corte, cada fragmento foi fixado em formalina
a 10% enviado para o Laboratório de Histologia da Universidade de Uberaba.
Para confecção das lâminas, as amostras foram desidratadas em
concentrações crescentes de álcool (até 100%), imersas em solução de xileno
para branqueamento e então colocadas em blocos de parafina. Cortes de 6
micrômetros foram realizados com micrótomo. As amostras foram então
reidratadas, coradas com hematoxilina-eosina (HE), desidratadas, clareadas,
cobertas com resina e protegidas por lamínula para leitura.
Análise estatística
Os dados foram colocados na base de dados do SPSS 14.0. Os resultados
foram expressos como média±EPM (erro padrão da média). As análises entre
os grupos foram baseadas na análise de variância (ANOVA) e no teste (post-
hoc) de comparações múltiplas de Tukey-Kramer. As análises intragrupo foram
realizadas empregando-se o teste t de Student para dados pareados. Os
achados anatomopatológicos foram submetidos ao teste qui-quadrado ou ao
teste de Fischer, se necessário. O nível de significância adotado foi de = 5%.
RESULTADOS
Conforme mostra a Tabela 1, houve redução significante dos níveis glicêmicos
no grupo de animais diabéticos tratados com 100 mg/Kg de extrato
hidroalcoólico (D100) em relação ao grupo animais diabéticos não tratados
(DC) na 2a semana de tratamento (DC, 374,78±32,77 x D100,
246,22±45,33 mg/dl; p=0,039), efeito esse que se manteve na 3a (DC,
428,00±15,25 x D100 198,71±65,27 mg/dl; p=0,005) e na 4a (DC, 443,22±42,72
x D100 253,29±47,37 mg/dl; p=0,021) semanas de tratamento. O tratamento
com 200 mg/Kg de extrato hidroalcoólico (D200) também promoveu redução
significativa nos níveis glicêmicos nos animais diabéticos (DC, 443,22±42,72 x
D200, 201,00±66,97 mg/dl; p=0,013), porém somente após 4 semanas de
tratamento. A alteração média dos níveis sanguíneos de glicose durante o
experimento (ou seja, a diferença entre glicemia final e glicemia inicial) foi
significantemente menor no grupo D200 do que no grupo controle (-
243,50±92,66 mg/dl e 87,77±64,01; p=0,012) (Tabela 1).
Tabela 1. Análise da glicose sanguínea, peso corporal e perfil lipídico nos animais
diabéticos tratados com extrato hidroalcoólico nas doses de 100 (D100) e 200 mg/Kg
(D200) ou gliburida (DG) por 4 semanas, comparados com os animais controle (CD)
CD D100 D200 DG Valor de p
Glicemia
Valor inicial 355,44 ± 25,83 322,90±14,09 464,00± 22,49** 294,56±24,0 0,009
(n=9)
(n=10) (n=8) 7 (n=9)
1ª semana 319,00±43,85
(n=9)
239,50±29,27 (n=10)
444,38±23,73 (n=8) 339,29±43,29 (n=7)
0,362
2ª semana 374,78±32,77 (n= 9)
246,22±45,33* (n=9)
345,83±18,11 (n=6) 466,14±17,02 (n=7)
0,039
3ª semana 428,00±15,25 (n=9)
198,71±65,27** (n=9)
426,00±9,73 (n=5)
403,71±60,56 (n=7)
0,005
4ª semana 443,22±42,72 (n=9)
253,29±47,37* (n=9)
201,00±66,97** (n=4)
472,67±32,31 (n=6)
0,021; 0,013
Variação da glicemia
87,77±64,01 (n=9)
-73,28±45,13 (n=9)
-243,50±92,66** (n=4)
199,16±52,84 (n=6)
0,012
Peso
Peso inicial 188,44±7,59 (n=9)
210,60±8,11 (n=10)
185,00±2,84 (n=8)
191,11±4,96 (n=9)
0,086
1ª semana 193,88±8,19 (n=9)
198,00±9,45 (n=10)
167,63±5,30 (n=8) 198,63±10,42
(n=8)
0,189
2ª semana 213,78±11,42 (n=9)
191,56±11,61 (n=9)
165,17±3,04* (n=6)
210,14±14,19 (n=7)
0,037
3ª semana 205,44±15,28 (n=9)
182,88±12,43 (n=8)
164,00±3,67 (n=5) 211,50±18,15 (n=6)
0,156
4ª semana 207,56±14,71 (n=9)
196,14±14,51 (n=7)
165,40±3,84 (n=5) 197,83±19,80 (n=6)
0,322
Variação de peso
19,11±11,63 (n=9)
-10,28±7,71 (n=7)
-19,40±6,73 (n=5) 9,66±13,93 (n=6)
0,080
LÍPIDES
Colesterol total
84,22±7,26 (n=9)
62,28±2,93* (n=7)
52,40±5,83** (n=5)
87,40±5,76 (n=5)
0,053; 0,008
Colesterol HDL
44,33±4,70 (n=9)
19,86±3,33** (n=7)
21,60±4,24** (n=5) 40,33±5,23 (n=5)
0,002; 0,011
Colesterol LDL
32,78±4,01 (n=9)
33,57±4,18 (n=7)
23,80±1,83 (n=5) 38,40±5,57 (n=5)
0,219
Triglicérides 34,89±6,31 (n=9)
46,43±4,29 (n=7)
34,00±4,92 (n=5) 50,60±22,62 (n=5)
0,599
Resultados expressos em média e erro padrão da média. (ANOVA, post-hoc: Tukey). *p< 0,05; **p<0,01.
