anÁlisis de flujos metabÓlicos en la producciÓn...
TRANSCRIPT
ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS EN LA
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO A PARTIR DE
Streptomyces clavuligerus
CLAUDIA PATRICIA SÁNCHEZ HENAO
Ingeniera Química, M.Sc.
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE INGENIERÍA
DOCTORADO EN INGENIERÍA
MEDELLIN (ANT.)
2013
ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS EN LA
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO A PARTIR DE
Streptomyces clavuligerus
CLAUDIA PATRICIA SÁNCHEZ HENAO
Ingeniera Química, M.Sc.
Tesis para optar al título de Doctora en Ingeniería
Director
JUAN CARLOS QUINTERO DÍAZ
Ingeniero Químico, M.Sc., Ph.D.
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE INGENIERÍA
DOCTORADO EN INGENIERÍA
MEDELLIN (ANT.)
2013
iii
Gracias Dios:
Por los dones que me has dado y por iluminarme
para saber cuál es el mejor camino a seguir,
por enseñarme a aceptar y aprender de las dificultades
y darme ánimos para seguir en la lucha de mis metas propuestas.
Porque he aprendido no sólo de los buenos resultados,
y de las excelentes personas que has puesto en mí camino,
sino también de aquellos que en ciertos momentos desearon hacerme daño.
Por permitirme ser un ser integral.
Debo este logro a la memoria de mi padre, por siempre creer en mí y brindarme su apoyo.
Inyectó energía a mi vida, mi hija, quien me motivo a continuar con mi trabajo.
Otra razón de inspiración, mi amor, quien me enseñó aprender a desaprender,
Sin duda, gracias a mis amigos y a toda mi familia por confiar en mí .
iv
AGRADECIMIENTOS
La autora expresa sus agradecimientos a:
La Universidad de Antioquia por su apoyo para iniciar mis estudios a través de la beca de
Estudiante instructor y posteriormente facilitar la culminación a través de Comisión de Estudios. Al
Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación - COLCIENCIAS, por financiar
mi estudios a través de la Convocatoria de Doctorados Nacionales – 2007.
La Universidad de Antioquia y a Colciencias, por el apoyo económico al proyecto ―Modelado
metabólico de la producción de ácido clavulanico‖ a través del contrato 227 de 2009 y por el apoyo
para dotación a través del proyecto de Sostenibilidad.
Los profesores evaluadores Claudio Avignone-Rosa, Pablo Iván Nikel y Rodrigo Torres por su
colaboración y disponer parte de su tiempo para la revisión, mejoramiento y sustentación de este
trabajo.
El Profesor Juan Carlos Quintero Díaz, Director de la Investigación, por sus enseñanzas, por su
compresión, por la confianza depositada en mí y la motivación durante el desarrollo del trabajo.
Los profesores Paloma Liras y Juan Francisco Martín por permitirme realizar la pasantía en
INBIOTEC y brindarme las orientaciones y acompañamiento para la realización de los cultivos de
producción de ácido clavulánico en este trabajo.
Los profesores Silvia Ochoa C. y Rigoberto Ríos E. por sus orientaciones para la realización del
proyecto modelado metabólico de la producción de AC y por su apoyo en este trabajo.
La estudiante de Maestría Nathalia Gómez Grimaldos por permitir profundizar más en los aspectos
de modelado cinético y por toda su colaboración en la realización de las pruebas experimentales y
en especial por su amistad.
Al profesor Rodrigo Torres Sáez y sus estudiantes Cesar Vargas García y Carlos García Sánchez
por su apoyo en el manejo del software CellNetAnalyzer y algunos tips para el trabajo en modelado
metabólico en sistemas subdeterminado (FBA).
La profesora María Esperanza López y el Ingeniero Cesar Augusto Botache por confiar en mí, y ser
mis codeudores ante el ICETEX en el crédito condonable concedido por COLCIENCIAS. Al
profesor Mauricio Sánchez por confiar en mí al servirme de codeudor ante la Universidad de
Antioquia para acceder a la comisión de Estudios.
Los integrantes del Grupo de Bioprocesos por su compañía, apoyo e interés en el buen desarrollo
de este trabajo.
A los profesores del Departamento de Alimentos de la Facultad de Química Farmacéutica, por
creer en mí y tener paciencia para la buena culminación de mis estudios doctorales.
Y a todos aquellos que se me escapan sus nombres de la mente, pero están en mi corazón y que de
alguna manera han estado colaborándome, como amigos o como personas silenciosas, pero
importantes también para el cumplimiento de esta meta.
v
ABREVIACIONES
AA
AAs
Ac.
AC
ACCOA
ACM
Aminoácido
Aminoácidos
Ácido
Ácido clavulánico
Acetil-coenzima A
Ac. clavamínico
dGTP
DHAP
DHC
DMC
proclavamínico
Deoxiguanosina-5 trifosfato
Dihidroxiacetona fosfato
Ac. dihidroxiclavamínico
Ac. dihidroxiclavamínico
Dimétil citraconato
AICAR 5-aminoimidazol-4- dTTP Deoxitimidina-5-fosfato
carboxamida E4P Eritrosa-4-fosfato
aIPM Alfa-isopropilmalato ED Entner- Deudoroff
aKG Alfa-cetoglutarato EMP Embden Meyerhoff Parnas
aKI
aKIC
Alfa-cetoisovalerato
Alfa-cetoisocaproato
F
F16P
Grados de libertad
Fructosa-1.6-bifosfato
aKMETVAL
ALA
APC
ARG
ARG-SUC
ASN
Alfa-ceto-beta-metilvalerato
Alanina
Ac. proclavamínico
Arginina, C-5
Argino-succínico
Asparagina
F6P
FADH2
FBA
FC
Fructosa-6-fosfato
Dinucleótido de flavina-
adenina (forma reducida)
Flux balance analysis, balance
de flujo metabólico
Fuente de carbono
ASP
ASPSEMALD
ATP
ß IPM
ß-LS
C55P
Aspartato
Semialdehido aspartato
Adenosina-5-trifosfato
β-isopropilmalato
ß-lactama sintetasa
Undecaprenil-fosfato
FN
FOBJ
FUM
G6P
GAP
GCL
Fuente de nitrógeno
Función objetivo
Fumarato
Glucosa-6-fosfato
Gliceraldehido -3-fosfato
Glicerol
C55PP
CAR
CARBP
CCHO
Undecaprenil-pirofosfato
Clavaldehído reductasa
Carbamoilfosfato
Clavaldehído
GCL3P
GLN
GLU
GLY
Glicerol-3-fosfato
Glutamina
Ac. glutámico
Glicerol
CEA
Ceas
CDP
CHOR
Carboxietil arginina
Carboxietil arginina sintasa
Citidina-5-trifosfato
Ac. corísmico
GPC
gN1P
gN6P
GTP
Ac. guanidinoproclavamínico
Glucosamina-1-fosfato
Glucosamina-6-fosfato
Guanosina-5-trifosfato
CITRU
CMP
CO2
CTP
CYS
Citrulina
Citidina-5-monofosfato
Dióxido de carbono
Citidina-5-trifosfato
Cisteína
HIS
HOMCYS
HSER
ILE
IM
Histidina
Homocisteína
Homoserina
Isoleucina
Ingeniería Metabólica
dATP
dCTP
D
DFM
DGPC
Deoxiadenosina-5-trifosfato
Deoxicitidina-5-trifosfato
Tasa de dilución
Distribución de flujos
metabólicos
Ac. deoxiguanidino-
ISOBUTCOA
ISOPP
LEU
LLDIAPIM
LYS
MAL
IsobutirilCoA
Isopentenil-pirofosfato
Leucina
Ac. LL-diaminopimélico
Lisina
Malato
vi
MCC
MET
Metabolismo central del
carbono
Metionina
TRP
TYR
Triptófano
Tirosina
METHF n5-n10-metilen-
tetrahidrofolato
UREA
UTP
Urea
Uridina-5-trifosfato
MP Medio de producción VAL Valina
MK-9H
NADH
Menaquinona-9-(reducida)
Nicotinamida-adenina-di
nucleótido-(reducida)
X5P Xilulosa-5-fosfato
NADPH Nicotinamida-adenina-di
nucleótido-fosfato-(reducida)
DGPC Ac. deoxiguanidino
proclavamínico
NAG1P N-acetil-glusosamina-1-fosfato 2METBUTCOA 2-metilbutirilCoA
NH4 Amonio 3METBUTCOA 3-metilbutirilCoA
O2 Oxígeno 3PG 3-fosfoglicerato,
OD Oxígeno disuelto
OAA Oxaloacetato
ORN
OTR
Ornitina
Velocidad de transferencia de
O2 (oxygen transfer rate).
OUR Velocidad de consumo de O2
por la célula (oxygen uptake
rate).
P Fósforo
PAH Proclavaminato
amidinohidrolasa
PEP Fosfoenolpiruvato
PHE Fenilalanina
PP Pentosa fosfato
ppGpp Nucleótido de guanosina
tetrafosfato
PRO
PRPP
Prolina
5-fosforibosil-pirofosfato
PYR Piruvato
R5P Ribulosa-5-fosfato
RIB5P Ribosa-5-fosfato
RNA Ácido ribonucleico (ARN)
mRNA Mensajero RNA
rRNA RNA ribosomal
tRNA RNA de transferencia
Sc Streptomyces clavuligerus
SED7P Sedoheptulosa-7-fosfato
SER Serina
SUC Ac. succínico
SUCCOA
T
Succinil-CoA
Temperatura
THR Treonina
vii
CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS .......................................................................................... iv
ABREVIACIONES ................................................................................................. v
LISTA DE TABLAS .............................................................................................. xii
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ xii
LISTA DE APÉNDICES ....................................................................................... xii
LISTA DE ANEXOS. ............................................................................................ xii
RESUMEN .......................................................................................................... xv
SUMMARY ......................................................................................................... xvii
INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 19
CAPÍTULO 1. ..........................................................................................................
SALUD PÚBLICA VS ENFERMEDADES INFECCIOSAS. ................................ 29
1.1. LOS ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS..................................................... 31
1.1.1. Generalidades. ............................................................................................ 31
1.1.2. Clasificación de los antibióticos. ............................................................... 33
1.2. RESISTENCIA MICROBIANA A LOS ANTIBIÓTICOS. ........................... 36
1.3. PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE β-LACTÁMICOS ................................. 38
REFERENCIAS ................................................................................................... 41
CAPÍTULO 2 ...........................................................................................................
METABOLISMO DE S. Clavuligerus .................................................................. 43
2.1. BIOLOGÍA DE Streptomyces sp. ................................................................. 44
2.1.1. Ciclo de Vida: ................................................................................................. 44
2.1.2. Clasificación del microrganismo en estudio: ................................................. 48
viii
2.1.3. Generalidades de algunos Estreptomicetos: .................................................. 49
2.1.4. Metabolitos secundarios producidos por Estreptomicetos: .......................... 51
2.2. CARACTERÍSTICAS METABÓLICAS DE Streptomyces .......................... 51
2.2.1. Requerimientos de energía. ....................................................................... 53
2.2.2. Síntesis de biomasa ................................................................................... 54
2.2.3. Ruta de Gluconeogénesis. .......................................................................... 54
2.2.4. Ruta de las pentosas fosfato. ..................................................................... 54
2.2.5. El ciclo de Krebs (ciclo de los ácidos tricarboxílicos). .............................. 55
2.2.6. Ciclo de la urea. ......................................................................................... 56
2.2.7. Biosíntesis de aminoácidos: ....................................................................... 57
2.2.8. Biosíntesis del ácido clavulánico y otras clavamas ................................... 63
2.3. REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO Y FORMULACIÓN DEL
MEDIO DE CULTIVO. ......................................................................................... 68
2.3.1. Fuentes de nitrógeno.................................................................................. 69
2.3.2. Fuentes de carbono: ................................................................................... 72
2.3.3. Estudios del efecto de la fuente de fósforo. ............................................... 73
2.3.4. Efecto de elementos trazas. ....................................................................... 74
2.3.5. Efecto del oxígeno .................................................................................... 75
2.4. TIPO DE OPERACIÓN: LOTE, LOTE ALIMENTADO y CONTINUO. ........ 78
2.5. MODELADO Y SIMULACIÓN EN BIOPROCESOS. ................................. 80
2.5.1. Modelado cinético de Streptomyces sp. ....... ¡Error! Marcador no definido.
2.5.2. Modelado metabólico .................................................................................. 85
REFERENCIAS ................................................................................................. 107
ix
CAPÍTULO 3 ...........................................................................................................
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO POR FERMENTACIÓN DE
Streptomyces clavuligerus: EVALUACIÓN DE DIFERENTES MEDIOS DE
CULTIVO Y MODELADO MATEMÁTICO. ....................................................... 115
3.1. INTRODUCCIÓN .................................................................................... 116
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 118
3.2. 1. Técnicas microbiológicas. ...................................................................... 118
3.2.2. Métodos analíticos .................................................................................. 120
3.2.3. Modelo matemático. ............................................................................... 121
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................... 122
3.3.1. Evaluación de los medios de cultivo. ....................................................... 122
3.3.2. Evaluación de la concentración de glicerol. ............................................ 124
3.3.3. Fermentación en biorreactor de laboratorio ............................................. 126
3.4. CONCLUSIONES ....................................................................................... 129
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 130
CAPÍTULO 4 ..................................................................................................... 133
UNA COMBINACIÓN DE ANÁLISIS DE SENSIBILIDAD Y AFM MUESTRAN
LA IMPORTANCIA DE LA ESTRATEGIA DE ALIMENTACIÓN DE
AMINOÁCIDOS PARA LA BIOSÍNTESIS DE AC EN Sc. ................................ 133
4.1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 134
4.2. MATERIALES Y MÉTODOS: .................................................................. 136
4.2.1. Técnicas microbiológicas. ....................................................................... 136
4.2.2. Métodos experimentales. ......................................................................... 138
4.2.3. Métodos analíticos ................................................................................... 141
4.2.4. Planteamiento de la red metabólica. ........................................................ 143
4.2.5. Análisis de flujos metabólicos y de sensibilidad. .................................... 146
x
4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 147
4.3.1. Cultivos en biorreactor en lote y continuo, para la producción de AC. . 147
4.3.2. Análisis cuantitativo del comportamiento metabólico intracelular. ......... 151
4.3.3. Análisis de la distribución de flujos metabólicos en Sc. ........................... 160
4.4. CONCLUSIONES ...................................................................................... 164
REFERENCIAS: ................................................................................................ 166
CAPÍTULO 5 ...........................................................................................................
ANÁLISIS DE BALANCES DE FLUJOS (FBA) EN LA PRODUCCIÓN DE AC
EN Streptomyces clavuligerus .......................................................................... 169
5.1. INTRODUCCIÓN .................................................................................... 170
5.2. METODOLOGÍA: .................................................................................... 172
5.2.1. Planteamiento de la red metabólica. ........................................................ 172
5.2.2. Análisis de balances de flujos metabólicos (FBA). ............................... 175
5.2.3. Evaluación de la función objetivo (FOBJ): ............................................ 176
5.2.4. Evaluación del efecto del flujo de nutrientes sobre la producción de AC. ...
................................................................................................................. 178
5.3. RESULTADOS Y DISCUSION .................................................................. 180
5.3.1. Ajuste del modelo metabólico evaluando tres funciones objetivo. ......... 180
5.3.2. Efecto de los flujos de nutrientes (C, O2, N, P) sobre la producción de
biomasa y AC y sobre algunos flujos metabólicos intracelulares. .......... 182
5.4. CONCLUSIONES ..................................................................................... 190
REFERENCIAS: ................................................................................................ 192
xi
LISTA DE TABLAS
CAPÍTULO 1.
Tabla 1. 1. Formulaciones comerciales, prescripciones médicas y microorganismos susceptibles de provocar enfermedades infecciosas ................................................... 32
CAPÍTULO 2.
Tabla 2. 1. Relación simplificada entre los aminoácidos y su producto de biosíntesis en la vía principal del carbono y los aminoácidos productos de síntesis .......................... 72
Tabla 2. 2. Importancia biológica de los elementos químicos en los microorganismos. 76
CAPÍTULO 3.
Tabla 3.1. Parámetros del modelo cinético estimados con un 95% de nivel de confianza, que fueron utilizados para la simulación de la fermentación de S. clavuligerus. ............................................................................................................... 127
CAPÍTULO 4.
Tabla 4.1. Parámetros del modelo cinético estimados con un 95% de nivel de
confianza, que fueron utilizados para la simulación de la fermentación de S.
clavuligerus 149
Tabla 4. 2. Valores de flujos medidos obtenidos a dos tasas de dilución. ............... 151
Tabla 4. 3. Análisis de sensibilidad para los flujos calculados con respecto a cambios en los flujos medidos ................................................................................................. 153
Tabla 4. 4. Reacciones que corresponden a los flujos medidos de mayor incidencia en el sistema, de acuerdo con el análisis de sensibilidad. .............................................. 160
CAPÍTULO 5.
Tabla 5. 1. Flujos medidos a una tasa de dilución de 0.03 h-1. 177
Tabla 5. 2. Condiciones de evaluación de los flujos de algunos sustratos a
condiciones de limitación de nutrientes. 179
Tabla 5. 3. Comparación entre flujos experimentales y simulados para diferentes
funciones objetivos (tasa de dilución 0.03 h-1). 180
xii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1.
Figura 1. 1. Estructura química de algunos antibióticos β-lactámicos 34
Figura 1. 2. Diagrama esquemático de una penicilina genérica, la hidrólisis catalizada por
β-lactamasa 38
CAPÍTULO 2.
Figura 2. 1. Ciclo de vida de Streptomyces sp. en medio sólido. 46
Figura 2. 2. Presentación jerarquica de la taxonomia de Streptomyces 48
Figura 2. 3. Morfología macroscópica de colonias de Streptomyces coelicolor. 50
Figura 2. 4. Esquema simplificado de requerimiento de precursores para la biosíntesis
de antibióticos 53
Figura 2. 5. Ruta de biosíntesis de ácido clavulánico y bifurcación hacia-ruta de las
clavamas. 66
Figura 2. 6. Esquema de un sistema de elementos que se tienen en cuenta para el
modelado en bioprocesos 82
Figura 2. 7. Diagrama de flujo de los pasos a seguir en la solución al modelado
metabólico. 88
Figura 2. 8. Presentación esquemática de la metodología empleada para realizar AFM.
90
Figura 2. 9 Modelo simplificado del metabolismo de S. clavuligerus 94
Figura 2. 10. Matriz estequiométrica correspondiente al ejemplo de estudio 94
Figura 2. 11. Desarrollo del AFM 95
Figura 2. 12. Representación esquemática de la metodología empleada para realizar
FBA 101
CAPÍTULO 3
Figura 3. 1. Efecto del uso de diferentes medios de cultivo sobre la producción de ácido
clavulánico (AC) 123
xiii
Figura 3. 2. Efecto de la concentración de glicerol (2, 5 y 10%), empleada como fuente
de carbono en cultivos de S. clavuligerus, sobre la producción de ácido clavulánico 125
Figura 3. 3. Cinética de fermentación de S. clavuligerus en un biorreactor de 5L,
empleando el medio 5 a una concentración de glicerol de 5%. 127
CAPÍTULO 4
Figura 4. 1. Representación esquemática del proceso de producción de AC en lote y en
continuo. 135
Figura 4. 2. Representación esquemática de la red bioquímica empleada para AFM en
Sc. 143
Figura 4. 3. Cinética de fermentación de S. clavuligerus en un biorreactor de 3L,
empleando el medio químicamente definido. 148
Figura 4. 4. Distribución de flujos metabólicos de la producción de AC a partir de
Streptomyces clavuligerus (Sc). 163
CAPÍTULO 5.
Figura 5.1. Representación sintética de la red bioquímica empleada para modelado
metabólico en Sc. 173
Figura 5.2. Representación simplificada de la red metabólica de Sc, incluyendo los flujos
intracelulares más representativos. 182
Figura 5.3. Efecto de la disminución del flujo de glicerol, sobre el flujo de AC y de
biomasa y sobre los flujos internos, "In Silico" para S. clavuligerus. 184
Figura 5.4. Efecto de la disminución del flujo de amonio, sobre el flujo de AC y de
biomasa y sobre los flujos internos, " In Silico" para S. clavuligerus. 185
Figura 5.5. Efecto de la disminución del flujo de oxígeno, sobre el flujo de AC y de
biomasa y sobre los flujos internos, " In Silico" para S. clavuligerus. 187
Figura 5.6. Efecto de la disminución del flujo de fosfato, sobre el flujo de AC y de
biomasa y sobre los flujos internos," In Silico" para S. clavuligerus. 189
xiv
LISTA DE APÉNDICES
CAPÍTULO 4
APÉNDICE A. Modelo de reacciones metabólicas para producir ácido clavulánico a
partir de Sc. 194
APÉNDICE B. Análisis de sensibilidad y de flujos metabólicos
Tabla B1. Análisis de sensibilidad de los flujos considerados como medidos. 196
Tabla B2. Análisis de flujos metabólicos, a dos tasas de dilución, en la producción de AC
a partir de S. clavuligerus. 197
CAPÍTULO 5
APÉNDICE A. Modelo de reacciones metabólicas para producir ácido clavulánico a partir
de Sc¡Error! Marcador no definido.
198
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1. IMPACTOS DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN 201
ANEXO 2. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA DERIVADA DE LA TESIS 205
xv
RESUMEN
El ácido clavulánico (AC) es un inhibidor β-lactámico que se usa combinado con otros β-
lactámicos con propiedades antibióticas para combatir algunas enfermedades infecciosas.
Actualmente se produce por fermentación a un costo elevado debido a que se obtiene en
muy bajas concentraciones (menores a 1 g L-1
). Hasta la fecha se han realizado importantes
avances para mejorar la producción de ácido clavulánico (AC) tanto por el estudio de las
variables ambientales que afectan su síntesis como por el establecimiento de las vías
metabólicas y los genes involucrados en éstas, encontrándose muy pocos trabajos que
involucran análisis de flujo. Para el mejoramiento genético de la producción de AC se han
empleado las técnicas mutaciones, lográndose algunos avances al respecto.
Con el presente trabajo se quiere resaltar la importancia de la aplicación del análisis de
flujo metabólico, una herramienta de la Ingeniería Metabólica, para incrementar la
producción de metabolitos de interés industrial, especialmente del ácido clavulánico
obtenido a partir de Streptomyces clavuligerus. La importancia de esta estrategia radica en
el análisis racional de las vías metabólicas para lograr identificar las enzimas responsables
de una óptima biocatálisis en donde se maximice el rendimiento y la productividad del AC.
Dentro de las metodologías usadas en ingeniería metabólica están: análisis de la capacidad
celular, análisis de flujo metabólico, análisis de control metabólico, síntesis de sistemas e
integración de datos bioinformáticos. En este trabajo se abordará el análisis de flujo
metabólico a partir de las rutas bioquímicas ya establecidas y del conocimiento fisiológico
y de fermentación existente. Para esto se validó alguna información de la literatura sobre el
medio de cultivo a emplear y las condiciones operacionales de producción en lote y en
xvi
continuo. Una vez obtenidas las cinéticas de fermentación en lote, las cuales fueron
referente de la investigación, se abordaron estudios en sistemas de operación continuos,
para evaluar, en estado estacionario, los flujos metabólicos de los diferentes compuestos
presentes en la ruta bioquímica ya definida, como glicerol, nitrógeno (asparagina), AC,
oxígeno y aminoácidos de forma directa y los otros de manera indirecta empleando el
balance de flujo metabólico tanto en sistema determinado (AFM) como subdeterminado
(FBA). Estos se calcularon a través de un modelo matemático del sístema en estado
estacionario haciendo uso del paquete computacional CellNetAnalyzer®.
El resultado obtenido sobre la cuantificación de los flujos metabólicos, sirvió para conocer
cuantitativamente el mapa metabólico de biosíntesis de AC y permitió realizar análisis de
distribución de flujos bajo diferentes condiciones y estrategias para proponer posibles
cuellos de botella, los cuales pueden servir para orientar posteriores trabajos de análisis de
control metabólico o mejoramiento genético para la biosíntesis de antibióticos en
Streptomyces clavuligerus. Se espera que conociendo las etapas controlantes de biosíntesis
de AC de Sc, se incremente el título de AC en la fermentación a través de modificaciones
genéticas u otras estrategias de alimentación de nutrientes y por ende se puedan disminuir
los costos de producción.
xvii
SUMMARY
Clavulanic acid (CA) is a potent β -lactamase inhibitor that is commonly used in
combination with other β -lactam antibiotics for the treatment of certain infection diseases.
Currently, CA is produced by fermentation at a relatively high cost, mainly because of the
low concentration levels that are achieved (typically below 1g L-1
). To date, there have
been accomplished important advances for improving CA production, both by means of
studying environmental parameters and culture medium, and by identifying metabolic
pathways and their related genes; however it has been found relatively few studies related
to flux analysis. Genetic improvements have also been performed for larger CA production.
This work is aim at highlighting the importance of performing metabolic flux analysis (a
Metabolic Engineering tool) for increasing the production of commercially important
metabolites, e.g. CA produced by Streptomyces clavuligerus. The importance of this
strategy relies on a metabolic-pathway rational analysis for the purpose of ascertaining the
enzymes responsible of optimal bio-catalysis, thus maximizing CA yield and productivity.
The following are the most frequently used methodologies in Metabolic Engineering:
analysis of cellular capacity, metabolic flux analysis, metabolic control analysis, systems
biology and data mining and bioinformatics.
In this work, metabolic flux analysis has been applied to the production of clavulanic acid,
based on the already established biosynthetic pathways, and the knowledge gained from of
Streptomcyes physiology and from fermentation studies.
.
xviii
Taking this into consideration, various experimental reports on culture media and batch and
continuous operation conditions were validated. Once the batch kinetic data, were
obtained, the continuous operation was performed with the aim of evaluating the steady
state flux distribution of the different external, internal and intermediate metabolites, e. g.
glycerol, nitrogen (asparagine), CA, oxygen and aminoacids. Flux measurements were
completed directly, by analytical techniques and indirectly by metabolic flux analysis
(MFA), for a determined system, and flux balance analysis (FBA), for an undetermined
system. MFA and FBA were calculated by means of a mathematical model of the system,
under steady-state conditions, employing the computational package CellNetAnalyzer®.
The results, related to metabolic flux quantification, were useful for quantitatively
deciphering the metabolic map of clavulanic acid biosynthesis; they also did allow
performing an analysis of metabolic flux distribution under diverse conditions, and to
advise strategies for proposing feasible bottlenecks that eventually would guide further
studies of metabolic control analysis and genetic improvements for the synthesis of CA in
Streptomyces clavuligerus. It is expected that knowing the controlling steps, CA titers
during fermentation would increase by virtue of genetic modification and feeding
strategies, thus contributing to reduce the costs of production.
19
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades infecciosas constituyen uno de los principales problemas de salud
pública en el mundo por la alta morbilidad y mortalidad que generan. Para la población
adulta se tiene un índice de mortalidad (número de fallecidos/1000 habitantes) 12 por
malaria y 15 por tuberculosis [1]. Este problema se ha venido combatiendo desde hace
cerca de 60 años con el uso de antibióticos, donde el descubrimiento de la penicilina, dio
origen a toda una familia de antibióticos, entre los que se encuentran los β-lactámicos.
La elevada exposición de los microorganismos a los antibióticos ha generado que
ocurran mutaciones naturales conduciendo a estos microorganismos a desarrollar
mecanismos de resistencia a los antibióticos. Este fenómeno ha obligado a la comunidad
científica a conducir investigaciones para obtener nuevos antibióticos y para mejorar los
procesos existentes para su obtención. La resistencia a los antimicrobianos se ha
convertido rápidamente en un grave problema de salud pública, con repercusiones
económicas, sociales y políticas de alcance mundial [2, 3].
El mecanismo de resistencia más frecuente entre las bacterias es la de no verse afectadas
por la presencia de antibióticos β-lactámicos, esto ocurre debido a la excreción de
enzimas β-lactamasas, que desdoblan el antibiótico impidiendo su acción. Para este tipo
de resistencia se ha encontrado una sustancia denominada Ácido Clavulánico (AC) que
actúa como inhibidor de las enzimas β-lactamasas, impidiendo que el antibiótico sea
desdoblado [4]. El AC posee baja actividad como antibiótico, pero es un potente
inhibidor de estas enzimas, por lo que se usa en conjunto con un antibiótico β-
lactámico, en formulaciones farmacéuticas.
20
El AC se produce mediante cultivo sumergido de la bacteria Streptomyces clavuligerus
(Sc) que emplea glicerol como su principal fuente de carbono, obteniéndose una
titulación menor a 1 g L-1
[5]. Este bajo nivel de producción hace que el AC tenga un
alto valor en el mercado causando dificultad de acceso para la población de bajos
recursos (la formulación combinada de amoxicilina y AC tiene un precio de mercado 40
veces mayor que el del antibiótico genérico amoxicilina). Por estas razones, se han
realizado múltiples investigaciones orientadas a incrementar la producción de AC
mediante la mejora del microorganismo y el proceso. Entre las estrategias que se han
empleado se encuentran tecnologías clásicas como mutagénesis aleatoria y
determinación de condiciones operacionales adecuadas para los cultivos, y otras
tecnologías más recientes como son la ingeniería genómica e ingeniería metabólica (IM)
[6].
La IM ha adoptado el nombre de ingeniería, dado que involucra dos aspectos esenciales
de ella, el análisis y la síntesis de procesos. En este caso, los procesos son las actividades
metabólicas que la célula lleva a cabo por medio de su metabolismo. En la célula se
llevan a cabo un gran número de reacciones que son acopladas y reguladas por otra serie
de reacciones y por sistemas selectivos de transporte membranal. La IM emerge a
comienzos de los 90s [6, 7]. Clásicamente, el mejoramiento de especies de
microorganismos (MO) para obtener metabolitos secundarios de interés industrial se han
basado en técnicas genéticas de selección y mutagénesis aleatoria, conllevando esto
muchos años de investigación, por lo que se pretende mediante IM racionalizar el
proceso de mejoramiento al disminuir el espectro de posibilidades de alteraciones
moleculares de la especie [8, 9]. Una de las herramientas empleadas para hacer IM es el
análisis de flujos metabólicos (AFM) que permite a partir de un modelo metabólico
21
establecido y mediante el uso de procedimientos matemáticos calcular los flujos
metabólicos intracelulares. A través de la comparación de diferentes cambios en los
valores de los flujos, se puede conocer o prever los efectos de perturbaciones
ambientales o genéticas sobre los metabolitos de interés. La metodología empleada para
llevar a cabo el AFM va desde la recopilación de información para el modelado
metabólico pasando por el desarrollo matemático necesario para hacer las respectivas
simulaciones hasta el análisis de las variaciones de los flujos intracelulares como
respuesta a perturbaciones [6, 8].
Se han realizado importantes avances en el estudio de las variables ambientales que
afectan la síntesis de AC y condiciones operacionales del proceso de fermentación. Entre
estos avances están el establecer que el glicerol y fuentes de nitrógeno complejas como
la harina de soja son nutrientes favorables para incrementar la titulación de AC y
lograr minimizar los efectos de represión catabólica por glicerol o amonio mediante
operación en continuo y en lote alimentado [5, 6, 9, 10, 11]. Los valores de producción
de AC observada en las diferentes investigaciones reportadas en la literatura, muestran
una gran variabilidad dependiendo de las condiciones de cultivo, el mejoramiento de la
cepa, el tipo de nutrientes, etc., y oscilan entre 50 y 1000 mg L-1
[5, 6]. También se ha
trabajado en la identificación de la vía metabólica y los genes involucrados en la
producción de AC, lo cual ha permitido establecer en mayor detalle la influencia de la
arginina y el glicerol en la biosíntesis de AC, establecer la importancia del ciclo de la
urea en esta bacteria, conocer las enzimas y los genes en la vía de biosíntesis de AC, y
conocer que a partir de ácido clavamínico (un intermediario en la vía de síntesis de AC)
22
se producen también otras clavamas que se ha encontrado, tienen propiedades anti
fúngicas y antibacteriales [9, 11].
Pocos trabajos con Sc se han orientado a la optimización del metabolismo para
identificar los efectos o las relaciones entre unos flujos metabólicos respecto de otros y
así orientar los flujos hacia la vía deseada, trabajos que se logran a través del uso del
AFM [9,12]. Esto se puede explicar porque solo hasta hace pocos años se han
confirmado ciertas reacciones de biosíntesis para la producción de AC [9,12] y tan sólo
en el 2011 se obtuvo un modelo metabólico a escala genómica de S. clavuligerus [13,
14]. Con esta nueva información es posible seguir realizando investigaciones que
permitan hacer inferencias importantes sobre el comportamiento de este
microorganismo, no sólo en la producción de una clavama como el AC, sino también en
la producción de otras como alanilclavama y en la producción de cefamicina
Existen pocos trabajos orientados al planteamiento de modelos matemáticos que
describan el comportamiento cinético del Streptomyces [6, 15] y los que hay han sido
propuestos para cultivos en medios químicamente definidos, estos modelos son de gran
importancia pues permiten analizar posibles fenómenos involucrados en el crecimiento
como inhibiciones, sustratos limitantes, importancia del consumo de sustrato para
mantenimiento celular, etc. Así como emplearlos para predecir la producción de
metabolitos y crecimiento celular a diferentes condiciones ambientales deseadas. Por lo
anterior, el planteamiento de modelos cinéticos que ajusten a los resultados
experimentales permitirá avanzar en el entendimiento del proceso tendiente a
incrementar la producción de AC. En esta misma dirección, son relevantes los estudios
para evaluar el efecto de la limitación de los nutrientes esenciales sobre el crecimiento
23
celular y la producción de AC, sin embargo hay pocos estudios relacionados que
emplean la técnica de AFM [16], también se han realizado trabajos analizando el efecto
de suplementar al medio de cultivo aminoácidos, especialmente de la familia del
aspartato, analizando sus efectos mediante el uso de AFM [12], o empleando modelos de
caja negra [6, 17], pero no se ha determinado la incidencia que tiene el tipo de
aminoácido sobre el metabolismo global y como un efecto combinado entre los
aminoácidos y el metabolismo central del carbono sirve para detectar puntos críticos del
proceso.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en donde se indica que tanto las fuentes de C
y N y algunos aminoácidos afectan significativamente la producción de AC, se propone
como hipótesis de trabajo que es posible plantear un modelo matemático que describa el
proceso de crecimiento y producción de AC como función de algunos de estos factores
así como la posibilidad del empleo de las técnicas de AFM para identificar los efectos de
estos mismos factores en el metabolismo celular que finalmente conduzcan a generar
efectos en la síntesis de AC.
Con base en la hipótesis planteada se propusieron los siguientes objetivos para
desarrollar en esta Tesis:
Objetivo General:
Evaluar y modelar la producción del Ácido clavulánico (AC) por fermentación de
Streptomyces clavuligerus (Sc) e identificar el efecto sobre el modelo metabólico de Sc
de los principales factores que afectan la producción de AC.
Objetivos específicos:
24
1) Identificar y modelar la cinética de fermentación de Sc en un reactor de tanque
agitado a escala de laboratorio;
2) Establecer las posibles rutas bioquímicas en Sc para la producción del AC, de
acuerdo con los reportes en la literatura.
3) Evaluar el comportamiento de flujos metabólicos de la ruta bioquímica propuesta en
función de cambios en los flujos de algunos aminoácidos y de las fuentes de C, N,
P, O
La presentación de este trabajo de investigación está estructurado en capítulos, en los
cuales los dos primeros corresponden a aspectos teóricos que permitieron la justificación
de este trabajo y la orientación del trabajo experimental para lograr los objetivos
propuestos. Los capítulos 3, 4 y 5 corresponden al trabajo experimental realizado para
lograr los objetivos propuestos, mencionados anteriormente y están estructurados en
formato de artículo, donde se incluye resumen, introducción, resultados y discusión,
conclusiones y referencias empleadas. A continuación se darán algunos aspectos que se
abordaran con mayor detalle en cada uno de los capítulos:
En el capítulo 1 se presenta un contexto del problema de la salud pública causada por
enfermedades infecciosas generadas por microorganismos patógenos que tienden a
desarrollar resistencia a los antibióticos y cómo el AC ha entrado a jugar un papel
protagónico para contrarrestar dicha resistencia.
En el capítulo 2 se presenta un marco teórico general sobre los aspectos relacionados
con la producción del AC, incluyendo las condiciones de crecimiento y mantenimiento
de Sc, así como las condiciones de producción de AC incluyendo el modelado del
proceso. Sobre el modelado del proceso se tuvieron en cuenta los conceptos teóricos de
25
dos tipos de modelado, uno cinético y otro metabólico. Se presentan algunos modelos
de tipo cinético que se han aplicado para la producción de antibióticos, entre los que se
encuentran modelos tipo Monod y Contois. Sobre el modelado metabólico se presentan
los aspectos que se deben tener en cuenta para su concepción hasta algunas de las
diferentes posibilidades de desarrollo matemático que existen y se han aplicado a este
tipo de microorganismo.
En el capítulo 3, se presentan los estudios de producción de AC con diferentes medios
de cultivo: Medios complejos y medios químicamente definidos. También se propone un
modelo cinético y se evalúa su capacidad de ajuste a resultados experimentales,
permitiendo así la identificación de algunas características del proceso con respecto al
crecimiento y a la producción de AC.
En el capítulo 4, Se evaluó la distribución de flujos metabólicos de Sc. empleando un
modelo metabólico reducido, de 60 reacciones con 47 metabolitos, a partir de datos
experimentales obtenidos en cultivos quimióstato a dos tasas de dilución. Este trabajo
permitió analizar la producción de AC usando una cepa salvaje de Sc y diversas
estrategias de enriquecimiento de medios. Adicionalmente se estudió la distribución de
flujos metabólicos como resultado directo de la adición de aminoácidos y cambio de tasa
de dilución, permitiendo hacer una descripción cuantitativa del efecto de la variación de
flujos metabólicos individuales sobre la acumulación de AC.
En el capítulo 5 se estudió ―in silico‖ el comportamiento de los flujos metabólicos de Sc
para la producción de AC en función de cambios en las condiciones nutricionales del
cultivo tales como consumo de fuente de carbono, nitrógeno, fósforo y oxígeno
empleando como función objetivo maximización del flujo de ATP. Para esto se empleó
26
un modelo metabólico ampliado de 100 reacciones con 91 metabolitos, en el cual la
reacción de biosíntesis de biomasa de Sc es más detallada que la empleada en el
capítulo cuarto, se consideró un mayor número de aminoácidos y macromoléculas. .
Este trabajo permitió hacer una descripción cuantitativa del efecto de la variación de los
flujos de los nutrientes sobre la generación de biomasa y la acumulación de AC e
identificar los cambios en los flujos internos de mayor importancia.
27
BIBLIOGRAFIA
[1] OMS, ―Estadísticas sanitarias mundiales 2012,‖ 2012. http://www.who.int. Consultada
en febrero de 2013.
[2] C. Cabrera, R. Gómez y A. Zuñiga, ―La resistencia de bacterias a antibióticos,
antisépticos y desinfectantes una manifestación de los mecanismos de supervivencia y
adaptación.,‖ Colombia Médica, vol. 38, no. 2, pp. 149–58, 2007.
[3] M. Chroma and M. Kolar, ―Genetic methods for detection of antibiotic resistance: focus
on extended-spectrum β-lactamases,‖ Biomedical papers of the Medical Faculty of the
University Palacký, Olomouc, Czechoslovakia, vol. 154, no. 4, pp. 289–96, 2010.
[4] M. Papagianni, ―Recent advances in engineering the central carbon metabolism of
industrially important bacteria,‖ Microbial Cell Factories, vol. 11, no. 50, pp. 1–13,
2012.
[5] L. Domingues, J. Teodoro, C. Hokka, A. Badino and M. Araujo, ―Optimisation of the
glycerol-to-ornithine molar ratio in the feed medium for the continuous production of
clavulanic acid by Streptomyces clavuligerus,‖ Biochemical Engineering Journal, vol.
53, no. 1, pp. 7–11, 2010.
[6] P. Saudagar, S. Survase and R. Singhal, ―Clavulanic acid: a review,‖ Biotechnology
advances, vol. 26, no. 4, pp. 335–51, 2008.
[7] G. Stephanopoulos, A. Aristidou and J. Nielsen, Metabolic Engineering: principles
and metodologies. Ed. Academic Press, Edición: 1, San Diego, 1998, p. 723.
[8] H. Shimizu, ―Metabolic Engineering — Integrating Methodologies of Molecular
Breeding and Bioprocess Systems Engineering,‖ Journal of bioscience and
bioengineering, vol. 94, no. 6, pp. 563–73, 2002.
[9] R. Li and C. Townsend, ―Rational strain improvement for enhanced clavulanic acid
production by genetic engineering of the glycolytic pathway in Streptomyces
clavuligerus,‖ Metabolic engineering, vol. 8, no. 3, pp. 240–52, 2006.
[10] M. Cvijovic, S. Bordel and J. Nielsen, ―Mathematical models of cell factories: moving
towards the core of industrial biotechnology,‖ Microbial Biotechnology, vol. 38, no. 2,
pp. 149–58, 2007.
[11] P. Liras, J. Gómez-Escribano and I. Santamarta, ―Regulatory mechanisms controlling
antibiotic production in Streptomyces clavuligerus,‖ Journal off Industrial Microbiology,
vol. 35, pp. 667–676, 2008
[12] M. Bushell, S. Kirk, H. Zhao and C. Avignone-Rossa, ―Manipulation of the physiology
of clavulanic acid biosynthesis with the aid of metabolic flux analysis,‖ Enzyme and
Microbial Technology, vol. 39, no. 1, pp. 149–57, 2006.
[13] I. Borodina, P. Krabben and J. Nielsen, ―Genome-scale analysis of Streptomyces
coelicolor A3 (2) metabolism,‖ Genome Research, vol. 3, no. 2, pp. 820–29, 2005.
[14] M. Medema, M. Alam, W. Heijne, et al, ―Genome-wide gene expression changes in an
industrial clavulanic acid overproduction strain of Streptomyces clavuligerus,‖ Microbial
biotechnology, vol. 4, no. 2, pp. 300–05, 2011.
[15] A. Baptista-Neto, E. Gouveia, A. Badino-Jr and C. Hokka, ―Phenomenological model of
the clavulanic acid production process utilizing Streptomyces clavuligerus,” Braz. J.
Chem. Eng, vol. 17, no. 4–7, 2000.
28
[16] S. Kirk, C. Avignone-Rossa and M. Bushell, ―Growth limiting substrate affects antibiotic
production and associated metabolic fluxes in Streptomyces clavuligerus,‖ Biotechnology
Letters, vol. 22, pp. 1803–09, 2000.
[17] L. Domingues, J. Teodoro, C. Hokka, A. Badino and M. Araujo, ―Optimisation of the
glycerol-to-ornithine molar ratio in the feed medium for the continuous production of
clavulanic acid by Streptomyces clavuligerus,‖ Biochemical Engineering Journal, vol.
53, no. 1, pp. 7–11, 2010.
29
CAPÍTULO 1.
SALUD PÚBLICA VS ENFERMEDADES INFECCIOSAS.
En 1928, el científico británico Alexander Fleming observó los efectos antibióticos del
moho Penicillium notatum. El producto de este hongo aparentemente modesto mostró
ser tan eficaz para combatir infecciones anteriormente consideradas mortales, que
desencadenó una revolución sanitaria sin precedentes en los anales de las ciencias
médicas. De esa primera muestra surgió toda una familia de antibióticos derivados de la
penicilina. Entre los antibióticos descubiertos posteriormente figuran las
estreptomicinas, tetraciclinas, quinolonas, antimicóticos, antiparasitarios y, más
recientemente, antivíricos. Estos medicamentos, llamados colectivamente
«antimicrobianos» han evitado muchas muertes, han reducido tanto la morbilidad como
las enfermedades nosocomiales (intrahospitalarias) [1, 2].
Después de la gran cantidad de descubrimientos efectuados entre 1930-1970, vinieron
unas décadas donde han sido menos los hallazgos en la lucha contra las enfermedades
infecciones. La búsqueda de nuevas moléculas que logren contrarrestar las enfermedades
infecciosas continúa, y se han realizado grandes avances en el desarrollo y
mejoramiento de los procesos existentes para incrementar los rendimientos [1]. Los
antibióticos β-lactámicos aún siguen aportando en el mejoramiento de la calidad de vida,
dado que se continúa investigando en el incremento en los rendimientos en los procesos
existentes como en el descubrimiento de nuevas moléculas [3].
30
Las enfermedades infecciosas constituyen la tercera causa de muertes en el mundo, en
especial en los países de bajos recursos económicos. El mayor problema se tiene con la
malaria y la tuberculosis con unos índices de mortalidad (número de muertos por cada
cien mil habitantes) de 12 y 15 respectivamente y los índices de morbilidad fueron de
3000 y 128 por cada cien mil habitantes por año, respectivamente [4, 5]. Para niños
menores de cinco años, se tiene un índice de mortalidad de 65 por cada mil nacidos
vivos. América Latina se encuentra entre las regiones con más alta incidencia de brotes
nosocomiales producidos por bacterias que presentan resistencia a múltiples antibióticos
[6]. Colombia como gran territorio tropical tiene per se una alta incidencia de
enfermedades infecciosas, siendo estas relevantes en todos los grupos de edad. Se tiene
proyectada para el quinquenio de 2010 a 2015 una mortalidad infantil en menores de
cinco años de 12.5 por mil nacidos vivos [7].
La forma de contrarrestar una infección es mediante el uso del antibiótico que se
clasifican de acuerdo con su función sobre la célula, más que de acuerdo con su
estructura química. Un antibiótico puede buscar la inhibición de la síntesis de la pared
celular (β-lactámicos, polipéptidos o glucopéptidos), de la síntesis de proteínas
(macrólidos, lincosaminas, aminoglucósidos, tetraciclinas y anfenicoles), del
metabolismo bacteriano (sulfonamidas), la actividad o síntesis del ácido nucleico
(aminoglucósidos, tetraciclinas, macrolidos, etc.) o alteración en la permeabilidad de la
membrana celular [8, 9]. Sin embargo, las bacterias pueden generar mecanismos de
resistencia que las protegen contra la acción de los antibióticos [10]. Las infecciones
causadas por bacterias resistentes a los antibióticos β-lactámicos son tratadas con
frecuencia con dos drogas: Una es la penicilina que inhibe la síntesis de la pared celular
de las bacterias patógenas y el otro es un inhibidor de las β-lactamasas evitando así la
31
hidrólisis de la penicilina [8]. Hay tres inhibidores de β-lactamasas de uso clínico AC,
Sulbatam y Tazobactam, el primero producido a partir de S. clavuligerus y los otros
obtenidos por síntesis química. En la tabla 1.1 se presenta las diferentes formulaciones
de estos inhibidores con alguna β-lactamasa de uso comercial de acuerdo con la
indicación médica y el microorganismo susceptible de provocar la enfermedad [9, 11].
Las aplicaciones y usos de estos inhibidores y nombres comerciales cambian de acuerdo
con los países y las regiones [8, 11], por ejemplo en varios países Europeos, Japón e
India se utiliza más Cefoperazone-Sulbatam, el cual no se comercializa en E.U. (Estados
Unidos) [11], . Dada la importancia de encontrar nuevas moléculas activas que
contrarresten las enfermedades infecciosas, se están realizando estudios para demostrar
la eficacia clínica de nuevos inhibidores como son penems, derivados de monobactamas
de penicilinas y cefalosporinas [11, 12].
1.1. LOS ANTIBIOTICOS β-LACTÁMICOS
1.1.1. Generalidades.
Los antibióticos β-lactámicos representan el grupo de antibióticos más numeroso y de
mayor uso en la clínica. Su nombre se debe a la presencia de un anillo β-lactámico en su
estructura conformado por un oxígeno en la posición β con respecto a un nitrógeno (ver
figura 1.1). De acuerdo con los radicales que se unen al anillo se derivan diversos
subgrupos, los cuales se mencionarán más adelante. Pero antes se describirá el
mecanismo general de cómo estos antibióticos logran destruir la bacteria infecciosa.
