FACULTATEA DE FARMACIEUNIVERSITATEA OVIDIUS CONSTANŢA

ANALIZA HPLC A COMPUŞILOR FENOLICI DIN PRODUSE OBŢINUTE

DINSTRUGURI

Coordonatori ştiinţifici:

Conf. univ. dr. Laura Bucur, Ş.L. dr. Antoanela Popescu

Student:

Ivanof Bianca- Mihaela

INTRODUCERE

Vinul a fost folosit din cele mai vechi timpuri cu scop terapeutic şi medicinal.

Pasteur spunea că "vinul este cea mai sănătoasă şi igienică băutură”.

Hipocrate recomanda vinul pentru stimularea poftei de mâncare, hrănirea şi întărirea trupului.

INTRODUCERE

Numeroase studii au arătat că vinul consumat în cantităţi moderate poate duce la reducere riscului apariţiei bolilor coronariene, întârzie apariţia tumorilor incipiente, inhibă adeziunea şi agregarea plachetelor sangvine, având remarcabile capacitaţi antioxidante.

S-a dovedit că efecte benefice ale vinului sunt datorate compuşilor fenolici din compoziţia sa. Concentraţii mari de compuşi fenolici de găsesc mai ales în vinul roşu, comparativ cu cel alb.

OBIECTIVELE LUCRĂRII

Evidenţierea compuşilor fenolici din diferite produse obţinute din struguri, prin folosirea analizei HPLC.

Studiul comparativ a trei produse obţinute din struguri din punct de vedere al conţinutului de compuşi fenolici (cantitatea lor corelată beneficiului terapeutic).

MATERIAL ŞI METODĂ

Pentru identificarea şi cuantificarea compuşilor fenolici s-a folosit o metodă HPLC standardizată conform monografiei USP30-NF25.

MATERIAL ŞI METODĂ

Condiţiile de realizare ale analizei HPLC au fost urmãtoarele:

Aparatură: HPLC Agilent 1200, pompă cuaternară, DAD, termostat, sistem de degazare, autosampler.

MATERIAL ŞI METODĂ

Condiţii de lucru: coloană cromatografică tip

C18, 250 mm, 4,6 mm; 5 µm (Zorbax XDB);

fază mobilă: Soluţia A – acid fosforic 0,1%; Soluţia B – acetonitril

temperatură: 350C;

debit: 1,5 mL/min; detecţie: UV 310 nm;

volum de injecţie: 20 µL;

timpul de analiză: 22 minute.

MATERIAL ŞI METODĂ

Analiza HPLC s-a efectuat pe trei produse diferite, obţinute din struguri:

PRODUS

Sirop Vitagrapes

Vin de casă

Vin Pinot Noir Murfatlar

Tabel I. Produşii folosiţi la analiza HPLC

MATERIAL ŞI METODĂ

Siropul Vitagrapes (Ropharma) a fost diluat cu alcool 50K în diluţtie 1:5 ( 5 ml sirop la 25 ml alcool 50K).

Soluţia s-a filtrat (prin hârtie de filtru şi microfiltre), iar filtratul s-a testat la aparatul HPLC.

MATERIAL ŞI METODĂ

Vinul de casă şi Vinul Pinot Noir Murfatlar s-au filtrat prin hârtie de filtru şi microfiltre. Cele două filtrate s-au testat la aparatul HPLC.

MATERIAL ŞI METODĂSubstanţe de referinţă

(soluţii în metanol 70%):

E - resveratrol = 37 mg/mL;

Z – resveratrol = 0,22 mg/mL (obţinut prin expunerea soluţiei de trans-resveratrol radiaţilor UV 254 nm, timp de 12 ore);

acid cafeic = 0,36 mg/mL;

acid clorogenic = 0,37 mg/mL;

acid cinamic = 0,58 mg/mL;

vanilină = 0,42 mg/mL;

acid galic = 0,39 mg/mL;

acid ferulic = 0,50mg/mL.

Nr. crt. Compus fenolic Timp de retenţie ± DS

1. E - resveratrol 14,467 ± 0,017

2. Z - resveratrol 15,751 ± 0,058

3. acid cafeic 4,598 ± 0,036

4. acid clorogenic 3,501 ± 0,015

5. acid cinamic 15,867 ± 0,007

6. Vanilină 6,919 ± 0,051

7. acid galic 0,990 ± 0,025

8. acid ferulic 8,565± 0,058

Tabelul II. Timpii de retenţie ai compuşilor fenolici, substanţe de referinţă

MATERIAL ŞI METODĂ

Figura 1. Cromatograma HPLC a amestecului de standarde

MATERIAL ŞI METODĂ

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

mAU

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

14.

