apj receptor mrna expression in the rat hypothalamic paraventricular nucleus: regulation by stress...

7
APJ Receptor mRNA Expression in the Rat Hypothalamic Paraventricular Nucleus: Regulation By Stress and Glucocorticoids A.-M. O'Carroll, A. L. J. Don and S. J. Lolait Henry Wellcome Laboratories for Integrative Neuroscience and Endocrinology (LINE), Dorothy Hodgkin Building, University of Bristol, Bristol, UK. Key words: APJ, apelin, PVN, restraint stress, adrenalectomy. Abstract The apelin receptor (APJ receptor, APJR) has recently come to prominence following the isolation and identi®cation of its endogenous ligand, apelin, from bovine stomach tissue extracts. Investigation of APJR mRNA expression has revealed a hypothalamic distribution similar to that of vasopressin suggesting that the apelin±APJR system may be involved in the regulation of the hypothalamic-adrenal-pituitary (HPA) stress axis. To investigate whether APJR is involved in the regulation of hypothalamic function during stress, APJR mRNA expression levels were measured by in situ hybridization in the hypothalamus of rats subjected to acute and repeated restraint stress. Acute stress caused an increase in APJR mRNA expression in the hypothalamic parvocellular paraventricular nucleus (pPVN) while repeated restraint stress induced a sustained up-regulation of pPVN APJR mRNA expression in intact rats. Removal of endogenous glucocorticoids by adrenalectomy also resulted in an increased expression of APJR mRNA in the PVN, suggesting a negative regulation of APJR mRNA expression by glucocorticoids. The role of glucocorticoids in mediating these stress-induced changes was investigated by analysing the effects of acute and repeated restraint stress on APJR mRNA levels in adrenalectomized rats. In these rats, APJR mRNA expression levels did not change above the already elevated levels of adrenalectomized-control rats. These data suggest that acute and repeated stress exert a stimulatory in¯uence on APJR mRNA expression at the hypothalamic level that may be dependent on basal levels of circulating glucocorticoids, and further suggest a role for APJR in the regulation of hypothalamic function. A critical component of a host response to stress is activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis. In response to acute stress, there is an increase in corticotropin-releasing factor (CRF) and vasopressin mRNA expression in the medial parvo- cellular regions of the hypothalamic PVN (pPVN) and a release of both hormones from the external zone of the median eminence into the hypophysial portal blood. CRF acts in synergy with vasopressin (which is colocalized in a proportion of CRF neurones in the pPVN) (1) to release adrenocorticotropin hormone (ACTH) from the anterior pituitary (2) which in turn stimulates production of the potent anti-in¯ammatory steroid corticosterone by the adrenal cortex. Synthesis of CRF and vasopressin in the pPVN is suppressed by glucocorticoids (3), while synthesis of vasopres- sin in the posterior magnocellular division of the PVN (mPVN) is not, suggesting a site-speci®c modulation of vasopressinergic par- vocellular neurones by corticosteroids. Adrenalectomy enhances CRF (4, 5) and vasopressin (6, 7) mRNA expression in the pPVN. These effects can be reversed by the administration of exogenous steroids (8). While CRF is the major activator of pituitary corticotroph ACTH release in acute stress, vasopressin appears to be important in maintaining the HPA axis response to a number of repeated and chronic stressors (9, 10). Despite colocalization of CRF and vasopressin within the same secretory granules of the same neurones in the pPVN (11), these two neuropeptides appear to be under independent control and regulation. The recently described peptide apelin (12) has been reported to have a regulatory effect on CRF and vasopressin release consistent with stimulation of the stress axis (13). This endogenous ligand for the apelin receptor (APJ receptor, APJR) was isolated from extracts of bovine stomach (12). The 36-amino acid peptide, apelin-36, is derived from the C-terminal portion of a 77-amino acid preproprotein. Synthetic apelin-13 and apelin-17, C-terminal fragments of apelin-36, exhibit greater biological activity than the parent peptide in pharmacological assays (e.g. inhibition of for- skolin-stimulated cAMP production) (12). The novel G protein- coupled receptor (GCPR) APJR, has closest identity to the angiotensin II receptor, type AT1a, but angiotensin II does not Journal of Neuroendocrinology, 2003, Vol. 15, 1095±1101 # 2003 Blackwell Publishing Ltd Correspondence to: Dr Anne-Marie O'Carroll, The Dorothy Hodgkin Building, Whitson Street, University of Bristol, Bristol BS1 3NY, UK (e-mail: [email protected]).

Upload: a-m-ocarroll

Post on 06-Jul-2016

213 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

��� ������ ���� ������� �� ��� ��� ����������������������� �������� ��������� �� ����� ��������������

����� ������� �� � �� �� ��� �� �� �������� ������� ������� � �������� � !�"������� ��� #�������� $ �!#%� ��&� ���'�� ("������� )�� ����� � (����� (����� )*�

*�� +��, �-�� �.����� -/!� ������� ������ ������������

�������

0&� �.���� ���.� $�-� ���.�� �-�1% &�� ������� ��� � .������� ���+��� �&� ������� ���

������2����� � ��� ������"� ������� �.����� �� � ��� �����& ����"� �3������ �� ���������

� �-�1 �1!� �3.����� &�� � ����� � &�.�&������ ������"��� ������ � �&�� � ��.����� �"��������

�&�� �&� �.����4�-�1 ������ ��� �� �� � �� �� �&� ��"����� � �&� &�.�&��������������.��"����

$�-�% ����� �3��� 0 �� �������� +&��&� �-�1 �� �� � �� �� �&� ��"����� � &�.�&������ �"����� �"���

������ �-�1 �1!� �3.����� �� ��� +�� ����"�� �� �� ���� &�����5���� �� �&� &�.�&����"�

� ��� �"�6����� � ��"�� ��� �.����� ������� ������ ��"�� ����� ��"��� �� ������� �� �-�1 �1!�

�3.����� �� �&� &�.�&������ .� ����"�� .�� �����"�� �"���"� $.-/!% +&��� �.����� ������� �����

���"��� � �"������� ".���"����� � .-/! �-�1 �1!� �3.����� �� ������ ���� 1�� �� � ������"�

��"�������� �� ����������� ��� ��"���� �� �� �������� �3.����� � �-�1 �1!� �� �&� -/!�

�"�������� � ������ � ��"����� � �-�1 �1!� �3.����� �� ��"��������� 0&� �� � ��"�������� ��

��������� �&��� ���������"��� �&����� +�� �� ��������� �� ��������� �&� ������� � ��"�� ���

�.����� ������� ����� � �-�1 �1!� �� ��� �� �����������5�� ���� �� �&��� ���� �-�1 �1!� �3.�����

�� ��� ��� �� �&���� �� � �&� ������ ��� ���� �� ��� � �����������5������� ���� 0&��� ����

�"����� �&�� ��"�� ��� �.����� ����� �3�� � ����"���� ��7"���� � �-�1 �1!� �3.����� �� �&�

&�.�&������ �� �� �&�� ��� �� ��.������ � ����� �� ��� � ���"������ ��"��������� ��� �"�&�

�"����� � �� � �-�1 �� �&� ��"����� � &�.�&������ �"������

� �������� ������� � � ���� ������� �� ������ �� ���������� � ��� ��������������������������� ����� ����� �� ������� ������� ������� ����� �� �� �������� �� ���������������������� �������� � ��� ���������� �!� ��������� �� ��� ����� ������������� ������� � ��� ���������� �"! ��"!� ��� � ������� � #��� ������� �� ��� �������� $��� � ��� ����� ����������� ��� ��������� ����� #����� �� ���� �� ������� %������������� �%���� �� ��������$�� �� � �������� � �� ���������� ��� �"!� �&� �� ������� ������������������ ������ ���'�� �� ��� �������� �������� �(� %���� �� ���� ��������� ���������� ��� ����� �������)������ ������� �������������� #� ���������� ������� *�������� � �� ��� ���������� �� ��� �"!�� �������� #� ��������������� �+�� %���� ��������� � ����������� �� ��� �������� ������������ �������� � ��� �"! ��"!� ������ ���������� � ���������,� ��������� � ��������������� ������������� �������� #� ���������������� ������������ ���������� �-� .� ��� ���������� �/� 0� �!� ��������� �� ��� �"!�'���� � ���� ��� #� �������� #� ��� ������������� � ����������������� �1��

2���� �� �� ��� �3�� ��������� � �������� �������������'� ������� �� ����� ������� ���������� ����� �� #� ��������� ���������� ��� ��� ���� ������� �� � ��#�� � ������� ���������� ��������� �4� &5�� 6����� ��������$����� � �� ������������� %����� ��� ��� ��������� �������� � ��� ����������� �� ��� �"! �&&�� ����� �%� ����������� ���� ��#� ����� ���������� ������� ��� �����������'�� �������� ������#�� ����� ����� �&(� ��� #��� ������� ��

���� � ���������� � ��� �� �� ��� ���������� ������� ����������%��� ���������� � ��� ������ ���� �&+�� '��� ���������� ������ ����� ����� ������� ���7 �������� ��7�� %�� �������� ���������� � #����� ������ �&(�� '�� +/����� ���� ������������+/� �� ������� �� ��� ��������� ������ � � 00��������� ����������� *�������� ������&+ ��� ������&0� ��������� ������� � ������+/� ����#�� ������� #��������� �������� ���� �������� ����� �� ������������� ������ ����� ����#����� � ����8�������������� ��9� ���������� �&(�� '�� ����� : ������������� ������� �:���� ��7�� ��� ������� �������� �� �������������� �� �������� ��� �'&�� #�� ����������� �� ���� ���

������� � �������� ��������� ����� ���� ��� ���������

� (55+ ;���8%��� ��#������� <��

������������ � ��� 6� �����9���� =>�������� '�� 6������ ����8�� ;�������� 2������ *������ ?��������� � ;������� ;������ ;*& +!@� ?A ������B

�����������C#�����������8��

���� �� #��� �� ���� �� ��� ��7� �6!� �������� �� ������� ���� ����� �&-� ��� ���#������ ������ ��7� ���� �� � ������� ,����� ��������� �� � ��#�� � ���� ������,����������� ����& ���"�&� ������� �&.�� '�� ��������� � ��7� ����������� #� ������� ��������������������� ����� �������� ��!'(! ��������� � %����� ���� �� ��������� �� ���� ����������������� ���� ���� ������� �� #� �������� �� ���� ���������� ����� ��7� �!� ��������� %�� ���� �������� �� ����1&//�6-�������� '����� ���� ���������� ���� ��� ��������� #� �������� �� ��� '����� ��#���� �&/�� 2���� ���� ��������� ���� ��� ������ ���� ���� ��7� ��� � ���� �� ����� ������������������ ��� ������������ ����� � ���� ������� ��� ���������� ������ ��� ��� ���� 8��%������������ �!� �� ������ �������� �� ��� ��� #�����

��������� ������� ������� ������ ��� �� ��� ���������� �"!�&0�� %���� ���� ��������� � ����� ������������ ,#��� ��� ����#����� ���� #��� �������� �� ��� �"!� �������� ������� �*=!���� ����� ������� �&1�� �� �������� �� ����� #���8��� ����� � ��" ���� #������������ ����� !��(D�6- ����� ��������� ��7��&4�� ������&+ ��� ���� #��� ������� �� �������� �������� #������������ �������� ����� ���� ��� �������� ����8��� #�������� ������ �&0� (5�� ������� ������������� � ������&0 ���� %������������ ��� �������� �� � ������� ������� ���� ��� ���� � ��� ���������� ������� #� ����������� �(5� %����� �� � ������������ ������&+ %�� ���� �� �������� ���������� ��� �� ������� �� ���������� ������� �� ����� �&+��2� ���� ������� ��� ������� � ��� ��� ��7� �6!� �(&� ��

�#���� ����������� %��� ����� �#���� ������� ��������#�� ������ ���� �� � �#�� � ��� : �������������������� ���� ����� ��� ��7� �!� ��������� �� ��� #������� �������� ������� ��� ��#��E������ #��� ������� #� �� �������� ����� �(&F(+�� '�� ��7� ���� �� �������� �� � ��#�� � �������� ������� ��� �� �������� ����� � ��� �������� ��#� � ������������ ��� ��������� �� ���������� �� ��� ������� ������� ������������� �� ��� ����� �"! ��� ��������� ������������ ��������� � ��� �"! ��� *=!� ����� ���� ������� ��� ���� ���������������������������� ����� ��������� ����������� �(-��'��� ���������� ������#����� � ��7� ��� ����� �!��� ���������� �� ��� ������� � ���� � ����� �� ���������� ��� �� �������� �������� � ������ ���� �� ��� ������� �� ���������� ������� �������� #� ����������� ���������� ���������� ����������� ������� �� ������������ ���������� ���D�� �� ��������� ���������� �� ���������� ����� ��'� ����������'� ����������� ��� ���� � ��7� �� ��� ���������� � ��� ������

����� %� ������� ��� � ���� � 8��%� ��������� � ��� �������� ����� ����� ��� ������� ��������� ������ ��� �������������� �� ��� ��������� � ��7� �!� �� ��� �"!� 2� ������������� ��� E������� � %������ ������� � ���� �� ��������������� ������ ������� ���� �� ��7� �!� ��������� �� ������������� � ������������$�� ���� %������ ������������������������

������� ��� ������

��� ��������� ��� ���� �� ��� ��E�������� � ��� ?����� A����� ������

�*������,� ����������� ���� &41/�

��!���

9��� 2����� ���� �������� ����� %����� &.5 �� %��� �#������ �� ;����� ���

A����� ������ ?A� ��� %��� ��������� �� � &- B &5 � �����D���8 �����������

����� ������� �� �� 5.�55 �� %��� ��� ������ �� ��� ��� %����� ���� %��� ����%�� ��

��������$� �� &%��8 #� ��� ��������� %��� �������8��� ��� ��������� %���

������� ��� #��%��� 51�+5 � ��� &+�55 �� ���� %��� ������� �������� �� ����

���������� ����� ��� +F- �� ������ G��� ���� � ���� %�� ������ �� ��� ���

���� ��� ��� ��� ������ �� ��� ��� %���� ���� ��� ���������� ������

"�����

*����� ��������� ������ � & � � ��������� �� � ������ ����������� � �������F

������������ ������� ����%��� %���� ��� ������ %��� �������� �� ����� �����

��� 8����� + � ����� ������ �������� �� ������� ��������� �� & � ����� �� 4 ����

����%��� %���� ��� ���� %��� �������� �� ����� ����� ��� 8����� + � � ��� � ,���

��������� �� ��� 4 �������� �������� ��������� � ��� ������������ ����8 #���� %��

���������� ������ ���� �� (.55 ���� �� &5�� ��� ������ �� �(5 �� ����� �������

�� ��������������� '�� #����� %��� ������ ������� ��$�� �� ��� ��� ��� ������ ��

�15 �� ����� ����

������� ��!�

���� %��� ���������� ������������$�� ��6H� #� #�������� ������ ������� ��

����������� �*��9� ����� ����������� %��� �� ��� ��3������ �&�D&55 � #���

%������ � � ������ � ( B ( B ( ���#���������� �(I%�D���� �� &55I ������� �1I �D

�� ��� (������#�����(��� �&�(I �D�� �� 5�4I ������� ������� *��9 ���� %���

������� �� ��� ��� %�� �� �6H ���� %���� ��� �������� %��� ������ #�� ���

�������� � ��� �������� �6H ���� �������� 5�4I ������ �� ����8��� %����� =�� %��8

� ��� �������� ���� %��� ��#3����� �� ��������� �������

#$����!����� ������

G��������� ����� ��������� � B �&� �������J �(� ������� ��������J �+� ���������

��������J �-� ��� ������������ �*��9� ����������J �.� *��9 ������� ��������J

�/� *��9 ��������� ��������J �0� ������������$�� ��6H� ����������J �1� �6H

������� �������� ��� �4� �6H ��������� ���������

%�����!!��������

'���� ���� �������������� %�� ������� �&5 �� ���� ������� �� .55�� #� �������� �������� 8����� ������ #� 6� :� 9�8��� ���������� � G���������

9�������� ;������� ��������� ��� ����� %��� �������� �� ��� ��� ������

%��� ����������� ��������� ���� ���� &5I� '�� ������ %�� K&(.�L��������������� ���!

;���������� ������� ��� ?*�� %��� � ����,� �������� � (F+��D��� '������������� � ��� ����� %�� &5 ��D��

�� ���� &�'����(����� &���� &�!����� )*"++,

������� �������� �&( �� � #����� %��� ���%������� ���� �%������������ ���

����������������� ������ ��� ������ ���15 �� ����� ��#����$������ '%� ��7� ��#�

����� ������ � +.*���#���#� �� � �� � �%� +.*���#����� ��������� -1�#���

��������������� ��#��� %��� ���� �� ������ ��� ��7� �!�� '�� ��� ������

� ��������� %�� ���� %��� ���� ��� � ��#��� ��7� ��������������� ��#�� ���� ��

���� ����� %��� ;01� �.�� �'::���'':'��::���:'::�'���:�'��

:��'��::�':�:�:'��+�� ��� ;01; �.�� ��'':���������'�:�':�:���'''��:���::�:�:��'�:�:::�+�� ��� ����������� �� #����

-(-F-0& �;01�� ��� 05.F0.( �;01;� � ��� ��� ��7� �6!� ����� �:��;��8

��������� � &1-11+�� '�� ��7� +.*���#���#� %�� ��������� ����� � +�� �� 6!�

������ �� � ����� ��������� ��#������ ���� :G9�-M �������� 9�������

2�� ?*��� '�� ��������� ��������� %�� ���������� �� #���� +(0F14- � ���

��7� �6!�� *���� ��� ��������� ��#���#�� %��� ��������� ����� '0 ��� *�/

��������� %��� +.*�?'� ��� ��� 9�H������ �� ����� ������������ 8�� ��#����

������� 'H� ?*��� '�� ��������� � ��� ��#�� %�� ����,�� #� ����������� ��$��

������� ��� 6!� ��E�������� '�� ����,���� � ��� ��#�� ��� #��� ������#��

��������� �&4�� '�� ��������������� ��#�� %��� ��#����� %��� +.*���'� ��

������#�� �(.� ��� ���� �� ��������� ��#�� �� �*��� ��#����$����� %�� �������

��� �� ������#�� ��������� �(/�� ;���)�� �� ��� ��������������� ��#��� ��#����$��

���� %�� ������� ��� �� &1 � �� +0 �� ����%�� #� -� &.��� %����� �� .. �� ��

&�**�D&9 6'' ��� (� .��� %����� �� ��� ��� #� �� �� ��� ����������

�� ��� �!� ��#��� ��� +.*���#����� ��#�� %��� ����� �� ��� �������� �� &1 � ��

.. ��� � ��� ��#����$������ ��� �������� %��� %����� -� .�� %��� -� **� ��

��� ���������� +5�� �� +0 �� �� �!��� �������� �(5 ��D� �!��� � �� 5�. 9

!���� &59 '�������� � 1�5� 5�(.9 ������������������������� ������

(� .�� �� 5�&� **�D&9 6'' �� ��� ��������� ��� (� +5�� �� /. ���� 5�&� **�D&9 6''� ��� ������ %��� E���8�� ������ �� ��������� %����� �����

������ �� � ������ ������� ������ ��� ������ *����� %��� ������ �� A���8 H�� ,�

&54/ *����� � ���� �� ���������� ��7 ������� ���������

� (55+ ;���8%��� ��#������� <��� ������� � �������� ��������� ��� &54.F&&5&

�A���8� ���������� !@� ?*�� �������� %��� � ������ � &-� ��������� �� -%��8� ��

��� ���������� *����� %��� ��#��E������ ���� �� �� ��� A. ������� �������

��� ������ ���������� �� - �� �� -F/����� #� ��� ��������� ����� A���8 6&4

�� ��� ����������

"������� �� ��������

�� �*�� ����� �������� � ��� ��������������� ����� � ��#� #���� ���

�������$�� �� ,� %�� ������� ����� !�� ���� �� �%��� ����#���� �������

&�((J ���BDD��#��� ���������D��������D� ��� �� �� ��� 9�������� :- ����� -F/

�������� �� ���� ���� �� �!� ��������� ��� ��������� ����� %�� ���� ��� ���

�����#�� ���� �������� #� ��� =6 %�� ���������� �� ������� �� ���������� �� ���

��� ��� ������� #� ��� ����,� ������� ������ � ����� ���� %�� ���� �� �����������

��������� ��� ������ �� #� ������������� ������ %��� �������� �� ��� ��� ����� ��

����� ���������� �����#������ ��� ���� %��� �������� ����� ��� *���������� ���8��� ��

*����� *�������� ������� 4�5 �*�** ����� �������� �<� ?*�� �������� � ��������

��!="�� ����%�� #� ������>� ����� �� 5�5. %�� ���������� ������������� �����,�����

�*�� ������� ��� �������� �� ��� ��� ��������� ������ �� �������� �������� ��

��#������ ����� � &55� %��� *G9� ������������� �������� �� ��� �"! %���

�� ���������� �� ������������ �������� #���� �� ��� ��������� ������#�����

� ��� ����������� ��#�� �� ����������� %��� ���������� ��� �� ��#������ ��

��E������� ���������

�������

#� � � ��������� ������ �� ����!� ���� �������� �� ���������� )�$����!����� ������ ���,

����� �������������� �������������� ����� ��� ������� �����,������� �#��� ������ �� ������� ����� �� + � � ��� ����� ������������ 5�5&�� ��%����� �� ���� ������ �� ����� ������� �������������� �������������� �������������� %��� ������ �� ����� ��������� ���� � ��� &��

#� � � ��������� ������ �� -�% !% �$�������� �� �&� -�)�$����!����� ������ ���,

���������� %��� ��� ������� ����� �(&�� ��7� �!� ����������� ������� ���� %�� �#������ �� ��������� �������� � ��� �������������������� ��� ����� ������������ ������� � ��� ����������� �"! � ��� (��� ��7� �!� ��������� �� ��� �"!��������� �����,������ #� (-5� -5I �� ������� ��� 5�5&�� ��� /5�� � ��������� � ��� (; ��� +�� ��7� �!� ����������� ��� �"! � ���� ������ �� ����� ������� ��������� �� & � ����� �� 4 ���� %�� �����,������ ��%�� ���� �� ��� �"! � ����

� ��� ����� ��������� ��� 5�5&� � ��� +�� ��%����� ��7� �!���������� �� ��� �"! � ����� ��������� ���������� ����������� �������� ������ �� ������� ������ ��� �������� � 4.� &&I �� �������� �� 5�5&� � ��� (� ��� +�� <����� � ��7��!� ��������� �� ��� �"! � ���� %��� ��� ����� #� #�������� ��� ������� ��������� ������ � ��� +��

#� � � �������� ��!� ��� ��������� ������ �� -�% !%

�$�������� �� �&� -� )�$����!����� ������ .��,

�� ����������� ���������� ����� ������ -F/�� ��7��!� ��������� �� ��� �"! ��������� �� � ����� �������� ���� � ������� ����� ������ &F+� � ��� ����� ��� ���������������� ������ � ��� (6F ��� -��� �� ��� �"!� ����� ��������������� ����8�� � &0.� &.I �������� �� ��7� �!� ��������� �� ���������� ����������� ���� ��� 5�5&� ��� ���������������� ������ ����8�� � -.� .I �������� �� ��������������������� ���� ��� 5�5.� � ��� -��� �6H ������ 0F4�������� ��������� ��7� �!� ��������� �� ��� �"! ���������� ����������� ���� � ��� 0 ���� ��������� � +5&� (1I ������������� ������� ��� 5�5&� � ��� (: ��� -��� <����� � ��7� �!� �� ��� �"! � �6H ���� ������� �� ��� �������� �� ���������� �6H ���� � ��� #��� ����� ��� ���������������� ������ � ��� (�F� ��� -���;� ��������� �� ��� �"! � ����������� ����������

����� ������ -F/�� ������ � ��7� �!� ��������� %������ ����� #� #��� ����� ��� ������� ������ � ��� -;�� ��%������6H �������� �� �� �������� �� ��7� �!� ��������� �� ����"! � ���� ��������� � &&&� ++I �� ����������� ��������� ��� 5�5.� %���� ������� �� ��� ��� ������ � ��� ����������� �� ������� ��������� ������ � ��� -;��

!��������

�� ���� ������ %� ���������� ���� ��� ��������� � ��7� �!��� ��� ���������� �"! ��������� �3�� ������� ������ �������'���� ������� ������ ������ �������� �� � ���� � ��7� �������� �� ��� ���������� � ���������� ��������'�� ������������ ����� � ��7� ��� ����� ��� ��� ���� 8��%��

�� ��� �������� ��� ������� ��� #��� ��������� �� ���� � ���� ����� ��������� � ������� ������� �(0�� �����������������������$����� ��� ������������ �� ��� ������� ������ ������ ������������ ,�������� �� ��� 8����� �(&� %����� �� ��� #����� ��7���� #��� ���������� %��� �������������� �(1� ��� ������� #����������� ������� �(5�� ���������� ������� ������������� ��� �������$����� � ��7� ��� ����� ���������� ������� � ���� �� ����������� ��� ��� ������ �� ���������� ��� ���� ��������� ��7���� ��������� �!�� ���� #��� ������$�� �� ��� �"! ����������� �&0� (&�� %���� ����� ������������ ���� #����� ���,#��� ��� ������ �� ��� �"! ��� ����� ������� �&1�� ����������� ���� ��� �������� �� ��� ������� � ��� ���� ��������� �� ������� #��� ���%� ���� ������&+ �����,������ ��������� �� ������������� ������� �� ���������� ������� �� ����� �&+� %�������������#������������� ������������� � ����� ��������� ������������ � #��� ���� ��'� ��� �������������� ��� ������������� ������ � ��������� �������$��� ������ ��� ������������������� ������ �&+�� '�� ������$����� � ��7� �!� �������� �������������� %����� ��� �"!� ����� %��� ��� �������������� � ���� � ������ �������� � ������ ������ � ����� ����7������������ �������� �� ��� �"!� ������ ���� ����� ���

Control Acute stress Repeat stress

1500

1000

500

0

CO

RT

(ng

/ml)

*

���� &� ������� � �������������� ��=�'� �� �� ����� ��������� �� � ���������������� �� 4 ����� "����� ��� �������� �� ��� ����*G9� ��� 5�5&������ %��� ������� ���� �#� ����%�� �!="� ����%�� #� ������>� ������

� (55+ ;���8%��� ��#������� <��� ������� � �������� ��������� ��� &54.F&&5&

*����� � ���� �� ���������� ��7 ������� ��������� &540

�������� ���� ��� ����� ��� ��� ������� ��� �������� �� ��� �������� ���������� ���������� ��������� �� �������� ����� ������������� ���D�� �� �������� ������ �� ��� �"!����������� ���� �� ��������� ������ �� ������������ ��� �����

������ %��� ������� ��� ���� ��������� !������ ������� �������%� ���� ����� ������ ������� �� ��������� ������ � #��� �� ������������� �!�� �� ��� �"! �(4F+&�� ��%����� � �� ����������� �� ������� ���� � ��#�� � ����� ��������� �� ����������$����� � ��� ��� ���� ��� ������ ��������� �� ���������

������������� �� ���� ��������� �������� �4� +(�� "�������������� �� ��� � �3�� ���� �� ���� ������� �������� 2������������� � �� �!�� ��'� ��� �������������� �������������� ���� � ��� ������� ��������� ������ �+(� ++�� ����� �� ����������� ��������� � ���������� �!� �� ��� �"! �����%��� �� �������� �� ��� �������� � ����� ���� ��������� �� ��� ���������� �+-�� �� ��������� �� ������ ������� ������������� ��#����$������ �� ��� #��� ���%� ���� �� ����� ��������������� ����%��� ������� ��������� ������� �� � ���� �������� ��

���� (� '�� � ��� � ����� �� ������� ��������� ������ �� ����� ������� ���7 �������� ��7�� �!� ��������� �� ��� ���������� �������������� ���������"!� �� ������� ���;���� ����������� �6�G� � ��� ������������$�� ��6H� �:�� ��� �� ����� 6��8,��� ������������� ���% ��� ������#����� � ��7��!� ����� �"! � ����������� ���6�:�� ������� �������� �;�G��� ��� ��������� �������� ��� ��� ������� ��������������� ������ ������ ���� %����� '�� ����������������� ��� ��� �������� ������������ �9� ������� � ��� �"! ��� ���������� 9����,������ �-55�

� (55+ ;���8%��� ��#������� <��� ������� � �������� ��������� ��� &54.F&&5&

&541 *����� � ���� �� ���������� ��7 ������� ���������

���������� �#�� ��� �� � ������������� �!� �� ��� �������������"! �+.�� '���� #� �������� �� ����� ���������� ���������� ������� ��� �� ������� ������� �� ���������� ��� ��� ����������� �� ��� ��� � ������� ��� ������� ��������� �+5� +(��'�� ������� � �� ��� ���������� �� ��� �������� �������������� ������� ������� ����,� : ������������� ��������� ����� & ��� "&# ����� ����� "+� ��������� ������������ ;����������� �� & ��� "&# �������� ��� ��������� ��� ����������������� ���������� ������ ������� #�� ���� ������� �� "&#������� ������ ���� �� ������� ��� ������� �� �������� ��'�������������� �+(� +/�� ����������� �� ������� ������� ��������������� ���� ���� � �� ���� � ��� �� ��� �������� � ��� ��� ����������� � ���������� ��������������� #� ������������ ��������� �� ������� ���������� � ��� ��� ���� %��� �������� �� ������������� �!� ��������� �� ��� �"! �+(� +0� ��� � �������������� � ��'� �+1���� ���� ������ %� ������� ��� � ���� � ��� ���� ���������� ��

��7 �������� �� ��� �"!� ����� ��� ������� ��������� ������ �������������� ������ %������ ���������� ������� ���� ��� ������������� ������ %��� ����������$�� ������� �� ��� ������� ������������� � ���������� ��� �� ������ =�� ���� ���% ���� ��������� � ���� �������������� ��� � ��7� �!� �� ��� �"!�������� �����,������ �� ������� �� ����� ��������� ������� '�� ������������ � ��7� �!� ��������� ����� �� #� ������������ �� ��� �"! %��� �� �������� �� ��� ����� � �!��������� �� ������������ �������� �� %��� �� �� �������� �� ����#������ ��#�� � �������� ��������� ��� ��7� ����� '���������������� ������� �� ��������� �������� �� ���� ���� ����#��� ��������� ���������� �� 4 ����� %��� ������ ��������� ��������� ������� ;� ��������� %���� ��� ������ � ��7��!� �� ����"! � ��������� ���������� ���� ��� �����,������ ��%�� ���� ����� �"! � ���� � ��� ����� ���������� ��� ��7� �!� ������ ������� ��������� ���������� ���� ����� �������� ������ ��������� ������� '��� ��������� ������������ �� ������ �� �����#������ �� ���������� �!� ��������� �� ��� �"! � ���������� ��������� ������� ��� �������� ���� ��7� ���������� ������������� ������� ����� ���������� � ������� �������

:�������������� ��� %��� 8��%� �� ����� ��������� ���#��8� ���� �� ���������� ��� �� �!� ��������� �� ��� �"!�+(�� �� ��� ������ ������ ������ � ���������� ���������������#� ������������ �������� �� �� ��������� ��������� � ��7��!� �� ��� �"!� ������ �������� ���������� � ��7��!� ��������� #� ���������������� �� ����������� ��������������� ������ ��� �������� ������ ������� %� ������������ ��� ���� ��������������� ��������������� �� ��� �� �������� ��� ����������������������� ������� ���� �� ��7� �!� ��������� �� ���������� #� �������� ��� � ���� � ����� ��� ������� ��������� �������� �6H ���� %������ �������������� ���������� �� ��� �#����� � ��������������� �� �6H ����� ��� ������� �������� ������ � ��7��!� ��������� �� ��� �"! ������� �� ��� ��� ������ � ���#���� ������ �� ������ ����� �� ������� ��������� ������� '�������� ������� ���� ��� �������������� ������� ���� �� ��7� �!���������� ��� ��8��� �� #� ������������������������ ��%�����%� ������ �������� ���� ��� ��� ������� �������� ��7� �!���������� �� ��� �"!�� ��)��� ��� ������� ����� � �������������#��� �����E������ ���������� � ���� � ������ %���� ��� #�

AP

JR m

RN

A in

the

pPV

N(%

of s

ham

con

trol

)A

PJR

mR

NA

in th

e m

PV

N(%

of s

ham

con

trol

)

(A)

(B)

No stress Acute stress Repeat stress

No stress Acute stress Repeat stress

* **

*

#

+

0

100

200

300

400

500

Sham

ADX

0

100

200

300

400

Sham

ADX

**** **

���� -� '�� � ��� � ����� �� ������� ��������� ������ �� ����� ������� ���7�������� ��7�� �!� ��������� �� ��� ��� ���������� ��������������������� ��"!� ��� �;� ������������ �������������� ������� ��"!� ������������� �*��� �� ������������$�� ��6H� ����� "����� ��� ���������� ��������� � ��� � ��������*G9� ��� 5�5& ������ �� �������������������� ����J ���� 5�5. ������ �� ��������� ���������������J N�� 5�5& ������ �� ���������� ����������� ����J ��� 5�5.������ �� ���������� ����������� ���� �#� ����%�� �!="� ����%��#� ������>� ������

AP

JR m

RN

A in

the

PV

N(%

of c

ontr

ol)

Control Acute stress Repeat stress

*

*#

0

100

200

300

400

mPVN

pPVN

���� +� '�� � ��� � ����� �� ������� ��������� ������ �� ����� ������� ���7�������� ��7�� �!� ��������� �� ��� ���������� ����������������"!� ��� ������������ ��"!� �"!� "����� ��� �������� �� ���������� ��� � �������� *G9� ��� 5�5& ������ �� ���������� ������� ����JN�� 5�5& ������ �� ������� �������� ���� �#� ����%�� �!="� ����%�� #� ������>� ������

� (55+ ;���8%��� ��#������� <��� ������� � �������� ��������� ��� &54.F&&5&

*����� � ���� �� ���������� ��7 ������� ��������� &544

�������#��� ��� ���� �������������� ��������$�� �� ��� �������������� %���� �� ���� ������ ������ �6H� �� #� ��������� ������ ������� ��������� ������� ������ ��������� ��� ���������� �� ����#���� %������ ������� ��������D������������� ����������� �������� � ���� �� ��7� �!� ��������� �� ��������������:������������� ���������� � ������������ ��������������

�������� ��� #��� ��������� ������� �+4�� %���� ���������������� %��� ���%� �� �������� ��� ��������� � ����������8�����!� ��������� �� #��� ��� �"! ��� �"!� '�� ��������������,����� � ��������� ��7� �!� ��������� �� ��� �"!� ��� ������������ ��E����� ������ ������������������������ �� �� ������� %������ ������� �� �!� �������� ���

��7� ��������� �� ������� �� ��� ������ � ��������� ������� � %� ����� ���� ����������� �� ��7� �!� ��������� ��� ���������� #� ��������� ������� �� ������� ���������� ����� �������������� ���� ��� ��7� �� �������� �� ��� ������� � ��� ������������ �� ������� �� ��������� ������� ��%����� ����� �� � ����������#�� ������������� � �������������� �������� �� �� ��������������� �������� �� ��� ������ � ���������� � ������� ��������� �����������,� ���%���� �� %��� �� ����� ������ ���������� �������� ���������� #����������� ���#���� ��� ���� ������ ���� ����� �� ��� ���� ��������� 2������ ��7� ������������� �� ������� �� ������� �� ��������� ����� ���� ��������������� ������ �� #� ����#�������

��"�#����������

'��� %��8 %�� ������� #� ������ �� ��� ;������������ ��� ;��������� *�������

�������� ������� ��� '�� 2������ '�����

������� && *���#�� (55+

��$������

& '��� :� ����� �� �����$ �� �#����� � ��� �� ������������ �������� ��� �������������� ������� �� ������ � �������������8� ���������������� �������� ����� ��� ������

( :������ :G� <����� G�� <�%�� �7� ���������������������� �������� � �����% �� �� ���������� ������� ���� #� ����������� ����� ����� ����������

+ ���� A� 9���� '� '�8������ A� 9���8�� =� ��� @� *���8� *� @��������A� *����� !� *�������� #� �������������� � ��� �������������� � ���������������������� ����� ��� ���������� �� ��� ��������������������� � ��� ����������� ����� � /��� ���� ��� �������

- @���� 2* ���� 9�$�� G� *����� �G� O����������� �� ���� ��#����$������ ������������� ������� ��������� ������ � ���������������������� ����� �!� � ��� ������������ �� ����� ����� � /��� ����� ������� ��

. <������ *<� @���� 2* ��� ��)����� � �������� �� ��� �������������������������������� ����� ��� �������8������ �!� �������� ��������� -�� ��� �� " � 0" ����� � �� ���� �

/ 2�� ��� ;� 9������ �2� 6���� <:� �����$�� �� ;������� 7�� ���������$����� � ������������ ��������� ����� ��� ���������� �!� ���������� � ��� ������������� ����� ����� ���� �����

0 @����2* ���� 9�$�� G� *����� �G� "��������� ��� �������� �!�>� ��������������$�� ��� ;������#��� ����B �������� #� E����������� �� ������#����$����� �������������� 1�� 2���� %�� ����� �� �������

1 A����� A7� 9�$�� G� 6����������� ����#��� ���������������������� ����� ���� ��������� �� ��� ��� �������������� �������� �������� ��3������ ���� �� �������

4 ���#�$ 9*� <������ *<� *����� ��� ��� ������������������������������� ������ ������� ��� ����������� ����������� � #��� ����� ��������� ������

&5 �������� :� ���������� � �������� ��'� ��������� ������ ������� �������4���� �������� ����� ����� ��� ����� �

&& '��� :� ����� �� �����$ �� �#����� � ��� �� ������������ �������� ��� �������������� ������� �� ������ � �������������8� ���������������� �������� ����� ��� ������

&( '������ A� ������ 9� ��#��� @� �3�� �� A�8���%� '� M�� 9H�A�%���� @� �8���� *� ����� *� A����� �� A���8�%� '� =��� �� �3��� 9� ��������� ��� ����������$����� � � ����� ���������� ����������� �� ��� ���� ��7 �������� 2�� &�! 2���&�� %�� ��!!�� ��������� �����

&+ '����� *� 9���� A� ����� 9� *�38���� G� A������ �� 6����� 2� 6�8���� *�3��� �� :����� 9� ;��� *� '�� � ���� � ��������� �����������������&+ �� ��� ����8�� %���� ����8� ��� �������� ������ ������� ������� 2�� &�! 2���&�� %�� ��!!�� � �� ���� �� ������

&- =>6�%� ; � ���#�� 9� ���� �� ���� ��� '��� <�� A������ 7<� *�� H��������� �� :����� *�� !����� '� � ���� ���� ���� ���%� �������� %������ ���� �������� ��� ����������� ������� �� ������� �� �������� &&�5��� ����� ��� ����� �

&. ���� �� ��$�� 9� A��8�� 9� 9����� A� *�� @� 9����� <� ����#��# 9�;���� 9� 6�� 9G� :����� !� :����� �� *�����8� 7� '�� ����� ������������#���� ������� ��7 ������ ��� ����� � ����� '���������������� ��� ��������� ���� ������,������ ����� ����&� � ����� �������� ���������

&/ G������ �<� �� �� '<� *������ 9� <�� ;� @� @� ���� 2� A����� 6<�9������� ;� M��� @� ����� 6� ������ �:� ������������ 7� ����8 ��6�� �2� �� ����� ������������#���� ����� ������� ��������%����� �� ��� #���� �������� �� � ���������� �� ���� ������,������� ����� ����& ��� ����� ������,������ ������ � ����� ����� �������� �

&0 <�� 6A� ����� �� !����� '� �� '� A�����%��� ��� <�� @� =����6�� :����� *�� =>6�%� ; � ����������$����� � ������ ��� ������ ����� ��7 �������� � ���� &�! � � ��� �����

&1 ����� �� :�����$ A� ���8����� 9� <������������� �� 6�����#����� � ��������������$��� ������� �� ��� ����� ��� #����� ����� ��� � � ������ �������

&4 M�� 9H� <�� �@� ��������� @� *��� @� '������ A� ������� �� ����������� #���8 ��� ����� � ���� ������,������ ����� ���"�� 4#2"/��� � � ���� �����

(5 ����� �� 6�9��� !� *8��������� �� <��8�� M� G� 9������ *� :�����$ A������� �� ���8����� 9� <������������� �� ������������� ���� � � ���������������� ������ ��� ��� ������� �� ��� ��� #����� � ���� &�! � ����� � ��� ���

(& =>������� ��9� *��#� '� ���8����� 9� <����� *7� 6�����#����� � �!��������� ;01D�3� ��� ��� �������� � ��� ���� ��7 �������� ������ ���������� ������ ����� �� #���� ��� �������� �������� 2�� &�!2���&�� �� � � ����� �� �

(( ������ 9� A�%���� @� �8���� *� �3�� �� ��#��� @� ����� *�A����� �� ����� *� A���8�%� '� =��� �� !������� =� �3��� 9�9�������� ��� ��������� ��������������� � ��7� � 2��� �&�! � � ������ ���� ��

(+ 6� 9��� !� <��8�� M� <������������� �� �������� �����������������������$����� ��� #���� ������#����� � ��� ��� ����� �������� ��3������ �������� � � ��� � � �

(- @��� �� 2��� <� 7� :� G������� �� ���������� ��������������������� �� �� ����������� ������ � ������������������� �����!3!���!��������� ��� �� �� ���

(. @���� 2* ���� ;����� '�� ;���� 9�� 9����������� ������ ��������������� ��� ��������� � ���������� �!�� �� ��� ��� ���#����� -�� ��� �� " � 0" ����� �� ��������

(/ ;������ 67� '�%�� ��� @���� 2* ��� *����� ��� ������ ��������� � ����� ��� #����������� ������ ������� �!��� ��������� ��� #��� (���#���� �� ��� ��������� ������ ������� ������ � ����� � �������� ������ ��

(0 A�%���� @� ��#��� @� �8���� *� ������ 9� �3�� �� ����� *�!����$�%� !� A����� �� =��� �� !������� =� �3��� 9� 9���������������� � �����B ������ ������#����� ��� ������� #������� 2�� &�!2���&�� �� � �� ���� ������

(1 A�������� *6� 9������ 77� 9�����%��� *�� 6������� ��� K&(.�L�����&� ������&+ �� � ����� ����������� �� ������$��� ��� ��7 ������������ �� ���� ��� ��� ������� %��� �������� �� � ��������������� ������ ��� 2� � -&��!� �� � �� ���� ������� �

(4 <������ *<� @���� 2* ��� ���������������������� ������ ������������� ����������������� �!� �������� �� ������ ��� ������ �� ������� � -&����� ����� ���� �������

+5 9�8��� *� *��� 9�� :��� �2� ��������� ��������� � ���������������������� ������ ��� ���������� �������� ��#�������� ���� ��!���� ��� ���������� �������������� ������� ������ ������� ������B

� (55+ ;���8%��� ��#������� <��� ������� � �������� ��������� ��� &54.F&&5&

&&55 *����� � ���� �� ���������� ��7 ������� ���������

����������� %��� ��������� �� �������������� ������� �!� �������#��� �������� ����� ��� ������ ��

+& 9� H�9� <��� �� <������ *<� ���� ������� �� ������������� �!� ������������������������ ������ ��� �������� ���������� �� ������� ������� ������� � �������� ����� ���� ���� �����

+( �������� :� ���������� � �������� ��'� ��������� ������ ������� �������4���� �������� ����� ����� ��� ����� �

++ 9� H�9� <������ *<� '�� �������� ���������� ��� ���������������������� ������ ���� ������������ �������� �� ������ ��E�������� ������� ������ �� ����� � -&����� ����� ���� � �����

+- 6� :���3 6�G� 7�$��� 6� '������ 7� ������� ������ �������� ����������� ��������� �� ������������ ��������� ����� ������� �� ��� ��������������� �������� 2���� %�� ����� ���� �������

+. 9� H�9� <��� �� <������ *<� G������� � �� �������� ������������������ ��"�� ������� �� ������ � ��� ������� ���������� � ����� �

#��� �"� ��� ���������������������� ������ �������� ��#������������ �9�!�� ��� ������������� �!�� #��� �������� ���� �����������

+/ ��#�����6���� �� <����� *7� �������� :� ���������� � �������� ����������� "&# �!� ������ ������ �� ��� ���� � �������� ����� ����� ��� ��� �

+0 ��8� '� !��� 7�<� ������ �� *�%����8� �G� "��� 2� 6� ������������������ � ���������������������� ����� �!� �� ��� #���� ������� #���������������� ��� ������� � ����� � ����� ��� �������

+1 9���� =� :������ �� :��$ � ������ �� 6����� �������� �� ��������������������� ����������� � ��� ������������������ ������� �� � ���������� ��������� ������� �������� ����� �� ��

+4 ������� �� <� �� �� 7������ �� ���, �� ������� 9��� 6������� �� '���:� :�������������� ���������� ��� ��������� � ����������8���� �!��� ��� ��� �������������� �������� 2���� %�� � � ��� �������

� (55+ ;���8%��� ��#������� <��� ������� � �������� ��������� ��� &54.F&&5&

*����� � ���� �� ���������� ��7 ������� ��������� &&5&