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Análisis Inmunofenotípico de los SLPc.

Aula Formativa Hematólogos Jóvenes, 24 de marzo 2011

Eugenia Fernández Mellid Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela

http://chusantiago.sergas.es/default.asp

Introducción

La citometría de flujo (CMF) estudia la presencia/ausencia deantígenos específicos (inmunofenotipo) en una población aestudio.

Para seleccionar los marcadores inmunofenotípicos (panel)que empleamos para estudiar una muestra nos basaremosen: Historia clínica. Hallazgos clínicos, analíticos y pruebas de imagen. Estudio morfológico. (Estudio CMF previo)

Poblaciones celulares/linajes a identificar: Linfocitos T Linfocitos B Células plasmáticas Serie mielomonocítica

2006 Bethesda International Consensus Recommendations on the Inmunophenotypic Analysis of

Hematolymphoid Neoplasia by Flow Cytometry: Optimal Reagents and Reporting for the Flow Cytometric

Diagnosis of Hematopoietic Neoplasia. Cytometry B Clin Cytom. 2007;72 Suppl 1:S14-22.

Interpretación y análisis del estudio mediante CMF

1. Linaje celular

2. Estadio madurativo.

3. Presencia de poblaciones clonales

4. Análisis del fenotipo de la población a estudio.

Análisis inmunofenotípico busca identificar:

Citometría de flujo en los SLPc

Síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPc): Proliferaciones de linfocitos maduros. Inmunofenotipo similar al de las células linfoides

maduras normales (ausencia de marcadores antigénicos de inmadurez).

Pueden ser: De células B De células T De células NK.

Muestras a analizar: Sangre periférica Aspirado de médula ósea. Muestras de células obtenidas por PAAF/biopsia de

ganglio, suspendidas en soluciones conservantes. Líquido ascítico, pleural, cefalorraquídeo….


IDENTIFICACIÓN DE POBLACIONES DE LINFOCITOS:

Basado en 3 marcadores:

CD19: Linfocitos B

CD3: Linfocitos T

CD56: Linfocitos NK.

Empleando CD45: proporción de lasdistintas poblaciones sobre la

celularidad total.

Citometría de flujo en los SLPc-B

Diferenciación linfoide B:

Dos fases:

1. Antígeno-independiente: tiene lugar en la

médula ósea (adulto)Linfocitos B

inmunocompetentes y autotolerantes.

2. Antígeno-dependiente: migración de linfocitos

B maduros desde la médula ósea a órganos

linfoides secundarios.


Población B anormal puede distinguirse: Cadenas ligeras de superficie:

Kappa o lambda. Ratio kappa/lambda <0,3 o > 4

Expresión aberrante de antígenos: Presencia de antígenos que no se expresan

normalmente en células de línea B (antígenos de línea linfoide T…)

Presencia de antígenos en una subpoblación de linfocitos B que se expresan normalmente en otras subpoblaciones pertenecientes a compartimentos biológicos/ganglionares distintos. (p.e Bcl2 en CD10+)

NEOPLASIAS DE LINFOCITOS MADUROS B


EXPRESIÓN ABERRANTE DE ANTÍGENOS: Expresión de CD5 y CD10:

CD5: molécula accesoria implicada en la modulación de los procesos de activación y diferenciación, expresada en la superficie de los linfocitos T y en una subpoblación de linfocitos B.

CD10: marcador de superficie de los precursores más inmaduros de linfocitos B

En función de la expresión de CD5 y CD10 distinguimos:

CD5+/CD10-

CD5+/CD10+

CD5-/CD10-

CD5-/CD10+


CD5+/CD10-

LLC-B Manto Otros

CD23+ CD23- Algunos LNH-B de zona marginal

Linfoma linfoplasmocítico

Linfoma B difuso de células grandes

…

Si CD 23 -/+d: ver CD200:

CD200++: LLC-B

CD200-/+d: Manto

Típicamente CD20 +d

CD22+d

FMC7-

Expresión débil de Igs de superficie

CD38

ZAP 70

CD20 +d/+

FMC7-/+d

LLC-B: ZAP-70 y CD38: valor pronóstico. ZAP-70: dificultades técnicas para una

determinación fiable: Marcador citoplásmico EDTA, tiempo… Positividades débiles

CD-38: determinación más fiable, aunque: No clara positividad/negatividad Células positivas y negativas en la misma muestra. Diferencias según fluorocromo, SP o BM… Variaciones en el curso de la enfermedad y tras

tratamientos.



ZAP-70 CD200


CD5-/CD10+

Folicular Difuso de células grandes

Otros

Bcl-2 +

CD43-

Bcl-2-/+d

CD43+

Burkitt en la infancia

Algunas Tricoleucemias.


LNH-B difuso de células grandes: No-centro germinal Centro germinal:

20-40% Habitualmente CD10+

Importancia diagnóstica de morfología y molecular.

Burkitt en la infancia: CD5-/CD10+ con elevada frecuencia Bcl-2 –,CD10++, CD43- Para diferenciar de LNHBCG tener en cuenta inmunofenotipo,

morfología, índice de proliferación y molecular.