Las bacterias tienen una pared conformada en parte por peptiduglucano que tiene como
función la estabilidad osmótica y proteger la célula. Este compuesto no está presente en
32
Tabla 1.1. Formulaciones comerciales, prescripciones médicas y microorganismos susceptibles de provocar enfermedades infecciosas [11].
Formulación β-lactámico-
inhibidor β-lactámico
Nombre comercial /
manufactura
Indicación clínica aprobada
Eficacia clínica demostrada para estos microorganismo susceptibles de provocar
enfermedades Amoxicilina-
clavulanato
Augmentin /
GlaxoSmithKline
Otitis media
Neumonía, sinusitis
bacteriana
Infecciones en la piel
Infecciones en el tracto
urinario
S. pneumoniae, H. influenzae,
Moraxella catarrhalis
H. influenzae,M. catarrhalis, K y S.
pneumoniae, methicillin-
susceptible,S. aureus,
S. aureus, E. coli, Klebsiella sp.
E. coli, Klebsiella spp.,
Enterobacter sp
Ticarcilina-
clavulanato
Timentin /
GlaxoSmithKline
Infecciones vías respiratorias
Infecciones óseas y
articulares
Infecciones en la piel
Infecciones en el tracto
urinario
Infecciones ginecológicas
Infecciones intra-abdominales
S. aureus, H. influenzae,
Klebsiella sp.
S. aureus
S. aureus, Klebsiella sp, E. coli
E. coli, Klebsiella sp, P.
aeruginosa, Citrobacter sp,
Enterobacter cloacae, Serratia
marcescens, S. aureus
Prevotella melaninogenicus,
Enterobacter sp,
E. coli, K. pneumoniae, S. aureus,
S. epidermidis
E. coli, K. pneumoniae, B. fragilis
Ampicilina-
sulbactam
Unasyn / Pfizer
a
Infecciones en la piel
Infecciones intra-abdominales
Infecciones ginecológicas
S. aureus, E. coli, Klebsiella sp,P.
mirabilis,
B. fragilis, Enterobacter sp, A.
calcoaceticus
E. coli, Klebsiella sp., Bacteroides
sp, Enterobacter sp
E. coli, Bacteroides sp
Piperacilina-
tazobactam
Zosyn / Wyeth Apendicitis
Piel y tejidos blandos
infecciones, incluyendo
infecciones del pie diabético
Endometriosis posparto o
inflamación pélvica
Neumonía
Nosocomiales
(intrahospitalarias)
E. coli, Bacteroides sp
S. aureus
E. coli,
H. influenza
S. aureus, A. baumannii, H.
influenzae, K. pneumoniae,
P. aeruginosab
33
los eucariotas. El petidoglucano está conformado por unidades glucosídica (N-acetil–D-
glucosamina y N-acetil-ácido murámico), las cuales se entrelazan por transglucosidasas.
Hay unas cadenas laterales pentapéptidos unidas al N-acetil-ácido murámico la cual es
entrelazada con otra molécula igual por la enzima transpeptidasa, PBP (penicillin-
binding-proteins) confiriéndole a la célula una pared protectora. El anillo β-lactámico es
estéricamente similar al pentapéptido unido a N-acetil-ácido murámico por lo que la
PBP lo asume como sustrato propio y lo integra en su síntesis de peptidoglucano, siendo
este proceso infructuoso evitando que se forme la pared celular y favoreciendo la lisis
osmótica [2, 8, 11].
1.1.2. Clasificación de los antibióticos.
Los antibióticos de mayor importancia, incluyendo el AC que es inhibidor de β-
lactamasas se muestran en la figura 1.1 y son:
a) Las penicilinas: Tienen como núcleo químico el anillo 6-aminopenicilánico o núcleo
penam que consta a su vez de un anillo de tiazolidina (un anillo aminofenílico de los
tiazoles), enlazado a un anillo β-lactámico y un grupo amino. Los compuestos difieren
entre sí por la estructura de su cadena lateral unida al grupo amino, el cual le confiere
las propiedades farmacológicas. Entre las penicilinas comerciales están los productos
Penicilina G, Amoxicilina, Ampicilina, [9, 11].
b) Las cefalosporinas: (derivados del ácido 7-aminocefalosporánico): son
antimicrobianos similares a la penicilina en su estructura y modo de acción, poseen un
anillo de dihidrotiazina de seis átomos en lugar del anillo de tiazolina de cinco átomos
característico de las penicilinas, enlazado a un anillo ß-lactámico y un grupo amino. Sin
34
penicilinas cefalosporinas
S
NCH2R
COOH
O
NHR2
O
R1
cefamicinas cefamicina C
monobactamas carbapenems
ON
O
R
R1
clavamas ácido clavulánico
Figura 1.1. Estructura química de algunos antibióticos β-lactámicos: La naturaleza de los sustituyentes R es responsable de cambios en las propiedades químicas y biológicas de las moléculas.
ON
S
COOH
NHCR
OCH3
CH3
12
34
56
7
R1
ON
SNHC
O
R2
OOH
7
8
1
3
4
2
5
6
SO3HON
NHCR
O
O
OH
ON
C
S-R
.R1
ON
O
CO2H
CH2
H
OH
S
N
COOH
O
OCH3
OCONH2
NH
O
NH2
COOH
35
embargo presentan más resistencia a las β-lactamasas y tienen un espectro de actividad
antibacterial más amplio que las penicilinas, gracias al desarrollo de modificaciones
semisintéticas de los radicales R1 y R2 [2, 13]. Entre los productos comerciales esta la
Cefalexina. Las cefamicinas son similares a las cefalosporinas, la única diferencia es
que tienen un grupo metoxi en el ácido 7-aminocefalosporánico. Son producidas por
hongos productores de β-lactamasa (Cephalosporium acremonium ), sin embargo se
han encontrado especies de Streptomyces (como clavuligerus) productoras tanto de
penicilinas como de cefalosporinas [2, 13]. Un producto comercial es la Cefamicina C,
con un anillo ß-lactámico, un anillo dihidrotiacínico, una cadena lateral de ácido α-
aminoadípico, un grupo metoxi en el carbono C-7, y un grupo carbamato en C-3.
c) Otros β-lactámicos no convencionales son las monobactamas, carbapenems,
clavamas y nocardicinas. El principal mecanismo de acción de estos compuestos es la
inhibición de la síntesis de la pared celular por lo que alteran la integridad de la
membrana citoplasmática impidiendo la síntesis de proteínas y la síntesis de los ácidos
nucleicos. Las monobactamas son antibióticos ß-lactámicos mono cíclicos que
interactúan con las PBP induciendo la formación de largas estructuras bacterianas
filamentosas. En caso de ser alérgico a la penicilina se usa una monobactama
[3,14].Clavamas es una familia de compuestos con una estructura básica de anillos
similar al del ácido clavulánico, pero son opuestos en su configuración estereoquímica.
La clavamas diferentes al AC poseen estructura 3S, 5S por lo que carecen de actividad
inhibidora de ß-lactamasas, pero algunos poseen actividad anti fúngica o antibacteriana.
Como modelo, la alanil-clavama posee actividad bacteriostática frente a bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas y frente a hongos, mediante la inhibición de la enzima
homoserina transacetilasa, que participa en la biosíntesis de metionina [3, 14].
36
Entre las calvamas, está el ácido clavulánico, una molécula inhibidora de β-lactamasas.
Se han realizado diversos estudios para determinar la eficacia clínica de varios
inhibidores de β-lactamasas bacterianas (AC, sulbactam, tazobactam) donde se ha
demostrado que el AC tiene mayor efectividad sobre bacterias aerobias y anaerobias
[13-15].
1.2. RESISTENCIA MICROBIANA A LOS ANTIBIÓTICOS.
El problema de resistencia de microorganismos Gram negativos a los antimicrobianos β-
lactámicos se describe a partir de 1960, cuando aparecieron cepas de Escherichia coli
productoras de β-lactamasas. Posteriormente también se describieron Klebsiella
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, resistentes a β-lactámicos
por producción de β-lactamasas[11, 16]. La resistencia a los antibióticos es un ejemplo
de como las bacterias desarrollan de forma natural nuevos fenotipos a través de
combinaciones de mecanismos difíciles de predecir y los cuales pueden estar
influenciados por el ambiente, el cual juega un papel importante en la selección y
mantenimiento de tales fenotipos [10, 14].
Los antibióticos son empleados para eliminar la capacidad de reproducción
bacteriananas atacando partes específicas en su estructura. Sin embargo estas bacterias
pueden generar mecanismos que las protegen de la actividad de los antibióticos. Entre
los mecanismos de resistencia que han sido identificados se encuentran: i) La
producción de enzimas principalmente en bacterias Gram negativas que destruyen el
antibiótico, especialmente de la familia de β-lactámicos y aminoglucósidos, ii) Cambios
en los sitios activos de las PBP que disminuyen la afinidad por los antibióticos β-
lactámicos, esta información se pasa a través de transformación natural y recombinación
37
de DNA con otros organismos confiriéndoles a las células resistencia. iii) El desarrollo
de proteínas complejas capaces de bombear el antibiótico hacia fuera de la célula, iv)
Modificaciones en la molécula de la célula que es objetivo del antibiótico [10, 11].
Las de β-lactamasas se clasifican en cuatro clases: A, B, C y D. Las pertenecientes a las
clases A, C y D poseen serina (SER) como el nucleófilo en un sitio activo, mientras que
en la de clase B un ión metálico (Zn2+
) es responsable de la inactivación de las β-
lactamasas. En Enterobacteriaceae (por ejemplo, en Escherichia coli y Klebsiella
pneumoniae) las β-lactamasas más frecuentes pertenecen a la clase A [19]. En la
actualidad la mayor parte de estudios están orientados a entender el mecanismo de
acción de β-lactamasas tipo A, donde algunas de ellas son inhibidas irreversiblemente
por AC, Sulbatam y Tazobactam [8, 11].
Las β-lactamasas (E.C. 3.5.2.6) son enzimas bacterianas periplásmicas (hidrolasas) que
son producidas principalmente en bacterias del género Enterobacteriaceae y son
responsables de la resistencia que estas bacterias presentan frente a la penicilina,
cefalosporina y carbapenems. Las enzimas hidrolizan el anillo β—lactámico, el cual
inactiva las propiedades antibacteriales de la molécula. En la figura 1.2 se presenta de
forma esquemática el mecanismo de reacción de hidrólisis de un genérico de penicilina
denominado como antibiótico activo (AA) con la enzima β-lactamasa (E). Con la
reacción horizontal se representa como la enzima β-lactamasa reacciona con parte de la
estructura del antibiótico denominada ácido 6-aminopenicilánico, del cual se derivan las
penicilinas, desdoblando esta estructura (antibiótico inactivo) y regenerándose la
enzima, esto se da en varias etapas que son mostradas en detalle en las referencias [11,
17]. Para evitar la destrucción del antibiótico, este se aplica en combinación con algún
inhibidor de las β-lactamasas (I) (reacción vertical en la figura 1.2), las β-lactamasas
38
reaccionan con el anillo β-lactámico de estos inhibidores formando el complejo EI de
forma covalente e irreversible, quedando disponible la penicilina para ser enlazada a la
PBP y provocar la destrucción de la célula por lisis osmótica [11, 17].
Figura 1. 2. .Diagrama esquemático de una penicilina genérica, la hidrólisis catalizada por β-lactamasa (parte superior) e inhibidores de β-lactamasa en la parte inferior [17].
1.3. PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE β-LACTÁMICOS
El desarrollo de diversas formulaciones requiere de una alta producción industrial de AC
[15, 18, 19]. Los antibióticos generaron ventas por USD 42 mil millones en el mercado
global, en 2009. Aproximadamente el 50% de las ventas corresponden a productos β-
lactámicos incluyendo penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, monobactamas, ácido
clavulánico y carbapenems [3]. El AC obtuvo un crecimiento anual del 4% entre 2005 y
2010 [20],
Muchos β-lactámicos de uso clínico son sintetizados químicamente por procedimientos
costosos y generando con bajos rendimientos [3], Es por esto que para producir
antibióticos a gran escala se combinan procesos fermentativos mediante los cuales se
Antibiótico Activo Antibiótico Inactivo Enzima (E)
+ Inhibidor (I)
Complejo EI
K2 >> K1
K1
K2
39
obtiene la molécula base que es sometida subsecuentemente a modificaciones
semisintéticas, obteniéndosen productos con adecuadas propiedades antimicrobianas y
farmacológicas. Hoy en día, la fermentación continúa siendo el procedimiento más
utilizado, empleando cepas mejoradas genéticamente, logrando altos rendimientos a
costos moderados, en particular con penicilina [3]. Se pueden destacar las siguientes
moléculas producidas a escala industrial:
Penicilinas: La Penicilina V y Penicilina G son las únicas penicilinas naturales de uso
clínico. Estas se obtienen a gran escala y con una alta titulación (50 g L-1
) por el cultivo
de Penicillium chrysogenum. Existen otras variaciones de penicilinas que se obtienen
por modificaciones semi sintéticas [2, 3].
Cefalosporinas y cefamicinas: Todas las cefalosporinas comerciales de mayor difusión
como antibiótico, son obtenidas mediante procesos semi sintéticos. Desafortunadamente
el proceso de producción es de bajo rendimiento y costoso. En la actualidad se obtienen
altos rendimientos de Cefalosporina C en cultivos del moho Acremonium chrysogenum
a gran escala con una alta titulación (30 g L-1
). Sin embargo, el compuesto presenta
problemas de estabilidad debido a su tendencia a degradarse durante la fermentación [2,
21].
Ácido clavulánico: El proceso de producción a partir de la bacteria Streptomyces
clavuligeus es de bajo rendimiento y de alto costo. La productividad del proceso,
depende de diversos factores, entre ellos tipo y concentración de nutrientes, condiciones
de operación de la fermentación y mecanismos intracelulares de biosíntesis. A pesar de
los esfuerzos de los investigadores que trabajan en el tema en el mundo, no se ha
alcanzado valores de producción (título) de AC superiores a 1 g L-1
[18, 22]. El mayor
productor mundial de AC, GlaxoSmithKline, ha reportado titulaciones de 561 mg L-1
40
[23] y algunas empresas como Antibióticos S.A. indican que algunos métodos de
purificación requieren que la concentración de AC en el medio de cultivo debe ser
mayor a 1 g L-1
para hacerlos más eficientes [24],
41
REFERENCIAS
[1] WHO (World Health Organization), ―Overcoming Antimicrobial Resistance, report on
infectious diseases 2000,‖ 2000. http://www.who.int/infectious-disease-report/.
Consultada en febrero 2013.
[2] L. Oster, ―Structure-Function Studies of β-lactam Biosynthetic Enzymes,‖ Swedish
University of Agricultural Sciences, Uppsala, Uppsala, Sweden, 2005.
[3] G. Ozcengiz and A. Demain, ―Recent advances in the biosynthesis of penicillins,
cephalosporins and clavams and its regulation,‖ Biotechnology advances, vol. 31, no. 2,
pp. 287–311, 2012.
[4] OMS, ―Estadísticas Sanitarias Mundiales 2010,‖ 2010.
http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/... Consultada en febrero de
2013.
[5] OMS, ―Estadísticas sanitarias mundiales 2012,‖ 2012. http://www.who.int. Consultada
en febrero de 2013.
[6] C. Cabrera, R. Gómez y A. Zuñiga, ―La resistencia de bacterias a antibióticos,
antisépticos y desinfectantes una manifestación de los mecanismos de supervivencia y
adaptación.,‖ Colombia Médica, vol. 38, no. 2, pp. 149–158, 2007.
[7] Mortalidad en la niñez, una base de datos de América Latina desde 1960. CEPAL-
Unicef, Santiago, Chile, p. 85, 2011.
http://cepal.org/publicaciones/xml/1/43921/mortalidad, consultada en febrero 2013.
[8] J. Calvo y L. Martínez-Martínez, ―Mecanismo de acción de los antimicrobianos,‖
Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., vol. 27, no. 1, pp. 44–52, 2009.
[9] C. Sánchez de Rivas, ―¿antibióticos, ayer, hoy y mañana...?,‖ Revista Química Viva, no.
2, pp. 63–77, 2006.
[10] J. Bonomo and R. Gill, ―Antibiotic resistance as a model for strain engineering,‖
Computers and Chemical Engineering, vol. 29, no. 3, pp. 509–17,. 2005.
[11] S. Drawz and R. Bonomo, ―Three decades of β-lactamase inhibitors,‖ Clinical
Microbiology Reviews, vol. 23, no. 1, pp. 160–66, 2010.
[12 ] J. Song, S. Jensen and K. Lee, ―Clavulanic acid biosynthesis and genetic manipulation
for its overproduction,‖ Applied microbiology and biotechnology, vol. 88, no. 3, pp. 659–
69, 2010.
[13] F. Schmidt, ―β-Lactam Antibiotics: Aspects of Manufacture and Therapy: Acomprensive
treatise on fungi as experimental systems for basic and applied research, Industrial
Aplication, The Mycota., J. W. Esser, K. and Bennett, Ed. New Orleans, Springer, pp.
69–90, 2002.
[14] P. Liras, J. Gómez-Escribano and I. Santamarta, ―Regulatory mechanisms controlling
antibiotic production in Streptomyces clavuligerus,‖ Journal of Industrial Microbiology,
vol. 35, pp. 667–676, 2008
[15] J. Song, S. Jensen and K. Lee, ―Clavulanic acid biosynthesis and genetic manipulation
for its overproduction,‖ Applied microbiology and biotechnology, vol. 88, no. 3, pp. 659–
69, 2010
[16] G. Martín, ―Resistencia Bacteriana a ß-lactámicos: Evolución y Mecanismos,‖ AVFT,
vol. 21, no. 1, pp. 107–116, 2002.
42
[17] P. Carey, Y. Chen, B. Gong and M. Kalp, ―Review. Kinetic crystallography by Raman
microscopy,‖ Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1814, pp. 742–49, 2011.
[18] R. Li and C. Townsend, ―Rational strain improvement for enhanced clavulanic acid
production by genetic engineering of the glycolytic pathway in Streptomyces
clavuligerus,‖ Metabolic engineering, vol. 8, no. 3, pp. 240–52, 2006.
[19] K.- Chen, Y. Lin, J. Wu and S. Hwang, ―Enhancement of clavulanic acid production in
Streptomyces clavuligerus with ornithine feeding,‖ Enzyme and Microbial Technology,
vol. 32, pp. 152–156, 2003.
[20] A. So, N. Gupta, S. Brahmachari, I. Chopra, et al, ―Towards new business models for
R&D for novel antibiotics,‖ Drug resistance update, vol. 14, no. 2, pp. 88–94, 2011.
[21] M. Jurgens, G. Seidel, and K. Schugerl, ―Production of Cephalosporin C by Acremonium
chrysogenum in semisynthetic medium,‖ Process Biochemistry, vol. 38, no. 2, pp. 263–
72, 2002
[22] J. Teodoro, A. Batista-Neto, M. Araujo, C. Hokka and A. Badino, ―Influence of glycerol
and ornithine feeding on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ vol.
27, no. 4, pp. 499 – 506, 2010.
[23] L. Gordon Cambell and L. Lilley, ―Clavulanic Acid Production,‖ U.S. Patent 1, 571,
888, 1980.
[24] T. Olleros Izard, J. L. Fernández Puentes and M. A. Moreno Valle, ―Procedimiento para
Mejorar la Extracción de ácido clavulánico,‖ U.S. Patent 537, 158, 1984.
43
CAPITULO 2
METABOLISMO DE S. Clavuligerus
En los últimos 20 años, se han desarrollado unas estrategias de modelado del
metabolismo celular, con el objetivo de identificar a partir de un análisis sistémico y
racional, los cuellos de botella en las rutas de biosíntesis de metabolitos de interés.
Eliminar estas limitaciones permitiría incrementar los rendimientos de productos así
como encontrar nuevos productos de interés. La aplicación de estas estrategias mediante
el uso de técnicas para el análisis racional del metabolismo celular que facilite y oriente
las posteriores estrategias de manipulación genética con el objetivo de mejorar los
bioprocesos, se conoce como Ingeniería Metabólica (IM). En la actualidad, la IM se
viene aplicando con acelerado crecimiento permitiendo entender mucho mejor los
procesos de biocatálisis orientados a maximizar el rendimiento y la productividad de
metabolitos de interés en campos, como Biotecnología de alimentos, Biotecnología
ambiental y, más recientemente, Biotecnología farmacéutica [1, 2, 3]. En este último
campo se han logrado obtener titulaciones más altas de algunos β-lactámicos y el
desarrollo de nuevos productos de interés farmacéutico [3]. La metodología incluye el
análisis de la capacidad celular, análisis de flujos metabólicos, análisis de control
metabólico (MCA) y síntesis de sistemas e integración de datos bioinformáticos. Dentro
de los trabajos para el mejoramiento de la producción de compuestos β-lactámicos se
han empleado como modelos diversas especies del género Streptomyces. Existen pocos
44
trabajos en los cuales se ha aplicado IM para incrementar la titulación de ácido
clavulánico (AC), inhibidor de β-lactamasas.
En este capítulo se presenta una discusión sobre el metabolismo de S. calvuligerus que
permitirá establecer el mapa o modelo metabólico que se empleará más adelante para
trabajos de análisis de flujos metabólicos (AFM) y análisis de balance de flujos
metabólicos (ABM).
2.1. BIOLOGIA DE Streptomyces sp.
2.1.1. Ciclo de Vida:
Los Estreptomicetos presentan un ciclo de vida complejo que implica procesos de
diferenciación morfológica y fisiológica. Estas bacterias son capaces de colonizar
sustratos con restos de materia orgánica, formando una red de hifas ramificadas y
septadas que dan lugar al ―micelio sustrato‖. Estas hifas obtienen los nutrientes de la
degradación del material orgánico insoluble gracias a sus numerosas enzimas
hidrolíticas [4, 5, 6]. En una primera fase, las zonas más alejadas de la fuente de
nutrientes empiezan a acumular sustancias de reserva (lípidos, glucógeno, etc.) hasta que
en un determinado momento, debido a la carencia de nutrientes reciben una serie de
señales en esta zona, que disparan la expresión de genes implicados en la formación del
micelio aéreo. Se produce así, el desarrollo de hifas que emergen del ―micelio sustrato‖
para dar lugar al micelio aéreo. Estas hifas se nutren de los productos de degradación
del micelio sustrato ―viejo‖, y en una segunda etapa sufren un proceso de curvatura,
enrollamiento, formación de septos y engrosamiento de la pared celular para dar lugar a
una cadena de esporas uninucleares, que se liberan al medio y que con las condiciones
adecuadas, germinan y desarrollan un nuevo micelio sustrato [5, 6]
45
El interés científico en las bacterias del género Streptomyces radica fundamentalmente
en dos importantes características: i) Su rico metabolismo secundario y ii) La
diferenciación morfológica que acompaña al primero (i) y se basa en el desarrollo
secuencial de un micelio aéreo, hifas y finalmente esporas descritas más adelante (ver
figura 2.1). Cuando una espora de Streptomyces se libera al medio ambiente y encuentra
las condiciones necesarias para su germinación, se pone en marcha una compleja
maquinaria molecular capaz de llevar a cabo un control genético temporal y espacial que
culmina con la formación de varios tejidos: micelio substrato, micelio aéreo y más
esporas, características morfológicas y fisiológicas similares a la de los hongos. Si bien
todas estas características asociadas a la bacteria Streptomyces son muy similares a la de
los organismos eucariotas multicelulares, las características celulares (típica de
procariotas) y el mecanismo de reproducción son muy diferentes. En la figura 2.1 se
presenta en forma gráfica y sintética el ciclo de vida de Streptomyces sp, y a
continuación se presenta en mayor detalle la forma como se lleva a cabo la interacción
micelio-sustrato [6, 7]:
Desarrollo del micelio sustrato: Cuando germina una espora unigenómica se forma un
tubo de germinación mediante crecimiento apical de la pared celular. Posteriormente las
células empiezan a desarrollar ramificaciones laterales logrando estabilizar la tasa de
crecimiento comenzando la septación [6, 7]. Las partes de micelio más viejas
comienzan a septarse, formando zonas apicales y sub-apicales. En las sub-apicales a
pesar de que aún hay síntesis de ADN, y se detiene el crecimiento de la pared celular
(en ocasiones, nuevas ramificaciones pueden aparecer en los compartimentos sub-
apicales, lo que lleva consigo la recuperación de ciertas características de la región
apical) [6]. Poco a poco el micelio sustrato se va expandiendo, la región más vieja se va
46
aglomerando y empiezan a ocurrir cambios en la colonia que llevarán a la creación de
micelio aéreo.
Figura 2. 1. Ciclo de vida de Streptomyces sp. en medio sólido. (a) Inicialmente un micelio filamentoso coloniza su sustrato. (b) Tras un periodo de crecimiento asimilativo, las hifas aéreas crecen hacia la atmósfera. (c) Posteriormente se septan (tabicación). Para (d) formar cadenas de esporas pigmentadas [3].
Desarrollo del micelio aéreo: Una vez desarrollado el aglomerado de hifas sobre el
sustrato, este se torna muy compacto en la zona central (y ancestral) donde ocurre un
agotamiento de las reservas de nutrientes y varios tipos de estrés fisiológico comienzan a
ejercer presión selectiva sobre la expresión de determinados genes. El
acondicionamiento a estos fenómenos está probablemente mediado por el gen relA y
nucleótidos polifosforilados como ppGpp [6, 8, 9]. Este fenómeno es conocido como
respuesta estricta y se basa en los siguientes mecanismos: i) El metabolismo primario se
(a)
(b)
(c)
(d)
47
vuelve más lento; ii) comienza la inducción del metabolismo secundario (proteínas
extracelulares, antibióticos, etc.); iii) hay un metabolismo acumulativo en la superficie
de la colonia; iv) comienza la lisis de ciertas regiones del micelio sustrato y se inicia el
crecimiento aéreo [6, 10].
Existe una muerte celular programada en la interacción micelio sustrato por la cual la
síntesis de diversas enzimas extracelulares permite a la colonia degradar el micelio
sustrato muerto así como otra materia orgánica remanente en el medio. La acumulación
de los nutrientes en la superficie de la colonia, permite el crecimiento de las hifas
aéreas de una forma saprofita (se alimentan de los segmentos aún viables del micelio
sustrato) y posteriormente forman esporas para colonizar nuevas áreas y la síntesis de
los compuestos biocidas del metabolismo secundario. Estos dos mecanismos otorgan
una importante ventaja a la bacteria a la hora de dominar su nicho [10].
La morfología de Estreptomicetos en medio líquido no ha sido muy estudiada por
considerar que bajo estas condiciones no hay esporulación y por ende diferenciación
morfológica [10]. Al crecer el microorganismo en medio líquido, el ciclo de vida
descrito anteriormente no se observa normalmente. Dependiendo del tipo de agitación,
componentes del medio de cultivo pueden formar agregados miceliares sencillos o en
tipo de pelet, el tamaño y la forma de éstos son relativos a la especie. En medio de
cultivo químicamente definido se tiene un crecimiento más disperso que el presentado
en medio de cultivo complejo con hidrolizados de harina soja. En este tipo de cultivos,
algunos componentes del medio, como el anti-espumante, almidón o agar a bajas
concentraciones pueden favorecer la dispersión del microorganismo, lo cual es bueno
para minimizar algunos problemas de transferencia de O2 y de nutrientes que se pueden
presentar. Sin embargo, el crecimiento disperso es frecuentemente acompañado por una
48
inhibición de metabolismo secundario. Indicando esto una relación entre la morfología y
la diferenciación fisiológica y la existencia de alguna señal involucrada en ambos
procesos de diferenciación [10].
2.1.2. Clasificación del microrganismo en estudio:
Hay aproximadamente 1017 especies de Streptomyces, de las cuales unas 100 son de
interés para la industria farmacéutica. Una clasificación de esta especie se basa en sus
características morfológicas, nutricionales y fisiológicas (ver la figura 2.2). Los
estreptomicetos antifúngicos son el más grande género de producción de antibióticos, el
cual produce antibacteriales y anti fúngicos, y un amplio rango de compuestos
bioactivos tales como immunosupresantes [7, 11, 12].
Figura 2.2. Presentación jerárquica de la taxonomía de la bacteria Streptomyces [11].
Streptomyces clavuligerus fue originalmente aislada de una muestra de suelo de América
del Sur, y se empleó inicialmente como productora de cefalosporinas. El nombre
clavuligerus se debe a la forma de bastón de las ramificaciones cortas que dan lugar a las
cadenas de esporas (del Latín clavula, pequeños bastones, e -igerus, que lleva). S.
Dominio: Bacteria
Phylum: Actinobacteria
Clase I: Actinobacteria
Subclase V: Actinobacteridae
Orden I: Actinomycetales
Suborden XIV:Streptomycineae
Familia I: Streptomycetaceae
Genero I: Streptomyces
49
clavuligerus está clasificado dentro de la Serie Gris de la Categoría IV del género
Streptomyces, con base en el color verde-grisáceo oscuro de las esporas maduras [11].
2.1.3. Generalidades de algunos Estreptomicetos:
Los Actinomicetos del género Streptomyces son los principales productores de
compuestos bioactivos para la industria biotecnológica [4, 5]. Son fuente de antibióticos
y biocompuestos de aplicación contra diversas enfermedades incluyendo el cáncer, así
como una amplia variedad de sustancias químicas inhibidoras de diversos procesos
celulares, como fungicidas, citostáticos, moduladores de la respuesta inmune y efectores
para el crecimiento de plantas [5, 10].
Los Estreptomicetos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, siendo el suelo su
hábitat más común, aunque también se han hallado en lechos marinos [4, 12]. Están
actualmente clasificados como bacterias debido a que poseen una pared celular con
características bioquímicas que se asemejan más a las de bacterias que a los de hongos.
Su similitud con estos reside en su morfología filamentosa (figura 2.3), pero se
diferencian notablemente por el reducido diámetro de su filamento vegetativo. Presentan
otras características típicas de procariotas tales como la carencia de núcleo definido,
mitocondrias y cloroplastos [4]. Los Estreptomicetos son bacterias aerobias, Gram
positivas y con un elevado contenido de guanidina y citosina (G + C) en el DNA de 69-
78 % mol.
Las bacterias del género Streptomyces son productoras de más de la mitad de los
antibióticos conocidos. También son productoras de gran cantidad de enzimas
extracelulares de interés en el sector industrial, entre las que destacan: proteasas,
celulasas, nucleasas, amilasas, lipasas, quitinasas y xilanasas [4].
50
Figura 2. 3. Morfología macroscópica de colonias de Streptomyces coelicolor (www.ecured.cu/index.php/Actinomiceto, junio 2013)
.
Los Estreptomicetos más ampliamente estudiados son: S. grieseus, la primera especie
utilizada para la producción comercial de antibióticos (estreptomicina) y S. coelicolor,
que es la cepa más ampliamente usada en los laboratorios de investigación. Los genomas
de estas dos especies han sido secuenciados, encontrando cromosomas lineales (8-10
Mb) que contienen más de 7000 genes, entre los cuales el 45% es común entre si [5].
Las redes metabólicas de estos microorganismos han servido de base para el
secuenciamiento de S. clavuligerus, del cual se cuenta ya con un 100% del genoma [13].
Streptomyces clavuligerus (Sc) produce un número de compuestos β-lactámicos,
incluyendo cefamicina C, ácido clavulánico (AC) y al menos otros cuatro metabolitos
de la familia de las clavamas cuyas rutas de biosíntesis son aún desconocidas [14]. El
AC y las clavamas difieren de la cefamicina C, por presentar un núcleo bicíclico que
contiene un átomo de oxígeno en lugar de un átomo de azufre, como ocurre en los
antibióticos más convencionales del tipo de la cefamicina [15]. De las clavamas,
solamente el ácido clavulánico (AC) posee actividad inhibitoria de β-lactamasa por su
51
estereoquímica 3R, 5R, que le permite unirse a la enzimas PBP (proteínas enlazadoras
de penicilina) y a las β-lactamasas [6, 16].
2.1.4. Metabolitos secundarios producidos por Estreptomicetos:
Los actinomicetos producen alrededor de 61% de todos los metabolitos secundarios
conocidos, de los cuales el 70-80% son producidos por especies de Streptomyces sp [11].
Los metabolitos secundarios son compuestos no esenciales para el crecimiento ni
supervivencia del microrganismo, presentan una diversidad de estructuras químicas
complejas, y en su mayoría son producidos en la fase de desaceleración de crecimiento
en cultivo sumergido en lote. La mayoría de los metabolitos secundarios tienen actividad
antibiótica. Además de antibióticos, entre los metabolitos secundarios producidos por
Streptomyces se cuentan sideróforos, antitumorales, factores de crecimiento en plantas,
herbicidas e inmunosupresores [10-12]
Se ha propuesto que la producción de antibióticos está sujeta a una red compleja de
interacciones entre pequeñas moléculas, proteínas regulatorias y promotores de genes.
Estas moléculas reflejan el estado fisiológico y nutricional de la célula y sirven como
señal para la expresión de genes involucrados en la biosíntesis de los antibióticos. Al
presente se conoce poco acerca de esta red compleja, la cual puede ser general o
específica para cada especie productora de antibióticos. La genética de producción de
antibióticos en general, y la de S. clavuligerus en particular ha sido muy investigada
debido a su importancia farmacéutica y comercial [11,16].
2.2. CARACTERÍSTICAS METABÓLICAS DE Streptomyces
El metabolismo primario involucra reacciones catabólicas y anabólicas que resultan en
un incremento en la biomasa; las reacciones de aprovechamiento de energía y poder
52
reductor son empleadas en la síntesis de los componentes macromoleculares de la célula
(proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y polisacáridos). El metabolismo secundario resulta
en la síntesis de metabolitos que no tienen una función aparente en el metabolismo. Los
miembros del género Streptomyces se han estudiado a profundidad para entender como
opera el metabolismo secundario, dada su importancia biotecnológica [5,10].
El metabolismo secundario es frecuentemente relacionado con el primario por el uso de
cofactores necesarios para la biosíntesis (aminoácidos o cofactores energéticos), así
como por el uso de ciertos metabolitos del MCC (piruvato, acetil CoA, oxaloacetato,
alfacetoglutarato, entre otros). Para lograr mejorar los procesos de producción de
metabolitos secundarios es necesario tener un conocimiento del metabolismo global
celular; consistente en conocer qué cambios (metabólicos y genéticos) en el
metabolismo secundario están relacionados con cambios en el metabolismo primario
[6, 17-18]. Si bien existen trabajos de investigación que profundizan en el metabolismo
primario y secundario para la producción de antibióticos [19-20, 22], hay pocos trabajos
orientados a conocer estas relaciones mencionadas del metabolismo [6, 18, 23-25].
A continuación se presentan algunos aspectos de cada una de las vías catabólicas y
anabólicas en cuanto a su interacción para aportar precursores y energía al crecimiento y
a la biosíntesis de antibióticos. En la figura 2. 4 se presentan de forma resumida el
aporte de algunos metabolitos generados en el MCC (metabolismo primario) para la
generación de antibióticos (metabolismo secundario). Algunos aspectos característicos
del metabolismo encontrados en otras especies de Streptomyces se tienen en cuenta
para plantear el mapa metabólico de S. clavuligerus [17]
53
Azucares
Triosa
PP
ácidosnucleicos
PEPTIDOSNUCLEOSIDOS
Piruvato
Acetil-CoA
Krebs
ShikímicoAminoácidos aromáticos GLICOPEPTIDOS
POLICÉTIDOS
lactamas
POLIPÉPTIDOS
AMINOGLUCOSIDOS
Aminoácidos alifáticos
Figura 2.4. Esquema simplificado de requerimiento de precursores para la biosíntesis de antibióticos. Figura adaptada [17]
2.2.1. Requerimientos de energía.
Los requerimientos de energía pueden ser categorizados en tres grupos. El primer grupo
involucra los requerimientos energéticos para la biosíntesis de precursores de
macromoléculas dentro de la célula, en términos del consumo de ATP en bioreacciones
y la energía de polimerización necesaria para la biosíntesis de macromoléculas. Esta
cantidad es una función lineal de la velocidad específica de crecimiento, asumiendo que
la composición celular es constante se denomina requerimiento de energía para
crecimiento. El segundo grupo involucra la energía para formación y secreción de
productos que no son dependientes del crecimiento. En este caso la energía requerida
depende de la formación del producto específico y de los productos de secreción. El
tercer grupo incluye la energía de mantenimiento requerida para reparar daños celulares
y controlar la presión osmótica y la movilidad de las células. La energía de
mantenimiento requerida puede depender de la concentración y de la composición de los
54
nutrientes del medio y así es un factor importante cuando se habla de un medio limitado
[25].
2.2.2. Síntesis de biomasa
En ausencia de información con miras a los requerimientos de precursores para la
acumulación de biomasa en Streptomyces sp, la ecuación estequiométrica para la síntesis
de biomasa en E. coli ha sido empleada como modelo para análisis de flujo metabólico
de S. coelicolor [25] y de S. lividans [26] y en otros actinomicetos. Para S. clavuligerus
se cuenta con un estudio detallado de la composición celular, tanto de sus
macromoléculas como de su composición elemental [27].
2.2.3. Ruta de Gluconeogénesis.
Muchos actinomicetos tienen la capacidad de crecer en glicerol como fuente de carbono,
como es el caso de Streptomyces sp. y pueden convertir fructosa 1-6 bisfosfato a
fructosa 6-fosfato, pero lo hacen de forma inusual (lo común es que la reacción se de por
la acción de la enzima fructosa 1-6 bisfosfatasa). Se ha propuesto en varios trabajos que
esta reacción se da por la acción de la enzima fosfofructokinasa dependiente de
pirofosfato [28]. Esta vía incluye todas las reacciones que van de fructosa 6 fosfato a
piruvato [27]. Intermediarios de esta vía forman aminoácidos como serina, glicina,
cisteína, triptófano, tirosina, fenilalanina, valina, alanina, leucina y precursores de
biomasa.
2.2.4. Ruta de las pentosas fosfato.
Esta ruta tiene como función producir equivalentes de reducción en forma de NADPH y
precursores para biomasa. Debido a que el NADPH es necesario para el crecimiento, es
55
lógico que la actividad de la ruta sea más importante en la fase de crecimiento que en la
formación de productos para metabolitos secundarios. Los flujos en esta ruta varían
entre 25 y 40% del flujo de carbono, excepto para cultivos de bajas velocidad de
crecimiento [29]. Varios estudios sugieren un importante rol para la ruta de las pentosas
fosfato (PP) en la producción de antibióticos de Streptomyces [19, 25].
En el metabolismo central del carbono, el NADPH es regenerado de NADP+
principalmente a través de la ruta oxidativa de PP. En esta ruta, dos unidades de
NADPH son generadas por cada unidad de glucosa-6-fosfato por la acción de la enzima
glucosa-6-fosfato dehidrogenasa y 6-fosfoglucanato dehidrogenasa. En algunas
especies, esta última enzima requiere NAD+ en lugar de NADP
+ como cofactor [17, 30].
El NADPH es también regenerado por isocitrato dehidrogenasa en el ciclo de Krebs.
Algunos policétidos y compuestos β-lactámicos requieren un incremento en el flujo de
NADPH para su biosíntesis [17].
2.2.5. El ciclo de Krebs (ciclo de los ácidos tricarboxílicos).
El ciclo de Krebs, conocido como el ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo del ácido
cítrico tiene función anfibólica (participar en reacciones catabólicas y anabólicas), este
ciclo es fundamental en todos los microorganismo aerobios. Este sirve de medio para
enlazar las rutas metabólicas encargadas de la degradación de los carbohidratos, las
grasas y las proteínas, mediante la transformación de metabolitos empleando un
complejo enzimático en gas carbónico y agua con formación de energía química. En
este ciclo se generan muchas moléculas que sirven como precursores en la biosíntesis de
aminoácidos y de antibióticos. Este complejo enzimático está ubicado en la mitocondria
56
en el caso de microorganismos eucariotas y en el citoplasma para microorganismos
procariotas [17, 22].
Este ciclo tiene como función generar precursores de energía en forma de NADH y
NADPH. Para todos los organismos se ha encontrado que la enzima citrato sintasa es la
puerta de entrada al ciclo de Krebs (cataliza la condensación de ACCOA y OAA en
citrato). Algunos Streptomyces como coelicolor e hygroscopicus han presentado como
funcional la enzima de la ruta anaplerótica del ciclo del glioxilato en el ciclo de Krebs.
Sin embargo la actividad para esta enzima no fue detectada en otros Streptomyces como
lividans y aureofaciens. Estas especies presentan escaso crecimiento en acetato, por lo
esta vía en el ciclo de Krebs no se considera activa [30]. En este ciclo se producen
precursores de aminoácidos glutamato y aspartato y productos de biosíntesis de los
aminoácidos fenilalanina, tirosina, isoleucina, leucina, triptófano, isoleucina, metionina,
treonina, valina, además se produce uno de los precursores directos (alfacetoglutarato)
y uno de los subproductos (succínico) de la biosíntesis de AC. El alfacetoglutarato es
precursor de biomasa también [27, 32].
2.2.6. Ciclo de la urea.
El ciclo de la urea conocido como también como ciclo de la ornitina tiene lugar por lo
general en mamíferos y se presenta de forma inusual en bacterias, su función principal es
la de expulsar urea y sustancias tóxicas del organismo producto de la síntesis y
degradación de proteínas enzimáticas específicas. Los mamíferos en la dieta de proteínas
para satisfacer sus requerimientos de fuente de carbono y energía, emplean los
aminoácidos como fuente de energía, liberando grupos aminos que son excretados en
forma de urea. Al modificar diferentes contenidos proteicos en la dieta de un mamífero,
57
se encontró que el complejo enzimático que hace parte del ciclo de la urea se vio
afectado más por la modificación del contenido en la dieta que por cambios en las
actividades de las enzimas ( uso de inhibidores o alteraciones en la estructura molecular
de las enzimas). Se propuso que el fenómeno observado era análogo al presentado en
algunas bacterias por alteraciones en la fuente de energía o de nitrógeno [33], este
efecto se ha presentado en S. clavuligerus [34]. Este ciclo involucra cinco enzimas:
carbamoil fosfato sintasa, ornitina transcarboxilasa, arginino succinato sintetasa, enzima
arginino succinato clivaja y arginasa [33]. Por la presencia de arginasa [35] y la fuerte
interrelación entre arginina y ornitina como precursores de AC en S. clavuligerus,
muestran la presencia de este ciclo [35, 36]. Es importante resaltar además la relación
entre el ciclo de la urea y el ciclo de Krebs al emplear aspartato como precursor y
generar fumarato. El fumarato generado del ciclo de la urea a su vez puede
transformarse enzimáticamente en malato y posteriormente en oxaloacetato, siendo
todos estos precursores en el ciclo de Krebs.
2.2.7. Biosíntesis de aminoácidos:
Los aminoácidos son los bloques de construcción de proteínas y sirven como
precursores directos en la biosíntesis de muchos antibióticos [22]. Un -aminoácido
está constituido por un átomo de carbono central, que corresponde al carbono , éste
está unido a un grupo amino, un grupo de ácido carboxílico, un átomo de hidrógeno y a
un grupo R. Este grupo R corresponde a la cadena lateral del aminoácido y es el que
confiere características a la molécula como tamaño, carga, capacidad de enlace de
hidrógeno, carácter hidrofílico y reactividad química. Todas las especies (bacterias,
hongos, etc.) están construidas de al menos veinte aminoácidos proteicos, aquellos
58
codificados en el genoma (alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteína, fenilalanina,
glicina, glutamato, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina,
serina, tirosina, treonina, triptófano y valina). La ornitina es un aminoácido de tipo no
proteicos [37]. Los aminoácidos considerados en estas discusiones están involucrados
en la relación estequiométrica de biomasa y en la síntesis de producto, los cuales
corresponden a metabolitos intermediarios. La ruta de biosíntesis de aminoácidos en
Streptomyces es muy similar a la presente en otras bacterias [22, 27, 31]. A continuación
se presentarán algunos detalles del catabolismo y anabolismo de aminoácidos agrupados
por familias, teniendo en cuenta su precursor en el MCC.
Aminoácidos de la familia de fosfoenol piruvato.
Incluye los aminoácidos aromáticos fenilalanina (PHE), tirosina (TYR) y triptófano
(TRP). Para PHE el sustituyente R es un grupo fenilo, para TYR el R es un grupo
hidroxifenilo, lo que lo hace menos hidrofóbico y más reactivo, y para TRP el R es un
grupo indol [37]. Estos aminoácidos aromáticos se usan como fuente de nitrógeno para
la producción de antibióticos. Existen reportes de vías catabólicas para PHE y TYR en
varios organismos, incluyendo varias especies de Streptomyces [22, 38, 39], por
ejemplo, S. setonii presenta la enzima homogentisata y es capaz de catabolizar todos los
aminoácidos de esta familia[38]. El TRP es un precursor importante para la biosíntesis
de varios metabolitos secundarios, como es la biosíntesis de actinomicina D a partir de
S. parvulus (A12) [40].
Aminoácidos de la familia del glutamato.
Corresponde a esta familia los aminoácidos, ácido glutámico (GLU) y su amida
glutamina (GLN), histidina (HIS), prolina (PRO), ornitina (ORN) y arginina (ARG).
59
Los aminoácidos de esta familia se ven favorecidos por el flujo de aKG en el ciclo de
Krebs El GLU es uno de los aminoácidos más importantes para la regulación de
asimilación de nitrógeno junto con lisina, metionina y valina [40].
El GLU tiene como R una cadena lineal acídica (ácido carboxílico) y la GLN tiene
como R una carboxamida [37]. Estos dos aminoácidos son casos especiales en los
Estreptomicetos, así como otras bacterias, pues representan la principal ruta de
asimilación de nitrógeno. El GLU dona el amonio a muchos aminoácidos, mientras la
GLN suministra el grupo amino a HIS, TRP y asparagina (ASN). La glutamina es
también un donor de amonio para compuestos tales como pirimidinas y purinas [40].
La histidina tiene el grupo R un imidazol cargado positivamente, hace parte de los
aminoácidos básicos junto con la lisina y la arginina, con un pKa cercano a 6 [37]. El
metabolismo de HIS se ha estudiado ampliamente en muchas bacterias, como son S.
coelicolor [41, 42] y S. clavuligerus [43]. Éste induce las enzimas de su biosíntesis,
siendo el urocanato y otros metabolitos intermediarios (GLU y aKG) inductores
fisiológicos [43].
La PRO es el único aminoácido proteinogénico que tiene la α-amina como una amina
secundaria en lugar de una amina primaria: Este aminoácido se conoce como un
iminoácido por poseer, como grupo R, una cadena lateral cíclica compuesta por 3
unidades de metileno; los cuales están unidos al carbono alfa y al grupo amino [44]. Este
iminoácido sirve como fuente de C y de N para la producción de antibióticos [40]. Por
ejemplo al utilizarlo como fuente de N para la producción de cefalosporina de Sc [45],
y para la producción del antibiótico undecilprodigiosin a partir de S. lividans (es uno de
los precursores directos de la biosíntesis) [26, 40]
60
La ARG es un importante precursor de varios metabólicos secundarios, como son
estreptomicina, sinefungin, ácido clavulánico y azomicina [21]. Las etapas de inicio de
la biosíntesis de dan desde glutamato y comparte parte de la vía con la biosíntesis de
prolina. Las enzimas involucradas en la biosíntesis son N-acetil glutamato kinasa,
ornitina N-carbamoil transferasa (OCTasa), arginino succinato sintasa, N-acetil
transferasa cíclica y N-acetil ornitinasa [21, 46]. Los aminoácidos ORN y arginina
(ARG) se han empleado como fuente de nitrógeno para la producción de AC,
obteniéndose buena titulación en ambos casos [21, 34, 35]. La ARG es el precursor
directo de la biosíntesis de AC y se produce en el ciclo de la urea, con ORN como
metabolito inductor del ciclo [21]. Al comparar la titulación de AC en cultivos
empleando medio complejo (por ej. fuente de nitrógeno harina de soja) con y sin
adición de aminoácido (ARG u ORN) se encontró que la ORN más más que la ARG
favorece la biosíntesis de AC [34, 35]. Existen reportes del mejoramiento de la titulación
de AC al adicionar ARG al medio [24, 47]. En ambos casos los aumentos no se dan de
forma directa con el incremento de la disponibilidad del aminoácido en medio, lo cual
evidencia un posible efecto de inhibición en una de las enzimas en esta vía catabólica
de ARG. También se puede decir que los aminoácidos que están presentes en el medio
complejo tienen un efecto positivo en el metabolismo global, aun no descrito.
