UNIVERZITET U BEOGRADUUNIVERZITET U BEOGRADU

FARMACEUTSKI FAKULTETFARMACEUTSKI FAKULTET

Profesor Profesor

Aleksandra TopiAleksandra Topićć

SEMINARSKI RADSEMINARSKI RAD

ALFA-1-ANTITRIPSINALFA-1-ANTITRIPSIN

StudentiStudenti

Jelena JeJelena Ječmenica Sandra Kneževićčmenica Sandra Knežević 9728/00 9736/009728/00 9736/00

Beograd, decembar 2008Beograd, decembar 2008

UvodUvod

Alfa-1-antitripsin (AAT) je osnovna komponenta Alfa-1-antitripsin (AAT) je osnovna komponenta alfa-1 frakcije globulina humane plazme (u alfa-1 frakcije globulina humane plazme (u frakciji se izdvaja odmah ispred albumina).frakciji se izdvaja odmah ispred albumina).Predstavnik familije proteina-SERPINA (Predstavnik familije proteina-SERPINA (SerSerin in PProteinase roteinase InInhibitori).hibitori).Laurell i Eriksson - deficit ovog proteina Laurell i Eriksson - deficit ovog proteina odgovoran za ranu pojavu emfizema; odgovoran za ranu pojavu emfizema; SerpinopatijeSerpinopatije-oboljenja vezana za mutacije na -oboljenja vezana za mutacije na serpinima kod obolelih i njihovih srodnika .serpinima kod obolelih i njihovih srodnika .Najvaznija fizioloska uloga AAT - inhibira Najvaznija fizioloska uloga AAT - inhibira leukocitnu elastazu koja se oslobadja iz leukocitnu elastazu koja se oslobadja iz neutrofila .neutrofila .AAT je reaktant akutne faze i njegova AAT je reaktant akutne faze i njegova koncentracija se povecava u cirkulaciji pri koncentracija se povecava u cirkulaciji pri inflamaciji i malignim stanjima,kao i pod inflamaciji i malignim stanjima,kao i pod dejstvom estrogena.dejstvom estrogena.Karakteristika ovog proteina je visok stepen Karakteristika ovog proteina je visok stepen polimorfizma .polimorfizma .

Struktura alfa-1 antitripsina,Struktura alfa-1 antitripsina, aktivni centar,aktivni centar,

reakcija sa proteazamareakcija sa proteazama Naziv alfa-1 antitripsin je star i neadekvatan zbog toga sto Naziv alfa-1 antitripsin je star i neadekvatan zbog toga sto tripsin tripsin

nije jedina proteaza koju inhibira ovaj protein. On inhibira nije jedina proteaza koju inhibira ovaj protein. On inhibira i elastazu, himotripsin, renin, kalikrein…i elastazu, himotripsin, renin, kalikrein…

Glavna inhibicija je inhibicija elastaze i to neutrofilne elastaze (Glavna inhibicija je inhibicija elastaze i to neutrofilne elastaze (NENE).).Neki autori - termin “alfa-1 proteaza inhibitor”.Neki autori - termin “alfa-1 proteaza inhibitor”.Zreli protein AAT cini 394 AK i 3 UH lanca .Zreli protein AAT cini 394 AK i 3 UH lanca .UH lanci su izgradjeni od N-acetilglukozamina,manoze,galaktoze i UH lanci su izgradjeni od N-acetilglukozamina,manoze,galaktoze i

sijalinske kiseline.sijalinske kiseline.Unutrasnjost molekule cini alfa heliks (30 %) i beta ploca(40 %).Unutrasnjost molekule cini alfa heliks (30 %) i beta ploca(40 %).Molekul AAT ima 8 alfa heliksa (Molekul AAT ima 8 alfa heliksa (A-I A-I ) i 3 beta ploce () i 3 beta ploce (A-CA-C).).Karakteristika molekule je dominantna Karakteristika molekule je dominantna petostrana beta ploca,petostrana beta ploca,koja koja

se oznacava kao se oznacava kao A ploca .A ploca .Konformacija aktivnog centra se jos uvek nezna sa pouzdanoscu,ali Konformacija aktivnog centra se jos uvek nezna sa pouzdanoscu,ali

se pretpostavlja da je aktivni centar (se pretpostavlja da je aktivni centar (MetMet358 358 – Ser– Ser359359) ) izlozena,mobilna petlja koja je smestena iznad pukotine,u centru izlozena,mobilna petlja koja je smestena iznad pukotine,u centru A ploce (A ploce (Slika 1a i c Slika 1a i c ).).