Tricoleucemia: morfología y respuesta al tratamiento similar a las CD10-


CD5-/CD10-

Tricoleucemia Marginal Otros

CD20++

CD22++

CD11c++

CD25+

CD103+

Kappa/lambda superficie+/++

CD11c+/-

CD103+/-

Ocasionalmente

Kappa/lambda superficie –

Kappa/lambda citoplásmica+

LNH-B difuso cels grandes

Folicular CD10-

Manto CD5-


Tricoleucemia


•CD5+/CD10+:

•Neoplasias linfoides maduras B que expresen CD5 y CD10 son infrecuentes.

•Múltiples subtipos de LNH pueden presentar este fenotipo. Valorar:

•Morfología

•Tamaño celular (Folicular, Manto, LLC vs Burkitt, LDCG, LLA)

•Citogenética, FISH…

Tipo Marginal Tricoleucemia LLC-B Manto Folicular LNHBCG Burkitt

CD19 + + + + + +/- +

CD5 -/(+) - + + - - -

CD10 - +/-Variante-

- - + + +

CD22 + + +d/- + + + +

CD23 - - + - - - -

Igs Superf

IgM IgM,IgG +d/- + + +/(-) +

CD43 - + + - -/(+) -

FMC7 + + - +/(-) +/- +/- -/(+)

CD103 -/(+) + Variante +/-

- - - - -

CD11c -/+ +

Variante+/-

-/+ - - - -

CD25 -/+ +

Variante-

-/+ - - -/(+) -

CD20 +/(-) + + + + +(-) +

CD79b + + - + - + +

Inmunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. M C Béné, T Nebe, P Bettelheim, B Buldini, H Bumbea, W Kern, F Lacombe, P Lemez, I Marinov, E Matutes, M Maynadié, U Oelschlagel, A Orfao, R Schabath, M Solenthaler, G Tschurtschenthaler, A M Vladareanu, G Zini, G C Faure and A Porwit Leukemia , (21 January 2011) | doi:10.1038/leu.2010.312

Citometría de flujo en los SLPc-T/NK

•Mayor dificultad para identificar poblaciones inmunofenotípicas anormales de células T o NK->clasificación peor establecida.

•Diagnóstico clínico+morfológico+inmunofenotípico+molecular.

•Desde el punto de vista de CMF, población T/NK puede diferenciarse por:

•Expresión débil/fuerte/pérdida de antígenos T/NK(CD3, CD5, CD7)

•Expresión aberrante de antígenos B.

•Alteración ratio CD4+/CD8+

•Expresión TCR V-beta (preferible reordenamiento TCR por técnicas moleculares)

Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasm Fiona E. Craig and Kenneth A. Foon

From www.bloodjournal.org by on April 14, 2009


PANEL DE SCREENING:

Identificación de poblaciones linfocitarias: CD19, CD3, CD56

Panel B (población CD19+): CD5, CD20, CD22, CD23, CD103, CD10, Kappa-

Lambda de superficie, CD25, CD79b, CD38.

Panel T: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD7

Panel NK: CD56, CD57, CD45, CD158, CD94

Inmunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. M C Béné, T Nebe, P Bettelheim, B Buldini, H Bumbea, W Kern, F Lacombe, P Lemez, I Marinov, E Matutes, M Maynadié, U Oelschlagel, A Orfao, R Schabath, M Solenthaler, G Tschurtschenthaler, A M Vladareanu, G Zini, G C Faure and A Porwit Leukemia , (21 January 2011) | doi:10.1038/leu.2010.312

Figure 2

MANTLE ZONE CD19, CD20, CD22, CD79,

FMC7, sIg, bcl-1, CD5, CD43,

(CD10, CD23 neg)

FOLLICULAR CD19, CD20, CD22, sIg+, CD79,

CD10, bcl-2

(CD5, CD23, CD43 neg)

DIFFUSE LARGE B CELL LYMPHOMAS, sIg+,

cIg+, CD19, CD20, CD79, CD22++, CD79, CD10+

(CD5 rare cases, bcl-2, bcl-6, MUM-1 can be useful

for further classification)

BURKITT CD19, CD20, CD22,

CD79, sIg, CD10, DR, bcl-6

(CD5, CD23, Tdt neg)

T LYMPHOMAS AND ANGIOIMMUNOBLASTIC

CD5+/CD10+/CD3+/CD4+

SEZARY CD3, CD2, CD5, CD4, CD7+/-(CD8 neg)

LARGE CELLS ANAPLASTIC CD2, CD4, CD3+, CD30

PERIPHERAL CD2, CD3, CD5, CD4

ANGIOCENTRIC CD2, CD5, CD4 ou CD8, CD56

INTESTINAL CD3, CD7, CD103

ATLL CD3, CD4, CD25, CD45RO, CD7neg

MARGINAL ZONE CD19, CD20, CD22, CD79, sIg, FMC7, bcl-2,

CD23+ (CD5, CD10, CD43, bcl-6 neg)

NODAL MALT

CLL CD19, CD20, CD43,CD23, sIg+/-, CD5 (CD79 CD10, CD22,

FMC7 neg)

HCL CD19, CD20, CD22, sIg++, CD11c, CD25, CD103, CD123


INTESTINAL OR LUNG MALT

Follicular, mantle zone,

marginal zone

SLVL

circulating marginal zone cells

WALDENSTROM CD19, CD20+, CD22,

CD79 sIg+, cIg, FMC7 (CD5, CD10,

CD23 neg)

MYELOMA cIg, CD56, CD45+,

CD38, CD138


análisis inmunofenotípico de los slpc. - aghh.es · centro germinal: 20-40% habitualmente cd10+...

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