Aminoácidos de la familia del aspartato.
Los aminoácidos pertenecientes a esta familia son ácido aspártico (ASP) y su amida
asparagina (ASN), los aminoácidos básicos ARG, lisina (LYS), el aminoácido azufrado
metionina (MET), el aminoácido hidroxilado treonina (THR) y su derivado isoleucina
(ILE).
61
Algunos medios de cultivo definidos han empleado ASN como fuente de nitrógeno
para producir cefalosporina a partir de Sc, en donde obtuvieron que las fuentes de
nitrógeno ASN y GLN comparadas con ARG y amonio son más favorables para la
biosíntesis del antibiótico [48], también se ha empleado en la producción de cefamicina
y AC [46] y para producción de AC solamente [49]
Al emplear medios de cultivos complejos y químicamente definidos en los cuales se
hace adición de aminoácidos de esta familia tanto de forma individual [24, 47, 50-51]
como varios a la vez [47], se encontró que los resultados acerca del efecto del
aminoácido en la biosíntesis difiere con el tipo de medio de cultivo, cuando se empleó
por ejemplo adicionar THR en el medio complejo produjo un incremento en la
titulación de AC [51], mientras que en el definido no hubo incremento de AC
comparado con el medio sin adición de aminoácido [47]. Y al adicionar varios
aminoácidos de esta familia juntos en el medio definido, si hubo incremento de la
titulación de AC con respecto al medio sin la adición de aminoácidos [47]. Al comparar
estos efectos de adición de aminoácidos sobre la titulación, se sugiere que hay un efecto
sinérgico entre los aminoácidos y el metabolismo global que favorece la biosíntesis de
AC y que pueden estar relacionados con la regulación que debe ejercer el N en el
metabolismo secundario.
El aminoácido LYS es precursor de una gran cantidad de metabolitos secundarios de
interés industrial como penicilinas y Cefamicina C. Las células pueden asimilarlo
como fuente de C o N. La biosíntesis de LYS se puede dar por la vía aminoadipato, la
cual no usa ASP como intermediario o por vía diaminopimelato que si lo incluye [22,
52]. Es importante tener un control sobre la concentración de LYS en el medio de
62
cultivo, ya que se da inhibición por retroalimentación de este aminoácido sobre las
enzimas específicas de la biosíntesis (homocitrato sintasa). La LYS es un inhibidor de la
síntesis de penicilina en P. chrysogenum [40] y ejerce un efecto positivo en Sc para la
producción de cefamicina [52], mas no para la producción de AC [53].
La metionina junto con LYS, GLU y VAL son los aminoácidos más importantes desde
un punto vista de regulación de la fuente de N en la producción de β-lactámicos, ejerce
una estimulación en la producción de penicilina N y cefalosporina [40].
Aminoácidos de la familia del piruvato.
Corresponden a los aminoácidos alifáticos valina (VAL), alanina (ALA) y leucina
(LEU).
La VAL es uno de los aminoácidos más importantes desde el punto de vista de
regulación [40]. Al alimentar un aminoácido sea VAL o LEU en un cultivo en continuo
empleando un medio definido para producción de AC a partir de Sc., mostró que se
produce un aumento en la titulación de AC con respecto al control sin aminoácidos, este
aumento fue del 77% al compararse con un medio al cual se alimentó ARG [50], se nota
entonces un efecto de regulación de estos aminoácidos en la biosíntesis de AC, a pesar
de no ser precursores directos como lo es la ARG [50]. La valina es necesaria en altas
cantidades como precursor de penicilina y cefalosporina [40].
Familia de la serina
Comprende serina (SER) que es un aminoácido hidroxilado y sus aminoácidos derivados
glicina (GLY) y Cisteína (CYS). La GLY es un aminoácido alifático y CYS es un
aminoácido azufrado.
La SER produce GLY a través de la transferencia de un grupo hidroximetil a
tetrahidrofolato. La SER a su vez provee una fracción significante del carbono
63
necesario para la biosíntesis de purina , timina, metionina e histidina y otra parte de
carbono se incorpora directamente para triptófano y fosfolípidos; la GLY provee el
carbón para compuestos de purinas y los que contienen grupos homo. Las biosíntesis de
estas reacciones hacen que haya un brazo de bifurcación apreciable en la vía glicolítica
a través del metabolito 3-fosfoglicerato (3PG) [54].
La SER no es adecuada como fuente de nitrógeno, y se ha observado toxicidad en
algunos Estreptomicetos a este aminoácido. Posiblemente este aminoácido reprime o
inhibe una o varias enzimas necesarias para la biosíntesis de metionina (MET) y GLY
[20], pero resulta favorable como fuente de N para la producción de AC a partir de Sc
[50]. El alimentar SER en un cultivo en continuo empleando un medio definido para
producción de AC, produjo un incremento del 77% en la titulación de AC con respecto
a un cultivo control (sin aminoácido) y con respecto a otro que se alimentó ARG [50],
se nota entonces un efecto de regulación de este aminoácido en la biosíntesis de AC, a
pesar de no ser precursor directo como lo es la ARG.
2.2.8 Biosíntesis del ácido clavulánico y otras clavamas
Las reacciones que dan origen a la síntesis de AC involucran los metabolitos GAP,
ARG, aKG, NADPH, O2 y ATP como sustratos y urea, CO2, NH4, SUC y AC, como
productos [27, 32]. En la Figura 2.5 se describe cada una de las etapas llevadas a cabo
en la ruta específica de biosíntesis de AC, incluyendo la bifurcación de ácido
clavamínico hacia otras clavamas. A continuación se detallan los compuestos y las
enzimas involucradas en cada una de las etapas de biosíntesis de AC.
Etapa 1. Involucra la condensación de gliceraldehído 3-fosfato (GAP) (abreviado como
como C-3) y arginina (ARG) (abreviado como C-5) para producir N2-(2-carboxietil)
64
arginina (CEA) mediante la acción de la enzima carboxietil arginina sintasa (Ceas), la
cual requiere tiamina, pirofosfato y Mg2+
para su actividad. El gen que codifica esta
enzima se describe con diferentes nombres pyc, orf2 o ceaS [16, 55].
Etapa 2. La enzima ß-lactama sintetasa (ß-LS) dependiente de ATP/Mg2+
, cierra el
anillo ß-lactámico de CEA para dar lugar al ácido deoxiguanidino-proclavamínico
(DGPC). La ß-LS es codificada por el gen bls [56].
Etapa 3. El DGPC sufre una hidroxilación mediada por la enzima clavaminato sintasa
(CAS) para producir ácido guanidinoproclavamínico (GPC). La enzima CAS es una
dioxigenasa intermolecular que requiere alfa-cetoglutarato (aKG), O2 y Fe (II) para
llevar a cabo la catálisis, y entre otros, genera los siguientes productos: ácido succínico,
CO2 y agua. Esta enzima cataliza tres reacciones oxidativas no consecutivas en la ruta
[57- 58].
Etapa 4. La enzima proclavaminato amidinohidrolasa (PAH) hidroliza el residuo
guanídico del GPC para formar ácido proclavamínico (APC), en presencia de agua y
Mg2+
, en esta reacción se libera además urea. Esta enzima es codificada por el gen pah.
La reacción llevada a cabo por PAH es esencial para permitir a CAS la catálisis de la
ciclización del ácido proclavamínico para formar el anillo oxazolidínico [56].
Etapa 5. El APC es transformado a ácido dihidroxiclavamínico (DHC) por la presencia
de la enzima CAS (segunda etapa de CAS, ciclación oxidativa) [57- 58].
Etapa 6. El DHC es transformado a ácido clavamínico (ACM), reacción de la
desaturación de CAS. Este es el último intermediario común entre el AC y otras
clavamas [23, 59].
65
O OPO3
2-
OH
NH2NH NH2
COOH
NH
CEAS (orf2)
TnP2/MgII
NHNH NH2
COOH
NH
HOOCGAP
ARG CEA ( N2-(2-carboxietil) arginina
Etapa 1.
Etapa 2.
Etapa 3.
NNH NH2
NH
COOH
O
DGPC
FeII/O2
CAS-(orf5)
NNH NH2
NH
COOH
O
OH
aKG
GPC(ácido de-oxiguanidinoproclavamínico) (ácido guanidinoproclavamínico)
Etapa 4.
Etapa 5
Etapa 6
Figura 2.5. Ruta de biosíntesis de ácido clavulánico y bifurcación hacia-ruta de las clavamas. (Continua)
DGPC
NNH NH2
NH
COOH
O
OH
NNH2
COOH
O
OHPAH (orf4)
GPC (ácido guanidinoproclavamínico) PC (ácido proclavamínico)
MgII
NNH NH2
NH
.
O
NHNH NH2
COOH
NH
HOOC
BLS (orf3)
ATP/MgII
CEA (N2-(2-carboxietil) arginina) DGPC (ácido de-oxiguanidinoproclavamínico)
COOH
NNH2
COOH
O
OH FeII/O2
CAS-(orf5)
NNH2
COOH
O
HO H
PC (ácido proclavamínico)
aKG
DHC (ácido dihidoxiproclavamínico)
NNH2
COOH
O
HO H
FeII/O2
CAS-(orf5)
2 OG N
NH2
COOH
O
HO
DHC (ácido dihidroproclavamínico) ACM (ácido clavamínico)
66
N
NH2
COOH
O
HO
ACM (ácido clavamínico)
N
COOH
COOH
O
HO
NO
HO
H
O H
O
2 - carboximeti lodenemclavama 2 - Formiloximeti lclavama
NO
HO
COOH
H
clavama - 2 - carboxilato
NO
HO
H
OH
2 - Hidroximeti lclavama
Etapa 7.
N
NH2
COOH
O
HO
oxidativa
NH
N
COOH
O
HO
O
NH2
NGC (ácido N-glicilclavamínico)NGC (ácido N-glicilclavamínico)ACM (ácido clavamínico) NGC (ácido N-glicilclavamínico)ACM (ácido clavamínico) NGC (ácido N-glicilclavamínico)
NH
N
COOH
O
HO
O
NH2
NGC (ácido N-glicilclavamínico)
deaminación
GCAS
Etapa 8.
N
O
COOH
O
HO
Hoxidativa
enantiomerización
deaminación
CCHO (clavaldehido)NGC (ácido N-glicilclavamínico)
NH
N
COOH
O
HO
O
NH2
Etapa 9.
N
O
COOH
O
HO
H
CAD(orf9)
NADPH, O2N
OH
COOH
O
HO
CCHO (clavaldehido) AC (ácido clavulánico)
Bifurcación de etapa 7 hacia otras clavamas
Figura 2. 5. .Ruta de biosíntesis de ácido clavulánico y bifurcación hacia-ruta de las clavamas. Continuación
Etapa 7. Recientemente ha sido descrito un nuevo intermediario, el ácido N-glicil-
67
clavamínico (NGC). Se forma por condensación de GLY y ACM en presencia de ATP,
Mg 2+
y K+ y la enzima glicilclavamino sintasa (GCAS) para producir NGC [59].
Etapa 8. El NGC es transformado a clavaldehído (CCHO), pero aún se desconocen
detalles de su reacción. Para efectos de construcción del modelo metabólico propuesto,
para el balance de la reacción se considera que la GLY consumida en la etapa anterior
es usada por la enzima como un cofactor que la activa, por lo tanto es liberada en esta
etapa y no se incluye en la reacción neta de biosíntesis de AC. Esta reacción comprende
una desaminación oxidativa dependiente de oxígeno molecular y durante la cual se
produce el cambio de la estereoisomería del grupo carboxilo de C-3 y el hidrógeno de C-
5 para dar lugar a una estereoquímica 3R, 5R, esencial para la actividad inhibidora de ß-
lactamasas [16, 27].
Etapa 9. El grupo aldehído del CCHO es reducido a AC por la acción de la enzima
clavaldehído reductasa (CAR), también llamada ácido clavulánico deshidrogenasa
(CAD), dependiente de NADPH. Esta enzima es codificada por el gen car. Este
compuesto que participa en la etapa final de la producción de AC es químicamente muy
inestable [16, 27].
Bifurcación de la etapa 7 hacia otras clavamas:
Existe la posibilidad de bifurcación del flujo de carbono en la etapa 7 hacia la
formación de otras clavamas. La presencia de diferentes modificaciones de la cadena en
el C-2 desde ácido clavamínico y la eliminación del grupo carboxílico en C-3, conducen
a la diversidad de clavamas 3S,
5S producidas por S. clavuligerus [23]. Alguna de las clavamas producidas a partir de
ácido clavamínico, como competencia en la vía hacia AC y a las cuales no se les
68
conoce en detalle el mecanismo de síntesis son: clavam2-carboxilato (tóxico), 2-
hidroximetilclavama, 2-formiloximetilclavama y clavulanato-9-alanilclavama [23, 59].
2.3. REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO Y FORMULACIÒN DEL MEDIO DE CULTIVO.
Los microorganismos obtienen la energía para realizar la biosíntesis y el crecimiento
desde los componentes de su ambiente en muchas formas. De acuerdo con la fuente de
energía, el organismo requiere diversas fuentes de compuestos químicos para la
biosíntesis de material celular como son las proteínas, ácidos nucleicos y para la síntesis
de metabolitos presentes en el metabolismo primario y secundario, para mantenimiento
y reproducción. Estos deben ser suministrados por el medio de cultivo [61].
Los medios de mantenimiento y de producción se caracterizan por tener una o varias
fuentes de carbono (FC), fuentes de nitrógeno (FN) y fuente de nutrientes traza, que por
lo general incluyen sales de magnesio, sodio, potasio, azufre, zinc, etc., así como
vitaminas. Los requerimientos nutricionales para el crecimiento son diferentes de los
necesarios para la producción de metabolitos secundarios.
Los resultados en la producción de antibióticos a partir de Streptomyces son sensibles a
las variaciones de subcultivo y conservación, las cuales muchas veces no se relacionan.
Aún queda mucho por entender acerca de la complejidad de la interacción entre
pequeñas moléculas, proteínas regulatorias y promotores de genes claves para la
activación de la producción de antibióticos [23]. A continuación se detallan las
características de los nutrientes y su efecto en el metabolismo, resaltando las
aplicaciones para la producción de antibióticos por Streptomyces sp. Todas las
69
condiciones establecidas en este numeral buscan suplir las necesidades básicas de la
célula para lograr multiplicarse y la generación de productos.
2.3.1. Fuentes de nitrógeno.
La fuente de nitrógeno (FN) por lo general es de tipo inorgánico (estructura molecular
sencilla) ya que la célula la asimila más fácilmente, pero puede a la vez tener un efecto
adverso para el crecimiento y el producto, por variación en el pH en el medio, como
ejemplos de FN inorgánica están las sales de amonio y nitratos. Para contrarrestar este
efecto adverso de cambio de pH en el medio se prefiere usar una FN orgánica o
compleja, ya que representa un mayor esfuerzo celular para ser consumida y hay mayor
regulación del amonio presente. Entre los tipos de FN orgánica están los aminoácidos, la
urea, hidrolizados de proteínas, etc. Estos presentan ventaja al ser usados en la
producción de metabolitos secundarios ya que actúan como como precursores de
antibióticos y tienen un papel regulatorio sobre el metabolismo de nitrógeno [22, 63],
Los aminoácidos son usados como FN en medios químicamente definidos, entre ellos el
de uso más común es el glutamato monosódico [22, 63]. Ya se describió en la sección
2.2.7 como el tipo de aminoácido precursor de un producto específico, puede tener un
papel regulatorio en todo el metabolismo. La regulación global del catabolismo
metabólico del nitrógeno tiene un efecto negativo sobre el crecimiento celular debido al
agotamiento de aminoácidos como nutrientes, lo cual provoca un incremento en la
concentración celular de alarmones ppGpp y pppGpp [9, 22-23], Estos nucleótidos son
responsables de la inactivación de la transcripción del rRNA, tRNA y operones de
proteína ribosomal y de detener el crecimiento de la pared celular así como ser
70
responsables en provocar modificaciones del metabolismo favoreciendo la producción
de metabolitos secundarios [22- 23].
Nitrógeno inorgánico: El nitrógeno inorgánico sólo puede ser incorporado a la biomasa
a través del metabolismo de glutamato y glutamina. Cuando la fuente de N es nitrato o
urea, el N inorgánico debe ser primero convertido a amonio, el cual puede difundirse a
través de la membrana citoplasmática para participar en la transaminación de glutamato
a glutamina [29].
La represión por nitrógeno en la producción de metabolitos secundarios se refiere a la
inhibición, reducción, y / o retraso en el inicio del metabolismo secundario por la
presencia de una fuente de nitrógeno rápidamente asimilable. La fuente de N que
reprime el metabolismo secundario lo hace incluso en presencia de una segunda fuente
de N que no causa represión [22]. Es importante notar que la concentración de la fuente
de nitrógeno necesaria para provocar la represión del metabolismo secundario es
usualmente alta, por ejemplo 10-120 mM [50, 65]. En el metabolismo primario se
conoce la cantidad de nitrógeno que necesita la célula, mientras que en el metabolismo
secundario es difícil saber que compuesto se está usando como fuente de N y como
puede causar represión en alguno de los precursores en el MCC y afectar el
metabolismo secundario [22].
Nitrógeno orgánico: Muchos organismos sintetizan y secretan proteasas extracelulares
las cuales hidrolizan proteínas a péptidos de bajo peso molecular y aminoácidos (AAs).
Los péptidos no son hidrolizados completamente a AAs antes de ser transportados como
nutrientes. Por ejemplo, muchos organismos pueden transportar hasta pentapéptidos
hacia el interior de la célula, los que son luego hidrolizados por proteasas intracelulares
71
o peptidasas. Una vez están dentro de la célula, estos son luego hidrolizados por
proteasas o peptidasas intracelulares. Las proteasas intra y extracelulares son
normalmente reprimidas por amonio y sus síntesis son frecuentemente inhibidas por
exceso de carbono, azufre y fosfato [66, 67]. Después de la hidrólisis de la proteína, el
catabolismo de muchos AAs resultantes comienza con la transaminación, donde el -
amino nitrógeno es transferido a aKG por la acción de la enzima glutamato transaminasa
(ver reacción (1)), y posteriormente el glutamato sufre una deaminación oxidativa por
la enzima glutamato-dehidrogenasa NAD+ dependiente, y regenerando el aKG (ver
reacción (2)). La enzima glutamato-dehidrogenasa NAD+ dependiente tiene función
catabólica principalmente y su actividad es baja durante el crecimiento en un medio
mínimo que no contiene AAs. Después de la deaminación el compuesto de carbono
obtenido es transformado a PYR, ACCOA o algún otro intermediario del ciclo de Krebs,
ver tabla 2.1 [66].
Glutamato + alfa-ceto-ácido = alfa-ceto-glutarato + aminoácido (1)
Alfa-ceto-glutarato + NH4 + NADH = glutamato + NAD+ + H2O (2)
Tabla 2. 1. Relación simplificada entre los aminoácidos y su producto de biosíntesis en la vía principal del carbono y los aminoácidos productos de la síntesis.
Aminoácidos Producto
ALA(1), SER(1), CYS(3) Y GLY(2) PYR
THR(1), LYS(10), LEU(8), TYR(7), PHE(8) Y
TRP (12)
ACCOA
GLU(1), GLN(2), PRO(3), ARG(4), HIS (5) aKG
ME(9), ISOLEU(9) Y VA (8) SUCCOA
ASP(1) Y ASN (2) OAA Nota: El número entre paréntesis se refiere al número de reacciones necesarias para transformar el aminoácido en
producto.
Algunos medios de cultivo para Sc contienen una FN compleja tal como extracto de
levadura, licor de maíz, proteína vegetal, proteínas de semillas o hidrolizado de tales
72
proteínas. La proteína de harina de soja (o su hidrolizado) ha resultado ser el más
eficiente nutriente para la producción de AC [34, 62]. Al hidrolizar la proteína se obtiene
una mezcla de AAs, los cuales presentan un efecto cruzado entre ellos que favorece la
síntesis de AC y cuyo mecanismo no ha sido aún elucidado [47, 63].
2.3.2. Fuente de carbono:
La fuente de carbono (FC) por lo general es un monosacárido como glucosa o fructosa,
disacáridos como lactosa, polisacáridos como dextrinas, almidones y celulosa, polioles
como glicerol, aceites y alcoholes [61, 64]. La glucosa es atractiva como FC, sin
embargo, el catabolismo rápido de la glucosa y otros carbohidratos se ha visto que
disminuyen la velocidad de biosíntesis de antibióticos, por ejemplo se ha reportado que
inhibe síntesis de penicilina de P. chrysogenum y la síntesis de Cefalosporina y AC de
Sc [64]. Debido a la dificultad de Sc para utilizar glucosa, se han utilizado como FC
lípidos (aceites vegetales) [68-71] y glicerol [61, 72-74], los cuales favorecen tanto el
crecimiento como la producción de antibióticos.
Es importante tener en cuenta el reto que tienen los procesos biotecnológicos por ser
procesos económicos, sostenibles, que empleen fuentes renovables, que sean escalables,
entre los aspectos a tener en cuenta esta la selección de las fuentes de carbono y de
nitrógeno, entre otros. Evitar efectos adversos que dificulten las etapas de purificación y
concentración del producto [75]. Por ejemplo emplear como FC lípidos, los cuales
presentan baja solubilidad en el medio de cultivo, lo que sirve como medio para evitar
represión catabólica. Los microorganismos al consumir lípidos exigen un mayor
requerimiento de oxígeno para su metabolismo, comparado con los carbohidratos.
Además hay necesidad de hacer tratamientos de purificación para eliminar los aceites
73
residuales [61, 64]. El emplear GLC como sustrato es ventajoso por no presentar los
problemas antes descritos (sustrato empleado actualmente a nivel industrial) [76-77],
sino por ser una alternativa de aplicación de un subproducto de la industria del biodiésel
(10% de la producción total del biodiésel) [78]. Desde hace más de dos décadas se está
estudiando el papel que desempeña el glicerol como FC tanto para el crecimiento como
para la biosíntesis de AC a partir de S. clavuligerus. Existen reportes acerca de
represión catabólica por glicerol a concentraciones superiores de 2% (20g/L) [50] las
cuales se han mitigado por estrategias como variación de la concentración de GLC y de
la FN en el medio [79] así como estrategias de cultivo en lote alimentado con GLC [74],
estos cambios en el proceso lograron incrementar la titulación y la estabilidad del AC.
2.3.3. Estudios de efecto de fuente de fósforo.
Los microorganismos requieren para subsistir de algunos elementos nutricionales en
menor cantidad, adicionales a la fuente de carbono y nitrógeno como son fósforo,
azufre, potasio, magnesio, calcio y cloro, entre otros. Los fosfatos son la principal
fuente de fósforo (FP) para la nutrición microbiana, ya que en el crecimiento celular
muchas de las enzimas del metabolismo primario y la expresión de genes de síntesis de
macromoléculas se estimulan con fosfato (PO4) [80]. El fosfato, usado como agente
buffer en los medios de cultivo, es crítico para la biosíntesis de ácidos nucleicos y para
el metabolismo de energía [63]. Las concentraciones de fosfato óptimas para
crecimiento celular se encuentran en el intervalo de 0.3–300 mM [80], pero dependiendo
del tipo de producto que se quiera obtener, estos límites varían así, a concentraciones de
fosfato ≥100 mM en el medio de cultivo pueden reducir la producción de AC en un
80%. Concentraciones de fosfato ≥50 mM pueden reducir en un 50% la producción de
74
cefamicina [48]. Se encontró que en Sc, el fosfato reprime la biosíntesis de las
enzimas cefamicina sintetasa y AC sintetasa, involucradas en la síntesis de cefamicina y
de AC. En la presencia de 2mM de fosfato, las actividades de estas enzimas fueron más
altas que a una concentración de 75mM de fosfato [61, 81]. Bajo limitación de fosfato
se ha encontrado mayor producción de AC [50].
Se ha encontrado que el nivel de fosfato inorgánico en el medio de cultivo, tiene un
efecto regulatorio en la biosíntesis de muchos antibióticos, como actinorrodina e
undecilprodigiosin de para S. coelicolor. Bajo condiciones de limitación de fosfato, se
da la síntesis del nucleótido guanosina tetrafosfato ppGpp activa la transcripción para
cambios en la producción de genes de rápido crecimiento a producción de genes para
iniciar fase estacionaria de la célula que reducen el crecimiento por limitación del
nucleótido y se inicia el metabolismo secundario, y en caso de suficiencia de fosfato se
reprime la transcripción del grupo de genes en la biosíntesis de antibióticos [5, 80]. El
mecanismo de regulación del fosfato no ha sido aún esclarecido [8, 23]. Se ha sugerido
que la concentración de ATP es el mediador intracelular para la regulación del fosfato
[8, 64]. También se comprobó para varias especies de Streptomyces (lividans,
avermitilis, antibioticus y giseus) que el ATP trabaja como molécula reguladora,
cambios que se den en el ATP a nivel intracelular están relacionados con la producción
de antibióticos [82]
2.3.4. Efecto de elementos trazas.
Los elementos trazas, en los cuales se incluye el magnesio, cobre, hierro, cobalto,
molibdeno, manganeso, calcio, boro, zinc, sulfatos y cloruros, no sólo son muy
importantes para la nutrición microbiana, sino que algunos de estos pueden afectar la
75
producción de antibióticos. En la tabla 2.2 se presenta cada uno de los elementos
importantes dentro de la célula y su función [61]. Las sales de cobalto tienen un efecto
positivo en la producción de tienamicina a partir de S. cattleya [64]. Existen pocos
trabajos orientados a optimizar el efecto de los nutrientes en el medio de cultivo [25, 83].
Se ha encontrado que el incremento de la concentración de sulfato estimula la
producción de AC [84], mientras que se observa una mayor estabilidad de AC con el
aumento de la concentración de magnesio en el medio [85] y de acuerdo con el tipo de
sal (NaCl >, CaCl2, > MgSO4 > Na2SO4) que se mezcle [60].
2.3.5. Efecto del oxígeno
Los procesos aerobios requieren oxígeno para el crecimiento celular, por lo que es
necesario suministrarlo de forma adecuada [86], y se requiere también para reoxidar
NAD(P)H2 o FADH2 para generar ATP, necesario para el metabolismo [17]. Además,
el suministro de oxígeno tiene un efecto importante tanto en la biosíntesis de AAs [27,
87] como en la biosíntesis de antibióticos en microrganismos aerobios [17], como en el
caso de Sc, el oxígeno es requerido para biosíntesis de AC [27, 32].
En un cultivo sumergido, la velocidad de transferencia de oxígeno está dada por la
ecuación (3)
(3) ]2[
OUROTRdt
Od
76
Tabla 2. 2. Importancia biológica de los elementos químicos en los microorganismos [58].
Elemento Símbolo Número
atómico Función fisiológica
Hidrógeno H 1 Constituyente del agua celular y materiales celulares orgánicos
Carbono C 6 Constituyente de materiales celulares orgánicos
Nitrógeno N 7 Constituyente de proteínas, ácidos nucleicos y coenzimas
Oxigeno O 8 Constituyente del agua celular y materiales orgánicos tales como
aceptor de electrones en respiración de aerobios
Sodio Na 11 Principal catión extracelular
Magnesio Mg 12 Importante catión divalente celular, cofactor inorgánico para muchas
reacciones enzimáticas, incluidas las que involucran ATP.
Fosforo P 15 Constituyente de los fosfolípidos, coenzimas y ácidos nucleicos.
Azufre S 16 Constituyente de la cisteína, cistina, metionina y proteínas ((COA y
cocarboxilasa).
cloro Cl 17 Principal anión intracelular y extracelular
Potasio K 19 Principal catión intracelular, cofactor para algunas enzimas.
Calcio Ca 20 Importante catión celular, cofactor para enzimas como las proteinasas.
Manganeso Mn 25 Catión cofactor inorgánico, cofactor para enzimas como las
proteinasas.
Hierro Fe 26 Constituyente de citocromos y otros hemo y no hemo proteínas,
cofactor para muchas enzimas
Cobalto Co 27 Constituyente de la vitamina B, y sus coenzimas derivadas
Cobre Cu 29 Constituyente inorgánico de enzimas especiales
El cambio de la concentración de oxígeno con el tiempo está dado por la diferencia entre
velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) y la velocidad de consumo de oxígeno por
la célula (OUR).
77
El OTR se relaciona con parámetros físicos de operación mediante la relación (4)
) C - * (C KL.a = OTR (4)
El OTR corresponde a la cantidad de oxígeno entregada al sistema, y está expresado en
unidades de mmol O2 L-1
h-1
. En la ecuación (4), KL es el coeficiente de transferencia de
masa interfacial, a es el área interfacial entre la fase gaseosa y liquida, C*, es la
concentración de saturación del oxígeno en el líquido, y C es la concentración de
oxígeno.
La OUR está dada por la ecuación (5).
(5) XQOOUR 2
El QO2X corresponde a la demanda de oxígeno por parte de las células, y se expresa en
unidades de mmol O2 L-1
h-1
donde QO2 es la demanda específica de oxígeno (mmol O2
gx-1
h-1
) y X es la concentración de biomasa (gx L-1
) [86].
Algunas investigaciones muestran que los niveles de oxígeno disuelto (OD) influyen en
la interacción entre las reacciones metabólicas y los mecanismos de regulación genética,
así como en la formación de productos y subproductos en los procesos de producción de
metabolitos secundarios a partir de Streptomyces [8-89]. Se encontró que a valores de
OD inferiores al 10% no hay producción penicilina a partir de P. chrysogenum [90].
En la producción de cefamicina C de Streptomyces clavuligerus se encontró que durante
la trofofase, el OD baja hasta 0% y para la idiofase este alcanza un valor de 50% y si se
mantiene el oxígeno en valores altos se logra altos rendimientos [88]. Valores de OD
superiores a 20% suplen las necesidad de oxígeno para la producción de AC de Sc.
Enriquecer el aire con oxígeno no representa mejoras en la producción, mientras que
variaciones en las condiciones de aireación y de agitación si mostraron cambios
78
favorables significativas en la titulación de AC, en la producción y en la OUR [89]. Una
estrategia de suministro de oxígeno moderada y por etapas representó un aumento en la
producción de ARG y la disminución de subproductos para Corinobacterium crenatum
[87].
Entender las características fisiológicas de los microorganismos en la producción de
metabolitos secundarios bajo diferentes condiciones metabólicas de asimilación de
oxígeno, empleando un método sistémico como el AFM, puede proporcionar
información interesante que permita entender y conocer los mecanismos metabólicos del
proceso. Basados en la información y el conocimiento obtenido por AFM se pueden
establecer estrategias de suministro óptimo de oxígeno que favorezcan el producto. Los
trabajos en los cuales se muestran interrelación entre perfiles de velocidad de consumo
de oxígeno con los flujos de metabolitos y producto es muy limitada [47, 87].
2.4. TIPO DE OPERACIÓN: LOTE, LOTE ALIMENTADO y
CONTINUO.
Las fermentaciones pueden ser operadas en reactores en lote, lote alimentado (LA) y
continuo. En reactor en lote todos los componentes, excepto los sustratos gaseosos tales
como oxígeno, agentes de regulación de pH y de espuma son adicionados al reactor al
inicio de la fermentación. En el proceso en lote alimentado, no se remueve nada del
reactor durante el proceso, pero el medio de cultivo o alguno de sus componentes, es
adicionado continuamente a modo de controlar la velocidad de reacción para evitar
efectos de represión catabólica sea por FC o FN. En un proceso continuo hay suministro
constante de nutrientes y salida constante de productos, regulando los caudales de
modo que el volumen de cultivo se mantiene constante y el sistema se mantiene en un
79
estado estacionario. La operación en continuo es más eficiente que en lote o LA en
términos de tiempo de proceso, debido a que hay menos tiempo muerto debido a la carga
y descarga de productos [61].
Para la producción de antibióticos han sido muchas las estrategias de modificación del
proceso empleadas hasta el momento. En el caso de AC se han realizado estudios
comparando estos tres tipos de procesos (lote, LA y continuo) para determinar el efecto
de la variación operacional sobre el producto, obteniendo titulaciones de AC de 194, 404
y 293 mg L-1
en lote, LA y continuo respectivamente. La productividad fue mayor en el
continuo obteniendo 10.6 mg L-1
h-1
, casi tres veces a la obtenida en lote, encontrando en
el proceso continuo una estrategia prominente para producir AC [91].
Cultivos en lote se han empleado para estudiar el efecto de algunos nutrientes, tratando
de optimizar un medio para la producción de AC. Variando la FN, se obtuvieron
titulaciones de AC de 380 mg L-1
para una concentración de aislado de proteína de soja
de 20 g L-1
(3 g de N total L-1
) [70].
Cultivos en lote alimentado se han empleado para controlar la velocidad de
crecimiento, prolongar la fase estacionaria y contrarrestar algún efecto de inhibición o
represión de algún metabolito. En la producción de AC, el sustrato más utilizado en este
tipo de procesos es el glicerol (GLC) [34, 70, 92], también se han empleado como
sustrato mezclas de GLC con un aminoácido sea ORN o ARG [34, 73], observando la
duplicación de la producción con respecto al lote, con títulos de 250 mg L-1
y mayor
estabilidad del producto en todos los casos [34, 73].
Cultivos en continuo se han empleado para recopilar información que permita hacer
análisis de flujos metabólicos, en el cual a través de ciertas herramientas matemáticas se
80
pueden establecer los flujos al interior de la célula [24, 93]. La discusión sobre esta
metodología se presenta en la sección 2.5.3.2.
2.5. MODELADO Y SIMULACIÓN EN BIOPROCESOS.
El modelado y la simulación juegan un papel muy importante en la optimización de
bioprocesos. Clásicamente, los modelados cinéticos de los procesos tienen como
objetivo, obtener algún parámetro que pueda predecir su comportamiento y obtener
criterios para escalar o hacer alguna variación en el proceso. Esto ha ido cambiando en
los últimos 20 años, en donde paulatinamente ha venido incursionando el concepto de
modelado metabólico, con el cual se permite un mayor acercamiento al comportamiento
celular como tal y se puede conocer más en detalle cómo se distribuyen los flujos
metabólicos para establecer posibles cuellos de botella y limitaciones estequiométricas
o energéticas. Esta información puede relacionarse con alguna estrategia de tipo
molecular para entender y optimizar los procesos. Puede decirse que la mayoría de los
trabajos orientados a mejorar y optimizar los procesos biológicos para la síntesis de
metabolitos de interés, están enfocados desde la observación macroscópica de los
fenómenos, y que con el modelado metabólico se logra un enfoque molecular de los
bioprocesos analizando las rutas bioquímicas que incluyen las reacciones de ensamble,
polimerización, biosíntesis y combustión.
En la figura 2.6 se presenta de manera esquemática un sistema de bioprocesos y alguno
de sus componentes. Se observa en dicha figura un sistema multi-jerarquico de
interacción entre variables intra y extra-celulares donde el propósito general es
maximizar productividad y rendimiento. A nivel extracelular (macroscópico) el
concepto de velocidad específica de crecimiento se usa no sólo como un importante
81
parámetro que indica la actividad microbiana, sino también como un parámetro cinético
en el campo de ingeniería de las reacciones para diseño de bioreactores y plantear
estrategias de operación. Así, las velocidades específicas de reacción se definen como
flujos de reacción de metabolitos extracelulares tales como sustratos y productos, los
cuales son parámetros útiles para el modelado metabólico. Al considerar el proceso
como un sistema en estado estacionario, se pueden plantear reacciones estequiométricas
que corresponden a balances de sustratos, productos, energía, incluye reacciones de
transporte, polimerización. Estas reacciones estequiométricas se pueden resolver por
análisis de flujos metabólicos y síntesis de los resultados. Si en el sistema se consideran
las reacciones cinéticas y un estado dinámico, se habla de control metabólico y el
sistema se resuelve por análisis de control metabólicos. En la parte inferior de la figura
2.6 se observa como a medida que se profundiza en el conocimiento del funcionamiento
celular, la descripción de los sistemas se hace más compleja y por ende se requiere de
mayor número de variables y del uso de herramientas computacionales que permitan
ayudar a organizar, manejar y obtener información de una manera sistémica. Para el
modelado metabólico se requiere de información de la ruta metabólica, la cual se puede
obtener de reportes bibliográficos o bases de datos científicas (como se explica en la
sección 2.2), el modelado metabólico se va haciendo tan complejo como se requiera, a
medida que se van adicionando reacciones de diferente tipo, hasta llegar a incluir
reacciones de tipo genético. El análisis y solución de los modelos metabólicos generados
requieren del uso de programas matemáticos de alta especialización [94, 95].
82
Figura 2. 6. Esquema de un sistema de elementos que se tienen en cuenta para el modelado en bioprocesos. El recuadro subrayado simboliza la célula y cada cuadro interno se refiere al nivel de complejidad para las variables del modelo. La metodología de solución al problema corresponde a modelado macroscópico y modelado metabólico [94].
A continuación se describirán algunos aspectos relevantes en el modelado cinético y
metabólico a tener en cuenta, orientados en su mayoría a casos de estudio con
Streptomyces sp.
2.5.1 Modelado cinético de Streptomyces sp.
Todo el esfuerzo realizado para poder construir un modelo matemático que describa un
sistema en estudio, se ve recompensado al obtener una herramienta para analizar en
forma cualitativa y cuantitativa, permitiendo su utilización para realizar predicciones,
optimización, control y diseño de equipos o para la determinación de nuevas condiciones
operacionales que mejoren el comportamiento del sistema [79].
En los modelos dinámicos propuestos para las fermentaciones, la concentración de
biomasa, sustrato y producto son variables temporales, que permiten evaluar la
evolución de la fermentación. Para describir la relación entre la velocidad de
crecimiento y la concentración de sustrato, se han propuesto diferentes modelos de
Propósito en el proceso:
Aumentar la
productividad y el
rendimiento
Velocidades específicas de: crecimiento
consumo de sustrato
formación de producto
formación de CO2
consumo de O2
formación de subproductos.
•Flujos metabólicos:
estequimetría
polimerización
transporte
termodinámica
•Control metabólico
reacciones
•Bioinformática:
Genoma
Transcriptoma
Proteoma
Metaboloma
Variables extracelular
Variables intracelulares
< 10 10-103 103-105
Metodología
Y
herramientas
Modelado
macroscópico
Modelado metabólico:
Análisis de flujos metabólicos
Análisis de control metabólico
Síntesis
Número de
variables
Microarreglos
Electroforesis
LC-masas
83
crecimiento microbiano, dentro de los cuales el más famoso de ellos es la expresión
propuesta por Jaques Monod en 1943, sin embargo la falta de consistencia en muchas
ocasiones con los datos experimentales, ha conducido a desarrollar modelos alternativos
como los propuestos por Contois, Teissier, Moser, entre otros [96].
Mientras las simulaciones constituyen una herramienta esencial para el desarrollo de
nuevos productos en diversas áreas industriales, este no es el caso en el desarrollo de
bioprocesos en la industria farmacéutica. Una de las razones es la complejidad de los
sistemas biológicos y el poco entendimiento que hay aún de los mismos. Este sector se
vería beneficiado si se emprenden esfuerzos para desarrollar modelos matemáticos y
programas de simulación que permitan incrementar la productividad y reducir costos
del proceso [95].
A pesar de que los modelos cinéticos son una importante herramienta para la
optimización y control de procesos, existen pocos modelos planteados para describir las
dinámicas de los procesos de fermentación de Estreptomicetos [64, 97]. Algunos
modelos cinéticos generados son el de tipo logístico para predecir el comportamiento de
crecimiento de S. coelicolor y el modelo tipo Luedeking-Piret para modelar la
producción de actinorrodina, los cuales se ajustan bien a los datos experimentales [98].
Es de resaltar que una característica de la producción de metabolitos secundarios es que
la cinética del producto no está asociada al crecimiento [97- 98], sin embargo, en este
microorganismo, donde la producción de actinorrodina resulta estar asociada al
crecimiento [98], puede atribuirse a diferencias en la naturaleza de los medios
empleados (definido vs complejo); se tomó información de velocidad de crecimiento de
un sólo grupo de datos empleando medio definido, pero se trabajó en medio complejo.
A pesar de esta diferencia en la cinética del producto, los parámetros encontrados
84
estuvieron dentro del rango de valores esperados comparado con los obtenidos para
otros cultivos microbianos.
El complejo comportamiento dinámico de S. tendae se ha descrito usando un modelo
estructurado y compartimentalizado y extrapolándolo luego a otras especies. En este
caso se presenta la velocidad de crecimiento como una función del contenido de
algunos compartimentos intracelulares [99-100]. También se han empleado modelos
cinéticos de crecimiento celular como los de Contois, Monod, Tessier y Logístico en
cultivo en lote para S. peucetius productora de rodomicina, encontrando en el Logístico
un mayor ajuste al comportamiento de crecimiento y consumo de sustrato [101]. Para Sc
existen pocos reportes de modelado cinético, entre los que están el modelo tipo Monod
que se ajusta bien al crecimiento. El modelo considera represión catabólica sobre
producción de AC durante la fase de crecimiento, y se asume formación de producto no
asociada al crecimiento, presentando un efecto mixto. La formación de AC comienza
cuando la concentración de glicerol (Cs) alcanza un valor crítico, Cs2, mayor que Cs1.
La muerte celular y la degradación del producto son consideradas como reacciones de
primer orden en relación a la concentración celular (Cx) y concentración de producto
(Cp) respectivamente. El efecto de la concentración de oxígeno disuelto (OD) no se
consideró en el modelo por mantenerse por encima del valor crítico para evitar
limitación por este sustrato. El modelo propuesto, el cual se ajustó bien a la cinética de
Sc para producir AC, se presentan en las ecuaciones (6), (7) y (8). Los parámetros
cinéticos son entonces encontrados al resolver este sistema de ecuaciones [102].
85
(6)
(7)
(8) Cp.k)Cs(f.Cx.
dt
dCp
pr
Cx.CsKs
Cs..
Y
1
dt
dCs
sr
)Cs(f.Cx.kCx.CsKs
Cs.
dt
dCx
xr
p2
max
s/x
1dmax
Donde: rx, rs, rp son las velocidades de crecimiento microbiano, consumo de sustrato y
generación de producto, respectivamente. f (Cs1) es una función de etapa, inicialmente
igual a cero y que asume valores iguales a 1 para concentraciones menores al valor
crítico, Cs1, cuando comienza la muerte celular; f(Cs2), es también una función de
etapa, inicialmente igual a cero, durante la represión catabólica. Esta asume un valor
igual a 1 cuando la concentración de glicerol cae por debajo del valor crítico, Cs2.
También se ha empleado una cinética de Contois para modelar múltiples sustratos
aditivos, en un proceso continuo para la producción de AC por Sc. El modelo describe
el comportamiento de crecimiento celular, de consumo de sustrato y de formación de
producto aplicado a diferentes bioreactores. En este caso el producto se consideró con
una cinética de producción no asociada al crecimiento [103].
2.5.2 Modelado metabólico
El modelado metabólico es el resultado de plantear las reacciones bioquímicas que
mejor representen la reacciones catabólicas y anabólicas relacionadas con la biosíntesis
de un producto y a través de herramientas matemáticas poder resolver el sistema
matricial obtenido, de tal manera que se puedan conocer todos los flujos hacia y desde
sistema. Esto se conoce como análisis de flujos metabólicos, el cual, entre otras
aplicaciones, es una herramienta de la ingeniería metabólica.
86
2.5.2.1. Fundamentos de modelado metabólico.
La mutagénesis al azar fue la primera estrategia tecnológica empleada para modificar
genéticamente organismos. Sin embargo sus resultados son tan aleatorios que se puede
considerar más un arte que una ciencia. La selección de cepas a través de mutaciones
naturales y la tecnología del ADN recombinante dieron paso a la manipulación genética
o de vías metabólicas generando resultados específicos a modificaciones deseadas. En
los años 80 aparecieron los primeros conceptos acerca de la manipulación dirigida de
vías metabólicas y algunas formas de llamar a esta nueva estrategia fueron ―producción
molecular‖, ―evolución in vitro‖, ―ingeniería de vías metabólicas‖ e ―ingeniería
metabólica‖ [104]. A comienzos de los 90´s un artículo en honor a James E. Bailey,
considerado uno de los primeros investigadores en IM, donde se definió la disciplina
como ― el mejoramiento dirigido de la actividad celular a través de modificaciones de
reacciones bioquímicas específicas por manipulación de la actividad de sus enzimas, del
transporte y de las funciones regulatorias de la célula mediante el uso de la tecnología
del ADN recombinante‖ [105], definición que aun hoy está en uso, con algunas
actualizaciones debidas al desarrollo y aplicación de poderosas técnicas ―-omicas‖ y
bioinformáticas para el estudio de sistemas biológicos.
Entre las diversas metodologías que se pueden aplicar en IM están: Análisis de la
capacidad celular, análisis de flujo metabólico (AFM), análisis de control metabólico
(ACM) y síntesis de sistemas e integración de datos bioinformáticos [104].
El AFM es de gran utilidad para: Calcular flujos extracelulares no medidos, calcular
rendimientos teóricos máximos, identificar vías alternas en el metabolismo e identificar
puntos de ramificación de control metabólico (rigidez de nodos) [95]. En la figura 2.7 se
87
presentan de forma esquemática las posibilidades que brinda el uso de modelado
metabólico. Una vez establecidas las reacciones bioquímicas más representativas, se
realiza un balance de materia o balance molar para cada uno de los metabolitos
intermediarios, generando una matriz estequiométrica, denominada como E, un vector
de flujos y se asume que el sistema está en estado estacionario. De acuerdo con la
posibilidad de solución a este sistema, sea considerado determinado, subdeterminado o
sobre especificado, se presentan alternativas para solucionarlo: Análisis de flujos
metabólicos (AFM), para sistemas determinados, el cual provee, una única respuesta y
balances de flujos metabólicos (FBA), análisis de modo de flujos elementales (EFM) y
análisis de vías extremas (EPA), para sistemas subdeterminados, donde se debe recurrir
a programas de optimización que proveen una familia de soluciones que satisfacen el
sistema. Los programas de optimización se basan en método Simplex para FBA y
método de análisis convexo para EPA y EFM. El método de análisis de consistencia de
datos se aplica para sistemas sobre especificados, el método se describe en la sección
2.5.2 [95,106].
88
Plantear la Ruta bioquímica Ruta clavamas, ruta PP, TCA, X, PO4, ácidos orgánicos, Rxnes de varios AA. Consideraciones: cofactores son energéticamente covalentes, composición celular constante, balance en es
Balance de materia de cada metabolito
Grados de libertad, F Clasificación de flujos a medir y a calcular F= flujos- metabolitos Determinar NC
Sobredeterminado Datos redundantes
Subdeterminado: FBA Establecer función objetivo (Z) Solución por programación lineal
Propuesta de flujos medidos (teóricos)
+Balances elementales Y de óxido reducción +Determinar matriz de redundancia +Obtener vector de residuos, matriz de varianza-covarianza y el índice de consistencia
AFM Análisis de resultados a cambops
Única respuesta
Plantear la reacciones estequiométricas del metabolismo Gluconeogénesis, ruta de PP, ciclo de Krebs, ciclo de la urea, síntesis de X, ruta clavamas, ruta, síntesis de aminoácidos.