Aktivni centar predstavlja “pseudo supstrat za protease”.Aktivni centar predstavlja “pseudo supstrat za protease”.AAT ima visok stepen homologije sa molekulom ovoalbumina.AAT ima visok stepen homologije sa molekulom ovoalbumina.Predlozena je kanonijska struktura koja formira stereohemijski Predlozena je kanonijska struktura koja formira stereohemijski

povoljan kompleks sa ciljnom proteazom, npr. elastazom koja ima povoljan kompleks sa ciljnom proteazom, npr. elastazom koja ima aktivni centar u obliku dzepa i pokazuje visok afinitet za aktivni aktivni centar u obliku dzepa i pokazuje visok afinitet za aktivni centar AAT.centar AAT.

Kada enzim reaguje sa AAT i to sa P1-P1’ ostatkom aktivnog Kada enzim reaguje sa AAT i to sa P1-P1’ ostatkom aktivnog centra ,petlja se dalje uvlaci u pukotinu A ploce,gradeci centra ,petlja se dalje uvlaci u pukotinu A ploce,gradeci ““zakljucanu” zakljucanu” konformaciju i inaktivira se ciljna proteaza (konformaciju i inaktivira se ciljna proteaza (Slika 1b Slika 1b ).).

Tokom reakcije sa enzimom struktura AAT se menja od Tokom reakcije sa enzimom struktura AAT se menja od napregnutog,labilnog do relaksiranog oblika.napregnutog,labilnog do relaksiranog oblika.

Disocijacija kompleksa enzim-inhibitor moze ici u dva pravca: Disocijacija kompleksa enzim-inhibitor moze ici u dva pravca: oslobadjanje intaktne molekule AAT ili cepanje a.centra na mestu oslobadjanje intaktne molekule AAT ili cepanje a.centra na mestu P1-P1’ veze i njegovog potpunog uvlacenja u pukotinu A ploce , pri P1-P1’ veze i njegovog potpunog uvlacenja u pukotinu A ploce , pri cemu je ova razlozena forma inaktivna i mnogo stabilnija od cemu je ova razlozena forma inaktivna i mnogo stabilnija od nativne molekule AAT ili AAT u formi kompleksa sa enzimom (nativne molekule AAT ili AAT u formi kompleksa sa enzimom (Slika Slika 1b1b).).

Slika 1. Trakasti dijagram A ploce i petlja aktivnog centra AAT : a) Shematski prikaz pretpostavljene strukture nativnog AAT ; b) shematski prikaz razlozene molekule AAT i c) Trakasti dijagram kompleksa AAT-tripsin

Molekulska osnova ’’ petlja-ploča’’ polimerizacije (loop-sheet polymerisation):Molekulska osnova ’’ petlja-ploča’’ polimerizacije (loop-sheet polymerisation):a) reaktivni centar (crveno) alfa-1-antitripsina koji je povezan za a) reaktivni centar (crveno) alfa-1-antitripsina koji je povezan za -ploču lako može biti uvučen u -ploču lako može biti uvučen u --

ploču druge molekule alfa-1-antitripsina kod određenih mutacija; b) dimer alfa-1-antitripsina; c) ploču druge molekule alfa-1-antitripsina kod određenih mutacija; b) dimer alfa-1-antitripsina; c) polimer alfa-1-antitripsina (različitim bojama su prikazane različite molekule alfa-1-antitripsina)polimer alfa-1-antitripsina (različitim bojama su prikazane različite molekule alfa-1-antitripsina)

Gen za AAT i njegova evolucijaGen za AAT i njegova evolucija

Gen za AAT je sastavljen od 7 egzona i 6 introna .Gen za AAT je sastavljen od 7 egzona i 6 introna .