A análise da variação intragrupo em animais diabéticos mostra que a
dose de 100 mg/Kg promoveu redução dos níveis glicêmicos em relação aos
níveis iniciais na primeira semana (t=3,254, p=0,010), enquanto a dose de 200
mg/Kg promoveu redução na segunda semana em relação à primeira (t=2,609,
p=0,048) e na quarta em relação à terceira (t=2,815; p=0,067) semana de
tratamento. Não houve redução nos animais tratados com gliburida ou água -
controles (Figura 1).
Análise intragrupo: teste t de Student para dados pareados * p<0,05; ** p<0,01.
Figura 1. Níveis glicêmicos em animais diabéticos tratados com extrato hidroalcoólico
de Plathymenia reticulata nas doses de 100 mg/Kg (D100) e 200 mg/Kg (D200), com
glibenclamida (DG) e com água (DC)
Os dados da Tabela 2 mostram que o tratamento de ratos não-
diabéticos com 100 mg/Kg de extrato hidroalcoólico (C100) promoveu queda
significante dos níveis glicêmicos nesses animais em relação aos controles na
1a (CC, 93,60±2,68 x C100, 81,20±1,94 mg/dl; p=0,006), 2a (CC, 102,60±2,31 x
C100, 80,80±4,84 mg/dl; p=0,014) e 4a (CC, 93,10±3,61 x C100 74,33±1,31
mg/dl; p=0,001) semanas de tratamento. O tratamento com 200 mg/Kg de
extrato hidroalcoólico (C200) levou a uma redução significante dos níveis
glicêmicos na 4a semana (CC, 93,10±3,61 x C200, 74,83±8,41 mg/dl; p=0,055)
(Tabela 2).
Tabela 2. Análise dos níveis glicêmicos, peso corporal e perfil lipídico nos animais
não-diabéticos tratados com extrato hidroalcoólico nas doses de 100 (D100) ou
200 mg/Kg (D200) de peso corporal ou gliburida (GC) por 4 semanas, comparados
com os animais controle (CC)
CC C100 C200 GC Valor
de p
Glicemia
Valor inicial 89,40±3,32
(n=10)
83,80±1,81
(n=10)
94,67±3,42
(n=9)
104,38±4,16**
(n=8)
< 0,001
1ª semana 93,60±2,68 81,20±1,94* 90,00±5,47 95,88±2,61 0,006
(n=10) (n=10) (n=9) (n=8)
2ª semana 102,60±2,31
(n=10)
80,80±4,84*
(n=10)
101,14±8,41
(n=6)
88,86±8,46
(n=8)
0,014
3ª semana 94,40±4,03
(n=10)
88,56±3,39
(n=9)
84,57±2,88
(n=6)
98,25±5,40
(n=8)
0,149
4ª semana 93,10±3,61
(n=10)
74,33±1,31*
(n=9)
74,83±8,41*
(n=6)
100,50±4,23
(n=8)
0,001;
0,055
Variação da
glicemia
3,7±6,35
(n=10)
-8,89±1,89
(n=9)
- 17,00±9,92
(n=6)
- 3,87±6,18
(n=8)
0,154
Peso
corporal
Peso inicial 201,20±7,25
(n=10)
317,20±5,76**
(n=10)
207,25±5,52
(n=9)
195,00±3,45
(n=8)
< 0,001
1ª semana 232,60±11,07
(n=10)
316,30±8,39**
(n=10)
195,25±18,86
(n=9)
201,00±5,82
(n=8)
< 0,001
2ª semana 273,20±9,21
(n=10)
293,60±12,69
(n=10)
225,17±9,42*
(n=6)
241,88±5,04
(n=8)
0,018
3ª semana 292,60±10,36
(n=10)
318,11±11,21
(n=9)
242,83±7,23*
(n=6)
270,88±3,60
(n=8)
0,003
4ª semana 310,80±11,00
(n=10)
330,11±7,65
(n=9)
241,60±12,60**
(n=6)
287,13±4,54
(n=8)
< 0,001
Variação de
peso
109,60±9,95 13,22±5,70** 29,00±9,08** 92,12±3,32 <
0,001;
corporal (n=10) (n=9) (n=6) (n=8) < 0,001
Lípides
Colesterol
total
80,11±4,01
(n=9)
58,75±3,13**