Consideraciones: Cofactores son energéticamente covalentes, composición celular constante, balance en estado estacionario. Metabolitos extracelulares con poco aporte se
El sistema puede ser:
Análisis de sensibilidad
Análisis de consistencia de datos experimentales
1 0 00 1 00 − 2 1
= 𝐸
𝑑𝐶𝐴 𝑑𝑡
𝑑𝐶𝐵 𝑑𝑡
𝑑𝐶𝑖 𝑑𝑡 =
1 0 00 1 00 0 1
.
𝜈1𝜈2𝜈𝑗
𝑬𝑻𝝂 = 0
Matriz estequiométrica (Ecuaciones estequiométricas derivadas del modelo metabólico)
Fuentes bibliográficas Para conocer y seleccionar las rutas metabólicas. Se consultan de: Bases de datos, artículos de revista y libros.
Un óptimo (Z) Varios ( Z)
Flujos medidos: datos experimentales
Determinado: AFM
Figura 2. 7. Diagrama de flujo de los pasos a seguir en la solución al modelado metabólico
89
2.5.2.2. Análisis de flujos metabólicos (AFM).
El análisis de flujo metabólico (AFM) es una herramienta de IM que permite mediante
el uso de programas matemáticos calcular los flujos metabólicos intracelulares, y
determinar así como estos flujos se distribuyen a través de las distintas rutas metabólicas
cuando el sistema se encuentra estado estacionario. A través de la aplicación de
diferentes cambios en la red metabólica, se puede conocer o prever los efectos de esas
modificaciones sobre alguna ruta o metabolito de interés. En la figura 2.8 se presenta la
metodología empleada para llevar a cabo un análisis de flujos metabólicos (AFM); el
proceso va desde la recopilación de información para el modelado metabólico hasta el
desarrollo matemático necesario para hacer las respectivas simulaciones y analizar la
variación de los flujos en el interior de la célula como resultado de modificaciones o
manipulaciones en el sistema.
La fisiología celular puede ser interpretada o entendida por observación de la
distribución de flujos bajo las condiciones ambientales investigadas. El impacto de una
estrategia de mejoramiento genético de un microrganismo, puede ser evaluada por
comparación de su distribución de flujos con respecto a la especie silvestre del
microrganismo [107].
Un método sistémico que detalla el procedimiento matemático a seguir para determinar
la distribución de flujos metabólicos ha sido presentado por varios autores [20, 106,
107]. El proporcionar la mayor información posible sobre reacciones y genes, etc.
permite el poder construir una red metabólica para trabajar y facilitar el obtener
información muy importante sobre el sistema. Sin embargo, ya que el análisis
cuantitativo del metabolismo, requiere de datos experimentales, es importante que la
90
consistencia de datos sea confirmada, antes de utilizarlos en la determinación de los
flujos metabólicos.
Fuentes bibliográficas
Balance de materia de cada metabolito
Figura 2. 8. Representación esquemática de la metodología empleada para realizar AFM. Donde E es matriz estequiométrica, Ci: concentración de metabolitos en estado estacionario. V: vector de fluxes metabólicos, subíndice c y m se refiere a calculados y medidos respectivamente, F: grados de libertad.
2.5.2.2.1 Modelización matemática de sistemas determinados
El análisis de flujo metabólico es realizado empleando un modelo estequiométrico en el
que se incluyen las reacciones bioquímicas más representativas para la biosíntesis de un
Plantear el Modelo estequiométrico ( E)
(ecuaciones estequiométricas derivadas del modelo
metabólico), determinar NC
Rutas metabólicas obtenidas
de bases de datos, artículos
de revistas y libros
Matriz estequiométrica
ETν= 0, estado estacionario
Clasificación de flujos a medir y a calcular
Análisis de grados de libertad
F = número de flujos - número de componentes
νC = - EC-1.
Em.νm, para realizar AFM
Análisis de resultados
Datos de flujos medidos para
sistema determinado
Simulaciones para AFM
Análisis de sensibilidad (AS)
Simulaciones para
AFM
E
120
010
001
jdtdCi
dtdCB
dtdCA
2
1
.
100
210
001
/
/
/
91
producto de interés. En caso de no tener suficiente información acerca del
microorganismo de estudio, se pueden agregar datos de otros microorganismos que
presenten rutas bioquímicas similares. El AFM se realiza mediante un balance de
materia alrededor de los metabolitos presentes en el modelo estequiométrico propuesto y
se asume estado estacionario, lo cual permite obtener un sistema de ecuaciones
algebraicas lineales, como se presenta en (21).
0
t
CEν
d
d (21)
Siendo E la matriz estequiométrica de dimensiones (e x n), donde las e filas representan
cada uno de los metabolitos y las n columnas representan las reacciones en las que
estos participan. El vector ν de dimensión (nx1), es el vector de flujos de todas las
reacciones. Los valores en cada columna corresponden a los coeficientes
estequiométricos de los metabolitos que participan en la reacción. Hay un coeficiente
negativo para cada metabolito consumido y positivo para cada metabolito producido. Un
coeficiente estequiométrico de cero se usa para metabolitos que no participan en la
reacción considerada. Se asume estado estacionario para las concentraciones todos los
metabolitos intracelulares (Ci) [66], con lo cual la velocidad de acumulación de todos
ellos es cero (lado derecho de (21)).
Para resolver este sistema de ecuaciones lineales (e x n), se deben establecer los grados
de libertad (F) que indican si el sistema es determinado, indeterminado o sobre
especificado; estos corresponden a la diferencia entre el número de reacciones presentes
(n) y el total de compuestos (e) empleados para los balances de materia. En caso de
poder medir el número de flujos dado por F, el sistema se considera determinado. Otra
92
situación que puede presentarse es que el número de flujos medidos sea inferior a F, lo
que implica que el sistema es insuficiente para obtener una única solución, en tal caso se
obtiene un sistema subdeterminado. En este caso el sistema debe resolverse utilizando el
análisis de balance de flujos (FBA, flux balance analysis). Para la solución de un
sistema subdeterminado se requiere definir una función objetivo a optimizar y unas
restricciones al sistema de acuerdo con el conocimiento que se tenga de la ruta
metabólica. El FBA se ha empleado para redes bioquímicas muy grandes en donde es
difícil o imposible agotar todos los grados de libertad [56, 107]. Más detalles se
presentan en la sección 2.5.2.3.
El término E.ν, presente en la ecuación (21), se puede reorganizar en dos matrices
considerando los flujos medidos (νm) y calculados (νc), como se presenta en la ecuación
(22). Al reorganizar la matriz E separando los flujos a calcular, se puede solucionar el
sistema matricial como se muestra en ecuación (23), que es la base para realizar los
cálculos de análisis de flujo metabólico (AFM) [56, 108].
0 = CCmm νE + νE (22)
De donde
mmCC νEEν1
- =
(23)
2.5.2.2.2 Metodología para realizar AFM
La construcción de un modelo metabólico, en principio parece depender sólo del
conocimiento de las reacciones estequiométricas. Sin embargo, asegurar la consistencia
dentro del grupo de reacciones escogidas para el balance de metabolitos y la
calculabilidad de las velocidades escogidas, no siempre es sencilla y sobre todo en
93
presencia de redes muy grandes. Por ejemplo, puede ocurrir que existan reacciones
dependientes, lo cual puede hacer que el problema sea no solucionable. Si la matriz
estequiométrica es de rango completo y no tiene reacciones dependientes, se puede
solucionar. Por el contrario si la matriz no es de rango completo y tiene una o más
reacciones dependientes, se puede obtener una solución. Por el contrario si la matriz no
es de rango completo y tiene una o más reacciones dependientes, no será posible obtener
una solución. . Se plantea a manera de ejemplo sencillo como es la estrategia de AFM
con una red simplificada para Sc.
Después de plantear la matriz estequiométrica derivada de las reacciones
estequiométricas definidas como el modelo metabólico, (figura 2.9), el siguiente paso es
encontrar qué reacciones o columnas de la matriz tienen dependencia lineal con otras.
Para esto se hace uso del algebra lineal y de programas computacionales, tales como
Matlab.
Cuando la matriz estequiométrica es pequeña, el análisis puede realizarse mediante una
simple inspección visual. Para el ejemplo citado en esta sección, puede verse que hay
linealidad entre los flujos de los metabolitos ORN y ACE (ver figura 2.10), por lo que
se elimina uno de ellos (en este caso se eliminó acetato, ya que se mide ORN). Una vez
se haya obtenido la matriz estequiométrica y verificado que no posee reacciones con
dependencia lineal entre sí, el siguiente paso consiste en determinar el número mínimo
de flujos a ser medidos, calculados a partir de los grados de libertad (F). En este caso,
los grados de libertad son 12-9 =3. Los flujos seleccionados medidos son las
velocidades netas de consumo de GLC, NH4 y velocidad de producción de ORN, que
corresponden a los flujos ν1, ν6 y ν8.
94
PEP
ACCOA
TCA
aKG
OAAAsp
GLU
NH4GLUEXT
GLC
ORN
Figura 2.9. Modelo simplificado del metabolismo de S. clavuligerus. Siglas usadas: GLC, glicerol; PEP, fosfoenolpiruvato; OAA, oxaloacetato; GLU, glutamato; ASP, aspartato; ACE, acetato; ORN, ornitina; EXT. Externo.
Figura 2. 10. Matriz estequiométrica correspondiente al ejemplo de estudio. Las celdas punteadas corresponden a los flujos medidos. Las celdas sombreadas corresponden a metabolitos intermediarios.
flujos
metabolitos GLC -1 0 0 0 0 0 0 0 0
NH4 0 0 0 0 0 -1 0 0 0
ASP 0 0 0 0 0 0 1 0 0
ORN 0 0 0 0 0 0 0 1 0
ACE 0 0 0 0 0 0 0 1 0
GLUext 0 0 0 0 0 0 0 0 1
C02 0 -1 1 1 1 0 0 0 0
PEP 1 -1 -1 0 0 0 0 0 0
aKG 0 0 0 1 -1 -1 1 1 0
OAA 0 1 0 -1 1 0 -1 0 0
ACCOA 0 0 1 -1 0 0 0 -1 0
GLU 0 0 0 0 0 1 -1 -2 -1
NADH(NADPH) 2 0 1 1 1 -1 0 -1 0
6 7 8 91 2 3 4 5
1 GLC + 2NAD → PEP + 2NADH
2 PEP + CO2 + ATP → OAA + ADP
3 PEP + NAD →ACCOA + CO2 + NADH
4 ACCOA + OAA + NADP → aKG + NADPH + CO2
5 aKG + NAD → OAA + NADH + ATP + CO2
6 aKG + NH4 +NADPH → GLU + NADP
7 OAA + GLU → ASP + aKG
8 2GLU + ACCOA + ATP + NADPH → ORN + aKG +ACE
9 GLU → GLUEXT
95
197
287
157
90
140
40
ν
ν
ν
ν
ν
ν
: tienese
50
10
100
ν
ν
ν
: con
9
7
5
4
3
2
c
8
6
1
m
-
-
-
νν
Reorganizando la matriz de la figura 2.10 de acuerdo con los flujos medidos y los que se
van a calcular y aplicando la ecuación (23) se tiene la relación presente en la figura
2.11.
8
6
1
9
7
5
4
3
2
ν
ν
ν
ν
ν
ν
ν
ν
ν
112
210
100
110
001
100
100
010
001
001110
110000
000110
011101
011100
000011
001111
100000
0100001
Figura 2. 11. Desarrollo del AFM, La solución de la ecuación permite obtener la distribución de los flujos intracelulares indicados en el modelo de la figura 2.9.
Con los resultados se puede analizar el comportamiento de la red, identificar los flujos
que aumentan o disminuyen y la magnitud de esos cambios frente a un cambio en uno de
esos flujos, ocasionado por una perturbación en el sistema, ya sea de tipo experimental o
por simulación, por citar algunas preguntas que se resuelven con AFM.
2.5.2.2.2.1 Análisis de sensibilidad
Es importante señalar que cualquier modelo estequiométrico está sujeto a un análisis
matemático para determinar si el problema está bien condicionado, de manera que, al
resolver la ecuación (23), la matriz de los flujos a calcular representan la menor
96
#
CC EE NC
propagación del error de los flujos medidos. En caso de estar mal condicionado se debe
replantear la red metabólica, cambiando alguno de los flujos a medir. El número de
condición (NC) refleja la ―sensibilidad‖ de una solución de las ecuaciones lineales al
error en los datos para la estequiometria asumida, y se calcula por medio de la ecuación
(24). El NC no solo es proporcional al error actual propagado sino también al tamaño
de la matriz. Un NC por debajo de 1000 puede reflejar que está bien condicionado [31].
(24)
Las barras () describen una norma matricial. La matriz pseudo-inversa es
T
C
1
C
T
C
#
C E*)E*(EE , el superíndice T indica que es matriz transpuesta.
El análisis de sensibilidad se realiza una vez que la matriz está bien condicionada. Este
análisis puede proporcionar información considerable no sólo de la precisión de los
cálculos, sino también de las propiedades dinámicas de la red metabólica propuesta. Al
variar el vector de los flujos medidos puede ayudar a mejorar el diseño experimental al
permitir la escogencia de un buen grupo de flujos medidos tal que proporcione un valor
de NC bajo [31].
Partiendo de un sistema determinado, y siguiendo la metodología propuesta por Daae
and Ison (1999) para realizar el análisis de sensibilidad de la ruta metabólica propuesta,
a partir de la ecuación (22), se puede proponer que un cambio en el flujo medido
ocasiona un cambio en el flujo calculado, como se muestra en la ecuación (25) [31].
(25) )( m1m2m
-1
CC1C2 ν - ν EE - = ν - ν
97
La ecuación (25) se puede presentar en forma diferencial mediante la ecuación (26), la
cual es la base para el análisis de sensibilidad y depende de la estequiometria
únicamente.
(26) 1-
- = mEC
E
m
C
ν
ν
d
d
El impacto acumulado sobre el sistema de cada uno de los flujos medidos (νm) se
encuentra al extraer la raíz cuadrada de la sumatoria de los valores individuales de los
coeficientes de sensibilidad asociados a cada flujo elevado al cuadrado. Una vez que se
ha determinado cuales son los flujos a medir que generan un bajo número de condición,
e identificado el impacto acumulado por cada flujo medido, se procede luego a realizar
el análisis de flujo metabólico (AFM) empleando la ecuación (23).
2.5.2.2.3 Trabajos reportados sobre AFM para Streptomyces.
El análisis de flujo metabólico (AFM) ha sido aplicado exitosamente en el diseño de
procesos, usando pequeñas redes metabólicas y buscando optimizar el rendimiento del
producto (ej. antibióticos). Entre los estudios realizados, es posible citar trabajos con S.
tenebrarius [19], S. lividans [20, 26], S. coelicolor [25, 29, 41, 83, 98, 109] y los
trabajos realizados con Sc [13, 24, 27, 47, 93].
Para la producción de un antibiótico a partir de S. tenebrarius, se estudió la interacción
entre el metabolismo primario y secundario al trabajar con dos medios, uno con glucosa
como única FC y el otro con una combinación de glicerol y glucosa. Con este último
medio se obtuvo que en la idiofase los flujos en la vía Entner- Deudoroff (ED)
disminuyeron e incrementaron los flujos en las vías PP y EMP, relacionado esto con
altos flujos de NADH y NADPH y este hecho fue asociada con mayor producción del
98
antibiótico tobramicina y disminución en el porcentaje del subproducto indeseado,
kanamicina B [19].
Para S. lividans productor de los antibióticos actinorrodina y undecilprodigiosin se ha
encontrado que un incrementó en la producción de biomasa promueve un aumento en la
vía PP y en la glicolisis. En un medio limitado en fosfato, las distribuciones de los
flujos de carbono a través de las rutas catabólicas mostraron la dependencia de las vías
EMP y PP con respecto a la velocidad de crecimiento y la fuente de carbono y energía
empleada (glucosa o gluconato). Las síntesis de ambos antibióticos fueron
desfavorecidas con aumento en los flujos en vía PP [26].
Son diversas las estrategias que han sido implementadas para mejorar la producción de
AC haciendo uso del AFM. Mediante el conocimiento de la distribución de flujos en el
metabolismo central del carbono (MCC) de Sc, generados al limitar el medio de cultivo
en las fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo se pudo proponer una estrategia racional
de mejoramiento del medio a través de alimentación de aminoácidos que favorecieran la
disponibilidad del precursor C5 (ARG). Se estableció que bajo limitación de nutrientes
en el medio, el flujo a través de la vía anaplerótica (carboxilación de PEP para producir
oxaloacetato) era bajo, consistente con la carencia del precursor ARG, limitando así los
flujos hacia la síntesis de AC. Con base en los resultados obtenidos se propuso que la
limitación de carbono restringe el flujo de carbono por la vía anaplerótica, reduciendo el
potencial requerido para el ciclo de Krebs. En este ciclo están involucrados los
metabolitos OAA y aKG que son precursores necesarios para síntesis de aminoácidos
como ASP y GLU necesarios en la biosíntesis de ARG, uno de los precursores directos
de AC. Bajo limitación de nitrógeno se encuentra una disminución en los flujos de
aminoácidos precursores de la biosíntesis de AC. Bajo limitación de fósforo, los
99
resultados mostraron altos valores de flujos en los precursores C3 y C5 que resultan en
un aumento de la producción de AC [93].
El AFM sirve para establecer estrategias de alimentación al cultivo de acuerdo con el
conocimiento previo de la distribución de flujos del MCC para Sc. Al comparar cultivos
en continuo con medio basal y con medio enriquecido por la adición de aminoácidos
individuales y combinados, se encontró que la adición de ASP, ASN y THR se
incrementan los flujos de la vía de síntesis de ARG con el consecuente aumento de 18
veces el rendimiento de AC, con respecto al medio sin adición de estos AAs [47]. Estos
resultados provenientes de resultados de modelado metabólico fueron confirmados
independientemente en experimentos donde al comparar una cepa silvestre con
mutantes, se identificaron los cuellos de botella de la biosíntesis de AC, y se propone
como estrategia alimentar ARG al cultivo, logrando incrementar la producción de AC
[24].
2.5.2.3 Análisis de balances de flujos (FBA).
Cuando se plantea un modelo metabólico como el representado en ecuación (21), se
pueden presentar tres situaciones dependiendo del número de flujos que se puedan
determinar experimentalmente para agotar los grados F del sistema. Para el caso donde
el número de flujos medidos es menor que los F, hay un número infinito de soluciones
que satisfacen el sistema, y los flujos pueden ser calculados mediante el uso de
algoritmos de programación lineal. Con esta técnica es posible obtener una solución
para los flujos intracelulares a partir de la optimización de una función objetivo
apropiada [104, 111].
100
La construcción de un modelo metabólico para aplicar análisis de balances de flujos
requiere establecer restricciones de diferente tipo, fisicoquímicas, espaciales,
topológicas, dependientes de las condiciones ambientales, de tipo regulatorio o genético.
El análisis asume que bajo algunas condiciones ambientales dadas, el organismo
alcanzará el estado estacionario que satisface esas restricciones fisicoquímicas. Ya que
las restricciones del sistema celular no se conocen en su totalidad, se pueden obtener
múltiples soluciones del estado estacionario. Para identificar un estado fisiológico
significativo en estado estacionario, se requiere de una optimización para encontrar los
valores óptimos de una función objetivo específica con respecto a las restricciones
dadas. El balance de masa es definido en términos de flujo a través de cada reacción y
se tiene en cuenta la estequiometria de la reacción. Esto da un conjunto acoplado de
reacciones diferenciales [111].
En la figura 2.12 se presenta la metodología empleada para llevar a cabo un análisis de
distribución de flujos metabólicos; el proceso va desde la recopilación de información
para la construcción del modelo metabólico hasta la solución matemática del modelo.
Posteriormente viene un análisis de los resultados de la distribución de los flujos al
interior de la célula en función de la implementación de algún cambio en el sistema.
El objetivo de FBA es identificar los flujos metabólicos desconocidos que proporcionan
una solución en estado estacionario bajo restricciones de tipo estequiométrico y de uno
o varios flujos medidos que permitan una única distribución de flujos. Un organismo
puede tener dos o más rutas redundantes y bajo diferente conjunto de datos se pueden
obtener los mismos óptimos. Para abordar esta problemática, recientemente se ha hecho
uso de análisis de variabilidad de flujos (FVA). Este tipo de análisis proporciona un
101
Balance de materia para cada metabolito
[dCi/dt] = E
Definición de número de observaciones
experimentales menores que los grados de
libertad del sistema
Análisis de resultados
Modelo subdeterminado (FBA)
, siendo C : ATP, µ o AC
Sujeto a :
Suposición estado estacionario
Análisis de grados de libertad
Grados de libertad (F)
F = número de flujos - número de componentes
Figura 2.12 Representación esquemática de la metodología empleada para realizar FBA. Donde E es matriz estequiométrica, Ci: concentración de metabolitos en estado estacionario.
: vector de flujos metabólicos, subíndice c y m se refiere a calculados y medidos respectivamente, F: grados de libertad.
Modelo metabólico propuesto
102
exp
supinf
0
ννννν
Eν
j
intervalo de valores para cada reacción en el sistema. Como el intervalo de solución es
único, los flujos considerados como verdaderos son los que estén incluidos en el
intervalo [111, 112].
2.5.3.3.1 Sistema subdeterminado, modelización matemática
Para encontrar la solución al sistema subdeterminado es necesario aplicar métodos de
programación lineal. En donde se plantea una función objetivo Z como hipótesis de que
el metabolismo celular es regulado de modo tal que se optimizan ciertas funciones de la
célula. La descripción del problema matemático a resolver se puede describir como se
presenta en la ecuación (27).
Maximizar/minimizar (27) )( CνZ f
La combinación lineal de flujos νC minimiza o maximiza bajo las siguientes
restricciones:
Siendo los subíndices inf, sup, exp: inferior, superior y experimental respectivamente.
Los valores inferior y superior corresponden a valores límites inferiores o superiores
que son establecidos por las diversas restricciones metabólicas, fisiológicas,
fisicoquímicas o ambientales. Las reacciones irreversibles se representan fijando el
límite inferior del valor del flujo en cero. Para reacciones reversibles sobre las que no se
tiene información acerca de los límites de su velocidad, se asignan a los límites inferior
y superior valores de gran magnitud (hasta del orden de 105). Un valor alto da libertad
para que todas las reacciones transcurran, negativo el primero y positivo el segundo
[113]. Si se quiere reducir más el espacio de solución, estas restricciones pueden
103
reducirse mediante la inclusión en el modelo de valores de flujos medidos a las
condiciones ambientales y/o genéticas en que se desea simular el comportamiento
celular. Estos valores se incluyen como restricciones de igualdad, y son los que permiten
ajustar el comportamiento celular a la situación particular que se desea analizar [111,
113].
Las suposiciones dadas para lograr obtener el óptimo son : Que la célula ha encaminado
su metabolismo a obtener el comportamiento óptimo respecto al objetivo propuesto, y
que dicho objetivo puede ser establecido matemáticamente en una forma apropiada
como se muestra en la ecuación (27), dando un peso relativo de 1 a la variable a
optimizar.
(27) )( Maximizar νωZ
Donde el vector ω representa el peso relativo que se asigna a cada flujo en la función
objetivo.
2.5.2.3.2. Funciones objetivo
En la mayoría de los trabajos con FBA se emplea como función objetivo la
maximización del crecimiento celular o velocidad de biosíntesis de biomasa [110, 111,
114], ya que se ha encontrado mucha consistencia entre los resultados del modelo y
datos experimentales. Sin embargo numerosas funciones objetivos adicionales pueden
ser empleadas y es posible compararlas de forma sistémica para seleccionar la más
apropiada [111, 115]. La simulación de producción de antibióticos presenta nuevos
cambios en la definición de la función objetivo, ya que estos como metabolitos
secundarios no se requieren para el crecimiento celular, y adicionalmente, bajo muchas
circunstancias puede decirse que el crecimiento celular óptimo y el metabolismo
104
secundario óptimo son mutuamente excluyentes, ya que la reducción de la velocidad de
crecimiento comúnmente induce el metabolismo secundario [115]. Otras funciones
objetivo que se pueden emplear son minimización de producción de ATP, minimización
de producción de poder reductor (NADH/NADPH), esto representa el concepto que el
metabolismo de la célula se esfuerza en operar en términos de eficiencia de energía [25,
110, 116]. También se ha empleado como función objetivo minimizar consumo de un
sustrato o maximizar algún producto de interés [115, 116]. También se puede emplear
una función objetivo múltiple, relacionando varios compuestos a maximizar o
minimizar [117].
La optimización puede ser realizada usando cualquier método de minimización
multivariable como por ejemplo la variación del algoritmo Simplex [118]. Existen
diversos programas especializados como CNA [119], COBRA [120], etc. que son
paquetes de programas que corren en el ambiente de Matlab, y que proporcionan una
interfase adecuada para la solución de problemas de FBA, FVA y para la simulación del
comportamiento de mutantes por eliminación de genes o la modificación de variables
ambientales (composición de medios de cultivo, etc.) [121].
2.5.2.3.3. Trabajos reportados sobre FBA para Streptomyces.
Se han realizado estudios de análisis de distribución de flujos metabólicos para algunas
Streptomyces entre los que se encuentra: El estudio del efecto de la limitación de
nutrientes (N, P, S, y K) sobre el metabolismo primario y secundario para S. coelicolor,
considerando como funciones objetivo maximizar la velocidad específica de
crecimiento y minimizar el requerimiento de energía. Al considerar el objetivo de
105
maximizar la velocidad de crecimiento, bajo limitación de P, los flujos calculados
coincidieron con los datos experimentales. Por el contrario, bajo limitación de N, el
objetivo celular que mejor se ajustó a los datos experimentales fue la minimización de
requerimiento de energía, se obtuvo por simulación mayor producción de actinorrodina
pero también hubo presencia de subproductos indeseables [25]. Esta bacteria también es
productora de un antibiótico dependiente de calcio (CDA), para el cual se ha estudiado
la distribución de los flujos, considerando como objetivo celular la maximización de
velocidad específica de crecimiento y la formación de producto, cada una de forma
independiente. Se encontró la producción de CDA está relacionada con la velocidad
específica de crecimiento. Con los resultados in silico con FBA se proponen estrategias
de manipulación genética para estudiar los efectos metabólicos deseados, logrando
buenas predicciones [29].
Se han logrado avances a nivel de la optimización, para redes a escala genómica. En el
caso de un mutante de S. coelicolor, se hizo uso de FVA y FBA para lograr seleccionar
una adecuada función objetivo. Para este caso se encontró que es necesaria una
aproximación indirecta, tal como examinar el efecto del proceso de alimentación sobre
la asimilación de nutrientes. Se encontró entonces que la mayor influencia del mutante
sobre la producción de antibiótico fue el resultado indirecto de la mutación sobre la
velocidad de asimilación de fosfato, cuando se consideró como función objetivo
maximizar la velocidad de consumo de glucosa [115]. Para S. clavuligerus se encontró
una muy buena correlación entre los resultados experimentales y los resultados
simulados empleando balance de flujo dinámico (FBAd).Este modelado sirvió para ver
que la mayoría de las modificaciones genéticas no contribuyen al entramado complejo
106
del metabolismo primario, pero son coincidentes con una regulación (upregulation) de
varios grupos de genes de biosíntesis de antibióticos. Los resultados conducen a que es
necesario realizar nuevos cambios a nivel transcripcional, tales como el incremento de
transcripción de genes en la transcripción de genes de glutamina y glutamato sintetasa, y
en los genes que codifican tansportadores de amonio y fosfato. Para los análisis se
compara la información experimental obtenida durante la fase de producción de AC y
cefamicina C para la cepa silvestre y cepas mutantes (obtenidos por mutagénesis al azar
y por IM) y con la información obtenida por simulación variando los flujos durante la
producción de antibióticos [13]. También para un mutante de S. lividans TK 24, se ha
empleado FBA para entender de forma sistémica e interpretativa diferentes
modificaciones a escala genómica, considerando como objetivo celular la maximización
del crecimiento y diferentes estrategias de alimentación al medio. Los resultados
experimentales fueron confrontados con los obtenidos en el modelado metabólico de
acuerdo con las restricciones dadas al sistema y éstos fueron consistentes entre si [122].
107
REFERENCIAS
[1] M. Chartrain, P. M. Salmon, D. K. Robinson, and B. C. Buckland, ―Metabolic
engineering and directed evolution for the production of pharmaceuticals,‖ Current
Opinion in Biotechnology, no. 11, pp. 209–214, 2000.
[2] N. Ishii, M. Robert, Y. Nakayama, A. Kanai and M. Tomita, ―Toward large-scale
modeling of the microbial cell for computer simulation,‖ Journal of biotechnology, vol.
113, no. 1–3, pp. 281–94, 2004.
[3] S. Lee, ―Metabolic engineering of microorganisms: general strategies and drug
production.,‖ Drug discovery today, vol. 14, no. 1–2, pp. 78–88, 2009.[1] K. F.
Chater and D. A. Hopwood, ―The Biology of Actinomycetes,‖ in The Biology of
Actinomycetes, A. Press, Ed. London, UK: , 1984, pp. 229–286.
[4] K. F. Chater and D. A. Hopwood, ―The Biology of Actinomycetes,‖ in The Biology of
Actinomycetes, A. Press, Ed. London, UK: , 1984, pp. 229–286.
[5] D. A. Hopwood, Streptomyces in Nature and Medicine: The Antibiotic Makers, 1st ed.
New York: Oxford University Press. Inc., 2007, p. 243.
[6] P. Ribelles de la Vega, ―Síntesis de antibióticos en Streptomyces y su relación con el
metabolismo global,‖ Tesis para optar a Doctor, Facultad de Ciencias, Biología
Molecular, Universidad Autónoma de Madrid, 2008.
[7] K. Flardh and M. Buttner, ―Streptomyces morphogenetics : dissecting differentiation in a
filamentous bacterium,‖ Nature Reviews Microbiology, vol. 7, pp. 36–49, 2009.
[8] B. Mervyn, ―Regulation of secondary metabolism in Streptomycetes,‖ Current Opinion in
Microbiology, vol. 8, pp. 208–215, 2005.
[9] A. Hesketh, W. Chen, J. Ryding, S. Chang and M. Bibb, ―The global role of ppGpp
synthesis in morphological differentiation and antibiotic production in Streptomyces
coelicolor A3(2),‖ Genome Biology, vol.8 no. 8 pp: R161.1-161-18, 2007.
[10] A. Manteca and J. Sanchez, ―Streptomyces developmental cycle and secondary
metabolite production,‖ in Current Research, Technology and Education Topics in
Applied Microbiology and Biotechnology, Ed. A. Méndez-Vilas, Spain, 2010, pp. 560–
566.
[11] J. Gómez-Escribano, ―La respuesta estricta en Streptomyces clavuligerus: Investigación
del papel de los genes relA y rplk (relC),‖ Tesis para optar a doctor, Universidad de
León, Departamento de Ecología, Genética y Microbiología, 2006.
[12] H. Schrempf, ―The Family Streptomycetaceae, Part II : Molecular Biology,‖ in The
Prokaryotes - A Handbook on the Biology of Bacteria, vol. 3, New York: Springer, 2006,
pp. 605–622.
[13] M. Medema, M. Alam, W. Heijne, M. Van den Berg, U. Müller, A. Trefzer, R.
Bovenberg, R. Breitling and E. Takano, ―Genome-wide gene expression changes in an
industrial clavulanic acid overproduction strain of Streptomyces clavuligerus,‖ Microbial
biotechnology, vol. 4, no. 2, pp. 300–305, 2011.
[14] S. Jensen, ―Biosynthesis of clavam metabolites,‖ Journal of Industrial Microbiology, vol.
39, pp. 1407–19, 2012.
108
[15 J. Oliveira, A. Granato, D. Hirata, C. Hokka, and M. Barboza, ―Acido clavulanico e
cefamicine C: uma perspectiva da biossíntese, processos de isolamento e meanismo de
acao,‖ Quim. Nova, vol. 32, no. 8, pp. 2142–50, 2009.
[16] P. Liras and A. Rodríguez-García, ―Clavulanic acid, a β-lactamase inhibitor: biosynthesis
and molecular genetics,‖ Applied microbiology and biotechnology, vol. 54, no. 4, pp.
467–75, 2000.
[17] N. Gunnarsson, A. Eliasson and J. Nielsen, ―Control of fluxes Towards Antibiotics and
the Role of Primary Metabolism in Production of Antibiotics,‖ Adv. Biochem.
Engin/Biotechnol., vol. 88, pp. 137– 178, 2004.
[18] A. Kern, E. Tilley, I. Hunter, M. Legisa and A. Glieder, ―Engineering primary metabolic
pathways of industrial micro-organisms,‖ Journal of biotechnology, vol. 129, no. 1, pp.
6–29, 2007.
[19] I. Borodina, C. Scholler, A. Eliasson, and J. Nielsen, ―Metabolic Network Analysis of
Streptomyces tenebrarius, a Streptomyces sp with an Active Entner-Doudoroff Pathway,‖
Applied and Environmental Microbiology, vol. 71, no. 5, pp. 2294–2302, 2005.
[20] E. Daae and A. Ison, ―Classification and Sensitivity Analysis of a Proposed Primary
Metabolic Reaction Network for Streptomyces Lividans,‖ Metabolic Engineering, vol. 1,
no. 2, pp. 153–65, 1999.
[21] J. Romero, P. Liras and J. Martin, ―Utilization of ornithine and arginine as specific
precursors of clavulanic acid,‖ Appl. Envir. Microbiol., vol. 52, no. 4, pp. 892–97, 1986.
[22] D. A. Hodgson, ―Primary metabolism and its control in streptomycetes: a most unusual
group of bacteria,‖ Adv Microb Physiol, vol. 42, pp. 47–238, 2000.
[23] P. Liras, J. Gómez-Escribano and I. Santamarta, ―Regulatory mechanisms controlling
antibiotic production in Streptomyces clavuligerus,‖ Journal of Industrial Microbiology,
pp. 667–76, 2008.
[24] R. Li and C. Townsend, ―Rational strain improvement for enhanced clavulanic acid
production by genetic engineering of the glycolytic pathway in Streptomyces
clavuligerus,‖ Metabolic engineering, vol. 8, no. 3, pp. 240–52, 2006.
[25] F. Naeimpoor and F. Mavituna, ―Metabolic flux Analysis in Streptomyces coelicolor
under Various Nutrient Limitations,‖ Metabolic Engineering, vol. 148, pp. 140-8, 2000.
[26] C. Avignone Rossa, J. White, A. Kuiper, P. Postma, M. Bibb and M. Teixeira, ―Carbon
flux distribution in antibiotic-producing chemostat cultures of Streptomyces lividans,‖
Metabolic engineering, vol. 4, no. 2, pp. 138–50, 2002.
[27] Roubos J. A., ―Fed-Batch Clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ Ph
D Thesis, Technische Universiteit Delft, 2002.
[28] N. Gunnarsson, P. Bruheim and J. Nielsen, ―Glucose metabolism in the antibiotic
producing actinomycete Nonomuraea sp. ATCC 39727‖. Biotechnol Bioeng, vol. 88, no.
5, pp. 652-63, 2004
[29] H. Kim, C. Smith, J. Micklefield and F. Mavituna, ―Metabolic flux analysis for calcium
dependent antibiotic (CDA) production in Streptomyces coelicolor.‖ Metabolic
engineering, vol. 6, no. 4, pp. 313–25, 2004.
[30] M. Dekleva and W. Strohl, ―Biosynthesis of epsilon-rhodomycinone from glucose by
Streptomyces C5 and comparison with intermediary metabolism of other polyketide-
producing Streptomycetes‖, Can J Microbiol. Vol.34, no. 11, pp. 1235-40, 1988
109
[31] E. Daae and A. Ison, ―Classification and Sensitivity Analysis of a Proposed Primary
Metabolic Reaction Network for Streptomyces Lividans,‖ Metabolic Engineering, vol. 1,
no. 2, pp. 153–65, 1999.
[32] C. Avignone-Rossa, ―comunicación personal,‖ 2010.
[33] R. Schimke, ―Adaptive characteristics of urea cycle enzymes in the rat,‖ The Journal of
biological chemistry, vol. 237, no. 2, pp. 459–68, 1962.
[34] K. Chen, Y. Lin, J. Wu and S. Hwang, ―Enhancement of clavulanic acid production in
Streptomyces clavuligerus with ornithine feeding,‖ Enzyme and Microbial Technology,
vol. 32, pp. 152–6, 2003.
[35] J. Romero, P. Liras and J. Martín, ―Utilization of ornithine and arginine as specific
precursors of clavulanic acid,‖ Appl. Envir. Microbiol., vol. 52, no. 4, pp. 892–97, 1986.
[36] C. Townsend and M. Ho, ―Biosynthesis of clavulanic acid: Origin of the C3 Unit,‖ J. Am.
Chem. Soc., vol. 107, pp. 1066–68, 1985.
[37] J. Berg, J. Tymoczko and L Stryer, capítulo 3. Protein structure and function,
Biochemistry. 5th edition. New York: W H Freeman, 2002.
[38] A. Pometto and D. Crawford, ―L-Phenylalanine and L-tyrosine catabolism by selected
Streptomyces species,‖ Applied and environmental microbiology, vol. 49, no. 3, pp. 727–
9, 1985.
[39] M. Hassan, M. EI-Naggar and W. Said, ―Physiological factors affecting the production
of an antimicrobial substance by Streptomyces violatus in batch cultures,‖ Egyptian
Journal of Biology, vol. 3, pp. 1–10, 2001
[40] A. Demain and P. Vaishnav, ―Involvement of nitrogen-containing compounds in β-
lactam biosynthesis an
d its control,‖ Critical reviews in biotechnology, vol. 26, no. 2, pp. 67–82, 2006.
[41] K. Kenrick and M. Wheelis, ―Histidine dissimilation in Streptomyces coelicolor,‖
Journal of General Microbiology, vol. 128, pp. 2029–40, 1982.
[42] I. Yoshifumi, N. Takayuki and Y. Nakada, ―Histidine catabolism and catabolite
regulation,‖ in Pseudomonas, ed. Juan-Luis Ramos and A. Filloux, Springer Netherlands,
pp. 371–395, 2007.
[43] V. Bascarán, C. Hardisson and A. Braña, ―Regulation of Nitrogen Catabolic Enzymes in
Streptomyces clavuligerus,‖ Jornal of general Microbiology, vol. 135, pp. 2465–74,
1989.
[44] D. Hayzer and T. Laisinger, ―Proline biosynthesis in Escherichia coli purification and
characterisation of glutamate-semialdehyde dehydrogenase,‖Eur. J. Biochem, no. 121,
pp. 561–65, 1982.
[45] R. Pérez, A. Rodríguez, J. Martín and P. Liras, ―Deletion of the pyc gene blocks
clavulanic acid biosynthesis except in glycerol-containing medium: Evidence for two
different genes in formation of the C3 unit,‖ Journal of bacteriology, vol. 181, no. 22, pp.
6922–8, 1999.
[46] A. Rodríguez-García, Á. de Fuente and P. Liras, ―Characterization and Expression of the
Arginine Bio- synthesis Gene Cluster of Streptomyces clavuligerus,‖ J. Mol. Microbiol.
Biotechnol, vol. 2, no. 4, pp. 543–50, 2000.
110
[47] M. Bushell, S. Kirk, H. Zhao and C. Avignone-Rossa, ―Manipulation of the physiology
of clavulanic acid biosynthesis with the aid of metabolic flux analysis,‖ Enzyme and
Microbial Technology, vol. 39, no. 1, pp. 149–57, 2006.
[48] Y. Aharonowitz and A. Demain, ―Nitrogen nutrition and regulation of cephalosporin
production in Streptomyces clavuligerus,‖ Can J Microbiol., vol. 25, no. 1, pp. 61–7,
1979.
[49] C. Sánchez Henao, N. Gómez. Grimaldos y J. Quintero Díaz, ―Producción de ácido
clavulánico por fermentación de Streptomyces clavuligerus : Evaluación de diferentes
medios de cultivo y modelado matemático,‖ Dyna, vol. 79, no. 1975, pp. 158–65, 2012.
[50] P. R. Ives and M. E. Bushell, ―Manipulation of the physiology of clavulanic acid
production in Streptomyces clavuligerus,‖ Microbiology, vol. 143, pp. 3573–9, 1997.
[51] P. Saudagar and R. Singhal, ―Optimization of nutritional requirements and feeding
strategies for clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ Bioresource
Technology, vol. 98, no. 10, pp. 2010–17, 2007.
[52] A. Fang, F., Keables and A. Demain, ―Unexpected enhancement of beta-lactam antibiotic
formation in Streptomyces clavuligerus by very high concentrations of exogenous
lysine,‖ Appl Microbiol Biotechnol, vol. 44, no. 6, pp. 705–9, 1996.
[53] Z. Zhihan and W. Yanping, "Application of Lat Gene Disruption to increase the
Clavulanic Acid production of Streptomyces clavuligerus", Journal of Molecular Catalysis
B: Enzymatic, vol. 43, no. 1-4, pp. 102-107, 2006.
[54] H. E. Umbarger, ―Amino acid biosynthesis and its regulation‖, Ann. Rev. Biochem. vol.
47, pp 533-606, 1978.
[55] K. Tahlan, H. U. Park and S. E. Jensen, ―Three unlinked gene clusters are involved in
clavam metabolite biosynthesis in Streptomyces clavuligerus,‖ Can J Microbiol, Vol. 50,
803-10, 2004.
[56] S. Jensen, K. Elder, K. Aidoo and A. Paradkar, ―Enzymes catalyzing the early steps of
clavulanic acid biosynthesis are encoded by two sets of paralogous genes in Streptomyces
clavuligerus,‖ Antimicrobial agents and chemotherapy, vol. 44, no. 3, pp. 720–6, 2000.
[57] C. Townsend, ―New reactions in clavulanic acid biosynthesis,‖ Current opinion in
chemical biology, vol. 6, no. 5, pp. 583–9, 2002.
[58] Z. Zhang, R. Jingshan, D. Stammers, et al, ―Structural origins of the selectivity of the
trifunctional oxygenase clavaminic acid synthase,‖ Nature Structural and Molecular
Biology, vol. 7, no. 2, pp. 127–133, 2000.
[59] G. Ozcengiz and A. Demain, ―Recent advances in the biosynthesis of penicillins,
cephalosporins and clavams and its regulation,‖ Biotechnology Advances, vol. 31, no. 2,
pp. 287–311, 2012.
[60] H. Arulanantham, N. Kershaw, K. Hewitson, C. Hughes, J.Thirkettle and C. Schofield,
―ORF17 from the Clavulanic Acid Biosynthesis Gene Cluster Catalyzes the ATP-
dependent Formation of N-Glycyl-clavaminic Acid,‖ Journal of Biological Chemistry,
vol. 281, no. 1, pp. 279 –287, 2006.
[61] P. Saudagar, S. Survase and R. Singhal, ―Clavulanic acid: A review,‖ Biotechnology
Advances, vol. 26, no. 4, pp. 335–351, 2008.
[62] A. Neto, D. Hirata, L. Cassiano, C. Bellão, A. Badino Júnior and C. Hokka, ―A study
on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus in batch, fed-batch and
111
continuous processes,‖ Brazilian Journal of Chemical Engineering, vol. 22, no. 4, pp.
557 – 63, 2005.
[64] P. Masurekar, ―Nutritional and engineering aspects of microbial process development,‖
Progress in Drug Research, vol. 65, pp. 293-328 2008.
[65] G. Visser-Luirink, A. Theodorus, M. De Laat and M. Klop, ―Fermentation of Clavulanic
acid at a controlled level of ammonia,‖ U.S. Patent 0187529A12002.
[66] G. Stephanopoulos, A. Aristiduo and J. Nielsen, Metabolic Engineering: principles and
metodogies. Academic Press, San. Diego, 1998, p. 725.
[67] K. Chater, S. Biró, K.. Lee, T. Palmer and H. Schrempf, ―The complex extracellular
biology of Streptomyces,‖ FEMS Microbiology Reviews, vol. 34, pp. 171–98, 2010.
[68] K. Large, A. Ison and D. Williams, ―The effect of agitation rate on lipid utilisation and
clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus,‖ Journal of Biotechnology, vol.
63, pp. 111 –19, 1998
[69] G. Maranesi, A. Baptista-Neto, C. Hokka and A Badino, ―Utilization of vegetable oil in
the production of clavulanic acid by Streptomyces clavuligerus ATCC 27064,‖ World
Journal of Microbiology and Biotechnology, vol. 21, no. 4, pp. 509–14, 2005.
[70] C. Ortiz, C. Hokka and A. Badino, ―Utilization of soybean derivatives on clavulanic
acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol.
40, no. 5, pp. 1071–77, 2007.
[71] M. Salem-Bekhit, F Alanazi and I. Alsarra, ―Improvement and enhancement of
clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus using vegetable oils,‖ Journal of
Biotechnology, vol. 9, no. 40, pp. 6806–12, 2010.
[72] K. Chen, Y. Lin, C Tsai, C. Hsieh and J. Houng, ―Optimization of glycerol feeding for
clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus with glycerol feeding,‖
Biotechnology Letters, vol. 24, no. 6, pp. 455–58, . 2002.
[73] L. Domingues, J. Teodoro, C. Hokka, A. Badino and M. Araujo, ―Optimisation of the
glycerol-to-ornithine molar ratio in the feed medium for the continuous production of
clavulanic acid by Streptomyces clavuligerus,‖ Biochemical Engineering Journal, vol.
53, no. 1, pp. 7–11, 2010.
[74] P. Saudagar and R. Singhal, ―Optimization of nutritional requirements and feeding
strategies for clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus.‖ Bioresource
Technology, vol. 98, no. 10, pp. 2010–17, 2007.
[75] J. Otero and J. Nielsen, ―Industrial systems biology,‖ Biotechnology and bioengineering,
vol. 105, no. 3, pp. 439–60, 2010.
[76] L. Gordon Cambell and L. Lilley, ―Clavulanic Acid Production,‖ U.S. Patent 1, 571,
888, 1980.
[77] T. Olleros Izard, J. Fernández Puentes and M. A. Moreno Valle, ―Procedimiento para
Mejorar la Extracción de ácido clavulánico,‖ U.S. Patent 537, 158, 1984.
[78] http://www.minminas.gov.co/minminas///hidrocarburos/Capitulo_0_Resumen_ejecutivo,
―Evaluación del ciclo de vida de la cadena de producción de biocombustibles en
Colombia, energía sostenible para Colombia‖ Ministerio de Minas y Energía, enero
2012, Medellín. Consultada en junio de 2013
112
[79] F. Godia Casablancas y J. López Santín, Ingeniería Bioquímica, Síntesis editorial,
Madrid, pp. 40-41, 215–233,1998,
[80] J. Martín, ―Control of antibiotic synthesis by phosphate‖, Advances in Biochemical
Engineering, vol. 6, pp. 105-27, 1977.
[81] A. Lebrihi, P. Gemain and G. Lefebvre. ―Phosphate repression of cephamycin and
clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus‖. Appl Microbiol Biotechnol
vol. 26, pp. 130–5, 1987.
[82] L. Meng, M. Li, S. Yang, T. KIm, and J. Suh, ―Intracellular ATP Levels Affect
Secondary Metabolite Production in Streptomyces spp,‖ Biosci. Biotechnol. Biochem,
vol. 75, no. 8, pp. 1576–81, 2011.
[83] K. Melzoch, M. de Mattos and O. Neijssel, ―Production of actinorhodin by Streptomyces
coelicolor A3(2) grown in chemostat culture.,‖ Biotechnology and bioengineering, vol.
54, no. 6, pp. 577–82, Jun. 1997.
[84] J. Romero, P. Lirasand J. Martin, ―Dissociation of cephamycin and clavulanic acid
biosynthesis in Streptomyces clavuligerus,‖ Applied Microbiology and Biotechnology,
vol. 20, no. 5, pp. 318–25, 1984.
[85] A. Roubos, P. Krabben, W. de Laat, R. Babuska and J. Heijnen, ―Clavulanic acid
degradation in Streptomyces clavuligerus fed-batch cultivations.,‖ Biotechnology
progress, vol. 18, no. 3, pp. 451–7, 2002.