Utvrdjeno je da hepatociti sadrze oko 200 puta vise AAT mRNA Utvrdjeno je da hepatociti sadrze oko 200 puta vise AAT mRNA transkripta po celiji nego MNM transkripta po celiji nego MNM

(monociti u krvi i alveolarni makrofagi), sto znaci da je jetra (monociti u krvi i alveolarni makrofagi), sto znaci da je jetra

osnovni organ za sintezu AATosnovni organ za sintezu AAT

Nasledjivanje varijanti AATNasledjivanje varijanti AAT

Geni za AAT se nasledjuje Geni za AAT se nasledjuje kodominantnokodominantno i od oca i od i od oca i od majke, fenotip AAT je rezultat ekspresije 2 alela nezavisno majke, fenotip AAT je rezultat ekspresije 2 alela nezavisno od oba roditelja i svaki alel u fenotipu funkcionise od oba roditelja i svaki alel u fenotipu funkcionise nezavisno.nezavisno.

SintezaSintezaBiosinteza AAT je tipicna za sekretorne glikoproteine.Biosinteza AAT je tipicna za sekretorne glikoproteine.Transkripcija mRNA sa AAT gena – izlazi na gER, vezuju se UH lanci i protein Transkripcija mRNA sa AAT gena – izlazi na gER, vezuju se UH lanci i protein

se savija i dobija trodimenzionalnu konformaciju – protein prelazi na se savija i dobija trodimenzionalnu konformaciju – protein prelazi na Goldzijev aparat ,zavrsna modifikacija UH lanaca i ZREO protein se Goldzijev aparat ,zavrsna modifikacija UH lanaca i ZREO protein se sekretuje u cirkulaciju (poluzivot je 4-5 dana).sekretuje u cirkulaciju (poluzivot je 4-5 dana).

Smatra se da je prezivljavanje AAT u cirkulaciji u direktnoj vezi sa UH lancima.Smatra se da je prezivljavanje AAT u cirkulaciji u direktnoj vezi sa UH lancima.Protein je detektovan u fetalnoj cirkulaciji vec posle cetvrte gestacione Protein je detektovan u fetalnoj cirkulaciji vec posle cetvrte gestacione

nedelje.nedelje.Sintezu AAT u jetri snazno stimulise IL-6 kao i OM,TGF beta 1, LIFSintezu AAT u jetri snazno stimulise IL-6 kao i OM,TGF beta 1, LIF..U epitelnim celijama intestinuma IL-6.U epitelnim celijama intestinuma IL-6.Kod bolesti pluca, emfizema i cisticne fibroze AAT utice na aktivnost HNE.Kod bolesti pluca, emfizema i cisticne fibroze AAT utice na aktivnost HNE.

LokalizacijaLokalizacijaLokalizacija i fizioloska uloga proteina su u direktnoj vezi.Lokalizacija i fizioloska uloga proteina su u direktnoj vezi.Osnovno mesto ekspresije i indukcije AAT je jetra.Osnovno mesto ekspresije i indukcije AAT je jetra.Drugi izvor su monociti,makrofage i neutrofili.Drugi izvor su monociti,makrofage i neutrofili.Treci izvor su epitelne celije (pluca, bronhije, intestinum).Treci izvor su epitelne celije (pluca, bronhije, intestinum).

Fizioloske ulogeFizioloske uloge

Osnovna f.u. AAT je inhibicija proteaza,a posebno Osnovna f.u. AAT je inhibicija proteaza,a posebno inhibicija inhibicija NE,NE,sto je ispitano preko konstante asocijacije. Zbog sto je ispitano preko konstante asocijacije. Zbog male male molekulske masemolekulske mase difunduje do vecine tkiva. AAT je jedan difunduje do vecine tkiva. AAT je jedan od od proteina akutne fazeproteina akutne faze i nivo AAT se povecava kod i nivo AAT se povecava kod inflamatorne reakcije,infekcije i u malignim bolestima. inflamatorne reakcije,infekcije i u malignim bolestima. Danas je dokazano da AAT inhibira vezivanje Danas je dokazano da AAT inhibira vezivanje transferinatransferina za receptore na razlicitim celijama za receptore na razlicitim celijama in vitro in vitro (membrane celija (membrane celija placente,eritroidne celije,fibroblasti ),sto se povezuje sa placente,eritroidne celije,fibroblasti ),sto se povezuje sa ulogom AAT u pojavi nekih anemija i inhibiciji rasta i ulogom AAT u pojavi nekih anemija i inhibiciji rasta i proliferacije pojedinih celija.proliferacije pojedinih celija.