457

15.

793

cis resveratrol

trans resveratrol

Figura 2. Cromatograma HPLC trans resveratrolului după expunere la UV

MATERIAL ŞI METODĂ

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

DAD1 A, Sig=310,4 Ref=360,100 (FERULIC15MCL.D)

8.5

78

acid ferulic

Figura 3. Cromatograma HPLC a acidului ferulic

REZULTATE ŞI DISCUŢII

În urma analizei HPLC, s-au identificat, E şi Z resveratrolul, vanilina şi acizii clorogenic, cafeic, galic şi ferulic. Cele trei produse diferă din punct de vedere al compuşilor identificaţi.

S-au cuantificat în urma analiziei HPLC următorii compuşi, în concentraţii diferite în cele trei produse analizate: E resveratrolul, vanilina, acizii clorogenic, cafeic, galic şi ferulic.

REZULTATE ŞI DISCUŢII

Produs E-

resveratrol mg%

Z-resveatrolul mg%

Acid clorogenic

mg%

acid cafeic mg%

vanilină mg%

Acid galic mg%

Acid ferulic mg

%

Sirop Vita Grapes

neidentificat neidentificat neidentificatneidentificat

neidentificat

95,770neidentific

at

Vin de casa neidentificat identificat neidentificat 0.374 0,451 5,868 0,116

Vin Pinot Noir 0.322 identificat 0,182 0,374 0,582 29,155 0,608

Tabelul III. Compuşii identificaţi şi concentraţiile lor în mg/100 mL produs

REZULTATE ŞI DISCUŢII

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

DAD1 A, Sig=310,4 Ref=360,100 (VITA.D)

1.0

67

acid galic

Figura 4. Cromatograma HPLC a compuşilor polifenolici din Siropul VitaGrapes

REZULTATE ŞI DISCUŢII

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

DAD1 A, Sig=310,4 Ref=360,100 (VIN DE CASA PROBA BUNA.D) 1

.102

4.6

28

7.1

76

8.2

80 15.

779

cis resveratrolacid ferulic

vanilinaacid cafeic

acid galic

Figura 5. Cromatograma HPLC a compuşilor fenolici din Vinul de casă

REZULTATE ŞI DISCUŢII

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

DAD1 A, Sig=310,4 Ref=360,100 (VIN PINOT NOIR.D)

1.0

92

3.5

18 4.6

23

7.1

77

8.5

61

14.

407

15.

990

cis resveratrol

trans resveratrol

acid ferulic

vanilinaacid cafeic

acid clorogenic

acid galic

Figura 6. Cromatograma HPLC a compuşilor fenolici din Vinul Pinot Noir de la Murfatlar

CONCLUZII

Prezenţa compuşilor fenolici în produsele analizete justifică folosirea lor pentru efectul antioxidant, antiinfecţios, vasoprotector, compuşii identificaţi avănd numeroase acţiuni, cum ar fi:

Acid galic – proprietăţi antifungice şi antivirale, acţiune citotoxică asupra celulelor tumorale, fără a le afecta pe cele sănătoase, este folosit în tratamentul albuminuriei şi al diabetului;

Acid cafeic – activitate imunomodulatoare şi imunostimulatoare, este antioxidant in vitro, dar şi in vivo, s-au demonstrat efecte antiinflamatoare şi anticanceroase pe celulele pielii;

CONCLUZII

Acid clorogenic – antioxidant in vitro, putând preveni apariţia Diabetului tip 2 şi a bolilor cardiovasculare;

Acid ferulic – antioxidant in vitro, reducând radicalii liberi (ce pot duce la apariţia cancerului, accelerarea îmbătrânirii celulare şi modificarea ADN-ului);

Resveratrol – acţiune estrogenică, antiinflamatoare, antitumorală in vitro pe diferite tipuri de cancer, hipocolesterolemiantă in vitro, are efect împotriva îmbătrânirii celulare, antioxidant in vitro şi antiagreagant plachetar, influenţând incidenţa bolilor coronariene .

VĂ MULŢUMESC PENTRU TIMPUL ACORDAT!