[86] F. Garcia-Ochoa and E. Gomez, ―Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in
microbial processes: an overview,‖ Biotechnology advances, vol. 27, no. 2, pp. 153–76,
2009.
[87] H. Xu, W. Dou, H. Xu, X. Zhang, Z. Rao, Z. Shi, and Z. Xu, ―A two-stage oxygen supply
strategy for enhanced l-arginine production by Corynebacterium crenatum based on
metabolic flux analysis,‖ Biochemical Engineering Journal, vol. 43, no. 1, pp. 41–51,
2009.
[88] P. Yegneswarant, M. Gray and B. Thompson, ―Effect of Dissolved Oxygen Control on
Growth and Antibiotic Production in Streptomyces clavuligerus Fermentations,‖
Biotechnol. Prog., vol. 7, pp. 246–50, 1991.
[89] J. Rosa, A. Baptista Neto, C. Hokka and A. Badino, ―Influence of dissolved oxygen and
shear conditions on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus.,‖
Bioprocess and biosystems engineering, vol. 27, no. 2, pp. 99–104, 2005.
[90] F. Vardar and M. Lilly, ―Effect of cycling dissolved oxygen concentrations on product
formation in penicillin fermentations‖, European journal of applied microbiology and
biotechnology, vol.14, no. 4, pp 203-11, 1982.
[91] A Neto, D. Hirata, L. Cassiano Filho, C. Bellão, A. Badino Júnior and C. Hokka, ―A
study on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus in batch, fed-batch and
continuous processes,‖ Brazilian Journal of Chemical Engineering, vol. 22, no. 4, pp.
557 – 63, 2005.
[92] K. Chen, Y. Lin, C. Tsai, C. Hsieh and J. Houng, ―Optimization of glycerol feeding for
clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus with glycerol feeding,‖
Biotechnology Letters, vol. 24, no. 6, pp. 455–458, 2002.
113
[93] S. Kirk, C. Avignone-Rossa and M. Bushell, ―Growth limiting substrate affects antibiotic
production and associated metabolic fluxes in Streptomyces clavuligerus,‖
Biotechnology Letters, vol. 22, pp. 1803–1809, 2000.
[94] H. Shimizu, ―Metabolic Engineering — Integrating Methodologies of Molecular
Breeding and Bioprocess Systems Engineering,‖ Journal of bioscience and
bioengineering, vol. 94, no. 6, pp. 563–573, 2002.
[95] N. Ishii, M. Robert, Y. Nakayama, A. Kanai and M. Tomita, ―Toward large-scale
modeling of the microbial cell for computer simulation,‖ Journal of biotechnology, vol.
113, no. 1–3, pp. 281–94, 2004.
[96] V. Trejos, J. Fontalvo and M. Gómez., ―Descripción matemática y análisis de Estabilidad
de Procesos Fermentativos,‖ Dyna, vol. 76, no. 158, pp. 111–121, 2009.
[97] K., Kiviharju, Optimization and modeling of bacterial procceses, Technical
Biochemistry report, Helsinki University of Technology, Departament of Chemical
Technology, Espoo, pp. 1-60, 2006
[98] K.Ozergin-Ulgen and F. Mavituna, ―Actinorhodin production by Streptomyces coelicolor
A3 (2): kinetic parameters related to growth, substrate uptake and production,‖ App.
Microbiol. Biotechnol, vol. 40, pp. 457–462, 1993.
[99] R. King, ―A structured mathematical model for a class of organisms: I. Development of a
model for Streptomyces tendae and application of model-based control,‖ Journal of
Biotechnology, vol. 52, no. 3, pp. 219–234, 1997.
[100] R. King and C. Budenbender, ―A structured mathematical model for a class of
organisms : II . Application of the model to other strains,‖ Journal of Biotechnology, vol.
52, pp. 235 – 44, 1997.
[101] K. Kiviharju, K. Salonen, M. Leisola, and T. Eerikäinen, ―Modeling and simulation of
Streptomyces peucetius var. caesius N47 cultivation and rhodomycinone production with
kinetic equations and neural networks.‖ Journal of biotechnology, vol. 126, no. 3, pp.
365–73, 2006.
[102] A. .Baptista-Neto, A. Goveia, E. Badino and A. Hokka, ―Phenomenological model of the
clavulanic acid production process utilizing Streptomyces clavuligerus,‖ Braz. J. Chem.
Eng, vol. 17, no. 4–7, 2000.
[103] B. Alvaro, J. Teodoro, L. Macedo Filho, D. Battaglia Hirata, A. . Badino Júnior, and C.
Hokka, ―Kinetic studies on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ in
2nd. Mercosur Congress on Chemical Engineering and 4th. Mercosur Congress on
Process System Engineering, 2005, pp. 1–10.
[104] G. Stephanopoulos, ―Metabolic fluxes and metabolic engineering,‖ Metabolic
engineering, vol. 1, no. 1, pp. 1–11, 1999.
[105] J. Bonomo and R. Gill, ―Antibiotic resistance as a model for strain engineering,‖
Computers & Chemical Engineering, vol. 29, no. 3, pp. 509–17, 2005.
[106] Q. Chen, Z. and D. Wei, ―Progress in the applications of flux analysis of metabolic
networks,‖ Chinese Science Bulletin, vol. 55, no. 22, pp. 2315–22, 2010.
[107] L. Quek, S. Dietmair, J. Kromer and L. Nielsen, ―Metabolic flux analysis in mammalian
cell culture,‖ Metabolic Engineering, vol. 12, pp. 161–71, 2010.
114
[108] J. Soto Cruz, O y Páez Lerma, ―Balances en Procesos de fermentación: Análisis de
consistencia y de flujos metabólicos,‖ Revista Mexicana de Ingeniería Química, vol. 4,
no. 1, pp. 59–74, 2005.
[109] D. Hood, R. Heidstra, U. Swoboda and D. Hodgson, ―Molecular genetic analysis of
proline and tryptophan biosynthesis in Streptomyces coelicolor A3(2): interaction
between primary and secondary metabolism — a review,‖ Gene, vol. 115, no. 1–2, pp. 5–
12, 1992.
[110] J. Orth, I. Thiele and B. Palsson, ―What is flux balance analysis?,‖ Nature
biotechnology, vol. 28, no. 3, pp. 245–8, 2010.
[111] K. Kauffman, P. Prakash and J. Edwards, ―Advances in flux balance analysis,‖ Current
Opinion in Biotechnology, vol. 14, no. 5, pp. 491–496, 2003.
[112] A. Zomorrodi, P. Suthers, S. Ranganathan and C. Maranas, ―Mathematical optimization
applications in metabolic networks,‖ Metabolic engineering, vol. 14, no. 6, pp. 672–86,
2012.
[113] F. Llaneras and J. Picó, ―Stoichiometric modelling of cell metabolism,‖ Journal of
bioscience and bioengineering, vol. 105, no. 1, pp. 1–11, 2008.
[114] A. L. Knorr, R. Jain, and R. Srivastava, ―Bayesian-based selection of metabolic objective
functions,‖ Bioinformatics (Oxford, England), vol. 23, no. 3, pp. 351–7, 2007
[115] C. Khannapho, H. Zhao, B. Bonde, A. Kierzek, C. Avignone-Rossa, and M. Bushell,
―Selection of objective function in genome scale flux balance analysis for process feed
development in antibiotic production,‖ Metabolic Engineering, vol. 10, no. 5, pp. 227–
33, 2008.
[116] J. M. Savinell and B. O. Palsson, ―Network analysis of intermediary metabolism using
linear optimization. I. Development of mathematical formalism,‖ Journal of theoretical
biology, vol. 154, no. 4, pp. 421–54, Feb. 1992
[117] C. García Sánchez, C. Vargas García and R. Torres Sáez, ―Predictive potential of flux
balance analysis of Saccharomyces cerevisiae using as optimization function
combinations of cell compartmental objectives,‖ PloS one, vol. 7, no. 8, p. e43006, 2012.
[118] E. Thomas, D. Himmelblau and L. Lasdon, ―Linear programming (LP) and aplications,‖
in Optimization of chemical processes, McGraw-Hill, 2da. Ed. p. 651, 2001.
[119] S. Klamt, ―Cell Net Analyzer, Structural Analysis of Cellular Networks.‖ Max-Planck-
Institute for Dynamics of Complex Technical System, Magdeburg, Germany,
[email protected], 2011.,
[120] J. Schellenberger, R. Que, R., Fleming, I. Thiele, J. Orth, et al. Quantitative prediction of
cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0. Nature.
Protocol., Vol. 6, pp 1290–1307, 2011.
[121] I. Rocha, P. Maia, P. Evangelista, P. Vilaça, S. Soares, J. Pinto, J. Nielsen, K. Patil, E.
Ferreira and M. Rocha, ―Optflujo: an open-source software platform for in silico
metabolic engineering,‖ BMC systems biology, vol. 4, p. 1-45, 2010.
[122] P. D’Huys, I. Lule, D. Vercammen, J. Anné, J. Van Impe and K. Bernaerts, ―Genome-
scale metabolic flux analysis of Streptomyces lividans growing on a complex medium,‖
Journal of biotechnology, vol. 161, no. 1, pp. 1–13, 2012
115
CAPITULO 3
PRODUCCIÓN DE ACIDO CLAVULÁNICO POR FERMENTACIÓN DE Streptomyces clavuligerus: EVALUACIÓN DE DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO Y MODELADO MATEMÁTICO.
El ácido clavulánico (AC) es un antibiótico -lactámico con una potente capacidad
inhibidora de la actividad -lactamasa, cuya producción por fermentación presenta bajos
rendimientos. En el presente trabajo se evaluaron cuatro medios de cultivo reportados en
la bibliografía y se compararon con un medio de cultivo desarrollado en esta
investigación para la producción de AC por S. clavuligerus. Asimismo, se estableció
también la concentración óptima de glicerol en el medio seleccionado, y con base en los
resultados obtenidos, se estudió la producción de AC en un biorreactor de laboratorio.
Los resultados obtenidos muestran que medios complejos con presencia de una mezcla
de aminoácidos libres son adecuados para la producción de AC, y que la concentración
de glicerol óptima para la producción de AC es de 50 g L-1
. Concentraciones superiores
a 100 g L-1
causan inhibición de la síntesis del antibiótico. Con el medio complejo y 50 g
L-1
de glicerol, la concentración de AC alcanzada fue de 994 mg L-1
. El proceso puede
ser representado mediante un modelo matemático, que incluye una cinética tipo Contois
para la biomasa y una cinética de formación de producto parcialmente asociado al
crecimiento. El modelo presenta un ajuste significativo con un 95% de nivel de
confianza.
116
3.1. INTRODUCCIÓN
El ácido clavulánico (AC), es una molécula que exhibe una potente actividad inhibitoria
de las enzimas β-lactamasas, por lo que se ha convertido en un importante producto
comercial disponible en combinaciones con antibióticos β-lactámicos como amoxicilina
(Augmentin TM
), tetraciclina (Timentín TM
) [1] y también como producto genérico. Su
efecto inhibidor fue descubierto en 1976 y desde entonces se han realizado exhaustivos
estudios con el fin de mejorar los títulos de antibiótico empleando procesos de
fermentación con la bacteria que naturalmente lo produce, Streptomyces clavuligerus
(Sc).
La productividad del proceso, depende de muchos factores, entre ellos del tipo y
concentración de nutrientes, de las condiciones de operación de la fermentación y de los
propios mecanismos intracelulares de biosíntesis. A pesar de los esfuerzos de los
investigadores que trabajan en el tema alrededor del mundo, aún no se ha conseguido
obtener valores de producción (título) de AC superiores a 1g L-1
[2-3], e incluso en la
gran mayoría de trabajos y después de estudios de optimización estos valores han sido
inferiores a 500 mg L-1
[4-6]. De acuerdo con información de patentes registradas a
nombre de importantes empresas farmacéuticas, se han reportado valores de producción
de AC entre 561 y 1000 mg L-1
[7-8]. Por tanto, es de gran importancia continuar
abordando estudios tendientes a mejorar la producción del AC, lo que permitirá reducir
sus costos y hacerlo más accesible a la población de escasos recursos.
En diferentes estudios publicados, se ha observado el empleo de una gran variedad de
formulaciones de medios para el cultivo de S c [2, 7-12]. Algunos de ellos son
químicamente definidos y otros son medios complejos. Estos últimos favorecen la
117
producción de AC puesto que la bacteria requiere para su biosíntesis la presencia de
aminoácidos [13], los cuales están presentes en sustratos complejos como harina de
cereales o digeridos de proteínas, que presentan la ventaja de ser nutrientes de bajo
costo. Sin embargo, debido a la complejidad del medio y la baja concentración del
producto, su purificación se torna compleja y costosa [8, 14]. Los carbohidratos son la
fuente de carbono y energía preferida por muchos microorganismo, pero Sc presenta
una inusual incapacidad de consumir glucosa y otros carbohidratos simples. La
principales fuentes de carbono para Sc producir antibióticos son los lípidos y el glicerol
[15-17]. Dado que el glicerol ha sido identificado como el precursor de 3 átomos de
carbono para la síntesis de AC [3, 18], en la gran mayoría de trabajos se emplea esta
sustancia como la fuente de carbono.
Debido a la gran heterogeneidad en la composición de los medios de cultivo reportados
en la literatura para la producción de AC, los cuales han sido desarrollados y evaluados,
no siempre a las mismas condiciones, se hace necesario evaluarlos bajo las mismas
condiciones y con la misma especie bacteriana, con el fin de determinar la verdadera
capacidad de estos medios para la producción de AC.
En este trabajo se evaluaron 5 diferentes composiciones de medios de cultivo para
producción de AC bajo las mismas condiciones de cultivo de S c, en Erlenmeyers. Una
vez seleccionado el medio de mayor producción se evaluaron diferentes concentraciones
de la fuente de carbono en Erlenmeyers, y el medio seleccionado se empleó para
producir AC en un biorreactor a escala de laboratorio. Basándose en las características
de los cultivos, se propuso un modelo matemático para describir el comportamiento
cinético de la fermentación.
118
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS
3.2. 1. Técnicas microbiológicas.
3.2.1.1. Microorganismo y medio de conservación.
Se empleó un liofilizado de la cepa de Streptomyces clavuligerus ATCC 27064. La
activación se realizó en caldo TSB (Tryptic Soy Broth) incubado a 28 ºC por 36 h. La
cepa activada se almacenó a -80ºC en tubos Eppendorf con medio TSB y glicerol al
40%. Estos tubos se emplearon como semilla para todos los ensayos [19].
3.2.1.2. Medios de cultivo.
Los inóculos empleados para cada ensayo se prepararon mezclando en Erlenmeyers de
500 mL, el contenido de un tubo semilla con 100 mL de medio TSB®, e incubándolos a
28 ºC y 220 rpm por 36 h. Bajo estas condiciones, la DO600nm obtenida osciló entre 0.6 y
0.8[19].
Los medios de cultivo utilizados para evaluar la producción de AC fueron: Medio 1:
Almidón (10 g L-1
), L-asparagina (2 g L-1
), MgSO4.7H2O (0.6 g L-1
), K2HPO4 (4.4 g L-
1), FeSO4.7H2O (1 mg L
-1), MnCl2.4H2O (1mg L
-1), ZnSO4.7H2O (1 mg L
-1) y
CaCl2.3H2O (1.3 mg L-1
). El medio se reguló con MOPS (100 mM) y se ajustó a pH 6.9
[2]. Medio 2: Es una modificación del medio 1, empleando en lugar de almidón, glicerol
a una concentración de 20 g L-1
[20]. Medio 3: glicerol (10 g L-1
), harina de soya (40 g
L-1
), aceite de soya (16 g L-1
), K2HPO4 (1.2 g L-1
), MnCl2.4H2O (1 mg L-1
),
ZnSO4.7H2O (1mg L-1
) y CaCl2.3H2O (1.3 mg L-1
). El medio se reguló con MOPS (100
mM) y se ajustó a pH 6.8 [9]. Medio 4: glicerol (20 g L-1
), harina de soya (5.5 g L-1
) y
K2HPO4 (0.8 g L-1
). El medio se reguló con MOPS (100 mM) y se ajustó a pH 7.0 [10].
119
Medio 5: glicerol (20 g L-1
), harina de soya (15 g L-1
) y casaminoácidos (5 g L-1
). El
medio se reguló con MOPS (100 mM) y se ajustó a pH 7.0 [21]. Antes de su
inoculación, los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave a 121 ºC durante 20 min.
3.2.1.3. Métodos experimentales
Se realizaron cinco cultivos de fermentación por triplicado en Erlenmeyers de 500 mL.
A cada frasco se adicionó 100 mL del medio de cultivo a evaluar y la biomasa contenida
en 10 mL de inóculo. Esta biomasa se obtuvo centrifugando 10 mL de inóculo a 5000
rpm por 10 min., eliminando el sobrenadante y resuspendiendo la biomasa con 10 mL de
medio de prueba del Erlenmeyer y retornándolo nuevamente al Erlenmeyer. Los frascos
se sellaron con tapones de algodón para permitir la difusión del oxígeno al cultivo y se
incubaron a 28 ºC y 220 rpm por 36 h.
Con el medio de cultivo seleccionado, se evaluaron tres concentraciones de glicerol: 20
g L-1
(2%), 50 g L-1
(5%) y 100 g L-1
(10%). Los cultivos se realizaron por triplicado
bajo las mismas condiciones operacionales ya descritas.
Para ambos ensayos, al final del periodo de incubación se tomaron muestras para
cuantificar la concentración de biomasa y de AC. Los valores medios de cada ensayo se
compararon estadísticamente mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan, con el
fin de determinar las diferencias significativas entre ellos [22, 23].
La producción de AC se evaluó por duplicado en un biorreactor de laboratorio de 5 L
(Biostat B Braun), con un volumen de trabajo de 3 L e inóculo al 10% v/v. La
fermentación se llevó a cabo a 28ºC, 400 rpm y un flujo de aire de 1 vvm. El pH se
controló en 6.8 +/- 0.2 con soluciones de NaOH (2N) y HCL (2N) adicionadas
120
automáticamente. La espuma se controló adicionando 008 mL L-1
de anti-espumante
(Antifoam A, sigma Aldrich) al inicio de la fermentación. El cultivo se desarrolló por
144 h y se tomaron muestras periódicamente para determinar las concentraciones de
biomasa, glicerol y AC.
3.2.2. Métodos analíticos
Las muestras de la fermentación se centrifugaron a 14000 rpm por 10 min. a 4ºC. Los
pellets se emplearon para determinar la concentración de biomasa y los sobrenadantes se
diluyeron con solución de MOPS (pH 6.8 y 100 mM) y se filtraron a través de
membranas de PTFE de 0.2 µm previo al análisis de AC y glicerol [19].
3.2.2.1. Determinación de biomasa:
El micelio se lavó dos veces con 10 mL de solución salina (NaCl 0.9%) y su biomasa se
determinó indirectamente mediante la técnica colorimétrica de DNA, basada en lectura
de la absorbancia a 600 nm del color azul generado por la reacción de la difenilamina
con la desoxirribosa [19, 24].
3.2.2.2. Determinación de ácido clavulánico:
La concentración de AC se determinó por HPLC empleando el método descrito por
Foulstone and Reading (1982) [25]. El AC presente en cada muestra, fue derivatizado
con imidazol y analizado en un HPLC Agilent/Hewlett Packard Chemstation 1100,
operado con columna C18 μ-Bondapack fase reversa (Waters), una fase móvil
compuesta por una solución de 94% v/v de KH2PO4 (50mM, pH 3.2) y 6% v/v de
metanol, aun flujo de 1mLmin-1
y un detector de arreglo de diodos. El AC derivatizado
se detectó a 311 nm.
121
3.2.2.3. Determinación de glicerol:
La concentración de glicerol se determinó por espectrofotometría a 412 nm, basado en la
reacción de oxidación del glicerol por ácido perclórico [13].
3.2.3. Modelo matemático.
El modelo propuesto para el proceso de producción de AC a partir de Sc, se obtuvo
realizando balances de masa para la biomasa, el sustrato y el producto en un sistema por
lote. Para la velocidad de crecimiento específica se propuso el modelo de Contois, se
representa en la ecuación (1), donde la velocidad específica de crecimiento es
inversamente proporcional a la biomasa. La velocidad de crecimiento microbiano se
representa por la ecuación (2). La velocidad de consumo de glicerol se representa como
una función directa de la velocidad de crecimiento microbiano, ecuación (3) y la
velocidad de producción de AC se representa como una función aditiva de la velocidad
de crecimiento microbiano y la concentración de biomasa, ecuación (4), es decir, se
representa como un metabolito producido con un aporte del metabolismo primario y un
aporte del metabolismo secundario. El retraso en la aparición de AC hasta el inicio del
crecimiento exponencial, se representa con la función de paso (t), siendo cero desde el
inicio del cultivo hasta un tiempo to y para tiempos superiores a to, la función toma un
valor de 1.
SXKs
S
.max
(1)
Xdt
dX.
(2)
122
XYdt
dS
XS
.
(3)
)(.. tXYdt
dP
XP
(4)
Donde X es la concentración de la biomasa (g L-1), S es la concentración de GLC (g L-1),
P es la concentración de AC (mg L-1), µ es la velocidad de crecimiento específica (h-1),
µmax es la velocidad de crecimiento máxima específica (h-1
), KS es la constante de
saturación de Monod (g L-1
), YXS es el rendimiento biomasa en glicerol, YXP es el
rendimiento de biomasa en AC (g mg-1
), α que es una productividad de AC específica
(mg g-1
h-1
) y (t) es una ―función de paso‖ que asume un valor de 0 en los rangos de
tiempo entre 0-48 h y el valor de 1 en el rango de tiempo entre 48-136 h.
La estimación de los parámetros del modelo cinético y la solución numérica de las
ecuaciones diferenciales que representan el modelo, se realizaron empleando el método
de optimización no lineal lsqnonline, basado en el algoritmo de Levenberg-Marquardt,
asociado con la herramienta ODE45 de Matlab 2008b (MathWorks, Cambridge, etc).
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.3.1. Evaluación de los medios de cultivo.
Los resultados de la evaluación de los cinco medios de cultivo se presentan en la Figura
3.1. La concentración de AC y el rendimiento de producto en biomasa (YP/X) son las
variables de elección para seleccionar el mejor medio de cultivo. Al realizar un análisis
estadístico empleando el test de rangos múltiples de Duncan, se observó que hay
diferencia significativa entre todos los medios evaluados. Los medios sintéticos (medios
123
1 y 2) presentan una baja producción de AC y un bajo rendimiento en producto. Igual
comportamiento se observó en el medio 3, que contiene harina de soja. El medio 4
presentó un alto rendimiento de AC con base a biomasa producida, pero una baja
concentración durante el cultivo. El medio de cultivo que reportó los más altos valores
de producción de AC fue el medio 5, con 335 mg L-1
, mientras que con los medios
químicamente definidos se alcanzaron valores de 140 mg L-1
.
De acuerdo con resultados de la bibliografía, la producción de AC con los medios
químicamente definidos se encuentra entre 5.6 y 25.4 mg L-1
[2], mientras que con
medios complejos se han alcanzado valores de entre 135 y 742 mg L-1
[3, 10, 26], lo que
coincide con los resultados encontrados en este trabajo. La baja producción de AC en los
medios 1 y 2 se puede explicar por la carencia de suficiente fuente de nitrógeno y la
ausencia de aminoácidos esenciales para su síntesis como leucina, serina, valina,
arginina, ornitina, entre otros, que han sido reportados por diferentes autores y sus
funciones están definidas en la ruta metabólica de biosíntesis de AC [10, 27].
Figura 3. 1. Efecto del uso de diferentes medios de cultivo sobre la producción de ácido clavulánico (AC) en mg L-1 (barras claras) y sobre el rendimiento de producto en mg AC g de biomasa seca -1 (barras oscuras) en cultivos de S. clavuligerus. Los valores de concentración de AC deben multiplicarse por 10.
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5
Medios de cultivo
124
Actualmente para la formulación de medios de cultivo para la producción de AC se
emplean mezclas de aminoácidos con el fin de proveer los nutrientes necesarios para la
síntesis [21, 28], y por esta causa los medios 4 y 5 fueron incluidos en el estudio. El
medio 4 contiene una mezcla compleja de aminoácidos presentes en las proteínas de la
harina de soja, mientras que el medio 5, además de tener los aminoácidos presentes en
harina de soja se suplementa con los aminoácidos libres presentes en los
casaminoácidos. Como se muestra en la figura 3.1, los resultados sugieren que la
presencia de aminoácidos libres incrementa la producción de AC de 100 a 330 mg L-1
.
Un fenómeno similar fue observado en cultivos con harina de soja y con proteína
hidrolizada de soja, donde con este último componente se incrementó la concentración
en un 100% [9]. La presencia de fuentes complejas de aminoácidos al parecer
desfavorece la formación de biomasa incrementando el rendimiento de producto. Podría
pensarse que hay un incremento en el potencial redox (NADH/NADPH) en la célula
dado por la síntesis de aminoácidos y la generación de biomasa, este potencial debe ser
equilibrado al interior de la célula, provocando un cese en el crecimiento y la activación
del metabolismo secundario.
3.3.2. Evaluación de la concentración de glicerol.
Basándose en los resultados de los medios de cultivo, la concentración de glicerol fue
evaluada en el medio 5 y los resultados se presentan en la figura 3.2. Al realizar un
análisis estadístico empleando el test de rangos múltiples de Duncan [22-23] para
comparar las velocidades específicas de crecimiento y concentración de producto, se
observan diferencias significativas entre todos los medios para la velocidad específica de
crecimiento pero no para la concentración del producto entre los medios con 2 y 10% de
125
0
20
40
60
80
100
120
140
2% 5% 10%
Contenido de glicerol
glicerol. Se observó un máximo en la producción de AC con 5% de glicerol alcanzando
994 mg L-1
, mientras que a 2% y 10% de glicerol la producción fue menor. El
rendimiento de producto no presenta este máximo y se observa una disminución del
rendimiento con el aumento de la concentración de glicerol, debido a un aumento en la
formación de biomasa.
Un comportamiento tipo campana de Gauss fue observado en la producción de AC en
función de la concentración de glicerol, también ha sido reportado este comportamiento
por otros autores, quienes indican que altas concentraciones de glicerol inhiben la
producción de ácido clavulánico y reprimen la producción de otros antibióticos en Sc [3,
29- 30].
Figura 3. 2. Efecto de la concentración de glicerol (2, 5 y 10%), empleada como fuente de carbono en cultivos de S. clavuligerus, sobre la producción de ácido clavulánico (AC) en mg L-1 (barras claras) y sobre el rendimiento de producto en mg de AC.g de biomasa seca-1 (barras oscuras), empleando el medio 5. Los valores de concentración de AC deben multiplicarse por 10.
126
3.3.3. Fermentación en biorreactor de laboratorio
Una vez evaluado el medio apropiado para la producción de AC y definida la
concentración de glicerol para este medio, se cultivó S. clavuligerus en un fermentador
con el fin de determinar las cinéticas de crecimiento, de consumo de sustrato y de
producción de AC, y evaluar el modelo matemático propuesto. Los resultados se
presentan en la figura 3. 3. Se observa que el AC se detectó a partir de las 24 h de
cultivo pero fue a partir de las 48 h que comenzó su fase de producción exponencial.
Durante este periodo y hasta las 81 h se observó crecimiento de la biomasa lo que
demuestra que la producción de AC está, en parte, asociada a la producción de biomasa.
Debido a que la concentración de AC es muy baja hasta las 48 h, se asumió en el modelo
que hasta este tiempo la producción era nula. Sin embargo los resultados experimentales
se muestran sin eliminar estos puntos. La velocidad de producción de biomasa cae a cero
cuando la concentración de glicerol está por debajo de 4.6 g L-1
, sin embargo el consumo
de glicerol continúa hasta las 107 h, donde la concentración de glicerol alcanza niveles
por debajo del límite de detección. Esto podría significar que velocidad de producción
de biomasa es en realidad el balance entre formación y disrupción de material celular. A
partir de las 81 h la velocidad de producción de AC experimentó una fuerte reducción
correlacionándose con la presencia de una baja concentración de glicerol. Esta menor
velocidad de producción se mantuvo constante hasta las 126 h. Durante este periodo, la
producción de AC, no estuvo asociada a la velocidad de crecimiento sino a la
concentración de biomasa presente.
127
Figura 3. 3. Cinética de fermentación de S. clavuligerus en un biorreactor de 5L, empleando el medio 5 a una concentración de glicerol de 5%. Los símbolos representan datos experimentales, las líneas continuas representan el ajuste con el modelo matemático propuesto. Símbolos: Glicerol (O), biomasa ( ) y ácido clavulánico (∆).
De acuerdo con el comportamiento del modelo, se puede observar que hay un ajuste
significativo con los datos de consumo de glicerol y de formación de AC y un mejor
ajuste con los datos de producción de biomasa, cuyos valores predichos son menores que
los observados durante la fase de crecimiento. Un mejor ajuste de los valores de biomasa
se observa en la fase estacionaria. Los valores de los parámetros del modelo se presentan
en la Tabla 3.1.
Tabla 3.1. Parámetros del modelo cinético estimados con un 95% de nivel de confianza, que fueron utilizados para la simulación de la fermentación de S. clavuligerus.
Parámetros Valores estimados
µmáx (h-1
) 0.046+/-0.002
Ks (g L-1
) 0.450+/-0.005
Yxs (g g-1
) 0.21+/-0.03
Yxp (g mg-1
) 0.010+/-0.003
α (mg g-1
) 0.0025+/- 0.0002
0
200
400
600
800
1000
1200
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150
AC
(m
g/L
)
Bio
mas
a y
Gli
cero
l (g
/L)
Tiempo (h)
128
El valor de velocidad específica de crecimiento celular es del mismo orden que algunos
de los valores reportados en la bibliografía [27, 31-32]. Los valores de rendimiento de
producto Yxp obtenidos con el ajuste del modelo fueron similares a los que se presentan
en las figuras 3.1 y 3.2 para el medio 5.
El modelo tipo Contois propuesto comparado con los modelos tipo Modod y Teisser es
el que mejor ajusta a los resultados experimentales (menor error residual, 3.71%) y
permite explicar el comportamiento de la fermentación con base en las hipótesis
postuladas al establecer las cinéticas de biomasa, sustrato y producto. Esto es, la
biomasa y el sustrato limitan la velocidad específica de crecimiento, y el AC es
producido con componentes asociados y no asociados a la velocidad de crecimiento.
A pesar de que los modelos matemáticos son una herramienta importante para desarrollo
de técnicas de optimización y control de procesos [33], existen pocos estudios al
respecto para Streptomyces. Ozergin-Ulgen en 1993, propuso el primer trabajo orientado
en obtener los parámetros cinéticos que describen la actividad de S. coelicolor para
producir actinorrodina en cultivo en lote. El modelo de formación de producto del tipo
Luedeking-Piret, permitió plantear que la producción era asociada al crecimiento [32].
Continuando con esta hipótesis, Baptista y colaboradores en el 2000, utilizaron un
modelo cinético basado en la ecuación de Monod para describir los datos experimentales
de Sc y emplearon un modelo cinético para el producto de efecto mixto, que considera
dos términos asociado y no asociado al crecimiento [34-35]. El modelo propuesto en
este trabajo incluye las consideraciones de estos autores para la formación de producto
observándose un buen ajuste con los resultados experimentales.
129
3.4. CONCLUSIONES
Un medio de cultivo complejo con fuentes de aminoácidos libres o hidrolizados de
proteínas favorece la síntesis de ácido clavulánico. Un medio con estas características, es
el medio 5, evaluado en el presente trabajo. El glicerol empleado como fuente de
carbono mostró un valor óptimo de concentración en 50 g L-1
, dentro de los valores de
concentración evaluados, confirmándose que a altas concentraciones de glicerol inhiben
la síntesis de AC. Los resultados obtenidos en la selección del medio y concentración de
glicerol se emplearon para realizar una fermentación en biorreactor de laboratorio, y el
modelo propuesto simuló con alto grado de ajuste los resultados experimentales,
confirmando la bondad del modelo, que incluye una cinética tipo Contois para la
biomasa y una cinética de formación de producto con componentes de formación
asociado y no asociado al crecimiento.
130
BIBLIOGRAFIA
[1] J. Song, S. Jensen and K. Lee, ―Clavulanic acid biosynthesis and genetic manipulation for its
overproduction‖, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 88, no. 3, pp., 659-69, 2010.
[2] S. Jensen, A. Wong, A. Griffin and B. Barton, ―Streptomyces clavuligerus has a second copy
of the proclavaminate amidinohydrolase gene,‖ Antimicrob Agents Chemother., vol.48, no. 2,
pp. 514-20, 2004.
[3] J. Teodoro, A. Baptista-Neto, M. Araujo, C. Hokka and A. Badino, ―Influence of glycerol and
ornithine feeding on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ Brazilian
Journal of Chemical Engineering, vol. 27, no. 4, 499 - 506, 2010.
[4] D. Viana, M. Carneiro-Cunha, J. Araújo, B. Barros-Neto, J. Lima-Filho, A. Converti, A.
Pessoa-Júnior and A. Porto, ―Screening of variables influencing the clavulanic acid production
by Streptomyces daufpe 3060 strain‖, Appl Biochem Biotechnol, vol. 160, no. 6, pp. 1797-
807, 2010.
[5] H. Jnawali, J. Yoo and J. Sohng, ―Improvement of clavulanic acid production in Streptomyces
clavuligerus by genetic manipulation of structural biosynthesis genes‖, Biotechnol Lett, vol.
33, no. 6, pp. 1221-6, 2011.
[6] D.Viana, M. Carneiro, J.Araújo, J. Lima-Filho, A. Converti, A. Pessoa Jr and A. Figueiredo,
―Optimization of clavulanic acid production by Streptomyces Daufpe 3060 by response
surface methodology‖, Brazilian Journal of Microbiology, vol. 42, pp. 658-667, 2011.
[7] G. Gordon Cambell, Laurence Lilley, ―Clavulanic Acid Production,‖ U.S. Patent 1, 571,
8881980.
[8] T. Olleros Izard, J. Fernández Puentes and M. Moreno Valle, ―Procedimiento para Mejorar la
Extracción de ácido clavulánico,‖ U.S. Patent 537,1581984.
[9] S. Ortiz, C. Hokka and A. Badino, ―Utilization of soybean derivatives on clavulanic acid
production by Streptomyces clavuligerus,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol.40, pp.
1071–1077, 2007.
[10] R. Li and C. Townsend, ―Rational strain improvement for enhanced clavulanic acid
production by genetic engineering of the glycolytic pathway in Streptomyces clavuligerus,‖
Metabolic engineering, vol. 8, no. 3, pp. 240–52, 2006
[11] J. Teodoro, A. Baptista-Neto, I. Cruz-Hernández, C. Hokka and A. Badino, ―Influence of
feeding conditions on clavulanic acid production in fed-batch cultivation with medium
containing glycerol,‖ Applied microbiology and biotechnology, vol. 72, no. 3, pp. 450–5,.
2006.
[12] S. Baños, R. Perez-Redondo, B. Koerman and P. Liras, ―Glycerol Utilization Gene Cluster in
Streptomyces clavuligerus,‖ Appl Environ Microbiol, vol. 75, no. 9, pp. 2991–2995, 2009.
[13] P. Saudagar and R. Singhal, ―Optimization of nutritional requirements and feeding strategies
for clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus‖, Bioresour Technol, vol. 98, no.
10, pp. 2010-7, 2007.
[14] C. Da Silva, M. Fabiano, V. Orlandin, W. Kwong, C. Hokka and M. Barboza, ―Separation of
clavulanic acid from fermented broth of amino acids by an aqueous two-phase system and ion-
exchange adsorption‖, New Biotechnology, vol. 29, no. 3, pp. 428-431, 2012.
131
[15] S. Kirk, C. Avignone-Rossa and M. Bushell, ―Growth limiting substrate affects antibiotic
production and associated metabolic fluxes in Streptomyces clavuligerus,‖ Biotechnology
Letters, vol. 22, pp. 1803–1809, 2000.
[16] P. Saudagar, S. Survase and R. Singhal, ―Clavulanic acid: A review,‖ Biotechnology
Advances, vol. 26, no. 4, pp. 335–351, 2008.
[17] R. Pérez, I. Santamarta, R. Bovenberg and J. Martín, ―The enigmatic lack of glucose
utilization in Streptomyces clavuligerus is due to inefficient expression of the glucose
permease gene‖, Microbiology, vol. 156, pp.1527–37, 2010.
[18] P. Liras, J. Gómez-Escribano and I. Santamarta, ―Regulatory mechanisms controlling
antibiotic production in Streptomyces clavuligerus,‖ Journal of Industrial Microbiology, pp.
667–76, 2008.
[19] L. Paloma and J. Martín, ―Assay Methods for Detection and Quantification of Antimicrobial
Metabolites Produced by Streptomyces clavuligerus‖, Methods in Biotechnol. 18: Microbial
Processes and Product, New Jersey, pp. 149–163, 2005
[20]. L. Malmberg, W.Shu and D. Sherman, ―Precursor flux control through targeted chromosomal
insertion of the lysine epsilon-aminotransferase (lat) gene in cephamycin C biosynthesis‖, J
Bacteriol, vol. 175, no. 21, pp. 6916-24, 1993.
[21] A. Botas, Comunicación personal con investigadora del Laboratorio de Microbiología,
Universidad de León y ensayado en el Instituto INBIOTEC (España), 2008.
[22] Duncan, D., ―Multiple range and multiple F-test‖, Biometrics, vol. 11, no. 1, pp. 1-42, 1955
[23] C. Kramer, ―Extension of multiple range test to group mean with unequal numbers of
replications‖, Biometrics, vol. 12, no. 3, pp. 307-310, 1956.
[24] K. Burton, ―A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the
colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid‖, Biochem J., vol. 62, no.2, pp. 315-23, 1956.
[25] M. Foulstone and C. Reading, ―Assay of amoxicillin and clavulanic acid, the components of
Augmentin, in biological fluids with high-performance liquid chromatography‖, Antimicrob
Agents Chemother, vol. 22, no. 5, pp. 753-62, 1982.
[26] A. Neto, D. Hirata, L. Cassiano, C. Bellão, A. Badino Júnior and C. Hokka, ―A study on
clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus in batch, fed-batch and continuous
processes,‖ Brazilian Journal of Chemical Engineering, vol. 22, no. 4, pp. 557 – 63, 2005.
[27] P. Ives and M. Bushell, ―Manipulation of the physiology of clavulanic acid production in
Streptomyces clavuligerus,‖ Microbiology, vol. 143, pp. 3573–9, 1997.
[28] C. Rodríguez Otero, M. Moreno Valle, M. López Nieto, A. Collado de la Vieja and A. Vitaller
Alba, ―Nuevo procedimiento de producción de ácido clavulánico y sus sales,‖ U.S. Patent
ES2-101-6581997.
[29] K. Chen, Y. Lin, C Tsai, C. Hsieh and J. Houng, ―Optimization of glycerol feeding for
clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus with glycerol feeding,‖
Biotechnology Letters, vol. 24, no. 6, pp. 455–58, 2002.
[30] G. Efthimiou, A. Thumser and C. Avignone-Rossa, ―A novel finding that Streptomyces
clavuligerus can produce the antibiotic clavulanic acid using olive oil as a sole carbon
source‖, Journal of Applied Microbiology, vol. 105, no. 6, pp. 1365-2672, 2008.
132
[31] M. Bushell, S. Kirk, H. Zhao and C. Avignone-Rossa, ―Manipulation of the physiology of
clavulanic acid biosynthesis with the aid of metabolic flux analysis,‖ Enzyme and Microbial
Technology, vol. 39, no. 1, pp. 149–57, 2006.
[32] K.Ozergin-Ulgen and F. Mavituna, ―Actinorhodin production by Streptomyces coelicolor A3
(2): kinetic parameters related to growth, substrate uptake and production,‖ App. Microbiol.
Biotechnol, vol. 40, pp. 457–462, 1993.
[33] V. Trejos, J. Fontalvo and M.Gómez., ―Descripción matemática y análisis de Estabilidad de
Procesos Fermentativos,‖ Dyna, vol. 76, no. 158, pp. 111–121, 2009.
[34] A. Baptista-Neto, A. Goveia, E. Badino and A. Hokka, ―Phenomenological model of the
clavulanic acid production process utilizing Streptomyces clavuligerus,‖ Braz. J. Chem. Eng,
vol. 17, no. 4–7, 2000.
[35] B. Alvaro, J. Teodoro, L. Macedo Filho, D. Battaglia Hirata, A. Badino Júnior, and C.
Hokka, ―Kinetic studies on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ in 2nd.
Mercosur Congress on Chemical Engineering and 4th. Mercosur Congress on Process System
Engineering, pp. 1–10, 2005.
133
CAPÍTULO 4
UNA COMBINACIÓN DE ANÁLISIS DE SENSIBILIDAD Y
AFM MUESTRAN LA IMPORTANCIA DE LA ESTRATEGIA
DE ALIMENTACIÓN DE AMINOÁCIDOS PARA LA
BIOSÍNTESIS DE AC EN Sc.
El análisis de flujo metabólico (AFM) es una herramienta de la IM, cuyo propósito es
proveer un nuevo enfoque de tipo sistémico para el diseño racional de sistemas biológicos
complejos. La aplicación de AFM implica la necesidad de realizar desarrollos matemáticos
que se vuelven robustos y difíciles de manejar a simple vista, por lo que se requiere
herramientas matemáticas que permiten resolver el sistema, y, previo a la experimentación,
poder definir las mejores variables a analizar de acuerdo con un análisis de sensibilidad. En
este trabajo se realizó un análisis de sensibilidad y un AFM, a partir de la representación
matemática de las rutas bioquímicas más importantes, consideradas en la biosíntesis de AC
por Sc. Se observó que los flujos metabólicos medidos que más inciden en el sistema
celular fueron los de las síntesis de los AAs fenilalanina, isoleucina, tirosina y lisina.
También se pudo establecer que, de acuerdo con la distribución de flujos a dos D (0.02 y
0.03 h-1
), la biosíntesis de AC se ve favorecida a una menor D, dando lugar a mayores
valores en los flujos de producción de gliceraldehido-3-fosfato, fosfoenolpiruvato y
piruvato, flujos precursores del ciclo de Krebs y del ciclo de la urea. Se encontró además
que el flujo de producción de ORN afecta directamente la biosíntesis de AC en mayor
grado que el flujo de ARG, lo cual deja ver la importancia del control del flujo de carbono
134
a través del ciclo de la urea, en la biosíntesis de AC.
4.1. INTRODUCCIÓN
Los antibióticos son sintetizados a partir de precursores metabólicos producto del MCC,
por lo que una mayor producción requerirá un adecuado suministro de algunos
metabolitos intermediarios relevantes, resultantes de la actividad de la célula. El
mejoramiento de la producción de antibióticos ha estado ligado a actividades de
mutagénesis aleatoria con importantes avances en los últimos años; uno de los organismos
más estudiados es Sc, especialmente en lo que respecta a sus características genéticas y
proceso de biosíntesis de antibióticos [1-3]. La combinación de aspectos genéticos y el
empleo de técnicas de IM permiten introducir cambios racionales en el metabolismo
central, y propender por el incremento de flujos de precursores metabólicos y cofactores
que permitan mejorar la concentración de un producto de interés [4], o minimizar la
generación de subproductos [5]. El AFM es uno de los núcleos metodológicos de la IM el
cual particularmente ayuda a la optimización de la distribución de flujos metabólicos
(DFM) [6-7].
Algunos trabajos en los cuales se ha empleado el AFM como herramienta para mejorar el
proceso se discuten a continuación. Kirk et al, (2000), realizaron un AFM para conocer la
distribución de flujos en el metabolismo central del carbono (MCC) de Sc, generados al
limitar el medio de cultivo en las FC, FN, FP [8]; esto permitió proponer una estrategia
racional de mejoramiento del medio a través de alimentación de AAs favoreciendo la
disponibilidad del precursor C5 (ARG). En este trabajo también se encontró que, bajo
limitación de nutrientes en el medio, el flujo a través de la vía anaplerótica (carboxilación
de PEP para producir oxaloacetato) era bajo, consistente con la carencia del precursor
135
ARG, desfavoreciendo así una buena producción de AC. Con base en los resultados
obtenidos se propuso que la limitación de carbono restringe el flujo de carbono por la vía
anaplerótica, reduciendo el potencial requerido para que en el ciclo de Krebs se pueda
favorecer la biosíntesis de los AAs precursores de AC. Estudios experimentales que
incluían limitación de N mostraron una reducción de los flujos de los precursores de la
biosíntesis de AC, debido a la reducción de los flujos de la biosíntesis de AAs. En el caso
de estudios con limitación de P, los resultados mostraron altos valores de flujos en los
precursores C3 y C5 que favorecieron la producción de AC [8].
Bushell et al, (2006), realizaron cultivos en continuo con medio basal y con medio
enriquecido por la adición de AAs individuales y mezclados, buscando favorecer la
producción de AC; para la estrategia de selección de estos AAs emplearon como
herramienta el AFM. Mediante la adición de AAs sintetizados a partir de ASP, ASN y
THR, entre otros, se incrementaron los flujos de la vía de síntesis de ARG, generando un
aumento de 5 veces el rendimiento de AC, con respecto al medio sin adición de estos AAs
[9].
Con el fin de estudiar el comportamiento del metabolismo celular ante cambios en
condiciones ambientales, se ha desarrollado un método basado en análisis de sensibilidad,
teniendo en cuenta la estequiometria, de la red metabólica propuesta. Empleando este
método se ha logrado analizar el efecto de perturbaciones en los flujos medidos sobre el
sistema y también el efecto de cambios de la composición de la biomasa sobre las
reacciones metabólicas calculadas [10]. Daae e Ison (1999), encontraron que un cambio en
el flujo de oxígeno es el que genera mayor impacto sobre la distribución de flujos del
sistema [10]. Además, demostraron que el uso de la composición de la biomasa de E. coli,
136
como modelo de biomasa para para S. lividans, es una buena aproximación, ya que no
afecta significativamente el patrón de flujos calculados en el metabolismo de S. lividans.
De esta manera es aceptable adoptar la composición de biomasa de E. coli para
representar la biomasa de S. lividans en estudios de IM [10].
Dada la importancia que amerita el estudio de medios y su efecto en la distribución de
flujos metabólicos (DFM), en el presente trabajo se analiza la producción de AC en medio
continuo, usando una cepa salvaje de Sc y diversas estrategias de enriquecimiento de
medios. Adicionalmente se estudia la DFM como resultado directo de la adición de AAs y
de la tasa de dilución (D), y se hace una descripción cuantitativa del efecto de la variación
de flujos metabólicos individuales sobre la acumulación de AC.
4.2. MATERIALES Y MÉTODOS:
En la figura 4.1 se presenta de manera esquemática la metodología empleada para llevar a
cabo la recopilación de datos experimentales para realizar el AFM; el trabajo experimental
consideró un proceso en continuo y la cuantificación de los flujos en estado estacionario,
tomando el promedio de tres tiempos de residencia, después de estado estacionario del
proceso.
4.2.1. Técnicas microbiológicas.
4.2.1.1. Microorganismo y medio de conservación.
Se empleó un liofilizado de la cepa Streptomyces clavuligerus (Sc) ATCC 27064. La
activación se realizó en caldo TSB a 28 ºC por 36 h. La cepa activada se almacenó a -80 ºC
en tubos eppendorff con medio TSB/glicerol al 40%. Estos tubos se emplearon como
semilla para todos los ensayos [11].