Molekulske varijante AATMolekulske varijante AAT

AAT pokazuje visok stepen polimorfizma( preko 90 ).AAT pokazuje visok stepen polimorfizma( preko 90 ).Sve varijante su klasifikovane kao Pi (Sve varijante su klasifikovane kao Pi (Protease inhibitorProtease inhibitor) )

system koji je prvi predlozio Fagerhol 1968. god. i oznacene system koji je prvi predlozio Fagerhol 1968. god. i oznacene su velikim slovima abecede prema pokretljiosti u su velikim slovima abecede prema pokretljiosti u poliakrilamid gelu (od anode prema katodi).poliakrilamid gelu (od anode prema katodi).

Varijanta kod koje izostaje AAT u serumu je oznacena kao Varijanta kod koje izostaje AAT u serumu je oznacena kao nulta.nulta.

Retke varijante se osim odgovarajucim slovom obelezavaju i Retke varijante se osim odgovarajucim slovom obelezavaju i nazivom grada u kome je otkrivena najstarija osoba sa nazivom grada u kome je otkrivena najstarija osoba sa retkim fenotipom(primer M pittsburg).retkim fenotipom(primer M pittsburg).

Podela svih varijanti prema koncentraciji u serumu i Podela svih varijanti prema koncentraciji u serumu i funkcionalnoj aktivnosti proteina:funkcionalnoj aktivnosti proteina:

Normalne, deficijentne, disfunkcionalne i nulta Normalne, deficijentne, disfunkcionalne i nulta varijantavarijanta (slika 3).(slika 3).

Slika 3.Slika 3. Prikaz AAT varijanti sa mestom na kome je doslo do Prikaz AAT varijanti sa mestom na kome je doslo do pojedinacne zamene AK u odnosu na M1 (Ala pojedinacne zamene AK u odnosu na M1 (Ala 213213 ) ili M1 ( Val ) ili M1 ( Val 213213 ) I razlike u sekvenci koje kodiraju egzoni. Strelice ) I razlike u sekvenci koje kodiraju egzoni. Strelice pokazuju evolutivni tok varijanti AATpokazuju evolutivni tok varijanti AAT

Normalne varijanteNormalne varijante

Predstavljaju najvecu grupu varijanti alela AAT.Predstavljaju najvecu grupu varijanti alela AAT.

Zajednicka osobina- koncentracija u serumu i funkcionalna Zajednicka osobina- koncentracija u serumu i funkcionalna aktivnost prema NE je normalna.aktivnost prema NE je normalna.

Nasledjen jedan alel normalne varijante pruza dovoljnu Nasledjen jedan alel normalne varijante pruza dovoljnu zastitu pluca, cak i kada je drugi roditeljski gen zastitu pluca, cak i kada je drugi roditeljski gen deficijentan ili nulti.deficijentan ili nulti.

Najucestaliji je M fenotip koji ima jos najmanje 8 podtipova.Najucestaliji je M fenotip koji ima jos najmanje 8 podtipova.

Najcesce normalne varijante su M1 (Ala Najcesce normalne varijante su M1 (Ala 213213 ) i oni koji su ) i oni koji su evolutivno nastali od ove: M1(Val evolutivno nastali od ove: M1(Val 213213 ), M2 i M3. ), M2 i M3.

Metode za identifikaciju M1 (Ala Metode za identifikaciju M1 (Ala 213213 ) i M1(Val ) i M1(Val 213213 ) je ) je izoelektrofokusiranje na imobilizovanom pH gradijentu ili izoelektrofokusiranje na imobilizovanom pH gradijentu ili na nivou DNK. Ova promena AK na polozaju 213 ne utice na nivou DNK. Ova promena AK na polozaju 213 ne utice na naelektrisanje molekule.na naelektrisanje molekule.

Cetiri M alela su najcesca i oni su osnova za nastajanje svih Cetiri M alela su najcesca i oni su osnova za nastajanje svih drugih alela razlicitim mutacijama.drugih alela razlicitim mutacijama.

Retke normalne varijanteRetke normalne varijante

M4 je retka normalna varijanta,alelna frekvencija je od 0,01 do M4 je retka normalna varijanta,alelna frekvencija je od 0,01 do 0,05 kod Evropske populacije.0,05 kod Evropske populacije.