(n=8)
64,83±2,84*
(n=6)
83,43±4,02
(n=7)
0,001;
0,037
Colesterol
HDL
37,60±3,75
(n=9)
20,86±1,33**
(n= 8)
31,33±3,66
(n=6)
50,17±2,94*
(n=7)
0,004;
0,053
Colesterol
LDL
27,33±4,65
(n=9)
30,25±2,18
(n=8)
23,00±3,59
(n=6)
24,83±4,78
(n=7)
0,623
Triglicérides 75,89±10,00
(n=9)
52,62±3,92
(n=8)
51,33±3,65
(n=6)
45,00±4,01*
(n=7)
0,013
Resultados expressos em média e erro padrão da média. (ANOVA, post-hoc: Tukey). *p<0,05; **p<0,01.
A análise da variação intragrupo em animais não-diabéticos mostra
redução dos níveis sanguíneos de glicose em relação aos valores iniciais na
primeira semana (t=2,594, p=0,029) e entre a quarta e a terceira semanas
(t=3,690, p=0,006) de tratamento com 100 mg/Kg de extrato (Figura 2).
Análise intragrupo: teste t de Student para dados pareados * p<0,05; ** p<0,01.
Figura 2. Glicose sanguínea em animais não-diabéticos tratados com extrato
hidroalcoólico de Plathymenia reticulata nas doses de 100 mg/Kg (D100) ou
200 mg/Kg (D200), glibenclamida (DG) ou água (DC)
O efeito sobre o ganho de peso dos animais também foi avaliado. O
tratamento com 100 mg/Kg (D100) ou 200 mg/Kg (D200) do extrato
hidroalcoólico não promoveu ganho significativo de peso corporal nos animais
diabéticos, exceto na 2a semana de administração de 200 mg/Kg extrato (DC,
213,78±11,42 x D200, 165,17±3,04; p=0,037). Também não houve variação
significativa de peso (peso final menos peso inicial) nos animais diabéticos
(Tabela 1). Em contrapartida, observou-se que o tratamento de animais não-
diabéticos com 200 mg/Kg de extrato hidroalcoólico (C200) promoveu redução
significativa do ganho natural de peso nesses animais ao longo da 2a (CC,
273,20±9,21 x C200 225,17±9,42 g; p=0,018), 3a (CC, 292,60±10,36 x C200,
242,83±7,23 g; p=0,003) e 4ª (CC, 310,80±11,00 x C200 241,60±12,60 g;
p<0,001) semanas de tratamento. Além disso, não houve diferença significativa
de ganho total de peso nos grupos tratados com 100 ou 200 mg/Kg de extrato
(CC, 109,60±9,95 x C100, 13,22±5,70 x C200 29,00±9,08 g; p<0,001) (Tabela
2).
O tratamento de animais diabéticos com 100 mg/kg de extrato promoveu
redução significante do colesterol total (DC, 84,22±7,26 x D100,
62,28±2,93 mg/dl; p=0,053) e colesterol HDL (DC, 44,33±4,70 x D100,
19,86±3,33 mg/dl; p=0,002) (Tabela 1). Nos animais não-diabéticos, houve
queda do colesterol total (CC, 80,11±4,01 x C100, 58,75±3,13 mg/dl; p=0,01) e
do colesterol HDL (CC, 37,60±3.75 x C100, 20,86±1,33 mg/dl; p=0,005)
(Tabela 2).
O tratamento com 200 mg/Kg de extrato levou a uma redução
significativa dos níveis de colesterol total tanto em ratos diabéticos (DC,
84,22±7,26 x D200, 52,40±5,83 mg/dl; p=0,008) quanto em ratos não-
diabéticos (CC, 80,11±4,01, n=9 x C200 64,83±2,84 mg/dl; p=0,037) e também
à queda do colesterol HDL em ratos diabéticos (DC, 44,33±4,70 x D200
21,60±4,24 mg/dl; p=0,011) (Tabela 2).