137
Figura 4.1. Representación esquemática del proceso de producción de AC en lote y en continuo. Siglas: AC: Acido clavulánico, Sc. Streptomyces clavuligerus, MP: Medio de
producción de AC, X, biomasa; AAs, aminoácidos; GLC, glicerol; , tiempo de residencia; D, tasa de dilución, V: volumen del cultivo T: temperatura, t: tiempo del cultivo
4.2.1.2. Medios de cultivo.
Para la preparación del preinóculo se empleó el medio de cultivo TSB (Triptone Soy Broth)
que está compuesto de: Bactotriptona (digerido pancreático de caseína) 17 g L-1
, Bacto
Soytone (digerido de harina de soja) 3 g L-1
, glucosa 2.5 g L-1
, NaCl 5 g L-1
y K2HPO4 2.5 g
L-1
.
Para realizar el modelado metabólico se requiere de un medio químicamente definido, por
esto se seleccionó el medio 2 trabajado en el capítulo 3. Los ensayos de fermentación se
realizaron con un medio de producción (MP) conteniendo la siguiente composición:
Glicerol 20 g L-1
, MgSO47H2O 1.23 g L-1
, K2HPO4 3.5 g L-1
, asparagina 2 g L-1
y 1 mL L-1
de solución de elementos traza. La composición de la solución de los elementos traza fue:
Análisis de AC,
X, AA, GLC, PO4 para AFM
MP
Productos
(AC) Lote:
Bioflo 110, 3L, V: 1L de MP
T:28°C, pH: 6.8+/-0.2, t: 100 h
500 rpm, agitadores Rushton
Flujo de aire: 1 vvm.
Continuo:
Bioflo 110, 3L, V: 1L de MP
T:28°C, pH: 6.8+/-0.2, t lote: 36-40 h
Continuo hasta 6 , D: 0.03 y 0.02 h-1 500-1200 rpm, agitadores Rushton
Flujo de aire: 1 vvm.
Botón de 10 mL Centrifugado a 23°C
10 min a 4000 rpm
Inóculo en MP
V: 100 mL,
Erlenmeyer con 4
bafles,
T:28°C, 220rpm, pH:7
t: 24-36 h
X= 8 +/- 1 g L-1 Stock de Sc.
Medio TSB con
Glicerol al 40% T : -80ºC
Tubo semilla
Preinóculo, Medio TSB V: 100 mL
Erlenmeyer con 4 bafles
T: 28°C, 220 rpm, pH: 7
t: 24-36 h
X = 8 +/- 1 g L-1
100 mL de inóculo
138
FeSO4.7H2O 1 g L-1
, MnCl2.4H2O 1g L-1
, ZnSO4.7H2O 1 g L-1
y CaCl2.3H2O 1.3 g L-1
. El
medio de producción fue ajustado a pH 6.9 con solución buffer MOPS (buffer [3-(N-
Morfolino)-ácido propanosulfónico]) (100 mM) [12].
Los medios fueron autoclavados a 121 ºC durante 20 min. Para el medio de producción, las
soluciones traza fueron esterilizadas por filtración.
4.2.2. Métodos experimentales.
4.2.2.1. Preparación del inóculo
Con el propósito de identificar la cinética de producción de AC y establecer las condiciones
para trabajar en continuo, se realizaron cultivos en lote bajo las siguientes condiciones:
Se desarrolló un preinóculo a partir de un tubo semilla de Sc, adicionando el contenido del
vial a un Erlenmeyer bafleado de 500 mL, que contenía 100 mL de medio TSB. Una vez se
alcanzó la fase exponencial, se tomó una muestra de 10 mL de cultivo, se centrifugó a 5000
rpm por 10 min con el fin de separar la biomasa. Después de eliminar el sobrenadante, la
biomasa fue resuspendida en 10 mL de medio de producción y transferida a otro
Erlenmeyer bafleado de 500 mL con 90 mL de medio de producción, con el fin de
desarrollar el inóculo para los ensayos en biorreactor. Los cultivos de preinóculo e inóculo
se incubaron a 28 ºC y 220 rpm por 36 h, tiempo en el cual se aseguraba un cultivo en fase
exponencial con una concentración de biomasa entre 8 y 9 g L-1
.
4.2.2.2. Cultivos en biorreactor
Los cultivos en biorreactor se desarrollaron en un fermentador BIOFLO 110 (New
Brunswick, USA), de 3 L, con dos agitadores tipo Rushton de 6 paletas planas y sistemas
de control de T, pH y OD.
139
Se operó con un volumen de trabajo de 1L de MP y un porcentaje de inóculo del 10% (v/v).
Las fermentaciones se llevaron a cabo a 28º C, 500 rpm y un flujo de aire de 1 vvm. El pH
se controló a 6.8 +/- 0.2 con soluciones de NaOH (2N) y HCL (2N), adicionadas
automáticamente. La espuma se controló adicionando 0.08 ml L-1
de anti-espumante
siliconado (Antifoam A, sigma Aldrich) al inicio de la fermentación. Los cultivos por lote
cumplieron una cinética de 100 h y periódicamente se tomaron muestras para determinar la
concentración de X, GLC, AAs, fosfato, O2 y AC. A partir de estos cultivos se evaluaron
los parámetros cinéticos velocidad específica de crecimiento y rendimientos de producto
necesarios para definir las condiciones de operación en continuo. Se evaluaron los
modelos cinéticos tipo Monod, Contois y Teisser.
Los cultivos en modo continuo se realizaron con el fin de evaluar el efecto de la D sobre la
producción de AC, y obtener información experimental sobre la D. Para poner en marcha
un proceso continuo, inicialmente se realizó un cultivo en lote; el proceso se llevó hasta el
final de la fase de crecimiento exponencial (aproximadamente 36 h), tiempo en el cual se
iniciaba la alimentación y descarga, en forma continua, usando medio MP y ajustando las
bombas peristálticas al caudal correspondiente a la D a evaluar. Se trabajó a dos D (0.02 y
0.03 h-1
). Para asegurar condiciones de estado estacionario se estableció en seis tiempos de
residencia () el tiempo para tomar las muestras correspondientes a las condiciones
estudiadas. El estado estacionario se verificó por la medición de biomasa y AC en cada
tiempo de residencia, para el tercer tiempo de residencia se inicia el estado estacionario y se
mantiene hasta el sexto tiempo de residencia (los datos se toman del promedio de las tres
últimos tiempos de residencia). Se tomaron muestras con el fin de evaluar X, AC, GLC,
PO4, OD, ASN, PHE, TYR, TRP, VAL, ILE, PRO, GLY y ALA.
140
Los cultivos en lote se realizaron por triplicado y el continuo se realizó por duplicado; los
análisis de las muestras se realizaron por duplicado.
4.2.2.3. Modelo matemático
Dado que para el modelado metabólico se requiere de un medio químicamente definido, es
necesario obtener los parámetros cinéticos bajo las condiciones experimentales detalladas
en este capítulo. Se siguió la misma metodología planteada en la Sección 3.2.3 para
plantear el modelo y validar los datos experimentales. Para la velocidad de crecimiento
específica se propuso el modelo de Monod, se representa en la ecuación (1), donde la
velocidad específica de crecimiento es inversamente proporcional a la concentración de
sustrato limitante. La velocidad de crecimiento microbiano se representa por la ecuación (2)
en la cual se considera también el término de muerte celular. La velocidad de consumo de
glicerol se representa como una función directa de la velocidad de crecimiento microbiano,
ecuación (3) y la velocidad de producción de AC se representa como una función aditiva de
la velocidad de crecimiento microbiano y la concentración de biomasa, ecuación (4), es
decir, se representa como un metabolito producido con un aporte del metabolismo primario
y un aporte del metabolismo secundario. A diferencia del modelo Contois planteado en la
Sección 3.2.3. No se considera función de paso..
SKs
S
.max (1)
Xkdt
dXd )( (2)
XYdt
dS
XS
.
(3)
141
XYdt
dP
XP
.
(4)
Donde X es la concentración de la biomasa (g L-1), S es la concentración de GLC (g L-1), P es
la concentración de AC (mg L-1), µ es la velocidad de crecimiento específica (h-1), µmax es la
velocidad de crecimiento máxima específica (h-1
), KS es la constante de saturación de
Monod (g L-1
), YXS es el rendimiento biomasa en glicerol, YXP es el rendimiento de biomasa
en AC (g mg-1
), α que es una productividad de AC específica (mg g-1
h-1
).
4.2.3. Métodos analíticos
Todas las muestras de fermentación se centrifugaron a 14000 rpm durante 10 min a 4 ºC.
Los pellets obtenidos se emplearon para determinar la concentración de biomasa y el
sobrenadante se filtró a través de membranas de PTFE de 0.2 µm. Los sobrenadantes
fueron almacenados a -20 ºC para su posterior análisis.
Determinación de biomasa: Los sólidos precipitados después de la centrifugación, fueron
secados por 4 h a 105 ºC en tubos de micro centrífuga eppendorff, previamente secados y
pesados.
Determinación de ácido clavulánico: El AC presente en el sobrenadante de las muestras,
fue derivatizado con imidazol en relación 1:3 durante 30 min a 30 ºC y almacenado a -80
ºC para posterior análisis (no superando el mes de almacenamiento). Como estándar se
empleó el antibiótico Curam® de 250 mg / 5 mL, presentación en polvo para suspensión
oral (cada mL de suspensión contiene en su mayoría amoxicilina, con 12.5 mg de AC).
El AC fue analizado por HPLC (Agilent Technologies Series 1200) equipado con detector
UV/VIS con arreglo de diodos, DAD, con una columna analítica de 5 m, ZORBAX
142
Eclipse XDB-C18 de 4.6 x 150 mm, una fase móvil compuesta por una solución de 94 %
v/v de KH2PO4 (50 mM, pH 3.2) y 6% v/v de metanol, a un flujo de 1 mL min-1
. El AC
derivatizado se detectó a 311 nm [13].
Determinación de glicerol: El GLC fue analizado por HPLC (Agilent Technologies Series
1200, detector: RID a 30ºC), operado con columna de 9 µm, SUPELCOGEL C-610H, 30
cm x 7.8 mm, una fase móvil compuesta por ácido sulfúrico 5mM, una T de 80 ºC y un
flujo de 1.2 mL min-1
[14]. Como estándar se empleó glicerina al 99.5%.
Determinación de aminoácidos: Los AAs fueron analizados por HPLC (Agilent
Technologies Series 1200, con detector UV/VIS con arreglo de diodos DAD); operado con
columna analítica de 5 µm, ZORBAX Eclipse AAA - C18, 4.6 x 150 mm, una fase móvil
en forma de gradiente preparada por bomba cuaternaria al mezclar las soluciones agua,
metanol, acetonitrilo y 40 mM Buffer NaH2PO4, ajustado el pH a 7.8 con solución de
NaOH (10N), una temperatura de 40 °C y un flujo de 2 mL min-1
.
Previo a los análisis la muestra de AAs fue derivatizada en línea usando O-ftalaldehído
(OPA) para amino ácidos primarios y 9-fluorenil-metil-oxi-carbonilo (FMOC) para amino
ácidos secundarios (prolina, iminoácido). Los primarios son detectados a 338 nm y los
secundarios a 262 nm. La prolina por ser un iminoácido no reacciona con el OPA pero si
con el FMOC. La recta de calibración se elaboró empleando una mezcla de estándares de
AA entre 90 y 900 pmol µ L-1
de Agilent Technologies [15]. Los AAs analizados
corresponden a VA, TRP, PHE, ISOLEU, PRO, ASN, GLN, GLY y THR presentes en el
sobrenadante de la muestras tomadas para análisis de AC.
Determinación de fosfatos: El fosfato se determinó por colorimetría empleando un
espectrofotómetro Helios alfa. La reacción de 1 mL de sobrenadante con 1 ml de mezcla
143
reaccionante produce un complejo de color azul intenso, fosfomolibdeno, que se detecta a
828 nm. La mezcla reaccionante está compuesta de 1 mL de H2SO4 6 N, 2 mL de agua
destilada, 1 mL de molibdato de amonio al 2.5% y 1 mL de ácido ascórbico al 10%. La
calibración se realizó en un rango de 0 a 8 mg L-1
de PO4 [16].
Determinación de consumo de oxígeno: Para determinar la velocidad de consumo de
oxígeno (OUR) en el biorreactor con 1 L de volumen de operación, se empleó la técnica
dinámica [17], a 1 vvm, 500 rpm y a una concentración celular de 7 g L-1
. Para monitorear
la concentración de oxígeno disuelto (OD) se empleó un electrodo de oxígeno (electrodo
polarográfico Clark Inpro®6800G, Mettler, Toledo, USA). El valor del OUR se corrigió
teniendo en cuenta el tiempo de respuesta del electrodo de 18 s [18].
4.2.4. Planteamiento de la red metabólica.
El modelo metabólico estequiométrico empleado en el presente capítulo consistió de 60
reacciones que involucran 47 metabolitos. Estas reacciones se presentan en el apéndice A1
y un esquema de ellas se presenta en la figura 4.2.
El modelo toma en consideración las reacciones que involucran el MCC (gluconeogénesis,
ruta de la pentosa fosfato (PP) y ciclo de Krebs común en la mayoría de Streptomyces sp
[19]; también se tuvo en cuenta la biosíntesis de todos los precursores involucrados en la
producción de biomasa [10], el ciclo de la urea [9, 20-21] y biosíntesis de AC [20]. Las
rutas correspondientes a Entner-Doudoroff y glioxilato no se consideraron ya que no son
comunes para la gran mayoría de Streptomyces sp [9, 22]. Además de la información
obtenida de la literatura, se utilizaron las bases de datos The Kyoto Encyclopedia of Genes
and Genomes– KEGG (www.genome.org/kegg).
144
GAP
PEP
PYR
ACCOA
TCA
aKGSUC
FUM
OAA
UREA
ORN
ARGASP
GLU
NH4
FUM
AC F6P
G6P R5P
X5P RIB5P
E4P
SED7P
1
aKG, 02
SUC, UREA, CO2, NH4
X
PHE
TYR
TRPVAL
ALA
LEU
CO2
CO2
GLNPRO
t
3
6
8
10
1114
15
16
17
18
ASPSEMALD
METLYS THR
ILE
ASN
1920
21
22
23 24
25
26
27
28
2930
31
34
CO2
40
SER
GLY
CYS
SUCCOA42
43
NADPH(NADH) + ADP
NADH
NADP(NAD) + ATP
NADPH
GLC
3PG
33
35 3637
38
39
2
4
44
7
9
1213
NH4 O
2 CO2
CITOPLAMAMEMBRANACELULAR
MEDIO EXTRACELULAR
AC GCL
AAs
Figura 4. 2. Representación esquemática de la red bioquímica empleada para AFM en Sc.
i indica el flujo de cada reacción y el subíndice i se refiere a una reacción específica.
En el MCC, el NADPH es regenerado de NADP+
principalmente a través de la ruta
oxidativa de pentosa fosfato (PP). En esta ruta, dos unidades de NADPH son generadas por
cada unidad de glucosa-6-fosfato por la acción de las enzimas glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa y 6-fosfogluconato deshidrogenasa. El NADPH es también regenerado por
la enzima isocitrato deshidrogenasa en el ciclo de Krebs y constituye el principal agente
reductor en la ruta de síntesis de antibióticos, específicamente del AC [23]. El sistema de
145
reacciones que conforman el modelo, considera también la presencia de la enzima
nicotinamida nucleótido transhidrogenasa, la cual cataliza la reacción reversible de
NADPH a NADH [9, 25]. La alta productividad de metabolitos secundarios es
principalmente determinada por la disponibilidad de precursores de biosíntesis como
ACCOA y malonil-COA, los cuales son productos metabólicos del MCC [26].
A continuación se describen, de manera más detallada, las diferentes vías involucradas en
el modelo metabólico propuesto.
Gluconeogénesis: Muchos actinomicetos tienen la capacidad de crecer en glicerol como
fuente de carbono, como es el caso de Streptomyces sp, y pueden convertir fructosa 1-6
fosfato a fructosa 6-fosfato, por la acción de la enzima fosfofructokinasa dependiente de
pirofosfato. La fructosa-6-fosfato es usada en la vía de EMP (Embden-Meyerhof-Parnas).
Esta vía incluye todas las reacciones de conversión de fructosa 6-fosfato a piruvato [23].
A partir de esta vía se derivan las rutas de síntesis de los AAs SER, GLY, CYS, TRP,
TYR, PHE, VAL, ALA, LEU y precursores de biomasa.
Síntesis de biomasa: La reacción estequiométrica para la síntesis de biomasa de Sc se basó
en la composición de la biomasa de E. coli. Esta misma ecuación ha sido usada en modelos
metabólicos de S. coelicolor [27] y de S. lividans [10].
Biosíntesis de aminoácidos: Los aminoácidos considerados fueron aquellos involucrados en
la relación estequiométrica de biomasa [10], en el ciclo de la urea [9] y en la biosíntesis de
producto (AC) [20].
Ciclo de la urea: Este ciclo tiene el papel de regulador del metabolismo de nitrógeno en
estas especies, y es esencial como intermediario en la generación de ORN y ARG y de
precursores de la biosíntesis de AC. En experimentos donde se emplearon compuestos
146
marcados isotópicamente se demostró que ORN era convertida a ARG (vía una secuencia
de reacciones análogas al ciclo de la urea) antes que esta fuera incorporada al AC [23].
Reportes de actividad arginasa en Sc sugiere la existencia del ciclo de la urea [24].
Biosíntesis de AC: La producción de AC conlleva varias etapas que unidas corresponden a
la reacción v3 de la figura 4.2. Estas etapas son descritas en detalle en la sección 2.2.8. La
reacción de biosíntesis de AC, (v3 de la Tabla A1 del apéndice) involucra entonces GAP,
ARG, aKG, NADPH, O2 y ATP como sustratos y urea, CO2, NH4, SUC y AC, como
productos [20].
4.2.5. Análisis de flujos metabólicos y de sensibilidad.
En la figura 2.8 se presenta la metodología empleada para llevar a cabo un AFM y en las
secciones 2.5.2.2.1 y 2.5.2.2.2 se describen en detalle los procedimientos para el cálculo y
el análisis de resultados. El proceso va desde la recopilación de información para el
modelado metabólico hasta el desarrollo matemático necesario para hacer las respectivas
simulaciones y analizar la variación de los flujos en el interior de la célula como resultado
de modificaciones o manipulaciones en el sistema.
El análisis de DFM resultado del efecto de adición de nutrientes al medio de cultivo, y de
trabajar a diferentes D, sobre la actividad metabólica de Sc, se realizó mediante la
construcción y uso de un modelo matemático que representa la actividad metabólica de la
cepa.
El AFM es realizado empleando un modelo estequiométrico en el que se incluyen las
reacciones más representativas propuestas para la biosíntesis de AC. Se realiza mediante
un balance de materia alrededor de los metabolitos presentes en el modelo estequiométrico
147
señalado en la sección 4.2.4 y se asume estado estacionario, lo cual permite obtener un
sistema de ecuaciones algebraicas lineales.
Dado que la matriz estequiométrica en este capítulo corresponde a las dimensiones (60 x
47), los grados de libertad son 13; así, para determinar el sistema se deben definir 13 flujos
dando una única respuesta de DFM.
Para el análisis de sensibilidad se seleccionaron los flujos medidos de los siguientes
metabolitos: GLC, O2, CO2, AC, NH4, X, ARG, GLU, SER, PHE, TYR, GLN, TRP,
VAL, ALA, LEU, ORN, ASN, CYS, MET, THR, LYS, PRO, ILE, GLY, OAA, PYR,
aKG y GAP, lo que da la posibilidad de seleccionar y hacer diferentes análisis de
sensibilidad, considerando alguno de estos como sustratos o como producto. Algunos de
estos metabolitos seleccionados presentan una mayor conectividad (metabolitos presentes
en gran cantidad reacciones) con respecto a otros metabolitos intermediarios en el MCC
[25].
4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.3.1. Cultivos en biorreactor en lote y continuo, para la producción
de AC.
En la figura 4.3 se presentan los resultados obtenidos durante el cultivo de Sc en medio
químicamente definido. Se observa una fase de producción de AC no asociada a la fase de
crecimiento que alcanza una máxima concentración de 62.3 mg L-1
, a las 72 h de cultivo. El
descenso en este valor después de las 72 h se puede explicar por agotamiento de los
nutrientes, en especial de la FN, una justificación puede ser que el AC por ser tan
inestable y contener N en su estructura, la Sc lo emplee como fuente alternativa de N [26].
Otra justificación puede deberse a que este producto, en su forma natural, es químicamente
148
inestable; ya se conoce a través de algunos estudios cinéticos, que hay unas velocidades de
producción y de degradación simultáneas de AC, siendo en la idiofase más alta la
producción que la degradación y en la trofofase estas se invierten, la velocidad de
degradación es mayor que la velocidad de producción, por lo que se nota el declive en la
curva cinética para la producción de AC por parte de Sc [27]. De acuerdo con la cinética
observada se puede establecer que entre las 36 y 42 h, la ASN, que es la única FN, se
encuentra en condiciones de limitación y a las 48 h se ha consumido completamente.
Durante el tiempo de cultivo estudiado, no se observó limitación de P ni de FC. El OD se
mantuvo a concentraciones superiores al 50% del valor se la saturación (datos no
reportados).
Figura 4. 3. Cinética de fermentación de S. clavuligerus en un biorreactor de 3L, Cultivo en lote. OD superior al 50%, 500rpm, 28ºC, 1vvm, pH 7, medio químicamente definido.
Los símbolos representan los datos experimentales. Símbolos: Glicerol (O), biomasa (□),
ácido clavulánico (∆), fosfato (◊) y asparagina (•).
0
20
40
60
0
4
8
12
16
20
24
0 24 48 72 96
AC
(m
g L
-1)
Bio
mas
a y s
ust
rato
s (g
L-1
)
Tiempo (h)
149
El modelo que mejor se ajusta a los datos experimentales empleando el medio
químicamente definido es el modelo cinético tipo Monod (menor error residual, 4% ). Los
valores de los parámetros del modelo se presentan en la Tabla 4.1.
Tabla 4.1. Parámetros del modelo cinético estimados con un 95% de nivel de confianza, que fueron
utilizados para la simulación de la fermentación de S. clavuligerus
Parámetros Valores estimados
µmáx (h-1
) 0.041 ± 0.005
Ks (g L-1
) 0.12 ± 0.01
Yxs (g g-1
) 0.38 ± 0.00
Yxp (g mg-1
) 0.15 ± 0.02
α (mg g-1
)
Kd (h-1
)
0.00015 ± 0.00012
0.0085 ± 0.0004
El valor de velocidad específica de crecimiento celular es del mismo orden que algunos de
los valores reportados en la bibliografía [9, 24] y el reportado en el capítulo 3. El valor de
Ks, es menor que el obtenido en el capítulo 3 y para ambos casos este valor bajo muestra la
afinidad del microorganismo por el sustrato. El valor de rendimiento de producto Yxp es
un orden de magnitud mayor que el obtenido en el medio complejo, correspondiente esto
con los bajos rendimientos de producto que se obtienen para un medio de cultivo de estas
características.
El parámetro cinético µmax es muy importante para establecer las condiciones de operación
del proceso en modo continuo. Para trabajar en continuo la D debe ser inferior al 80% del
valor de la máxima velocidad específica de crecimiento (µmax) obtenida en lote. De
150
acuerdo con la literatura, a menor D se obtiene mayor producción de AC [9]. En estas
fermentaciones se obtuvo un agotamiento de nitrógeno después de las 50 h de iniciado el
cultivo, en este tiempo no se encontró limitación de P ni de GLC y se evidencia un
crecimiento exponencial de producción de AC. Para iniciar los ensayos en modo continuo,
se puso en marcha un proceso en lote y se tomó como base de tiempo para iniciar la
alimentación de nutrientes y salida de productos un tiempo entre 40 y 48 h, tiempo en el
cual se presenta una desaceleración de producción de biomasa, agotamiento de la fuente de
nitrógeno y máxima producción de AC, características estas dadas en cultivos de
metabolito secundarios.
En la Tabla 4.2 se muestran los resultados de los flujos medidos a las dos tasas de dilución
evaluadas. Después de alcanzar el estado estacionario, los valores obtenidos fueron
normalizados con respecto al flujo de glicerol a la mayor tasa de dilución con dos
propósitos, uno mitigar errores de cálculo y para facilitar la comparación entre las dos
condiciones. Estos valores serán utilizados para determinar la DFM calculados.
De estos resultados se puede notar que al reducir la tasa de dilución se obtiene una mayor
producción de AC (dos veces), lo que correlaciona con observaciones hechas por otros
autores [9]. También se observa que al reducir la tasa de dilución se genera una mayor
demanda de glicerol y de oxígeno, y se incrementa la demanda de la FN (ASN).
La velocidades de síntesis de los AAs, en su mayoría, fueron mayores a menor D, como es
el caso de νPHE, νTRP, νILE, νASN, νGLY y νALA, correlacionando con una menor νX, que pasó
de 1.17 a 0.78 g L-1
, cuando se cambió D, de 0.03 a 0.02 h-1
.
151
Tabla 4. 2. Valores de flujos extracelulares medidos, obtenidos a dos tasas de dilución. Para efectos de AFM se seleccionaron los flujos normalizados.
flujos medidos
(mmolg-1h-1)
TASA DILUCIÓN D (h-1
)
0.03 0.02 0.03 0.02
sin normalizar normalizado
vGLC (ν1) 0.3522 0.6895 100 195.7
vPHE (ν7) 4.6 E-05 5.33 E-05 0.013 0.015
νTYR (ν8) 7.21E-05 2.17 E-05 0.021 0.006
νTRP (ν9) 0.0000 6.67 E-05 0.0000 0.0189
νVAL (ν12) 8.2 E-05 8.33 E-05 0.0233 0.0237
νASN (ν21) 3.03E-07 2.5 E-04 8.59E-05 0.0710
νILE (ν26) 5.33E-05 7.33 E-05 0.0151 0.0208
νPRO (ν29) 5.6 E-05 2.67 E-05 0.0159 0.0076
νX (ν32) 1.17 0.78 332 221
νO2 (ν41) 0.1740 0.2175 49.4 61.8
νGLY (ν43) 0.0000 8.33 E-05 0.0000 0.0237
νNH4 (ν47) 0.06 0.05 17.2 14.2
νALA (ν13) 1.7E-04 0.04827 0.000143 0.0406
4.3.2. Análisis cuantitativo del comportamiento metabólico intracelular.
El modelo estequiométrico propuesto, mostrado en la figura 4.2 y apéndice A1, presenta
un grupo de ecuaciones lineales independientes que conforman una matriz de 60 x 47, con
un número de condición de 42, indicando que la matriz tiene baja sensibilidad a posibles
errores experimentales de los flujos medidos. Como se disponía de suficiente información
experimental para agotar los F, se trabajó un sistema determinado. Para la selección de los
flujos a medir se tuvo en cuenta el análisis de sensibilidad aplicando la ecuación (26)
(capítulo 2).
En la tabla 4.3 se presentan los resultados obtenidos para el análisis de sensibilidad del
modelo metabólico con 13 flujos medidos, y en la tabla B1 del apéndice B, se muestra un
análisis de sensibilidad con 6 compuestos adicionales, considerándolos como posibles
152
flujos medidos. El análisis de sensibilidad con estos compuestos adicionales se realizó con
el fin de determinar su efecto sobre el sistema metabólico definido y además determinar
cuál matriz de flujos calculados presenta el menor número de condición (ver Apéndice B).
En la primera columna de la tabla 4.3 están indicados los flujos a calcular y en la primera
fila los flujos propuestos a medir. Cada celda de la tabla muestra el efecto o la sensibilidad
de un flujo calculado con respecto a cambios en un flujo medido. Este coeficiente, permite
determinar cuál de las perturbaciones generadas en los flujos medidos genera el cambio
más significativo en los flujos calculados, o lo que es lo mismo, cuál de los flujos
calculados presenta mayor sensibilidad a cambios finitos en los valores de los flujos
medidos. En la última fila de la tabla se presenta el efecto total de cada flujo medido sobre
el sistema metabólico, es decir sobre todos los flujos calculados.
De los flujos medidos con los que se obtiene un menor número de condición, los flujos de
νPHE, νILE y νTYR, son los que generan un mayor efecto sobre el sistema metabólico
propuesto, alcanzando cuantitativamente un 55% del efecto global de todos los 13 flujos
medidos.
Sin embargo, con todos los flujos medidos y analizando su sensibilidad sobre el sistema,
(Tabla 4.3 y Tabla B1), se observa que el mayor efecto de un flujo sobre el sistema recae
153
Tabla 4. 3. Análisis de sensibilidad para los flujos calculados (c) con respecto a
cambios en los flujos medidos (m). El nombre del flujo que se toma como medido está en la fila superior y los resultados de los flujos calculados están en la primera columna. El valor de cada casilla corresponde al cociente .
* El acumulado corresponde a la sumatoria de la sensibilidad para cada flujo medido.
Flujos
νc PHE ILE TYR TRP VAL GLC PRO O2X ALA ASN NH4 GLY
ν3PG (ν2) -3.6636 -2.6636 -3.1364 -1.6091 -1.5182 2.0818 -1.0727 -0.9455 -0.8307 -0.4727 -0.0091 -0.0273 0.0000
νAC (ν3) -0.3273 -0.3273 -0.2727 -0.2182 -0.0364 0.1636 -0.1455 0.1091 -0.0984 0.0545 -0.0182 -0.0545 0.0000
νPEP (ν4) -1.7545 -1.7545 -1.0455 -1.3364 0.0273 1.6273 0.1091 -0.5818 0.0438 0.7091 1.2636 -0.2091 0.0000
νSER (ν5) -1.9091 -0.9091 -2.0909 -0.2727 -1.5455 0.4545 -1.1818 -0.3636 -0.8745 -1.1818 -1.2727 0.1818 0.0000
νOAA (ν6) -0.3273 0.6727 -0.2727 -0.2182 -0.0364 0.1636 0.8545 0.1091 0.2416 0.0545 0.9818 -0.0545 0.0000
νPYR (ν10) -3.4273 -2.4273 -2.7727 -3.1182 0.0636 1.4636 -0.7455 -0.6909 -0.2367 0.6545 0.2818 -0.1545 0.0000
νACCOA (ν11) -3.4273 -3.4273 -2.7727 -2.1182 -1.9364 1.4636 -0.7455 -0.6909 -0.4917 -0.3455 0.2818 -0.1545 0.0000
νALA (ν13) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000
νLEU (ν14) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0650 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
νaKG (ν15) -3.1000 -3.1000 -2.5000 -1.9000 -1.9000 1.3000 -0.6000 -0.8000 -0.6233 -0.4000 0.3000 -0.1000 0.0000
νSUC (ν16) -1.7909 -1.7909 -1.4091 -1.0273 -1.7545 0.6455 -1.0182 -1.2364 -0.4356 -0.6182 0.3727 0.1182 0.0000
νFUM (ν17) -2.7727 -2.7727 -2.2273 -1.6818 -1.8636 1.1364 -1.4545 -0.9091 -0.6619 -0.4545 0.3182 -0.0455 0.0000
νOAA(TCA) (ν18) -1.5364 -2.5364 -0.8636 -2.1909 -1.2818 0.5182 -1.1273 -0.6545 -0.1709 -0.3273 -0.3909 0.8273 0.0000
νASP (ν19) 1.2364 1.2364 1.3636 -0.5091 0.5818 -0.6182 0.3273 0.2545 0.5840 0.1273 0.2909 0.8727 0.0000
νARG (ν20) 1.2364 0.2364 1.3636 -0.5091 0.5818 -0.6182 0.3273 0.2545 0.4910 0.1273 -0.7091 0.8727 0.0000
νASPSEMALD (ν22) 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0930 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
νMET (ν23) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0190 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
νTHR (ν24) 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0240 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
νLYS (ν25) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0500 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
νGLU (ν27) -0.3273 0.6727 -0.2727 -1.2182 -0.0364 0.1636 -0.1455 0.1091 -0.3104 0.0545 -1.0182 0.9455 0.0000
νORN (ν27) -0.3273 -0.3273 -0.2727 -0.2182 -0.0364 0.1636 -0.1455 0.1091 -0.0984 0.0545 -0.0182 -0.0545 0.0000
νGLN (ν30) 0.0000 0.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0310 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000
νUREA (ν31) 1.5636 0.5636 1.6364 -0.2909 0.6182 -0.7818 0.4727 0.1455 0.5894 0.0727 -0.6909 0.9273 0.0000
νGAP-F6P (ν33) 2.9909 2.9909 2.4091 1.8273 1.5545 -1.2455 1.2182 0.8364 0.7292 0.4182 0.0273 0.0818 0.0000
νG6P (ν34) 7.9727 8.9727 6.2273 4.4818 4.6636 -3.7364 3.6545 2.5091 1.8325 1.2545 0.0818 0.2455 0.0000
νR5P (ν35) 7.9727 8.9727 6.2273 4.4818 4.6636 -3.7364 3.6545 2.5091 1.8025 1.2545 0.0818 0.2455 0.0000
νX5P (ν36) 4.9818 5.9818 3.8182 2.6545 3.1091 -2.4909 2.4364 1.6727 1.1143 0.8364 0.0545 0.1636 0.0000
νRIB5P (ν37) 2.9909 2.9909 2.4091 1.8273 1.5545 -1.2455 1.2182 0.8364 0.6882 0.4182 0.0273 0.0818 0.0000
νX5P-F6P (ν39) 1.9909 2.9909 1.4091 0.8273 1.5545 -1.2455 1.2182 0.8364 0.5392 0.4182 0.0273 0.0818 0.0000
νE4P (ν40) 2.9909 2.9909 2.4091 1.8273 1.5545 -1.2455 1.2182 0.8364 0.5752 0.4182 0.0273 0.0818 0.0000
νATP (ν41) 1.3091 1.3091 1.0909 0.8727 0.1455 -0.6545 0.5818 0.5636 0.3937 -0.2182 0.0727 0.2182 0.0000
νSED7P (ν38) 2.9909 2.9909 2.4091 1.8273 1.5545 -1.2455 1.2182 0.8364 0.5752 0.4182 0.0273 0.0818 0.0000
νSUCCOA (ν42) -1.7909 -1.7909 -1.4091 -1.0273 -1.7545 0.6455 -1.0182 -1.2364 -0.3666 -0.6182 0.3727 0.1182 0.0000
νCYS (ν44) -1.9091 -0.9091 -2.0909 -1.2727 -1.5455 0.4545 -1.1818 -0.3636 -0.8745 -1.1818 -1.2727 0.1818 -1.0000
νNADH (ν45) 10.5364 9.5364 7.8636 6.1909 6.2818 -5.5182 4.1273 2.6545 2.2249 2.3273 1.3909 -0.8273 0.0000
Acumulado * 19.5885 19.9704 15.4284 11.7135 11.4679 9.4872 8.3402 5.8183 4.4421 4.0670 3.4122 2.2542 1.0000
Sensibilidad de los flujos medidos
dd mC
154
en el flujo del AC con un valor de sensibilidad de 77.64. La relativa alta sensibilidad del
sistema a cambios en el flujo de AC está íntimamente relacionada con su estequiometria
(involucra el 22% de los compuestos de todo el sistema). La síntesis de AC involucra
precursores C3 (GAP) y C5 (ARG), precursores energéticos como ATP, NADPH,
intermediarios del metabolismo de los ácidos tricarboxílicos (SUC y aKG). Siendo el
AC un metabolito secundario, su producción está condicionada por la manera como se
distribuyen los diferentes flujos a lo largo del metabolismo central del carbono, el cual
contribuye a la síntesis de estos precursores
Dado que el fosfoenol piruvato, el piruvato y el oxaloacetato se derivan del metabolismo
central de carbono, y que estos son precursores directos de los aminoácidos PHE, ILE y
TYR, es posible explicar el alto efecto en la sensibilidad del sistema al cambio de los
flujos de estos aminoácidos. Es preciso resaltar el elevado número de metabolitos que
están involucrados en las reacciones de síntesis de estos tres aminoácidos (involucran
entre el 16-18% los compuestos de todo el sistema). Adicionalmente, algunos
investigadores han encontrado evidencia experimental de que estos tres aminoácidos
muestran un alto coeficiente sensibilidad sobre el AC [9]. Estos mismos autores,
encontraron que los aminoácidos ASP, GLU y ASN, no afectan sensiblemente la
producción de AC, lo cual está en concordancia con los resultados de análisis de
sensibilidad indicados en la Tabla B1.
Al realizar el análisis de sensibilidad considerando los flujos de ARG y ORN como
medidos, se observa baja incidencia acumulada de los flujos calculados sobre el
sistema. Adicionalmente, se obtienen diferentes sensibilidades en el flujo calculado de
la urea, el cual es más sensible y favorable al perturbar el flujo de ARG que el de ORN.
155
Al analizar la sensibilidad de la adición de cualquiera de estos dos AAs, precursores
importantes y directos en la producción de AC, se observa que la sensibilidad es baja, de
0.0727, lo que implica que a grandes cambios en los flujos de ARG u ORN se dan
pequeños cambios considerables en el flujo de AC. Sin embargo en diversos estudios se
ha considerado como estrategia para mejorar la producción de AC, adicionar ARG y
ORN al cultivo en medios complejos, obteniéndose mejores resultados al adicionar ORN
[14, 28]; igualmente, se ha evaluado la adición de ORN o ARG a un medio
químicamente definido, y se ha observado una mejora importante en la producción
específica de AC al adicionar ORN [9], mientras que la adición de ARG no logra
mejoras en la producción [24].
Era de esperarse que la perturbación de flujos precursores en la formación de
antibióticos pudiera repercutir de una manera significativa en la distribución de flujos
anabólicos orientados a la formación de producto [25]. Sin embargo, de acuerdo con los
resultados obtenidos, se observa poca incidencia de algunos de estos flujos, tales como
PYR, aKG, OAA y GAP. Así, es posible que existan otros factores alternos al
metabolismo, como el caso de las características cinéticas de cada reacción o
inhibiciones por sustrato o producto, las cuales no son tenidas en cuenta en el análisis
de sensibilidad.
Al hacer un análisis de los efectos individuales de la incidencia de perturbación de los
flujos medidos sobre la distribución de los flujos calculados, es posible identificar
perturbaciones en aquellos flujos específicos, factibles de vencer el umbral de
robustez, principalmente de la actividad catabólica del metabolismo central. Así por
ejemplo, para perturbaciones en los flujos de PHE, TYR y TRP, los flujos calculados
156
que más se ven afectados son los flujos, ν34, ν35, ν36 y ν45. El ν45 es el de mayor
incidencia positiva y corresponde a la reacción de transhidrogenación de NADPH a
NADH. Los flujos que le siguen en importancia son, ν34, que corresponden a los flujos
de formación de G6P a partir de F6P. El metabolito intermediario G6P fue propuesto
para estudio en S. coelicolor, por ser considerado un indicador muy sensible del inicio
de la limitación de nutrientes, antes de cesar el crecimiento microbiano [25]. El ν35,
relativo a la reacción de formación de R5P a partir de G6P, el cual corresponde a la
etapa de inicio de la ruta PP oxidativa, y el ν36, flujo de formación de X5P a partir de
R5P. Los coeficientes de sensibilidad para estos flujos son positivos, lo que implica que
un incremento en el flujo de precursores de PEP, genera un incremento global del flujo
en la ruta oxidativa PP. De otra parte, al analizar la sensibilidad para el flujo calculado
del producto AC, ν3, se observa que los coeficientes son negativos, lo que indica que
para alcanzar una mayor producción de AC se debe generar una reducción en el flujo de
formación de los AAs precursores de PEP. Es evidente entonces que un incremento en
el flujo de precursores de PEP promueve el crecimiento celular a partir del aumento en
el flujo de carbono a lo largo de la ruta oxidativa PP, y consecuentemente, se promueve
una disminución en el carbono disponible para la generación de producto; este aspecto
es consistente con lo reportado por otros autores en medio químicamente definido [9],
pero no se cumple en el medio complejo empleando S. peucetius, donde hay otros
factores, tales como interacción o efectos cruzados, ocasionados por la presencia de
varios AAs [29].
157
Perturbaciones en el flujo de precursores de OAA como los flujos de ASP, que a su vez
son precursores de ILEU y ASN, generan su mayor efecto en los flujos, ν34, ν35, ν36
y ν45. Al analizar la distribución del νPHE en un medio sin y con adición de ILEU, se
encontró que el νPHE se triplica por la presencia de ILE en el medio, indicando que la
presencia de ILE favorece la disponibilidad del metabolito PYR, el cual a su vez
favorece el νPEP. Algunos autores encontraron una correlación negativa con el νAC al
comparar la producción de AC en un medio basal con uno al que se le adiciona ILE [9];
esto concuerda con el análisis de sensibilidad aquí presentado.
Perturbaciones en el flujo medido de ASN muestran que los flujos calculados que más
se ven afectados son los flujos ν5, ν44 y ν45. Al incrementar el νASN, incrementa el
ν45, transhidrogenación (generación de NADH) y presenta una disminución en los ν5,
ν44 que corresponden a los flujos de SER y CYS respectivamente. También se observa
que con bajos flujos de ASN se estimula la producción de AC. Bushell et al, (2006)
realizaron estudios en continuo comparando un medio basal con uno al que se le
adiciona ASN y encontraron que aumenta el νx, pero el νAC se mantiene y la
concentración de AC como tal, disminuye en un 61% [9]; este efecto es observado
también en el análisis de sensibilidad (ver figura 4.2).
Para perturbaciones en los flujos medidos de VAL y ALA, GLC y O2, los flujos
calculados que más se ven afectados son los flujos ν34, ν35, ν36 y ν45, los mismos
flujos analizados para el caso de considerar el νPHE como medido. Para el flujo medido
158
VAL se tiene una sensibilidad negativa con respecto al flujo calculado ν3 (νAC), mientras
que para la ALA esta sensibilidad es positiva, lo que implica que para promover la
producción de AC se requiere una disminución en las velocidades del flujo de VAL y
un aumento de νALA. En trabajos realizados en donde se compara un medio basal con
otro al que se alimenta VAL, se encontró que el flujo de AC incrementó un 45%, lo cual
pudo deberse al favorecimiento en la disponibilidad de PYR precursor anabólico de la
síntesis de VAL, LEU y ALA [28]. Al comparar un medio basal con otro al que se
alimenta ARG o VAL resultó un incremento en la disponibilidad de glutamato [24],
pero ya se ha reportado que una mayor disponibilidad de este precursor (GLU) no
produce mejora en el flujo de AC [9]. La VAL favorece la biosíntesis de antibióticos
como cefalosporina y penicilina [30]. El favorecimiento del flujo de AC al aumentar el
flujo de ALA puede estar dado por la producción de aKG, intermediario en el ciclo de
Krebs, anabólico, más que por la ALA, que por sí sola es precursor de otros
antibióticos. La regulación de los iones amonio ejerce un control negativo sobre la
formación de antibióticos β-lactámicos en casi todos los microrganismos que los
producen [31]. La ALA también parece jugar un papel importante en la inhibición de la
actividad de la cefalosporina sintasa [3], hecho que favorecer la síntesis de AC.
Para perturbaciones en un incremento en el flujo medido de GLY, precursor de 3-
fosfoglicerato, el único flujo calculado que se ve afectado es el ν44, la disminución del
νGLY favorece el νCYS, mientras el aumento o disminución de este flujo no afecta el
νAC, según la estequiometria planteada. Se tiene además que con disminuciones en el
νGLC se puede lograr un aumento en los flujos en la vía PP y en el flujo de
159
transhidrogenación (generación de NADH). Por el contrario, al analizar la sensibilidad
para el flujo ν3 (νAC), se observa que es positivo, lo que implica que para promover la
producción de AC se debe estimular el consumo de GLC (aumentar νGLC). En una
investigación realizada, donde se varió la concentración de GLC para ver su efecto
sobre la producción de antibióticos, empleando cepas mutantes; los autores encontraron
que todas las especies crecían en ausencia de GLC, sin embargo, si éste estaba presente,
su crecimiento aumentaba al doble, aproximadamente. Por otro lado, investigaciones
donde se compararon cultivos continuos empleando un medio de alimentación con y
sin glicerol, encontraron que bajo limitación se ve afectada la vía anaplerótica,
minimizando el potencial hacia el ciclo de Krebs, e inhibiendo la síntesis de AC,
mientras que la producción de biomasa se obtuvo hasta en ausencia de GLC [8].
Por otro lado, un aumento en el flujo de consumo de O2 favorece el aumento en los
flujos de la vía PP y en el flujo de transhidrogenación (generación de NADH). En el
análisis de sensibilidad la velocidad de consumo de O2 no se encontró como uno de los
flujos medidos dominantes. En investigaciones realizadas con variación de O2,
encontraron que al aumentar la velocidad de producción de biomasa, aumentaba la
velocidad de consumo de oxígeno en el medio, pero la relación con la formación de
producto, AC, fue inversa, demostrando esto que aparte de la relación estequiométrica
hay otros factores como las características cinéticas que afectan el proceso metabólico
que en este primer análisis no se tienen en cuenta [9].
Para perturbaciones en el flujo medido de NH4., los flujos calculados que más se ven
afectados son los flujos ν27 y ν 31 correspondientes a los flujos de glutamato y de
160
urea, respectivamente. Un aumento en el νNH4 ocasiona una disminución en el νAC.
En algunos trabajos se ha estudiado el efecto de la concentración de amonio sobre la
producción de AC y se ha demostrado que este puede ser un represor del crecimiento a
ciertas concentraciones [24]. Los iones amonio ejercen un control negativo sobre la
formación de antibióticos en virtud de los organismos que lo producen [32].
Finalmente, para perturbaciones en el flujo medido de X, los flujos calculados que más
se ven afectados son los flujos ν34, ν35, ν36 y ν45. Se tiene que con un aumento en el
flujo de generación de X se puede lograr un aumento en los flujos en la vía PP y en el
flujo de transhidrogenación. Este flujo presenta una relación inversa con respecto al
flujo calculado del producto AC, ν3, lo cual está en concordancia con lo reportado [9];
igualmente, esta relación inversa se encontró en el caso de la producción del antibiótico
actinorrodina a partir de S. coelicolor [33].
En general, pueden considerarse válidas las conclusiones obtenidas usando una red
metabólica tan limitada en el número de reacciones, ya que los resultados obtenidos por
las simulaciones en su gran mayoría son confirmados con muchas de las observaciones
realizadas experimentalmente sin tener en cuenta este tipo de análisis apoyados en AFM.
4.3.3. Análisis de la distribución de flujos metabólicos en Sc.
El modelo estequiométrico propuesto, mostrado en la figura 4.2 y apéndice A1, presenta
un grupo de ecuaciones lineales independientes, matriz (60 x 47), cuyo grado de
libertad es de 13. Los valores medidos para el análisis de flujo metabólico se presentan
en la tabla 4.2; el sistema se resolvió empleando la ecuación (3) para determinar la
distribución de flujos de la red metabólica, al comparar procesos llevados a cabo a dos
161
D. La distribución de los flujos se presenta de manera resumida en la figura 4.5; se
incluyen en ella los compuestos de mayor importancia en la biosíntesis de AC, teniendo
en cuenta las reacciones de mayor incidencia en el sistema, de acuerdo con el análisis de
sensibilidad.
Para realizar el AFM se tuvieron en cuenta los resultados obtenidos en el análisis de
sensibilidad, incluyéndose como flujos medidos a los flujos de mayor incidencia en los
sistemas νPHE, νILE y νTYR, que están incluidos en la tabla 4.2, y cuyas reacciones
estequiométricas se presentan en la tabla 4.4.
Los flujos de mayor efecto sobre el modelo metabólico obtenidos en el AFM a las dos
D, corresponden a: i) fosforilación oxidativa, ν41, ii) flujo de transhidrogenación, ν45,
iii) flujo de pentosa fosfato oxidativa, ν35, iv) los flujos presentes en la ruta glicolítica
(EMP), ν33 y en la ruta del ciclo de Krebs, ν15, vi) flujo de biomasa, ν32 y vii) flujo
de AC, ν3.
Al incrementar la D de 0.02 a 0.03 h-1
, se observa un significativo incremento en los
flujos de la fosforilación oxidativa, vía PP y transhidrogenación. A menor D los tres
flujos funcionan en sentido inverso, y, en el caso de la vía PP, favorece la formación de
GAP, precursor del metabolismo de síntesis de AC.