Ostale normalne retke varijante imaj frekvenciju nizu od 0,001 Ostale normalne retke varijante imaj frekvenciju nizu od 0,001 i predstavljaju samo pojedinacne slucajeve.i predstavljaju samo pojedinacne slucajeve.

Deficijentne varijanteDeficijentne varijante

Z varijantaZ varijanta je poznata kao “klasicna” deficijentna AAT je poznata kao “klasicna” deficijentna AAT varijanta.varijanta.

Ova varijanta je cesta u Skandinaviji, gde se smatra da je doslo Ova varijanta je cesta u Skandinaviji, gde se smatra da je doslo do mutacije pre 2000 godina.Veoma je retka u populaciji do mutacije pre 2000 godina.Veoma je retka u populaciji crnaca i azijata.crnaca i azijata.

Z mutacija je Z mutacija je GluGlu342342-Lys-Lys342342 ,sto je razlog katodnog putovanja. ,sto je razlog katodnog putovanja.Intracelularna akumulacija Z varijante u hepatocitima se Intracelularna akumulacija Z varijante u hepatocitima se

objasnjava petlja-ploca (loop-sheet ) polimerizacijom jedne objasnjava petlja-ploca (loop-sheet ) polimerizacijom jedne molekule AAT sa drugom.molekule AAT sa drugom.

Osim sto je Z alel deficijentan , on ima poremecenu funkciju Osim sto je Z alel deficijentan , on ima poremecenu funkciju prema NE.prema NE.

S varijanta S varijanta je najcesca kod naroda na Iberijskom poluostrvu.je najcesca kod naroda na Iberijskom poluostrvu.Mutacija kod S varijante je Mutacija kod S varijante je GluGlu264264-Val-Val264264 i to je uzrok migracije S i to je uzrok migracije S

alela prilikom izoelektricnog fokusiranja izmedju M1(Val alela prilikom izoelektricnog fokusiranja izmedju M1(Val 213213 ) i ) i Z.Z.

S molekula je nestabilna i prosetljiva prema intracelijskoj S molekula je nestabilna i prosetljiva prema intracelijskoj proteolizi,te stoga celije koje sintetisu S homozigot sekretuju proteolizi,te stoga celije koje sintetisu S homozigot sekretuju do 40% manje nego normalno.do 40% manje nego normalno.

Postoje i Postoje i Retke deficijentne varijante.Retke deficijentne varijante.

Nulte varijanteNulte varijante

Nije detektovan AAT u serumu.Nije detektovan AAT u serumu.Nasledjeni nulti alel od oba roditelja dovodi do ekstremno Nasledjeni nulti alel od oba roditelja dovodi do ekstremno

velikog rizika za pojavu emfizema i oni koji prezive 10 velikog rizika za pojavu emfizema i oni koji prezive 10 godina retko dozive 40 godina.godina retko dozive 40 godina.

Deficit ovih varijanti je posledica razlicitih delecija i mutacija Deficit ovih varijanti je posledica razlicitih delecija i mutacija na genu.na genu.

Disfunkcionalne varijanteDisfunkcionalne varijante

Poznata je samo jedna- Pi Pittsburg.Poznata je samo jedna- Pi Pittsburg.Nivo ovog proteina je normalan u serumu, a migrira katodno Nivo ovog proteina je normalan u serumu, a migrira katodno

od M varijante.od M varijante.Kod ovog proteina je supstitucija na a.centru ( Kod ovog proteina je supstitucija na a.centru ( Met Met 358358-Arg-Arg ). ).Posledica ove mutacije-AAT vise nije inhibitor NE, vec Posledica ove mutacije-AAT vise nije inhibitor NE, vec

preuzima ulogu antitrombina III ,preuzima ulogu antitrombina III ,postaje inhibitor postaje inhibitor trombina.trombina.

Ovako mutiran AAT ima aktivnost koja je nezavisna od Ovako mutiran AAT ima aktivnost koja je nezavisna od heparina,ali je stimulisana traumom.heparina,ali je stimulisana traumom.

Posledice ove mutacije su Posledice ove mutacije su krvarenjakrvarenja koja mogu biti koja mogu biti fatalnafatalna..