A análise histopatológica revelou ausência de diferenças significantes
em relação à hemorragia, degeneração hidrópica, hiperemia e presença de
cistos pancreáticos. Observou-se hiperplasia significante das ilhotas
(X2=20,384, p=0,005) (Figura 3) e dilatação significante de ductos pancreáticos
(X2=14,232, p=0,047) nos grupos D200 e C100 (Tabela 3).
Figura 3. Hiperplasia das ilhotas de Langerhans em animais diabéticos
tratados com Plathymenia
Tabela 3. Porcentagem de alterações patológicas encontradas no pâncreas de
animais diabéticos tratados com extrato hidroalcoólico de Plathymenia e animais
controle
CC DC C100 C200 D100 D200 GD GC Valor de p*
Pâncreas
Sem alterações
28,6 28,6 71,4 28,6 42,9 50,0 42,9 28,6 0,755
Hemorragia em ilhotas
0 0 0 0 0 0 0 0
Hemorragia no pâncreas
0 0 0 0 0 0 0 0
Degeneração hidrópica
0 42,9 0 14,3 0 0 28,6 14,3 0,13
Hiperemia 0 0 0 0 14,3 33,3 0 0 0,08
Cistos pancreáticos
14,3 0 0 57,1 57,1 33,3 47,9 14,3 0,06
Hiperplasia de ilhotas
42,9 0 28,6 0 0 33,3 0 71,4 0,005
Dilatação de ductos pancreáticos
0 28,6 0 0 0 0 0 0 0,047
* teste qui-quadrado.
DISCUSSÃO
Plathymenia reticulata é uma planta do cerrado brasileiro com altos teores de
proteína e enzimas.(21) Estudos prévios mostraram que o extrato hidroalcoólico
dessa planta possui atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas
(Streptococcus mutans e Staphylococcus sp.) in vitro.(14) Os extratos brutos
(quente e frio) mostraram atividade anti-inflamatória, reduzindo a migração
leucocitária na peritonite induzida por carregenina em camundongos. Os
extratos brutos também induziram atividade antiedematogênica, reduzindo o
edema de patas induzido pela carregenina, além de mostrar atividade
antiproliferativa em células tumorais no pulmão, ovário e melanoma e inibição
da nocicepção em testes de algesia induzida por ácido acético, com perfil
similar ao da indometacina.(7)
Relatos recentes mostraram que o extrato hidroalcoólico de Plathymenia
reticulata (à base de cachaça) possui atividade antifúngica (22) e que as frações
hexano, diclorometano e etil-acética do extrato etanólico inibiem o efeito tóxico
do veneno de B. jararacussu, provavelmente por meio de taninos.(23)
Os efeitos anti-hiperglicêmicos do extrato de Plathymenia reticulata
ainda não foram relatados. Entretanto, esse estudo abre a possibilidade de um
novo tratamento para o diabetes mellitus, com possível proteção pancreática,
além de uma nova estratégia preventiva da doença, dada a capacidade do
extrato de induzir perda de peso e hiperplasia de ilhota em animais não-
diabéticos.
A ação farmacológica da planta estudada se traduziu em efeito anti-
hiperglicêmico importante, com queda dos níveis sanguíneos de glicose em
ratos diabéticos e não-diabéticos, sendo que nos animais não-diabéticos a
queda foi significante, embora sem manifestação clínica (hipoglicemia). Além
disso, foi observado efeito protetor sobre o pâncreas (hiperplasia de ilhotas
pancreáticas). O efeito hipoglicemiante pode refletir a capacidade do extrato
vegetal de promover a neogênese de células beta, conforme sugere a
ocorrência de hiperplasia de ilhotas e dilatação de ductos pancreáticos, ou
restaurar a diferenciação de células beta, um processo através do qual as
células dediferenciadas revertem para células progenitor-like que expressam
Neurogenin 3, Oct4, Nanog e L-Myc. Algumas drogas destinadas ao tratamento
do diabetes disponíveis no mercado são capazes de promover a neogênese de
células beta ou restaurar a diferenciação.(24,25)
O efeito hipoglicemiante foi precoce nos animais tratados com
100 mg/kg de peso corporal (na segunda semana) e tardio nos animais
tratados com 200 mg/kg de peso corporal, e pode ter refletido o efeito hormese:
um fenômeno dose-resposta caracterizado pela estimulação por baixas doses
e inibição por altas doses. Esse conceito indica uma nova percepção da
natureza fundamental da relação dose-resposta, que não é linear nem de
limiar, e sim em formato de U, alterando o conceito e a condução da avaliação
toxicológica e de risco.(26)
A disfunção das células beta tem papel fundamental no
desencadeamento e progressão do diabetes tipo 2. Dentre os fatores
adquiridos, a lipotoxicidade e a glicotoxicidade podem ter importância singular
na lesão celular. Mais recentemente, foi proposto que a inflamação tem papel
predominante na disfunção das células beta no diabetes tipo 2.(27) Portanto, a
planta estudada poderia ser indicada tanto para o diabetes mellitus tipo 1
quanto para o tipo 2.