Los resultados mostrados en la figura 4.4 indican que bajas D favorecen la velocidad de
formación AC (ν3) lo cual coincide con una reducción en la velocidad de formación de
biomasa (ν32). Este comportamiento es típico de la producción de antibióticos.
162
Tabla 4. 4. Reacciones que corresponden a los flujos medidos de mayor incidencia en el sistema, de acuerdo con el análisis de sensibilidad.
flujos a
analizar
Reacción estequiométrica Valores de
sensibilidad
referidos a AC
νAC 4 O2 + GAP + 3 aKG + ARG + 2 NADPH + ATP ==>AC +NH4 + UREA + 3 CO2
+ 3 SUC 1
νPHE 2 PEP + GLU+ NADPH + ATP+ E4P<==>PHE + CO2 + aKG -0.3273
νTYR 2 PEP + GLU+ NADPH + ATP+ E4P <==>TYR + CO2 + aKG + NADH -0.2727
νILE * PYR + GLU + 3NADPH + 2ATP+ASP <==>ILE + CO2 + aKG + NH4 -0.3273
νLYS* PYR + GLU+ 2NADPH + ATP + ASP + SUCCOA<==>LYS +CO2+aKG + SUC 0.2182
* Corresponde a las reacciones netas de ILE (suma de reacciones de biosíntesis de ASPSEMALD, THR e
ILE, equivalente a las reacciones 22, 24 y 26, respectivamente) y de LYS (suma de reacciones de
biosíntesis ASPSEMALD y LYS que corresponden a 22 y 25, respectivamente).
Al reducir la tasa de dilución, se observan también mayores valores en algunos flujos de
la vía glicolítica como son ν3PG, νPEP y νPYR que generan una mayor disponibilidad de
carbono en el MCC. El flujo anaplerótico (ν6), se encuentra muy activo en ambas D,
siendo éste el que logra promover la actividad metabólica en el ciclo de Krebs, más que
el ν11, que es la vía principal de flujo de carbono. En la figura 4.4 también se observa
que hay un gasto de PYR, a la D más alta, orientado hacia otros metabolitos como X,
LYS, ILE, LEU, ALA y VAL, lo que ocasiona una restricción en el flujo de carbono
hacia el ciclo de Krebs, dando lugar a una limitación en los precursores OAA y aKG.
163
GAP
PEP
PYR
ACCOA
TCA
aKG
OAA
ORN
ARGASP
GLU
CA
F6P
G6P R5P
RIB5P
X
PHE
TYR
ASPSEMALD
LYS
16129
16.2-11.9
GLC
NADPH
NADH
NADPH(NADH)
NADP(NAD) + ATP
3PG
SUCCOA
Figura 4. 4. Distribución de flujos metabólicos de la producción de AC a partir de Streptomyces clavuligerus (Sc). Los valores de los flujos correspondientes a la tasa de dilución 0.02 h-1 se nuestra en la parte superior de cada flujo, y los correspondientes a la tasa 0.03 h-1 en la parte inferior. Las siglas se presentan en la lista de abreviaciones.
El aKG es precursor de GLU el cual favorece la biosíntesis de ORN; los flujos en esta
dirección aumentan al aumentar la D, mientras que se observa un efecto inverso a
menores tasas de dilución. El rol de GAP, PEP y PYR, en la síntesis de AC ha sido
ampliamente discutido por diversos autores [9, 24]. Los altos flujos de estos
intermediarios del metabolismo glicolítico generan altos flujos de carbono en el ciclo de
Krebs, necesarios para la posterior formación ARG como precursor de AC.
164
Un aspecto difícil de establecer a la luz de los resultados, es la generación de ATP en
concentración suficiente para mantener activa la red metabólica completa [28]. En los
resultados mostrados en la figura 4.5, se observa una relación inversa entre el flujo de
ATP y el de AC, lo cual está de acuerdo con las reacciones establecidas en la tabla 4.3,
en donde el ATP debe estar disponible como sustrato mientras que el AC está disponible
como producto. Lo anterior es consistente con lo observado en otros trabajos, donde en
cultivos de S. lividans, se encontró una relación inversa entre la presencia de ATP
intracelular y la acumulación de antibióticos [34].
Los valores de los flujos obtenidos para ORN y AC, a las D evaluadas, fueron iguales
(figura 4.4) por lo que se puede inferir que el flujo de ORN, más que el de ARG, es
limitante para la biosíntesis de AC. Esto se observa claramente a la mayor D, en donde
a pesar de estar disponible el precursor de ARG y haber limitación del flujo de ORN, no
se vio favorecida la biosíntesis de AC. Ya en trabajos previos, otros autores habían
reportado que el simple aumento en los niveles de acumulación de ARG, no conducía
de manera directa a la mayor producción de AC [14, 24].
4.4. CONCLUSIONES
A partir de la combinación de un análisis de sensibilidad y de flujo metabólico, fue
posible establecer la incidencia de la velocidad de formación de diversos flujos de
aminoácidos y/o productos metabólicos, sobre la distribución de flujos metabólicos
dirigidos a la formación de ácido clavulánico, a partir de Streptomyces clavuligerus. El
sistema celular fue representado a partir de una modelo matemático que consideraba 60
reacciones bioquímicas, representativas de las capacidades metabólicas de Streptomyces
clavuligerus.
165
De manera general se observó que, para lograr altos rendimientos en la formación de
AC, se debe garantizar una buena disponibilidad de los flujos de los metabolitos
intermediarios, GAP, PEP, PYR, OAA y ORN. Para la red metabólica propuesta se
encontró que los flujos metabólicos medidos que más afectan el sistema celular son los
flujos de PHE, TYR, ILE. A su vez, los flujos calculados que más se ven afectados por
los flujos medidos corresponden a los flujos generadores de NADPH, tanto por la vía
oxidativa de la pentosa fosfato, como por la reacción de transhidrogenación de NADPH.
A partir del análisis de sensibilidad, también fue posible observar que a pesar de ser
algunos compuestos puntos nodales de mucha conectividad en la red metabólica
propuesta (OXA, aKG, GAP, ARG, ORN y ASP) no constituyen etapas
significativamente incidentes en la distribución del flujo de carbono, durante el proceso
de síntesis de AC. Finalmente, se encontró que el flujo de la ornitina, más que el flujo de
arginina, afecta directamente la biosíntesis de AC, dejando ver la importancia del control
del flujo de carbono a través del ciclo de la urea, en la biosíntesis de AC.
166
REFERENCIAS:
[1] P. Liras, J. Gómez-Escribano and I. Santamarta, ―Regulatory mechanisms controlling
antibiotic production in Streptomyces clavuligerus,‖ Journal of Industrial Microbiology,
pp. 667–76, 2008.
[2] L. Lorenzana, R. Pe, I. Santamarta, J. Martín and P. Liras, "Two Oligopeptide-Permease-
Encoding Genes in the Clavulanic Acid Cluster of Streptomyces clavuligerus are Essential
for production of the β-lactamase Inhibitor", Journal of Bacteriology, vol. 186, no. 11, pp.
3431-3438, 2004.
[3] J. Song, S. Jensen and K. Lee, "Clavulanic Acid Biosynthesis and Genetic Manipulation
for its Overproduction", Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 88, no. 3, pp. 659-
669, 2010.
[4] S. Lee, H. Kim, J. Park, J. Park and T. Kim, "Metabolic Engineering of Microorganisms:
General Strategies and Drug Production", Drug Discovery Today, vol. 14, no. 1-2, pp. 78-
88, 2009.
[5] Z. Zhihan and W. Yanping, "Application of Lat Gene Disruption to increase the
Clavulanic Acid production of Streptomyces clavuligerus", Journal of Molecular
Catalysis B: Enzymatic, vol. 43, no. 1-4, pp. 102-107, 2006.
[6] M. Cvijovic, S. Bordel and J. Nielsen, "Mathematical Models of Cell Factories: Moving
towards th Core of Industrial Biotechnology", Microbial Biotechnology, vol. 4, no. 5, pp.
572-584, 2011.
[7] M. Kohlstedt, J. Becker and C. Wittmann, "Metabolic flux and Beyond-Systems Biology
Understanding and Engineering of Microbial Metabolism", Applied Microbiology and
Biotechnology, vol. 88, pp. 1065-1075, 2010.
[8] S. Kirk, C. Avignone-Rossa and M. Bushell, ―Growth limiting substrate affects antibiotic
production and associated metabolic fluxes in Streptomyces clavuligerus,‖ Biotechnology
Letters, vol. 22, pp. 1803–1809, 2000.
[9] M. Bushell, S. Kirk, Z. H-J. and R. Avignone-Rosa, "Manipulation of the Physiology of
Clavulanic Acid Biosynthesis with the aid of Metabolic flux Analysis", Enzyme and
microbial technology, vol. 39, no. 1, pp. 149-157, 2006.
[10] E. Daae and A. Ison, ―Classification and Sensitivity Analysis of a Proposed Primary
Metabolic Reaction Network for Streptomyces Lividans,‖ Metabolic Engineering, vol. 1,
no. 2, pp. 153–65, 1999.
[11] J.-L. Barredo, "Microbial Processes and Products: Methods in biotechnology", New
Jersey: Humana press Inc., pp. 149-164, 2005.
[12] L. Malmberg, W.-S. Hu and D. H. Sherman, "Precursor flux control through targeted
chromosomal insertion of the Lysine E-aminotransferase (lat) gene in Cephamycin C
biosynthesis," Journal of Bacteriology, vol. 175, no. 21, pp. 6916-24, 1993.
[13] M. Foulstone and C. Reading, "Assay of Amoxicillin and Clavulanic Acid, the
Components of Augmentin, in Biological Fluids with High-performance Liquid
Chromatography", Antimicrobial agents and chemotherapy, vol. 22, no. 5, pp. 753-762,
1982.
[14] K. Chen, Y. Lin, J. Wu and S.-C. Hwang, "Enhancement of Clavulanic Acid Production in
Streptomyces clavuligerus with Ornithine Feeding," Enzyme and Microbial Technology,
no. 32, pp. 152-156, 2003a.
167
[15] Agilent Technologies, Agilent ZORBAX Eclipse AAA Instructions for Use, USA, 2008.
[16] P. S. Chen, T. Y. Toribara and H. Warner, "Microdetermination of Phosphorus",
Analytical chemistry, vol. 28(11), pp. 1756-1758, 1956.
[17] F. Garcia-Ochoa and E. Gomez, ―Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in
microbial processes: an overview,‖ Biotechnology advances, vol. 27, no. 2, pp. 153–76,
2009.
[18] A. M. Torres, J. C. Quintero y L. Atehortúa, "Determinación de la Velocidad Especifica
de Consumo de Oxígeno en Microorganismos Incluyendo el Tiempo de Respuesta del
Electrodo de Oxígeno", Revista Facultad de Ingeniería Universidad de Antioquia, nº 43,
pp. 33-41, 2008.
[19] I. Borodina, P. Krabben and J. Nielsen, "Genome-Scale Analysis of Streptomyces
coelicolor A3 (2) metabolism", Genome Research, vol. 3, no. 2, pp. 820-829, 2005.
[20] J. A. Roubos, ―Fed-Batch Clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ Ph
D Thesis, Technische Universiteit Delft, 2002.
[21] C. Avignone-Rosa, J. White, A. Kuiper, P. Postma, M. Bibb and M. Teixeira de Mattos,
"Carbon flux Distribution in Antibiotic-producing chemostat Cultures of Streptomyces
lividans", Metabolic engineering, vol. 4, no. 2, pp. 138-150, 2002.
[22] N. Gunnarsson, A. Eliasson and J. Nielsen, ―Control of fluxes Towards Antibiotics and the
Role of Primary Metabolism in Production of Antibiotics,‖ Adv. Biochem. Engin. And
Biotechnol., vol. 88, pp. 137– 178, 2004.
[23] P. Brian, Valentine, et al.―Evidence that arginine is a later metabolic intermediate than
ornithine in the biosynthesis of clavulanic acid by Streptomyces clavuligerus‖, J. Chem.
Soc., Chem. Commun, vol. 100, no. 3, pp. 439-47, 1993.
[24] P. R. Ives and M. E. Bushell, ―Manipulation of the physiology of clavulanic acid
production in Streptomyces clavuligerus,‖ Microbiology, vol. 143, pp. 3573–9, 1997.
[25] R. Mira de Orduña and U. Theobald, ―Intracellular Glucose 6-Phosphate Content in
Streptomyces Coelicolor Upon Environmental Changes in a defined Medium‖, Journal of
Biotechnology, vol. 77, no. 2-3, pp. 209-218, 2000.
[26] H. C. Lynch y Y. Yang, ―Degradation products of clavulanic acid promote clavulanic acid
production in cultures of Streptomyces clavuligerus”, Enzyme and Microbial Technology,
vol. 34, pp. 48-54, 23, 2004.
[27] D. Marques, R. Oliveira, P. Perego, A. Porto, Jr. Pessoa and A. Converti, ―Kinetic and
thermodynamic investigation on clavulanic acid formation and degradation during
glycerol fermentation by Streptomyces DAUFPE 3060‖, Enzyme and Microbial
Technology, vol. 45, no. 2, pp. 169-173, 2009.
[28] L. Domingues, J. Teodoro, C. Hokka, A. Badino and M. Araujo, "Optimization of the
Glycerol-to-Ornithine Molar Ratio in the Feed Medium for the Continuos Production of
Clavulanic Acid by Streptomyces clavuligerus", Biochemical Engineering Journal, no. 53,
pp. 7-11, 2010.
[29] K. Kiviharju, U. Moilanen and M. Leisola, ―A Chemostat Study of Streptomyces
peucetius var. caesius N47‖, Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 73, pp. 1267-
1274, 2007.
[30] M. Papagianni, "Recent Advances in Enginnering the Central Carbon Metabolism of
Industrially Important Bacteria", Microbial Cell Factories, vol. 11, no. 50, pp. 1-13, 2012.
168
[31] A. Demain and P. Vaishnav, ―Involvement of nitrogen-containing compounds in β-lactam
biosynthesis and its control,‖ Critical reviews in biotechnology, vol. 26, no. 2, pp. 67–82,
2006.
[32] S. Baños, R. Perez-Redondo, B. Koekman and P. Liras, ―Glycerol Utilization Gene
Cluster in Streptomyces clavuligerus”, Applied and Environmental Microbiology, vol. 75,
no. 9, pp. 2991-2995, 2009.
[33] C. Khannapho, H. Zhao, B. Bonde, A. Kierzek, C. Avignone-Rossa and M. Bushell.
―Selection of objective function in genome scale flux balance analysis for process feed
development in antibiotic production,‖ Metabolic Engineering, vol. 10, pp. 227– 233,
2008.
[34] L. Meng, M. Li, S. Yang, T. KIm, and J. Suh, ―Intracellular ATP Levels Affect Secondary
Metabolite Production in Streptomyces spp,‖ Biosci. Biotechnol. Biochem, vol. 75, no. 8,
pp. 1576–81, 2011.
169
CAPITULO 5
ANÁLISIS DE BALANCE DE FLUJOS (FBA) EN LA
PRODUCCIÓN DE AC EN Streptomyces clavuligerus.
El Análisis de Balances de flujos (FBA) es una herramienta que facilita el estudio de
procesos metabólicos permitiendo proponer estrategias para el mejoramiento de la
producción de metabolitos en biotecnología. Se empleó FBA para analizar la red
metabólica estequiométrica correspondiente a Sc, que tiene en cuenta las reacciones más
representativas que involucran catabolismo y anabolismo en la biosíntesis de AC a partir
de Sc. Se empleó la teoría de optimización para cuantificar todos los flujos y así poder
entender las limitaciones que tiene la célula impuestas por su estequiometria, además de
entender como influye el flujo a través de cada ruta en el comportamiento global del
metabolismo. La solución matemática del modelo metabólico se realizó aplicando
criterios de maximización de tres funciones objetivo (FOBJ): la velocidad específica de
crecimiento, los requerimientos de energía como ATP y formación de producto. Se
observó que la maximización de ATP, muestra la mejor aproximación del modelo
metabólico a valores experimentales. Posteriormente se empleó FBA con maximización
de ATP como objetivo celular para predecir bajo condiciones de limitación de nutrientes
(glicerol, amonio, oxígeno y fosfato) el efecto sobre las velocidades específicas de
crecimiento y de producción de AC específicas. Con los resultados obtenidos bajo las
limitaciones de nutrientes se puede inferir que las condiciones de limitación de amonio y
de fosfato son las que más favorecen la biosíntesis de AC, y mientras que los flujos
170
internos que más afectan la biosíntesis de AC por la limitación de los nutrientes
(concentraciones en el medio de C, N, P y O2 en cantidades menores a las requeridas por
la célula para su mantenimiento) son los flujos νORN y el flujo que alimenta al ciclo de
Krebs, ν12.
5.1. INTRODUCCIÓN
Una de las herramientas fundamentales en IM es el análisis de balances de flujos
(FBA), con el cual se logra determinar una DFM en una célula y su análisis permite
entender el comportamiento metabólico del microorganismo en función del interés
deseado para la síntesis de metabolitos, eliminación de subproductos entre otros. En los
últimos años se ha logrado un incremento en el desarrollo de la metodología FBA a nivel
experimental, con la incorporación de técnicas de análisis para detectar marcadores
isotópicos por GC-MS o NMR, y a nivel computacional como el uso de software para
analizar redes metabólicas extensas y algoritmos matemáticos mejorados [1-2]. Existen
pocos trabajos en los cuales se ha aplicado modelado metabólico con el objetivo de
incrementar la producción de AC [3- 4].
La descripción del metabolismo se representa por un modelo estequiométrico que puede
incluir varios cientos de reacciones. Estas reacciones implican una serie de restricciones
al comportamiento celular y cada una de ellas representa un flujo metabólico activo.
Es por esto que un entendimiento de la estequiometria es crucial para identificar y
caracterizar el comportamiento celular a nivel de la distribución de los flujos
metabólicos. Cuando la célula crece en un medio de cultivo definido, la metodología
FBA también permite evaluar cómo la adición o remoción de nutrientes puede afectar la
171
DFM y con esto, la síntesis de metabolitos de interés. La estrategia para realizar esta
predicción parte de la identificación de la red metabólica de la célula del
microorganismo de interés, la cual es normalmente muy grande y contiene más
metabolitos que reacciones estequiométricas. Para la determinación de los flujos
metabólicos del modelo metabólico propuesto se requiere la medición experimental de
algunos flujos para agotar los grados de libertad del sistema. Sin embargo a menudo esto
no es posible, con lo que el sistema se torna subdeterminado requiriendo para su
solución técnicas de optimización. Los métodos matemáticos de optimización se
emplean para maximizar o minimizar una FOBJ biológica, permitiendo así la obtención
de los flujos metabólicos del modelo. La identificación de un modelo metabólico
subdeterminado y su solución con estrategias de optimización, se conoce como análisis
de balance de flujo (FBA-flux Balance Analysis) [5].
Existen varios trabajos reportados en la literatura aplicando FBA tendientes a identificar
condiciones de alta producción de antibióticos con cepas del género Streptomyces. En
estos trabajos se han evaluado estrategias para la formulación de medios de cultivo,
resolviendo el modelo con funciones objetivo basadas en el crecimiento de la biomasa
bacteriana [6-7].
Se han realizado estudios con FBA para evaluar los efectos del cambio en la FC y en los
AAs (GLU, ASP, THR y ARG), que permitieron encontrar condiciones óptimas para
incrementar el rendimiento del producto de interés [3, 6, 8]. Estos estudios se basaron en
el empleo de una FOBJ basada en el crecimiento de la biomasa
La función objetivo a ser optimizada (maximizada o minimizada) en el sistema, el
modelo de reacciones estequiométricas que describen el metabolismo y la definición de
172
algunos flujos medidos, como el flujo de carbono y de producto de interés por ejemplo,
son restricciones que limitan el espacio de solución del sistema para encontrar un óptimo
[2, 6]. La FOBJ que más ha sido empleada para estudios con FBA es la tasa de
crecimiento específico, lo cual es consistente con la ventaja evolutiva de las especies de
rápido crecimiento. La función objetivo de biomasa se define como una ecuación
estequiométrica a partir de la las macromoléculas que la componen, generando también
una demanda metabólica de metabolitos para el crecimiento [2]. Otras FOBJ que han
sido consideradas para el análisis del metabolismo de Streptomyces por FBA han sido la
producción de ATP [6- 7] y la formación de producto de interés [9-10].
Este trabajo pretende evaluar el efecto de la variación de los flujos de las fuentes de C,
N, P, O2, sobre las velocidades de crecimiento de Sc y la producción de AC empleando
FBA con el fin de identificar condiciones de cultivo adecuadas aplicables a escala de
laboratorio. Para realizar el FBA, previamente se evaluaron tres FOBJ metabólicas
(producción de biomasa, de energía (ATP) y formación de AC) con el fin de seleccionar
la que permita alcanzar resultados más ajustados respecto de valores experimentales
tomados de la bibliografía.
5.2. METODOLOGÍA:
5.2.1. Planteamiento de la red metabólica.
El modelo metabólico estequiométrico empleado en el presente trabajo consistió de 100
reacciones que involucraban 92 metabolitos [11]. Estas reacciones se presentan en el
apéndice A1 y una representación sintética a modo de mapa metabólico se presenta en la
figura 5.1. Para este caso no se consideraron las reacciones de transporte de
aminoácidos.
173
SUC, UREA,C
O2,NH4
ADP
NADPH
ATP
AC
aKG, CO2NADPH,ATP
ACext
X
UREA
ORN
Fu
GLN
CARBP
ARGSUCC
ARG
CITRU
NADPHaKG,
GAP
PEP
PYR
ACCOA
TCA
aKGSUC
FUM
OAA
NH4
F6P
G6P R5P
X5P RiB5P
E4P
SED7P
NADH
VAL
ALA
CO2, NADH
CO2
LYS
NH4
CO2,NADPH
NADH
, NADPH
NADPH
GCL
GCL3P
MAL
3PG
CO2, NADH
HSER
HOMCYS
ME
THR
AKMETVAL
ASPSEMALD
2METBUTCOAILE
LLDIAPIMASN
UTP
PRO
NA
DP
H
GLN
CO2
SUCCOA
GLU
ASP
CO2
DHAP
CO2
NH4
LEU
3METBUTCOA
NAG1P
SER
GLY, METHF
CYS
aKI
aIPM 3METBUTCOA
GLU aKGGLU aKG
TRP
TYR
PHE
CHOR
GLN, PRPP
CO2, GAP,GLU,PYR
GLU aKG,CO2
GLU aKG,CO2
F16P
GLITEICH
CO2ISOPPGLITEICH
CDP,
CTP
E4P
HIS
PRPP
GLN
aKG
AICAR
GTP
dGTP
GLN,GLY,ASP\CO2
FUGLU
ASP, GLN
GLU
O2 CO
2
GCLext
PO4
NADHMK9H
97
98
84
3
4
9
10
90
23 11
12
1314
15
16
91
29
36
37
38
39
40
93
44
45
7
6
5
17
96
2
1
100
85
28
24
26
27
30
NADPPH
ATPEXT
CITOPLASMA
MEDIO EXTRACELULAR
Figura 5.1. Representación sintética de la red bioquímica empleada para modelado metabólico en Sc. vi indica el flujo de cada reacción y el subíndice i se refiere a una reacción específica .
174
El modelo tiene en consideración las reacciones del modelo planteado en el capítulo 4, a
excepción de la reacción de biomasa. La reacción de síntesis de biomasa empleada para FBA
es propia para Sc, y se cuenta con información acerca de su composición macromolecular.
Además se describen más reacciones de síntesis de aminoácidos, se detallan más las
reacciones involucradas en el ciclo de la urea y que conectan el ciclo de la urea con el ciclo de
Krebs. La gluconeogénesis involucra las reacciones en el MCC que corresponden a los flujos
5 a 10 y 90. La vía PP involucra los flujos 17 a 22 y el ciclo de Krebs involucra los
flujos 12 a 16 y 91 común en la mayoría de Streptomyces sp [12]. También se tuvo en
cuenta la biosíntesis de todos los precursores involucrados en la producción de biomasa de Sc
(85) [11-12], el ciclo de la urea (38 a 40 y 93) [3, 13] y biosíntesis de AC (84) [14].
A continuación se describen las reacciones metabólicas que fueron incorporadas al modelo y
que no están incluidas en el modelo propuesto en el capítulo 4.
Síntesis de biomasa: La reacción estequiométrica para la síntesis de biomasa de Sc se basó en
su contenido macromolecular el cual está representado en la siguiente ecuación
estequiométrica [10]:
= 0.075CARBO + 0.01 DNA + 0.065 GLYTEICH + 0.15 LIPID + 0.1 PEPGLY + 0.5 PROTEIN + 0.1 RNA
Teniendo en cuenta la reacción de síntesis de cada contenido macromolecular se genera la
ecuación de biosíntesis de biomasa representada por la reacción ν85 del Apéndice A1.
La composición elemental de la biomasa de Sc para los elementos C, H, N, O y P, está dada
por CH1.77N0.22O0.51P0.02 (PM 25.68 g mol-1
) [8].
Biosíntesis de aminoácidos: Los aminoácidos considerados en el modelo metabólico fueron
todos aquellos involucrados en la relación estequiométrica de biomasa [11], en el ciclo de la
175
urea [11] y en la biosíntesis AC [14] y en la vía de la PP [11,14].
Ciclo de la urea: Además de los metabolitos que se tuvieron en cuenta en el modelo del
capítulo 4, se tuvo en cuenta la síntesis de carbamoil fosfato y síntesis de sus precursores [11,
14].
Requerimientos de energía: Los cofactores moleculares ATP, NADH, NADPH, son
indispensables, debido a su importancia en la reacciones de abastecimiento energético y como
puntos de interconexión entre las reacciones del catabolismo y anabolismo. Las reacciones de
abastecimiento energético tienen como propósito, generar energía libre de Gibbs,
principalmente en forma de ATP, y generar poder reductor (o equivalentes de reducción),
principalmente en forma del cofactor NADPH, el cual es requerido en las reacciones
biosíntesis y para formación de metabolitos precursores en la biosíntesis de biomasa [15].
Para el modelo metabólico se consideraron además otras reacciones de biosíntesis de
nucleótidos y los componentes de energía de polimerización para construcción de bloques
(reacciones 24, 25, 63 a 71, 77, 79, 87 y 88) [11]. Un mayor detalle de estas
reacciones se puede encontrar en: (http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-2105-1-1-
s2.pdf).
5.2.2. Análisis de balances de flujos metabólicos (FBA).
La matriz estequiométrica empleada en este capítulo corresponde a las dimensiones (100 x
91), con 8 grados de libertad. Para lograr que el sistema quede determinado se deben medir
experimentalmente 8 flujos metabólicos. En este capítulo, se aborda un análisis del efecto de
algunos flujos de nutrientes esenciales para el microorganismo y por esto se requiere permitir
176
que el sistema tenga libertad para evaluar soluciones posibles a estas restricciones, y esto no es
posible cuando el sistema está completamente determinado. Para este caso se plantea entonces
un sistema subdeterminado con tres restricciones de flujos. El sistema se puede resolver por
programación lineal definiendo una función objetivo de optimización.
En la figura 2.13 se presenta la metodología empleada para llevar a cabo un FBA y en la
sección 2.5.3.3.1 se describen en detalle los procedimientos para los cálculos y los análisis.
El proceso va desde la recopilación de información para el modelado metabólico hasta el
desarrollo matemático necesario para hacer las respectivas simulaciones y analizar la
variación de los flujos en el interior de la célula como resultado de modificaciones en el
sistema.
5.2.3. Evaluación de la función objetivo (FOBJ):
Se evaluaron tres FOBJ maximizar flujo de ATP (FBA-ATP), maximizar flujo específico de
biomasa (FBA-μ) y maximizar flujo de AC (FBA-AC). El criterio para seleccionar estas
funciones objetivo se presentan en detalles en la sección 2.5.3.3.2. La maximización de
cualquiera de estas funciones objetivo es una buena consideración para la producción de
antibióticos de Streptomyces, ya que hay buena similitud entre los resultados experimentales
con los simulados.
De los resultados obtenidos de la modelación en el capítulo 4, se obtuvo que las los flujos de
mayor incidencia en el metabolismo celular involucran NADPH y ATP como sustratos, se
espera que al tener la célula suficiente energía en esta forma, se pueda favorecer la síntesis de
AC. La función objetivo biomasa es interesante por tener involucrada en su síntesis gran
cantidad de componentes del MCC y de reacciones de síntesis de macromoléculas y sus
precursores, como se observa en el mapa metabólico en la figura 5.1.
177
Los valores de los flujos medidos que se tuvieron en cuenta para resolver los problemas de
optimización fueron los reportados en la literatura a una D de 0.03 h-1
, en la tabla 5.1 se
presentan los flujos medidos experimentalmente, unos corresponden a los datos de entrada
para la simulación (flujos de entrada) , están descritos como ―Simulación de FBA‖ y los otros
flujos medidos se emplean para los cálculos de error descritos como ― Validación de FBA‖.
Además de los flujos medidos GLC, O2 y NH4, se tuvo como restricción la matriz
estequiométrica. Al medir el flujo de GLC, éste valor de flujo debe orientarse en su mayoría
a través del MCC hacia producto y al medir el flujo de O2, en el metabolismo queda
restringido el crecimiento microbiano. En todos los casos, los flujos medidos que se dejan
libres para ser calculados por FBA (flujos de CO2, AC, μ) sirvieron para calcular la medida
del error y probar el desempeño de cada función objetivo sin exceso de información,
permitiendo de esta manera obtener una buena representación matemática del objetivo celular
[16].
Tabla 5.1. Flujos medidos a una D de 0.03 h-1 [3]. Se emplearon para FBA considerando como función objetivo, maximizar biomasa, ATP o AC.
Flujos (mmol gx-1
h-1)
vGLC (ν97) νNH4 (ν96) νO2 (ν2) νCO2 (ν1) ν (ν85) (h-1
) νAC (ν98)
Simulación de FBA 4.89 1.16 12.81
Validación de FBA 8.86 0.03 0.0016
Evaluación del error en el ajuste del modelo:
Con el fin de evaluar cual función objetivo predice mejor el comportamiento celular en el
FBA, en cuanto a la exactitud de las predicciones obtenidas, se empleó el cálculo del error en
la predicción de la tasa específica de crecimiento y el error en la predicción de los flujos de
intercambio para los cuales se conocía el valor experimental.
178
El error en la predicción de la tasa específica de crecimiento, o error de biomasa, fue calculado
como la diferencia entre flujo de biomasa específico simulado con el experimental como se
muestra en la ecuación (1).
(1) 100*
medido
simulado -
medido = másico flujoError %
μ
El error en la predicción de los flujos de intercambio, o error flujos, consiste en la distancia
euclidiana entre los valores experimentales de los flujos de intercambio, y los valores
estimados por el FBA de estos flujos, como se indica en la ecuación (2). El cual corresponde a
la diferencia de los flujos medidos extracelulares con respecto al valor de dichos flujos
simulados.
(2) 100= flujos Error % *) (
medido
simuladomedido
Se consideran ambos tipos porque las unidades de las magnitudes comparadas en cada uno de
ellos son diferentes (la tasa específica de crecimiento se expresó en h-1
, mientras que los flujos
fueron representados en mmol gx-1
h-1
). En cualquier caso, se tuvieron en cuenta ambos tipos
de errores para el análisis de las diferentes funciones objetivo exploradas.
5.2.4. Evaluación del efecto del flujo de nutrientes sobre la producción de AC:
Una vez seleccionada la FOBJ para el modelo metabólico, se realizan nuevas simulaciones por
medio de FBA empleando este objetivo celular y considerando cambios en los valores de los
flujos de los nutrientes tal como se muestra en la tabla 5.2. Entre los flujos considerados para
este estudio están los flujos medidos descritos en la tabla 5.1, valores que corresponden a la
179
máxima expresión metabólica de formación de producto, que se genera a la menor D. Los
valores de estos flujos se tomaron como un punto dentro de los cálculos de los flujos
estudiados. Para establecer el rango de valores de dichos flujos se tuvo en cuenta el valor de
referencia obtenido en la bibliografía a menor tasa de dilución (0.03 h-1
) y algunos valores de
limitación de tipo estequiométrico. Para establecer el rango de valores se aplicó la regla áurea
para los segmentos equidistantes a tener en cuenta entre los valores a estudiar, excepto para O2
y el valor de fosfato de 0.06. Para el efecto de variación de flujo de fosfato se seleccionó 0.06
por ser un dato de referencia para Coelicolor [17]. El medio de cultivo empleado para los
cultivos en quimióstato está limitado en N y P [3]. Para la FOBJ estudiada, se emplearon como
restricciones al modelo, la matriz estequiométrica y los flujos como se describen en la tabla
5.2. Se buscó mantener la misma relación C/N, para poder encontrar el verdadero efecto de la
variación del flujo del nutriente a condiciones inferiores al requerimiento celular. Cuando se
consideró la variación en el flujo de GLC o NH4, se incluyó el flujo de O2 como restricción
del modelo. Los valores de la primera columna corresponden a los requerimientos celulares
en condiciones estequiométricas, los valores al lado derecho de la primera columna son
limitantes al requerimiento celular, lo que implica la limitación del nutriente.
Tabla 5.2. Condiciones de evaluación de los flujos de algunos sustratos a condiciones de limitación de nutrientes.
*Valores definidos en la tabla 5.1.
Los resultados de este estudio permiten predecir cómo se afecta la producción de AC y la
síntesis de biomasa, entre otros flujos, como una función del cambio en los flujos de algunos
Flujo fijo *
4.89 3.27 1.62 0.83 O2, NH4
1.58 1.16 0.34 0.16 GLC, O2
12.81 7 5 3 GLC, NH4
0.2885 0.1443 0.06 0.0024 GLC, NH4
O2
PO4
Valor de flujo para simulación Flujo de sustrato (mmol g-1
h-1)
GLC
NH4
180
nutrientes esenciales. Igualmente, los resultados permiten identificar cambios en flujos
intracelulares originados también por cambios en los flujos de estos nutrientes. Los resultados
de este análisis se muestran por medio de los flujos intracelulares representativos de cada una
de las vías principales del metabolismo celular como son vía de pentosa fosfato (17), vía de la
gluconeogénesis (10), vías del ciclo de Krebs (23 y 12), vía de biosíntesis de ASP (44), vía
de biosíntesis de GLU (29), vía de biosíntesis de GLN (30), vías del ciclo de la urea (36,
37 y 39) y vía de producción de AC (84).
5.3. RESULTADOS Y DISCUSION
5.3.1. Ajuste del modelo metabólico evaluando tres funciones objetivos.
En la tabla 5.3 se comparan los valores de los flujos predichos por el modelo metabólico para
cada FOBJ evaluada, con los valores de los flujos experimentales para diferentes metabolitos
extracelulares indicados en la tabla 5.1.
Tabla 5.3 Comparación entre flujos experimentales y simulados para diferentes funciones objetivos (tasa de dilución 0.03h-1).
De los resultados se observa que el menor % de error acumulado de los flujos está dado para
la FOBJ maximización de biomasa. Esto se puede explicar porque la reacción de producción
de biomasa es la que tiene la mayor conectividad y mayor sensibilidad dentro de la red
metabólica. De otro lado, se observa una producción nula de AC que está en correspondencia
con la maximización biológica de la biomasa, pues para que esto ocurra la célula deja de
simulados error (%) simulados error (%) simulados error (%)
νCO2 (ν1) 8.86 11.00 24 7.29 18 6.64 25
ν (ν85) 0.03 0.03 0 0.03 0 0 100
νAC (ν98) 0.0016 0.0196 1125 0 100 1.16 72400
Flujos medidosFBA-ATP FBA- FBA-AC
181
producir AC. Aunque el mejor ajuste se haya obtenido con la maximización de la biomasa, las
condiciones metabólicas proporcionadas por esta suposición, no son las adecuadas para la
producción de AC, ya que este metabolito se produce en condiciones de baja velocidad de
crecimiento, comportamiento propio del metabolismo secundario. De otro lado, la
optimización celular maximizando el flujo de producción de ATP, también muestra un ajuste
importante a los resultados experimentales de flujo de CO2 y biomasa. El flujo de biomasa
simulado con la función ATP, tiene el mismo valor que el obtenido con la función objetivo de
maximización de biomasa, lo cual es completamente consistente ya que la maximización de la
biomasa demanda un máximo de producción de ATP y la maximización de ATP genera una
máxima producción de biomasa, puesto que estos dos flujos son directamente proporcionales
entre sí. De otro lado, la función objetivo producción de ATP exhibe un valor de flujo de AC
mayor que cero y más cercano a los que debe dar experimentalmente, ya que solo es un orden
de magnitud superior al valor experimental. Otras simulaciones realizadas con esta misma
función objetivo, a tasas de dilución mayores que 0.03 h-1
(datos no mostrados) mostraron que
la producción de AC se reduce al aumentar la tasa de dilución, lo que también es consistente
con resultados experimentales observados para AC [3]. Para el objetivo celular de maximizar
AC, a pesar de no haber un error considerable en el flujo de CO2, se observa un valor de flujo
de AC tres órdenes de magnitud superior al valor experimental, por lo que para fines de
análisis, esta función no conduce a una aproximación deseable. De acuerdo con todas estas
consideraciones y a pesar de ser matemáticamente mejor modelo de predicción la
optimización de biomasa específica, no lo es desde un punto de vista biológico. Además,
algunos reportes para predecir comportamiento de Streptomyces sp, han mostrado este
objetivo celular como una buena aproximación al metabolismo secundario [6-7]. Por lo que la
182
PEP
PYR
ACCOA
aKGSUC
FU
OAA
UREA
ORN
ARG ASP
GLU
GLN
AC
10
12
23
MAL
GLC
GAP
3PG
37
30
29
44
CARBP
CITRU
pp
TCA
FOBJ de maximización de ATP es adoptada para continuar los estudios del efecto de los flujos
de nutrientes.
5.3.2. Efecto de los flujos de nutrientes (C, O2, N, P) sobre la producción
de biomasa y AC y sobre algunos flujos metabólicos intracelulares.
Los resultados del efecto de la variación de los flujos de carbono (GLC), nitrógeno (NH4),
oxígeno (O2) y fósforo (PO4-2
), se presentan en las figuras 5.3 a 5.6 respectivamente. El efecto
de estos cuatro flujos de nutrientes esenciales para Sc, se complementa con un análisis del
cambio en algunos de los flujos internos más representativos de la red metabólica. Estos flujos
internos se muestran esquemáticamente en la figura 5.2.
Figura 5.2. Representación simplificada de la red metabólica de Sc, incluyendo los flujos intracelulares más representativos.
183
El efecto de cambios en el flujo de la FC se muestra en la figura 5.3A. Allí se observa que al
disminuir el flujo de GLC a valores inferiores al requerimiento celular estequiométrico se
genera una menor producción de AC, mientras que la velocidad específica de crecimiento de
biomasa se mantiene constante. La reducción en la producción de AC con la reducción del
flujo de carbono es consistente con resultados obtenidos por otros autores en donde incluso a
flujos de consumo muy bajos de carbono, el flujo de AC llega a ser cero [13]. El resultado
observado durante la simulación en donde la velocidad específica de crecimiento se mantiene
constante al incrementar la limitación de carbono, es un fenómeno atípico dado que, tal como
lo explica la ecuación de Monod, la velocidad de biomasa debería disminuir conforme
disminuye la FC en condiciones de limitación. Este comportamiento atípico solo podría
explicarse si el rendimiento de biomasa en sustrato (YXS) se incrementa a medida que la fuente
de carbono disminuye, sin embargo no se encontraron estudios experimentales al respecto para
confrontar este resultado.
Con relación a los flujos internos, una reducción en el flujo de consumo de la FC (GLC),
ocasiona una disminución en la mayoría de estos flujos como se puede observar en la figura
5.4B. La reducción de la producción de AC, se genera por la disminución de sus flujos
precursores como 29, 36 y 39. También se observa un incremento en la actividad del ciclo de
Krebs lo que es consistente con la maximización de la función objetivo de producción de ATP
y lo cual genera una reducción en los flujos periféricos al ciclo como se observa en la
importante reducción del 29 de producción de glutamato. Dado los flujos 12, 17, 29 y 44,
son flujos precursores de metabolitos de biomasa, se observa que algunos de ellos se
incrementan y otros disminuyen durante la simulación de una reducción en el flujo de
184
carbono, con lo cual se puede esperar un equilibrio en la síntesis de biomasa que la conlleve a
permanecer constante
Figura 5.3. Efecto de la disminución del flujo de glicerol (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y de biomasa (gráfica A) y sobre los flujos internos (gráfica B), "In Silico" para Sc. Símbolos:
(○) flujo de ácido clavulánico (mmol g-1 h-1); (□) flujo de biomasa (h-1).
Los resultados del efecto la reducción del flujo de N (NH4) se presentan en la figura 5.4. En la
figura 5.4A, se observa que en el intervalo de flujos de nitrógeno entre 1.2 y 0.3, el flujo de
AC es constante y máximo con respecto a valores de flujo de nitrógeno superiores e inferiores
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
Cam
bio
en e
l f
lujo
(%
)
Flujos intracelulares
Gráfica B
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0 1 2 3 4 5 6
Flu
jo A
C
y
Flujo de glicerol
Gráfica A
185
Figura 5.4. Efecto de la disminución del flujo de amonio (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y de biomasa (gráfica A) y sobre los flujos internos (gráfica B), " In Silico" para S. clavuligerus.
Símbolos: (○) flujo de ácido clavulánico (mmol g-1 h-1); (□) flujo de biomasa (h-1).
a este rango. Algunos autores han observado que incrementando el flujo de amonio en
condiciones de exceso, el flujo de AC experimenta una disminución, por lo que se ha
explicado que el nitrógeno reprime su síntesis [13, 18]. Esta observación es consistente con los
resultados de las simulaciones de este trabajo. Es interesante resaltar el resultado de encontrar
también una disminución del flujo de AC a muy bajos valores de flujo de amonio, por debajo
de 0.3. Este comportamiento también se ha observado a nivel experimental en el cual, una alta
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Flu
jo A
C
y
Flujo de amonio
Gráfica A
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
Cam
bio
en e
l f
lujo
(%
)
Flujos intracelulares
*5
Gráfica B
500 %
186
limitación de nitrógeno genera que el microorganismo consuma AC como FN y se
experimente un flujo medido menor [19], sin embargo, aunque el modelo genera una
tendencia de acuerdo con la evidencia experimental, este resultado no es generado por una
representación adecuada del microorganismo in silico, dado que el modelo metabólico no
incluye reacciones de consumo de AC.
También se observa que el flujo de biomasa se reduce linealmente con el incremento de la
limitación de nitrógeno, que dentro del modelo se evidencia por la alta sensibilidad que tiene
el flujo de biomasa con respecto al de amonio. Igualmente este fenómeno se ha evidenciado
experimentalmente, en donde cultivos continuos de Sc alimentados bajo la misma tasa de
dilución pero reduciendo alternativamente el flujo de nitrógeno, han mostrado una reducción
significativa de la velocidad de producción de biomasa concomitante con el incremento de la
producción de AC [18].
En la figura 5.4B se observa que hay una reducción del flujo de AC con la reducción del flujo
de nitrógeno. Esto se debe a que en la figura se está tomando la reducción del flujo de
nitrógeno en todo el intervalo de estudio, sin embargo ya se ha dicho que existe un intervalo
donde el flujo de AC es máximo. La actividad del ciclo de Krebs disminuye en un 500% con
forme se limita el flujo de nitrógeno, lo que explica la caída en el flujo de biomasa en más del
87% en el mismo intervalo.
Los resultados del efecto de cambios en el flujo de oxígeno se presentan en la figura 5.5. En la
figura 5.5A, se observa que mientras se disminuye el flujo de consumo de oxígeno entre 13 y
7 no se observa ningún cambio los flujos de biomasa y de AC, sin embargo, una mayor
reducción en el flujo por debajo de 7, genera un aumento exponencial en el flujo de AC
187
Figura 5.5. Efecto de la disminución del flujo de oxígeno (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y de biomasa (gráfica A) y sobre los flujos internos (gráfica B), " In Silico" para S. clavuligerus.
Símbolos: (○) flujo de ácido clavulánico (mmol g-1 h-1); (□) flujo de biomasa (h-1).
conjuntamente con una disminución en el flujo de biomasa. Como se observa, el modelo
metabólico muestra un efecto significativo del flujo de oxígeno y permite identificar que una
manera plausible de incrementar la producción de AC es regular la transferencia de oxígeno en
el proceso fermentativo obligando a la célula a consumir oxígeno de acuerdo con la oferta del
mismo. Estas predicciones del modelo son consistentes con resultados experimentales toda vez
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 3 6 9 12 15
Flu
jo A
C
Flujo de oxígeno
Gráfica A
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
Cam
bio
en
el
flu
jo (
%)
Flujos intracelulares
6000%
Gráfica B
145%217%
3500%5000%
188
que al ser Sc un microorganismo aerobio, una mayor demanda de oxígeno corresponde a un
mayor aumento del flujo de biomasa y dado que el AC es un metabolito secundario,
incrementos en la velocidad de producción de biomasa reducen la producción de AC [3, 20].
En la figura 5.5B se observa que hay un aumento en el flujo de AC muy superior a los valores
reportados experimentalmente, lo que lleva a concluir que son valores poco realistas en cuanto
a la predicción deseada por un modelo. Este resultado es congruente con el aumento
igualmente poco realista de los flujos de los precursores 36, 37, 39. Sin embargo, estos
resultados sirven para analizar de forma cualitativa tendencias sobre los efectos esperados del
flujo de oxígeno. Por ejemplo, una reducción del flujo consumo de oxígeno incrementa la
producción de AC, como fuera mencionado antes. También reduce el flujo de producción de
biomasa el cual está relacionado con los flujos 17 y 30 que también disminuyen. Con
relación al incremento en la actividad en el ciclo de Krebs dada por 12, es difícil encontrar
una explicación coherente sobre este fenómeno debido a la disminución del flujo de consumo
de oxígeno. Al contrario, se esperaba que una reducción del flujo de oxígeno generara una
reducción en el flujo hacia el ciclo de Krebs por la limitación que se generaría en la etapa de la
fosforilación oxidativa impidiendo una adecuada regeneración del NAD+ para volver al ciclo
de Krebs y formación de ATP.
Estos resultados permiten recordar que el estudio realizado es basado en un modelo que ha
sido previamente validado con algunos datos experimentales pero que de ninguna forma puede
tomarse como una herramienta completamente elaborada y es válida para obtener primeras
aproximaciones al comportamiento fisiológico del microorganismo.
Los resultados del efecto del cambio en el flujo de fosfato sobre la producción de AC y flujo
de biomasa, se presentan en la figura 5.6. En la figura 5.6A, se observa que la disminución de
189
Figura 5.6. Efecto de la disminución del flujo de fosfato (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y de biomasa (gráfica A) y sobre los flujos internos (gráfica B)," In Silico" para S. clavuligerus.
Símbolos: (○) flujo de ácido clavulánico (mmol.g-1.h-1); (□) flujo de biomasa (h-1).
este flujo de consumo de la fuente de fósforo no genera efectos o cambios significativos en los
flujos de biomasa y AC. Al comparar estos valores de flujo de AC bajo limitación de fosfato
con respecto a los obtenidos por simulación con el modelo metabólico bajo limitación de otros
nutrientes (flujo de glicerol y flujo de amonio), se observa que los valores más altos de flujos
de AC se obtienen justamente bajo esta limitación, aumentando en un 500%. Este valor
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
Cam
bio
en
el
flu
jo
(%)
Flujos intracelulares
0.027
0.0275
0.028
0.095
0.096
0.097
0.098
0.099
0.100
0.101
0.102
0.0 0.1 0.2 0.3
µ
Flu
jo d
e A
C
Flujo de fosfato
Gráfico A
190
aunque elevado en comparación con los resultados de los flujos de glicerol y nitrógeno, es un
resultado realista ya que la evidencia experimental de diversos autores muestra que la
limitación de fósforo es el detonante principal para incrementarla producción de AC [13]. De
otro lado, bajo las consideraciones de alimentación de fósforo de la figura 5.6A, la biomasa no
se ve afectada.