O papel da disfunção mitocondrial na lesão de células beta (apoptose de
células beta em decorrência da produção de espécies reativas de oxigênio –
ROS - mediada por estresse metabólico) foi relatado no diabetes tipo 2 (28) e em
animais com diabetes tipo 2.(29). Outros relatos recentes indicam que a
presença de depósitos de amiloides nas ilhotas pancreáticas, observada em
material coletado em autópsia, contribui para a redução da massa de células
beta em pacientes com diabetes tipo 2.(30) Experimentos em macacos (modelo
primata não-humano) também mostraram uma correlação com a hiperplasia de
células alfa, levando à deficiência de insulina, hiperglucagonemia e resistência
à insulina.(31)
A perda de peso observada nos ratos não-diabéticos tratados com doses
de 200 mg/Kg ou 100 mg/Kg sugere efeito adicional no controle da obesidade.
A perda de peso pode ter refletido a redução do consumo alimentar ou a menor
absorção alimentar em resposta aos taninos presentes no extrato vegetal.(23)
Estudos analisando o consumo alimentar e hídrico nesses animais estão em
andamento para elucidar o mecanismo responsável pelo efeito antiobesidade
observado.
O mesmo efeito hormese pode ser observado na variação de peso nos
animais não-diabéticos, que apresentaram menor ganho de peso com a dose
de 100 mg/kg, seguida pela dose de 200 mg/kg.(26) A diferença de peso
corporal inicial entre os animais levou à adoção da variação de peso (peso
inicial menos peso final) como parâmetro nesse estudo.
Houve efeito positivo sobre os níveis de colesterol total, porém redução
do colesterol HDL. O colesterol HDL transporta o colesterol para o fígado, onde
o mesmo é captado pelos receptores SR-B1, contribuindo para a proteção do
leito vascular contra a aterogênese por meio de mecanismos como a remoção
de LDL oxidada, a inibição da fixação de moléculas de adesão e monócitos ao
endotélio e o estímulo da liberação de óxido nítrico.(32)
A redução do colesterol total é salutar para a população em geral e para
indivíduos diabéticos em particular. Entretanto, e redução do colesterol HDL
pode aumentar o risco cardiovascular, o que não é desejável em indivíduos
diabéticos.
O modelo experimental de diabetes induzida por altas doses de
estreptozotocina empregado é uma ferramenta útil para o estudo de diversos
aspectos relacionados ao diabetes tipo 1.(33) Neste estudo, o extrato
hidroalcoólico de Plathymenia reticulata Benth administrado pela via oral
promoveu redução importante da glicose sanguínea e levou à hiperplasia de
ilhotas no animais. Tais resultados podem representar o início do processo de
obtenção de uma nova droga de uso oral para tratamento do diabetes tipo 1 e
possivelmente tipo 2.
CONCLUSÃO
Outros estudos se fazem necessários para desvendar os mecanismos
relacionados aos efeitos do extrato, investigar sua toxicidade e identificar o
composto responsável pelos efeitos descritos. Este estudo abre a perspectiva
para novas terapias para o diabetes tipos 1 e 2, baseadas no efeito
hipoglicemiante e na preservação das células beta e, ainda mais importante,
para a identificação de um composto capaz de prevenir o desencadeamento do
diabetes tipo 2 em indivíduos susceptíveis por meio da proteção pancreática e
de perda de peso. Os efeitos benéficos descritos podem refletir a capacidade
do extrato vegetal de promover a neogênese ou restaurar a dediferenciação de
células beta.
AGRADECIMENTOS
A Deborah Hallal Jorge pela revisão do artigo original em inglês. Este estudo
teve apoio da Universidade de Uberaba.
INFORMAÇÕES DOS AUTORES
Magalhães FO: http://orcid.org/0000-0002-0581-4279
Uber-Bucek E: http://orcid.org/0000-0001-5163-4116
Ceron PI: http://orcid.org/0000-0003-4359-6548
Name TF: http://orcid.org/0000-0001-5446-6007
Coelho HE: http://orcid.org/0000-0001-5961-3985
Barbosa CH: http://orcid.org/0000-0001-6977-4459
Carvalho T: http://orcid.org/0000-0002-3053-7242
Groppo M: http://orcid.org/0000-0003-2932-7798
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