Los flujos intracelulares muestran muy poca variación con relación al cambio en el flujo de
consumo de fosfato (figura 5.6B), que correlaciona con las mínimas variaciones predicas para
los flujos de AC y de biomasa.
Una reducción del flujo de fósforo, reduce la actividad del ciclo de Krebs y por consiguiente
se incrementa la actividad de las reacciones de bifurcación del ciclo como la de producción de
glutamato 29. Sin embargo, como ya se indicó, los cambios observados son mínimos.
5.4. CONCLUSIONES
El modelo metabólico propuesto para Sc permite realizar análisis preliminares sobre el
comportamiento celular, como para analizar los efectos de variables de interés como el flujo
de carbono, nitrógeno y fósforo sobre variables relevantes como el flujo de biomasa y de AC.
El modelo presenta las mejores predicciones empleando como función objetivo la
maximización de la producción de ATP con respecto a las demás funciones evaluadas,
producción de biomasa y producción de AC.
Bajo las consideraciones de limitación de nutrientes se puede establecer que bajo limitación de
glicerol y amonio, los flujos de AC se ven disminuidos, siendo crítica la limitación de C,
mientras que la limitación de NH4 en cierto rango se mantiene constante el valor de flujo de
AC obteniéndose el máximo valor permitido de acuerdo con las restricciones del modelo
metabólico.
191
Los flujos internos más relevantes a condiciones de limitación de carbono fueron el flujo de
GLU, flujo de la vía PP y el flujo de biosíntesis de GLN. Para el caso de limitación de
nitrógeno los flujos que tuvieron mayor disminución por la disminución del flujo de amonio
fueron los flujos en el ciclo de Krebs con el ν12 y el ν36 correspondientes a biosíntesis de
ORN.
Para los casos de disminución de oxígeno y fósforo se obtuvieron los valores máximos de
flujo de AC. El caso de disminución de flujo de oxígeno el modelo no explica el aumento del
AC. Se encontró que los flujos de mayor aumento fueron los flujos en el ciclo de Krebs y ν36
que corresponde al flujo de ORN. Bajo condiciones de limitación de fosfato, se ve favorecido
el flujo de GLU.
Para el ciclo de la urea, se consideraron los flujos precursores ν36 (flujo de ORN), ν37 (flujo
de CARBP) y ν39 (flujo de ARG-SUC), encontrando que el mayor efecto bajo las
condiciones de limitación de todos los nutrientes está dada por el cambio en el flujo de ORN
más que en los otros dos precursores del ciclo de la urea. Además de verse el mismo cambio
para los ν37 y ν39 para todas las condiciones de limitación.
En conclusión general, la comparación de los resultados experimentales con los resultados
obtenidos por FBA a diferentes funciones objetivo, resulta muy útil, ya que se puede evaluar
el potencial biológico de un cultivo particular. Entre los propósitos de este tipo de estudio está
el poder indicar algún objetivo o estrategia a seguir para la manipulación genética o
modificaciones en el proceso de producción, que permitan disminuir u optimizar los tiempos
destinados para obtener mayores valores en los flujos de AC.
192
REFERENCIAS:
[1] B. A. Boghigian, G. Seth, R. Kiss, and B. A. Pfeifer, ―Metabolic flux analysis and
pharmaceutical production,‖ Metabolic Engineering, vol. 12, pp. 81–95, 2010.
[2] M. Cvijovic, S. Bordel, and J. Nielsen, ―Mathematical models of cell factories: moving towards
the core of industrial biotechnology,‖ Microbial Biotechnology, vol. 4, no. 5, pp. 572-584,
2011.
[3] M. Bushell, S. Kirk, H. Zhao and C. Avignone-Rossa, ―Manipulation of the physiology of
clavulanic acid biosynthesis with the aid of metabolic flux analysis,‖ Enzyme and Microbial
Technology, vol. 39, no. 1, pp. 149–57, 2006.
[4] R. Li and C. Townsend, ―Rational strain improvement for enhanced clavulanic acid production
by genetic engineering of the glycolytic pathway in Streptomyces clavuligerus,‖ Metabolic
engineering, vol. 8, no. 3, pp. 240–52, 2006.
[5] J. M. Savinell and B. O. Palsson, ―Network analysis of intermediary metabolism using linear
optimization. I. Development of mathematical formalism.,‖ Journal of theoretical biology, vol.
154, no. 4, pp. 421–54, Feb. 1992.
[6] P. D’Huys, I. Lule, D. Vercammen, J. Anné, J. Van Impe and K. Bernaerts, ―Genome-scale
metabolic flux analysis of Streptomyces lividans growing on a complex medium,‖ Journal of
biotechnology, vol. 161, no. 1, pp. 1–13, 2012
[7] F. Naeimpoor and F. Mavituna, ―Metabolic flux Analysis in Streptomyces coelicolor under
Various Nutrient Limitations,‖ Metabolic Engineering, vol. 148, pp. 140-8, 2000.
[8] I. Borodina, C. Scholler, A. Eliasson, and J. Nielsen, ―Metabolic Network Analysis of
Streptomyces tenebrarius, a Streptomyces species with an Active Entner-Doudoroff Pathway,‖
Applied and Environmental Microbiology, vol. 71, no. 5, pp. 2294–2302, 2005.
[9] C. Khannapho, H. Zhao, B. Bonde, A. Kierzek, C. Avignone-Rossa, and M. Bushell,
―Selection of objective function in genome scale flux balance analysis for process feed
development in antibiotic production,‖ Metabolic Engineering, vol. 10, no. 5, pp. 227– 33,
2008.
[10] H. Kim, C. Smith, J. Micklefield and F. Mavituna, ―Metabolic flux analysis for calcium
dependent antibiotic (CDA) production in Streptomyces coelicolor.‖ Metabolic engineering,
vol. 6, no. 4, pp. 313–25, 2004.
[11] C. Avignone-Rossa, ―comunicación personal,‖ 2010.
[12] I. Borodina, P. Krabben, and J. Nielsen, ―Genome-scale analysis of Streptomyces coelicolor A3
(2) metabolism,‖ Genome Research, vol. 3, no. 2, pp. 820–829, 2005.
[13] S. Kirk, C. A. Avignone-Rossa, M. E. Bushell, ―Growth limiting substrate affects antibiotic
production and associated metabolic fluxes in Streptomyces clavuligerus,‖ Biotechnology
Letters, vol. 22, pp. 1803–1809, 2000.
[14] J. A. Roubos, ―Fed-Batch Clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus,‖ Ph D
Thesis, Technische Universiteit Delft, 2002.
[15] A. Nielsen, A. Stephanopoulos, J. Aristiduo, ―Metabolic Engineering: principles and
metodogies”. San. Diego, 1998, p. 723.
[16] C. García Sánchez, C. Vargas García and R. Torres Sáez, ―Predictive potential of flux balance
analysis of Saccharomyces cerevisiae using as optimization function combinations of cell
compartmental objectives,‖ PloS one, vol. 7, no. 8, 2012.
193
[17] M. Bushell, S. Sequeira, C. Khannapho, H. Zhao, K. Chater, M. Butler, a Kierzek, and C.
Avignone-Rossa, ―The use of genome scale metabolic flux variability analysis for process feed
formulation based on an investigation of the effects of the zwf mutation on antibiotic production
in Streptomyces coelicolor,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 39, no. 6, pp. 1347–1353,
2006.
[18] P. R. Ives and M. E. Bushell, ―Manipulation of the physiology of clavulanic acid production in
Streptomyces clavuligerus,‖ Microbiology, vol. 143, pp. 3573–9, 1997.
[19] H. C. Lynch y Y. Yang, ―Degradation products of clavulanic acid promote clavulanic acid
production in cultures of Streptomyces clavuligerus”, Enzyme and Microbial Technology, vol.
34, pp. 48-54, 23, 2004.
[20] J. Rosa, A. Baptista Neto, C. Hokka and A. Badino, ―Influence of dissolve oxygen and shear
conditions on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus.,‖ Bioprocess and
biosystems engineering, vol. 27, no. 2, pp. 99–104, 2005.
194
APÉNDICES
CAPÍTULO 4.
APÉNDICE A. Modelo de reacciones metabólicas para producir AC a partir de Sc.
Flujos Reacciones
ν1 GLC ==> GAP + NADH
ν 2 GAP <==> 3PG + NADH + ATP
ν 3 4 O2 + GAP + 3 aKG + ARG + 2 NADPH + ATP ==> NH4 + UREA + 3 CO2 + AC + 3 SUC
ν 4 3PG <==> PEP
ν 5 3PG + GLU ==> aKG + NADH + SER
ν 6 CO2 + PEP + ATP <==> OAA
ν 7 2 PEP + GLU + E4P + NADPH + ATP <==> CO2 + PHE + aKG
ν8 2 PEP + GLU + E4P + NADPH + ATP <==> CO2 + TYR + aKG + NADH
ν 9 GLN + 2 PEP + E4P + NADPH + ATP + SER ==> CO2 + TRP + GAP + PYR + GLU
ν 10 PEP <==> PYR + ATP
ν 11 PYR <==> CO2 + ACCOA + NADH
ν 12 2 PYR + GLU + NADPH <==> CO2 + VAL+ aKG
ν 13 PYR + GLU <==> ALA + aKG
ν14 2 PYR + ACCOA + GLU + NADPH ==> 2 CO2 + LEU + aKG + NADH
ν 15 ACCOA + OXA <==> CO2 + aKG + NADPH
ν 16 SUCCOA <==> SUC + ATP
ν 17 SUC<==> FUM
ν 18 FUM<==> OAA + NADH
ν 19 OAA + GLU <==> aKG + ASP
ν 20 ASP + ORN + CARBMP + ATP <==> FUM + ARG
ν 21 GLN + ASP + ATP ==>ASN + GLU
ν 22 ASP + NADPH + ATP <==> ASPSEMALD
ν 23 ASPSEMALD + ATP + CYS + SUCCOA<==> NH4 + MET + PYR + SUC
ν 24 ASPSEMALD + NADPH + ATP <==>THR
ν 25 PYR + A ASPSEMALD + GLU + NADPH + SUCCOA ==> CO2 + LYS + aKG + SUC
ν 26 PYR + THR + GLU + NADPH <==> NH4 + CO2 + ILE + aKG
ν 27 NH4 + aKG + NADPH <==> GLU
ν 28 ACCOA + 2 GLU + NADPH + ATP <==> aKG + ORN + ACE
ν 30 NH4 + GLU + ATP <==> GLN
ν 31 ARG <==> UREA + ORN
ν 32 0.2 NH4 + 0.065 LEU + 0.05 LYS + 0.031 GLN + 0.019 MET + 0.01 GAP + 0.039 PEP + 0.094 PYR
195
0.165 ACCOA + 0.075 aKG + 0.11 OAA + 0.024 THR + 0.031 GLU + 0.011 F6P + 0.03 G6P
+ 0.113 RIB5P + 0.036 E4P + 0.343 NADPH + 0.973 ATP ==> 0.036 CO2 + X + 0.078 NADH
ν33 2 GAP <==> F6P + ATP
ν 34 F6P <==> G6P
ν 35 G6P <==> CO2 + R5P + 2 NADPH
ν 36 R5P <==> X5P
ν 37 R5P <==> RIB5P
ν 39 X5P + E4P <==> GAP + F6P
ν 40 GAP + SED7P <==> F6P + E4P
ν 41 O2 + 2 NADPH <==> 4 ATP
ν 29 GLU + 2 NADPH + ATP ==>PRO
ν 38 X5P + RIB5P <==> GAP + SED7P
ν 42 aKG <==> CO2 + SUCCOA
ν 44 ATP + SER<==> CYS
ν 45 NADPH <==> NADH
ν 43 ATP + SER<==>GLY
ν 46 NH4-up ==> NH4
ν 47 GLC-up ==> GLC
ν 48 PHEexit<==> PHE
ν 49 TYRexit<==> TYR
ν 50 Xexit ==> X
ν 51 O2_up ==> O2
ν 52 ASNexit ==> ASN
ν 53 TRP exit ==> TRP
ν 54 VALexit ==> VAL
ν 55 ILEexit<==> ILE
ν 56 PROexit ==> PRO
ν 57 GLYexit<==> GLY
ν 58 ACexit ==> AC
ν 59 ALAexit<==> ALA
ν 60 CYS exit <==> CYS
196
Fluj
os
νcA
LA
AC
CY
SL
YS
OR
NA
RG
ASP
SER
ME
TT
HR
LE
UG
LU
GL
NO
AA
PYR
aKG
GA
PG
6P
ν 3PG
(ν2)
-0.4
727
-8.6
667
-0.0
273
2.10
911.
0364
1.03
64-0
.018
2-0
.027
30.
6455
1.09
09-0
.830
7-0
.009
1-0
.009
1-0
.518
2-0
.027
3-0
.509
11.
5545
3.08
18
ν CA
(ν3)
0.05
451.
0000
-0.0
545
0.21
820.
0727
0.07
27-0
.036
4-0
.054
00.
2909
0.18
18-0
.098
4-0
.018
2-0
.018
2-0
.036
4-0
.054
5-0
.018
20.
1091
0.16
36
ν PEP
(ν4)
0.70
9113
.000
0-0
.209
10.
8364
-1.0
545
-1.0
545
-1.4
727
-0.2
091
1.28
180.
3636
0.04
38-1
.736
4-1
.736
4-1
.972
7-1
.209
1-2
.236
40.
9182
1.62
73
ν SER
(ν5)
-1.1
818
-21.
6667
0.18
181.
2727
2.09
092.
0909
1.45
450.
1818
-0.6
364
0.72
73-0
.874
51.
7273
1.72
731.
4545
1.18
181.
7273
0.63
641.
4545
ν OA
A (ν
6)0.
0545
1.00
00-0
.054
5-0
.781
8-0
.927
3-0
.927
3-1
.036
4-0
.054
5-0
.709
1-0
.818
20.
2416
-1.0
182
-1.0
182
-1.0
364
-0.0
545
-1.0
182
0.10
910.
1636
ν PY
R (ν
10)
0.65
4512
.000
0-0
.154
51.
6182
-0.1
273
-0.1
273
-0.4
364
-0.1
545
1.99
091.
1818
-0.2
367
-0.7
182
-0.7
182
-0.9
364
-1.1
545
-1.2
182
0.80
911.
4636
ν AC
CO
A (ν
11)
-0.3
455
-6.3
333
-0.1
545
2.61
82-0
.127
3-0
.127
3-0
.436
4-0
.154
50.
9909
1.18
18-0
.491
7-0
.718
2-0
.718
2-0
.936
4-0
.154
5-1
.218
20.
8091
1.46
36
ν ALA
(ν13
)1.
0000
18.3
333
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
ν LEU
(ν14
)0.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0650
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
00
ν aK
G (ν
15)
-0.4
000
-7.3
333
-0.1
000
2.40
000.
8000
0.80
00-0
.400
0-0
.100
00.
7000
1.00
00-0
.623
3-0
.700
0-0
.700
0-0
.900
0-0
.100
0-1
.200
00.
7000
1.30
00
ν SU
C (ν
16)
-0.6
182
-11.
3333
0.11
822.
5273
1.50
911.
5091
-0.2
545
0.11
820.
5364
0.27
27-0
.435
60.
3727
0.37
27-0
.754
50.
1182
-0.1
273
0.26
360.
6455
ν FU
M (ν
17)
-0.4
545
-8.3
333
-0.0
455
2.18
181.
7273
1.72
73-0
.363
6-0
.045
50.
4091
0.81
82-0
.661
90.
3182
0.31
82-0
.863
6-0
.045
5-0
.181
80.
5909
1.13
64
ν OA
A(T
CA
) (ν 1
8)-0
.327
3-6
.000
00.
8273
2.69
091.
5636
1.56
36-0
.781
8-0
.172
70.
7545
0.90
91-0
.170
9-0
.390
90.
6091
-2.2
818
-1.1
727
-1.8
909
-0.1
545
-0.4
818
ν ASP
(ν19
)0.
1273
2.33
330.
8727
-0.4
909
-0.1
636
-0.1
636
-1.4
182
-0.1
273
-0.6
545
-0.9
091
0.58
40-0
.709
10.
2909
-1.4
182
-1.1
273
-1.7
091
-0.7
455
-1.6
182
ν AR
G (ν
20)
0.12
732.
3333
0.87
270.
5091
-0.1
636
-0.1
636
-0.4
182
-0.1
273
0.34
550.
0909
0.49
10-0
.709
10.
2909
-1.4
182
-1.1
273
-1.7
091
-0.7
455
-1.6
182
ν ASP
SEM
ALD
(ν22
)0.
0000
0.00
000.
0000
-1.0
000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
-1.0
000
-1.0
000
0.09
300.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
ν MET
(ν23
)0.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
00-1
.000
00.
0000
0.01
900.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
ν TH
R (ν
24)
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
00-1
.000
00.
0240
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
00
ν LY
S (ν
25)
0.00
000.
0000
0.00
00-1
.000
00.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0500
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
00
ν GLU
(ν27
)0.
0545
1.00
000.
9455
0.21
820.
0727
0.07
27-0
.036
4-0
.054
5-0
.709
10.
1818
-0.3
104
-0.0
182
0.98
18-0
.036
4-0
.054
5-0
.018
20.
1091
0.16
36
ν OR
N (ν
28)
0.05
451.
0000
-0.0
545
0.21
82-0
.927
3-0
.927
3-0
.036
4-0
.054
50.
2909
0.18
18-0
.098
4-0
.018
2-0
.018
2-0
.036
4-0
.054
5-0
.018
20.
1091
0.16
36
ν GLN
(ν30
)0.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0310
0.00
00-1
.000
00.
0000
0.00
000.
0000
0.00
000.
0000
ν UR
EA (ν
31)
0.07
271.
3333
0.92
730.
2909
-0.2
364
0.76
36-0
.381
8-0
.072
70.
0545
-0.0
909
0.58
94-0
.690
90.
3091
-1.3
818
-1.0
727
-1.6
909
-0.8
545
-1.7
818
ν GA
P-F6
P (ν
33)
0.41
827.
6667
0.08
18-2
.327
3-1
.109
1-1
.109
10.
0545
0.08
18-0
.936
4-1
.272
70.
7292
0.02
730.
0273
0.55
450.
0818
0.52
73-0
.663
6-2
.245
5
ν G6P
(ν34
)1.
2545
23.0
000
0.24
55-6
.981
8-3
.327
3-3
.327
30.
1636
0.24
55-2
.809
1-3
.818
21.
8325
0.08
180.
0818
1.66
360.
2455
1.58
18-1
.990
9-4
.736
4
ν R5P
(ν35
)1.
2545
23.0
000
0.24
55-6
.981
8-3
.327
3-3
.327
30.
1636
0.24
55-2
.809
1-3
.818
21.
8025
0.08
180.
0818
1.66
360.
2455
1.58
18-1
.990
9-3
.736
4
ν X5P
(ν36
)0.
8364
15.3
333
0.16
36-4
.654
5-2
.218
2-2
.218
20.
1091
0.16
36-1
.872
7-2
.545
51.
1143
0.05
450.
0545
1.10
910.
1636
1.05
45-1
.327
3-2
.490
9
ν RIB
5P (ν
37)
0.41
827.
6667
0.08
18-2
.327
3-1
.109
1-1
.109
10.
0545
0.08
18-0
.936
4-1
.272
70.
6882
0.02
730.
0273
0.55
450.
0818
0.52
73-0
.663
6-1
.245
5
ν X5P
-F6P
(ν39
)0.
4182
7.66
670.
0818
-2.3
273
-1.1
091
-1.1
091
0.05
450.
0818
-0.9
364
-1.2
727
0.53
920.
0273
0.02
730.
5545
0.08
180.
5273
-0.6
636
-1.2
455
ν E4P
(ν40
)0.
4182
7.66
670.
0818
-2.3
273
-1.1
091
-1.1
091
0.05
450.
0818
-0.9
364
-1.2
727
0.57
520.
0273
0.02
730.
5545
0.08
180.
5273
-0.6
636
-1.2
455
ν AT
P (ν
41)
-0.2
182
-4.0
000
0.21
82-0
.872
7-0
.290
9-0
.290
90.
1455
0.21
82-1
.163
6-0
.727
30.
3937
0.07
270.
0727
0.14
550.
2182
0.07
27-0
.436
4-0
.654
5
ν SED
7P (ν
38)
0.41
827.
6667
0.08
18-2
.327
3-1
.109
1-1
.109
10.
0545
0.08
18-0
.936
4-1
.272
70.
5752
0.02
730.
0273
0.55
450.
0818
0.52
73-0
.663
6-1
.245
5
ν SU
CC
OA
(ν42
)-0
.618
2-1
1.33
330.
1182
1.52
731.
5091
1.50
91-0
.254
50.
1182
-0.4
636
0.27
27-0
.366
60.
3727
0.37
27-0
.754
50.
1182
-0.1
273
0.26
360.
6455
ν CY
S (ν
44)
-1.1
818
-21.
6667
0.00
001.
2727
2.09
092.
0909
1.45
451.
1818
-0.6
364
0.72
73-0
.874
51.
7273
1.72
731.
4545
1.18
181.
7273
0.63
641.
4545
ν NA
DH
(ν45
)2.
3273
42.6
667
-0.8
273
-8.6
909
-4.5
636
-4.5
636
-0.2
182
0.17
27-1
.754
5-3
.909
12.
2249
-0.6
091
-1.6
091
2.28
180.
1727
1.89
09-2
.845
5-5
.518
2
Acu
mul
ado
4.06
7077
.645
9502
2.24
0016
.487
39.
0510
9.08
013.
6700
1.81
556.
4427
8.45
64.
531
4.11
544.
4853
6.37
983.
5195
6.56
405.
3715
10.9
575
NC
:13
8.00
370.
0016
7.00
89.0
088
.53
87.8
013
1.00
104.
0089
.64
135.
6086
.40
132.
0094
.50
131.
9513
2.00
133.
5012
4.27
104.
95
Sens
ibili
dad
de fl
ujos
med
idos
APÉNDICE B. Análisis de sensibilidad y de flujos metabólicos
Tabla B1. Análisis de sensibilidad de los flujos considerados como medidos.
* El acumulado corresponde a la sumatoria de la sensibilidad para cada flujo medido, NC: número de condición de la
matriz con los flujos a calcular.
197
Tabla B2. Análisis de flujos metabólicos, a dos tasas de dilución, en la producción de AC a partir de Sc, (flujos normalizados respecto a glicerol).
Análisis de flujos metabólicos
Flujos D:0.03(h-1
) D:0.02(h-1
)
𝑣1 𝑣𝐺𝐿𝐶−𝑈𝑃 100 195.7694
𝑣2 𝑣3𝑃𝐺 -115.1844 164.5832
𝑣3 𝑣𝐴𝐶 -11.9008 16.1787
𝑣4 𝑣𝑃𝐸𝑃 144.9166 289.4033
𝑣5 𝑣𝑆𝐸𝑅 -260.101 -124.8201
𝑣6 𝑣𝑂𝐴𝐴 101.0783 91.5762
𝑣7 𝑣𝑃𝐻𝐸 0.013 0.0151
𝑣8 𝑣𝑇𝑌𝑅 0.0205 0.0062
𝑣9 𝑣𝑇𝑅𝑃 0 0.0189
𝑣10 𝑣𝑃𝑌𝑅 30.8155 189.1095
𝑣11 𝑣𝐴𝐶𝐶𝑂𝐴 -54.0055 132.546
𝑣12 𝑣𝑉𝐴𝐿 0.0233 0.0237
𝑣13 𝑣𝐴𝐿𝐴 0.0483 0.0406
𝑣14 𝑣𝐿𝐸𝑈 21.593 14.3952
𝑣15 𝑣𝛼𝐾𝐺 -118.5107 65.4304
𝑣16 𝑣𝑆𝑈𝐶𝐶 -139.3567 -44.9138
𝑣17 𝑣𝐹𝑈 -152.1372 18.9034
𝑣18 𝑣𝑂𝐴𝐴(𝑇𝐶𝐴) -23.2021 34.7202
𝑣19 𝑣𝐴𝑆𝑃 159.8449 36.5049
𝑣20 𝑣𝐴𝑅𝐺 128.9351 15.8168
𝑣21 𝑣𝐴𝑆𝑁 0.0001 0.071
𝑣22 𝑣𝐴𝑆𝑃𝑆𝐸𝑀𝐴𝐿𝐷 30.9097 20.6171
𝑣23 𝑣𝑀𝐸𝑇 6.3118 4.2078
𝑣24 𝑣𝑇𝐻𝑅 7.9879 5.336
𝑣25 𝑣𝐿𝑌𝑆 16.61 11.0733
𝑣26 𝑣𝐼𝐿𝐸𝑈 0.0151 0.0208
𝑣27 𝑣𝐺𝐿𝑈 -65.1222 -16.4445
𝑣28 𝑣𝑂𝑅𝑁 -11.9008 16.1787
𝑣30 𝑣𝐺𝐿𝑁 10.2983 6.9553
𝑣31 𝑣𝑈𝑅𝐸𝐴 140.8359 -0.3619
𝑣32 𝑣𝑋 332.2 221.4651
𝑣33 𝑣𝐺𝐴𝑃−𝐹6𝑃 160.6117 -29.3068
𝑣34 𝑣𝐺6𝑃 363.8706 -166.5808
𝑣35 𝑣𝑅5𝑃 353.9046 -173.2247
𝑣36 𝑣𝑋5𝑃 206.9131 -134.8378
𝑣37 𝑣𝑅𝐼𝐵5𝑃 146.9915 -38.3869
𝑣39 𝑣𝑋5𝑃−𝐹6𝑃 97.4602 -71.4254
𝑣40 𝑣𝐸4𝑃 109.4529 -63.4125
𝑣41 𝑣𝑜2−𝑈𝑃 97.0031 -2.9601
𝑣29 𝑣𝑃𝑅𝑂 0.0159 0.0076
𝑣38 𝑣𝑆𝐸𝐷7𝑃 109.4529 -63.4125
𝑣42 𝑣𝑆𝑈𝐶𝐶𝑂𝐴 -116.4349 -29.6327
198
CAPÍTULO 5.
APENDICE A. Modelo de reacciones metabólicas para producir ácido clavulánico a partir de Sc.
1: CO2_EX : CO2 <==>
2: O2_UP : <==> O2
3: GCL_GCL3P : ATP + GCL <==> GCL3P + ADP
4: GCL3P_DHAP : GCL3P <==> DHAP + MK-9H
5: F6P_G6P : F6P <==> G6P
6: F16P_F6P : F16P <==> ATP + F6P
7: DHAP+GAP_F16P : DHAP + GAP <==> F16P
8: GAP_DHAP : GAP <==> DHAP
9: GAP_3PG : GAP + PO4 + NAD <==> 3PG + ATP + NADH
10: 3PG_PEP : 3PG <==> PEP
11: PYR_ACCOA : PYR + NAD <==> ACCOA + CO2 + NADH
12: ACCOA_aKG : ACCOA + OAA <==> aKG + CO2 + NADPH
13: aKG_SUCCOA : aKG <==> CO2 + SUCCOA
14: SUCCOA_SUC : SUCCOA + ADP + PO4 <==> ATP + SUC
15: SUC_FUM :SUC <==> FUM + MK-9H
16: FUM_MAL : FUM <==> MAL
17: G6P_R5P : G6P + 2 NADP <==> CO2 + 2 NADPH + R5P
18: R5P_RIB5P : R5P <==> RIB5P
19: R5P_X5P : R5P <==> X5P
20: E4P+X5P_F6P+GAP : E4P + X5P <==> F6P + GAP
21: GAP+SED7P_E4P+F6P : GAP + SED7P <==> E4P + F6P
22: RIB5P+X5P_GAP+SED7P : RIB5P + X5P <==> GAP + SED7P
23: ANAPLEROTIC : CO2 + PEP <==> OAA
24: NADH_MK-9H : NADH <==> MK-9H
25: METHF_NADPH : METHF <==> NADPH
26: ATP_DISSIPATION : ATP <==>
27: OX_PHOSPHORYLATION : 2 NADH + O2 <==> 4 ATP
28: TRANSHYDROGENASE : NADPH <==> NADH
29: GLU_SYNTH : aKG + NADPH + NH4 <==> GLU + NADP
30: GLN_SYNTH : ATP + GLU + NH4 <==> GLN + ADP
31: GLN_GLU : aKG + GLN + NADPH <==> 2 GLU + NADP
32: CHOR_SYNTH : ATP + E4P + NADPH + 2 PEP <==> CHOR + ADP + 4 PO4 + NADP
33: PHE_SYNTH : CHOR + GLU <==> aKG + CO2 + PHE
34: TYR_SYNTH : CHOR + GLU + NAD <==> aKG + CO2 + NADH + TYR
35: PRO_SYNTH : ATP + GLU + 2 NADPH <==> PRO + ADP + PO4 + 2 NADP
36: ORN_SYNTH : ATP + 2 GLU + NADPH <==> aKG + ORN + ADP + PO4 + NADP
37: CARBP_SYNTH : 2 ATP + CO2 + GLN <==> CARBP + GLU + ADP + PO4
38: CITRU_SYNTH : CARBP + ORN <==> CITRU + PO4
199
39: ARG-SUC_SYNTH : ASP + ATP + CITRU <==> ARG-SUC
40: ARG_SYNTH : ARG-SUC <==> ARG + FUM
41: SER_SYNTH : 3PG + GLU <==> aKG + NADH + SER + PO4
42: GLY_SYNTH : SER <==> GLY + METHF
43: CYS_SYNTH : ATP + SER <==> CYS + ADP + PO4
44: ASP_SYNTH : GLU + OAA <==> aKG + ASP
45: ASPSEMALD_SYNTH : ASP + ATP + NADPH <==> ASPSEMALD + ADP + PO4
46: HSER_SYNTH : ASPSEMALD + NADPH <==> HSER
47: THR_SYNTH : ATP + HSER <==> THR + ADP + PO4
48: HOMCYS_SYNTH1 : CYS + HSER + SUCCOA <==> HOMCYS + NH4 + PYR + SUC
49: HOMCYS_SYNTH2 : HSER + SUCCOA <==> HOMCYS
50: MET_SYNTH : HOMCYS <==> MET
51: aKMETVAL_SYNTH : NADPH + PYR + THR <==> aKMETVAL + CO2 + NH4
52: ILE_SYNTH : aKMETVAL + GLU <==> aKG + ILE
53: ALA_SYNTH : GLU + PYR <==> aKG + ALA
54: PYR_aKI : NADPH + 2 PYR <==> aKI + CO2
55: VAL_SYNTH : aKI + GLU <==> aKG + VAL
56: LEU_SYNTH : ACCOA + aKI + GLU <==> aKG + LEU + NADH
57: RIB5P_PRPP : ATP + RIB5P <==> PRPP
58: TRP_SYNTH : CHOR + GLN + PRPP + SER <==> CO2 + GAP + GLU + PYR + TRP
59: AICAR_SYNTH : ASP + 4 ATP + CO2 + GLN + GLY + PRPP <==> AICAR + FUM + GLU + 4 ADP +
4 PO4
60: HIS_SYNTH : ATP + GLN + PRPP <==> AICAR + aKG + HIS + 2 NADH + PO4
61: LYS_SYNTH : ASPSEMALD + GLU + NADPH + PYR + SUCCOA <==> aKG + CO2 + LYS + SUC
62: ASN_SYNTH : ASP + ATP + GLN <==> ASN + GLU
63: CMP_CDP : ATP + CMP <==> CDP
64: GTP_SYNTH : AICAR + ASP + 3 ATP + GLN <==> GLU + GTP
65: dGTP_SYNTH : GTP <==> dGTP
66: dATP_SYNTH : ATP <==> dATP
67: UTP_SYNTH : ASP + 2 ATP + CARBP + O2 <==> CO2 + UTP + 2 ADP + 2 PO4
68: CTP_SYNTH : ATP + NH4 + UTP <==> CTP + ADP + PO4
69: dCTP_SYNTH : CTP <==> dCTP
70: dTTP_SYNTH : 2 ATP + dCTP + METHF + NH4 <==> dTTP
71: LLDIAPIM_SYNTH : ASP + ATP + GLU + 2 NADPH + PYR + SUCCOA <==> aKG + LLDIAPIM
+ SUC
72: aKI_aIPM : ACCOA + aKI <==> aIPM
73: aIPM_DMC : aIPM <==> DMC
74: DMC_bIPM : DMC <==> bIPM
75: bIPM_aKIC : bIPM <==> aKIC + CO2 + NADH
76: aKI_ISOBUTCOA : aKI <==> CO2 + ISOBUTCOA + NADH
77: aKIC_3METBUTCOA : aKIC <==> 3METBUTCOA + CO2 + NADH
78: aKMETVAL_2METBUTCOA : aKMETVAL <==> 2METBUTCOA + CO2 + NADH
79: C55PP_C55P : C55PP <==> C55P
80: F6P+GLN=GLU+gN6P : F6P + GLN <==> GLU + gN6P
200
81: gN6P=gN1P : gN6P <==> gN1P
82: gN1P_NAG1P : ACCOA + gN1P <==> NAG1P
83: UREA_NH4 : UREA <==> CO2 + 2 NH4
84: CA_SYNTH : 3 aKG + ARG + ATP + GAP + 2 NADPH + 4 O2 ==> CA + 3 CO2 + NH4 + 3 SUC +
UREA + PO4 + 2 NADP 85: mue : 0.0393 2METBUTCOA + 0.1101 3METBUTCOA + 3.0001 ACCOA + 0.9654 ALA + 0.391
ARG + 0.0795 ASN + 0.287 ASP + 12.1708 ATP + 0.19159 C55P + 0.55387 CTP + 0.0365 CYS
+ 0.004545 dATP + 0.01169 dCTP + 0.01169 dGTP + 0.004545 dTTP + 0.09009 F6P + 0.4695
G6P + 0.124 GLN + 0.2665 GLU + 0.5578 GLY + 5.7969 GTP + 0.11 HIS + 0.134 ILE + 0.078
ISOBUTCOA + 0.478 LEU + 0.1078 LLDIAPIM + 0.096 LYS + 0.0795 MET + 2.7251 NADH +
2.7928 NADPH + 0.2155 NAG1P + 0.1078 NH4 + 0.03825 O2 + 0.1078 PEP + 0.1235 PHE +
0.29 PRO + 0.02895 PYR + 0.44005 SER + 0.0285 SUCCOA + 0.289 THR + 0.071 TRP + 0.096
TYR + 0.2815 UTP + 0.3995 VAL + 0.2235 GCL3P ==>
86: ISOPP_SYNTH : ATP + CTP + GAP + 2 NADPH + PYR <==> CMP + CO2 + ISOPP 87: C55PP_SYNTH : 4 ISOPP <==> C55PP 88: CTP_CDP : CTP <==> ATP + CDP 89: OAA_PEP : ATP + OAA <==> CO2 + PEP 90: PEP_PYR : PEP <==> ATP + PYR 91: MAL_OAA : MAL <==> NADH + OAA 92: MAL_PYR : MAL <==> CO2 + NADH + PYR 93: ARG_ORN+UREA : ARG <==> ORN + UREA 94: THR_GLY : ATP + THR <==> ACCOA + GLY + NADH 95: SER_PYR : SER <==> NH4 + PYR 96: NH4_up : <==> NH4 97: GCL_up : <==> GCL 98: clav_export : CA ==> 99: ADP_ATP : ADP + PO4 <==> ATP 100: PO4_up : <==> PO4
201
ANEXO 1. IMPACTOS DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
1.1. IMPACTO AMBIENTAL DEL PROYECTO:
Colombia es un país agrícola que ha entrado en la era de los biocombustibles, y de la
industria del biodiesel se genera un subproducto (glicerina) que es la principal materia
prima a emplear como sustrato de la bacteria Streptomyces clavuligerus, en la
elaboración de ácido clavulánico. Empleando la glicerina como substrato, en este trabajo
se ha logrado obtener rendimientos hasta de 20 mg AC / g de glicerina empleada valor
superior a los reportados en la bibliografía. Se producen actualmente 56000 Ton de
glicerina/año y se espera que en los próximos años se pueda suplir una demanda de
396000 Ton de glicerina/año. En la actualidad hay 83 plantas productoras de biodiesel
en el país.
Se puede observar como una posibilidad dentro del empleo de tecnología limpias y en
caso de que este proceso se lleve a cabo a nivel industrial en nuestro País, el poder
utilizar a mediano plazo parte de la glicerina generada en los procesos de fabricación de
biodiésel, para la producción de ácido clavulánico u otros antibióticos provenientes del
cultivo de Streptomyces. La selectividad del ácido clavulánico en este medio es de
alrededor de 1 g/L.
1.2. PERTINENCIA SOCIAL:
Incrementar la productividad en la producción de ácido clavulánico y emplear materias
primas de bajo costo, permitirán lograr producir medicamentos a un costo más asequible
a las personas de bajos recursos económicos, para lograr mejorar la calidad de vida de
las personas con enfermedades infecciosas.
Lograr formar personal altamente calificado que continué con el proceso de formación
de otros profesionales que propendan por el desarrollo de nuevos productos y procesos
para mejorar la calidad de vida y el nivel educativo del país, generación de expertos en
estos temas de tercera generación.
Esta tesis permite incrementar la cultura de investigación y mejoramiento de los
procesos desde el conocimiento fenomenológico del mismo, más que con el solo estudio
202
del proceso como una caja negra. Esto permite el mantenimiento de altos estándares de
conocimiento de frontera. Los resultados de esta Tesis, pueden motivar a entidades
gubernamentales a destinar más recursos para investigar en la generación de nuevos
productos orientados hacia el mantenimiento y mejoramiento de la salud humana.
1.3. APORTE A LA EDUCACION:
Formación de personal altamente calificado con conocimientos de tecnología de punta
que permiten aplicación de las herramientas de Ingeniería Metabólica a otros tipos de
microorganismos y de procesos. Dado que la persona formada con esta Tesis
actualmente es profesora Universitaria, sin duda su experiencia y conocimiento
adquirido irá a redundar en las aulas en los cursos que imparta y en la formación de más
investigadores.
Con el inicio de esta Tesis, se creó en el grupo de Bioprocesos de la universidad de
Antioquia la línea de investigación en ingeniería metabólica y mejoramiento de
producción de antibióticos. Esta línea actualmente pervive y cuenta con tres estudiantes
de doctorado y uno de maestría realizando sus tesis. Este trabajo es pionero en el país
para este tipo de bacteria.
1.4. APORTE A LA UNIVERSIDAD:
El desarrollo de esta Tesis estuvo incluido dentro de un proyecto de investigación
financiado por Colciencias, que permitió conseguir una infraestructura importante para
la Universidad en dotación de equipos y capacitación de profesores y estudiantes.
1.5. APORTE AL CONOCIMIENTO:
El desarrollo de esta Tesis ha generado los siguientes aportes al conocimiento:
Se demostró que S. clavuligerus puede crecer y producir AC a concentraciones de
glicerol incluso de 100 g L-1
, sin embargo, una concentración más adecuada para la
producción es de 50 g L-1
. Estos resultados no se habían reportado antes en la literatura.
203
Se pudo establecer un modelo cinético tipo Contois para la biomasa y una cinética de
formación de producto asociado y no asociado al crecimiento que mostró un buen ajuste
a los resultados experimentales. Estos resultados no se habían reportado antes en la
literatura.
El análisis de Flujo metabólico empleando una red metabólica de 60 reacciones
estequiométricas, permitió conocer que, para lograr altos rendimientos en la formación
de AC, se debe garantizar una buena disponibilidad de los flujos de los metabolitos
intermediarios, GAP, PEP, PYR, OAA y ORN.
Con esta red se encontró que los flujos metabólicos medidos que más afectan el
sistema celular son los flujos de PHE, TYR, ILE.
A su vez, los flujos calculados que más se ven afectados por los flujos medidos
corresponden a los flujos generadores de NADPH, tanto por la vía oxidativa de la
pentosa fosfato, como por la reacción de transhidrogenación de NADPH.
A partir del análisis de sensibilidad, también fue posible observar que a pesar de ser
algunos compuestos puntos nodales de mucha conectividad en la red metabólica pro-
puesta (OXA, aKG, GAP, ARG, ORN y ASP) no constituyen etapas significativamente
incidentes en la distribución del flujo de carbono, durante el proceso de síntesis de AC.
Finalmente, se encontró que el flujo de la ornitina, más que el flujo de arginina, afecta
directamente la biosíntesis de AC, dejando ver la importancia del control del flujo de
carbono a través del ciclo de la urea, en la biosíntesis de AC.
Analizando una red metabólica de 100 reacciones estequiométricas mediante FBA, se
pudieron obtener resultados preliminares sobre el comportamiento celular para analizar
los efectos de variables de interés como el flujo de carbono, nitrógeno y fósforo sobre
204
variables relevantes como el flujo de biomasa y de AC. Ningún estudio similar fue
hallado en la literatura para la producción de AC este microorganismo, por lo que el
estudio y los resultados se consideran inéditos.
El modelo propuesto presentó las mejores predicciones empleando como función
objetivo la maximización de la producción de ATP con respecto a las demás funciones
evaluadas, producción de biomasa y producción de AC.
Bajo las consideraciones de limitación de nutrientes se pudo establecer la limitación de
glicerol y amonio, los flujos de AC se ven disminuidos, siendo crítica la limitación de C,
mientras que la limitación de NH4, en cierto rango, se mantiene constante el valor de
flujo de AC obteniéndose el máximo valor de acuerdo con las restricciones del modelo
metabólico. Algunas de estas consideraciones ya habían sido obtenidas
experimentalmente por otros autores y aplicando AFM, pero a redes metabólicas más
pequeñas en el cual se considera el modelo determinado.
En general se pudo establecer que los flujos precursores en el ciclo de la UREA, en
especial el flujo de ORN es el que presenta mayor variación frente a las limitaciones de
nutrientes consideradas.
En conclusión general, la comparación de los resultados experimentales con los resulta-
dos obtenidos por FBA a diferentes funciones objetivo, resultó muy útil, ya que se pudo
evaluar el potencial biológico de este cultivo de S. clavuligerus. Entre los propósitos de
este tipo de estudio está el poder indicar algún objetivo o estrategia a seguir para la
manipulación genética o modificaciones en el proceso de producción, que permitan
disminuir u optimizar los tiempos destinados para obtener mayores valores en los flujos
de AC.
205
ANEXO 2. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA DERIVADA DE LA TESIS.
2. 1. TRABAJOS PUBLICADOS
Artículos en Revista (2)
Capítulo 3:
C. Patricia, S. Henao, N. Andrea, G. Grimaldos, J. Carlos, and Q. Díaz, ―Producción de
ácido clavulánico por fermentación de Streptomyces clavuligerus : evaluación de
diferentes medios de cultivo y modelado matemático,‖ Dyna, vol. 79, no. 1975, pp. 158–
165, 2012.
Capítulo 4:
SANCHEZ C. P., GOMEZ N. A., QUINTERO J. C., OCHOA S. and RIOS R. A
combined sensitivity and metabolic flux analysis unravel the importance of amino acid
feeding strategies on clavulanic acid biosynthesis in Streptomyces clavuligerus. Los
artículos serán publicados en la Serie: Advances in Intelligent Systems and
Computing‖ de Springer (Esta serie será indexada en Thomson Reuters y en la Base de
Datos de Proceeding por EI/Compendex y SCOPUS). (Aprobado).
N. A. Gómez, C. P. Sánchez and J. C. Quintero, "Phenomenological Model of the
Clavulanic Acid production, inhibitor of the enzymes β-lactamases using a method of
multiple regression analysis nonlinear" 2013 Panamerican Health Care Exchanges
(PAHCE) Conference, Worshops and exhibits. Cooperation/linkages. April 29-May 4,
2013, Medellín Colombia. ISBN 978-1-4673-6157-3. IEEEcatalog number CFP 13186-
ART; ISSN 2327-8161, pp. 1-4. www. ieeexplore.ieee.org/xpr/aboutUs.jsp
Trabajos en eventos (11)
PONENCIA ORAL "cinética de producción de ácido clavulánico en medios complejos,
usando diferentes concentraciones de glicerol como fuente de carbono. V Simposio
sobre Biofábricas y I Congreso de Flujos Reactivos. Agosto 30 y 31. Medellín-
Colombia, Universidad Nacional.
PONENCIA ORAL "Análisis de flujo metabólico in silico de la biosíntesis de ácido
clavulanico‖. Congreso Iberoamericano de Biotecnología y Biodiversidad. Septiembre
21 al 24 de 2011. Manizales-Colombia.
206
PONENCIA ORAL ―Modelado de la cinética de Producción de Ácido clavulanico
empleando un medio complejo‖. Congreso Iberoamericano de Biotecnología y
Biodiversidad. Septiembre 21 al 24 de 2011. Manizales-Colombia.
PONENCIA ORAL ―Phenomenological Model of the Clavulanic acid production,
inhibitor of the enzymes β-lactamases using a method of multiple regression analysis
nonlinear‖. VIII Panamerican Health Care Exchanges Conference (PAHCE-2013) y
el V Congreso Colombiano de Bioingeniería e Ingeniería Biomédica (V-CCBIO-
2013).Medellín- Colombia. Abril 29 a Mayo 4 de 2013.
PONENCIA ORAL. ―A combined metabolic flux and sensitivity analysis unravel the
importance of amino acid feeding strategies in clavulanic acid biosynthesis‖. Segundo
Congreso Colombiano de Biología Computacional y Bioinformática (CCBCOL 2013),
a presentar en Manizales del 25 al 27 de Septiembre de 2013.
PONENCIA EN POSTER "Análisis de flujo metabólico en la producción de ácido
clavulánico a partir de la fermentación con Streptomyces clavuligerus". Congreso
Colombiano de Biología Computacional. Fecha de realización: 23 al 25 de Marzo de
2011, Bogotá, Colombia
PONENCIA EN POSTER ―Estudio del efecto de la variación de la concentración de
fosfato y glicerol sobre la biomasa de Streptomyces clavuligerus‖. XIV Congreso
Nacional de Biotecnología y Bioingeniería. Fecha de realización: 19 al 24 de Junio de
2011, en Querétero, México.
PONENCIA EN POSTER. ―Metabolic flux analysis of clavulanic acid biosynthesis
using glycerol as the unique carbon source‖. Libro de memorias del evento 12th
Mediterranean Congress of Chemical Engineering. Noviembre 15 al 18 de 2011.
Barcelona, España.
PONENCIA EN POSTER. ―Determination of kinetic parameters for the production of
clavulanic acid antibiotic in culture of streptomyces clavuligerus using as source
nitrogen the soy flour‖. Libro de memorias del evento 12th Mediterranean Congress of
Chemical Engineering. Noviembre 15 al 18 de 2011. Barcelona, España
PONENCIA EN POSTER. “Evaluating ornithine effects on clavunic acid biosynthesis
with the aid of metabolic flux analysis‖. XV Congreso Nacional de Biotecnología y
Bioingeniería y en el 12º Simposio Internacional sobre la Genética de
Microorganismos Industriales (SMBB/GIM-2013). Junio 23 al 28 de 2013. Cancún,
Q.R., México
PONENCIA EN POSTER. “Modeling the production of clavulanic acid from
Streptomyces clavuligerus”. XV Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería y
207
en el 12º Simposio Internacional sobre la Genética de Microorganismos Industriales
(SMBB/GIM-2013). Junio 23 al 28 de 2013. Cancún, Q.R., México.
2.2. TRABAJOS EN REVISIÓN POR EL TUTOR.
Capítulo 2.
ARTÍCULO 1. ―Fundamentos de la ingeniería metabólica: caso de estudio producción
de ácido clavulánico. Revisión de literatura‖ (en preparación).
Capítulo 5.
ARTÍCULO 2. ―Efecto de la limitación de nutrientes en la producción de AC a partir de
Streptomyces clavuligerus empleando análisis de balance de flujos (FBA)‖ (para
someter).