Klinicki znacaj deficijencije AATKlinicki znacaj deficijencije AAT

Bolesti plucaBolesti plucaProucavanje AAT je i pocelo kada je uocena veza izmedju odsustva Proucavanje AAT je i pocelo kada je uocena veza izmedju odsustva

alfa-1 globulinske frakcije humane plazme i rizika pojave bolesti alfa-1 globulinske frakcije humane plazme i rizika pojave bolesti pluca koji se nasledjuje.pluca koji se nasledjuje.

Najznacajniju anti-NE ulogu u bronhoalveolarnom lavatu(BAL)donjih Najznacajniju anti-NE ulogu u bronhoalveolarnom lavatu(BAL)donjih respiratornih puteva ima respiratornih puteva ima AATAAT (95 %),dok su u manjoj meri (95 %),dok su u manjoj meri zastupljene jos dve antiproteaze: zastupljene jos dve antiproteaze: sekretorna leukoproteaza sekretorna leukoproteaza inhibitor i alfa-2 makroglobulin.inhibitor i alfa-2 makroglobulin.

Z Z mutacija AAT znacajno povecava rizik za pojavu emfizema.mutacija AAT znacajno povecava rizik za pojavu emfizema.Osobe nulti homozigoti su izuzetno ugrozeni pojavom emfizema jos u Osobe nulti homozigoti su izuzetno ugrozeni pojavom emfizema jos u

detinjstvu.detinjstvu.Pusaci sa deficijencijom AAT imaju veci rizik za ranu pojavu emfizema Pusaci sa deficijencijom AAT imaju veci rizik za ranu pojavu emfizema

u odnosu na nepusace sa deficijencijom AAT.u odnosu na nepusace sa deficijencijom AAT.Razlog za ovu pojavu je velika osetljivost a.centra AAT (na Razlog za ovu pojavu je velika osetljivost a.centra AAT (na Met Met 358358 ), ),

prema oksidansima iz duvanskog dima,sto dovodi do redukcije prema oksidansima iz duvanskog dima,sto dovodi do redukcije aktivnosti AAT prema NE u donjim delovima RT kod pusaca.aktivnosti AAT prema NE u donjim delovima RT kod pusaca.

Poremecaj antiproteaza-proteaza dovodi do nekontrolisane aktivnosti Poremecaj antiproteaza-proteaza dovodi do nekontrolisane aktivnosti NE kod razlicitih oboljenja pluca: cisticna fibroza, emfizem, usled NE kod razlicitih oboljenja pluca: cisticna fibroza, emfizem, usled deficijencije AAT, emfizem kao posledica pusenja i respiratorni deficijencije AAT, emfizem kao posledica pusenja i respiratorni distress sindrom kod odraslih.distress sindrom kod odraslih.

Rendgenskom analizom pluca uoceno je da je emfizem koji je Rendgenskom analizom pluca uoceno je da je emfizem koji je uzrokovan deficijencijom AAT lokalizovan pretezno u donjim uzrokovan deficijencijom AAT lokalizovan pretezno u donjim zonama pluca , nasuprot emfizemu kod osoba sa normalnim AAT.zonama pluca , nasuprot emfizemu kod osoba sa normalnim AAT.

Razlog za to je veci protok krvi u jedinici vremena u donjim Razlog za to je veci protok krvi u jedinici vremena u donjim zonama,a cirkulisuci neutrofili su izvor elastaze koja zonama,a cirkulisuci neutrofili su izvor elastaze koja unistava pluca.unistava pluca.

Bolesti jetreBolesti jetre

• Molekulska osnova ’’ petlja-Molekulska osnova ’’ petlja-ploča’’ polimerizacije (loop-ploča’’ polimerizacije (loop-sheet polymerisation):sheet polymerisation):

• a) reaktivni centar (crveno) a) reaktivni centar (crveno) alfa-1-antitripsina koji je alfa-1-antitripsina koji je povezan za povezan za -ploču lako može -ploču lako može biti uvučen u biti uvučen u -ploču druge -ploču druge molekule alfa-1-antitripsina molekule alfa-1-antitripsina kod određenih mutacija; b) kod određenih mutacija; b) dimer alfa-1-antitripsina; c) dimer alfa-1-antitripsina; c) polimer alfa-1-antitripsinapolimer alfa-1-antitripsina

• Deficijencija AAT tipa ZZ je relativno najcesci uzrok genetski uslovljenog Deficijencija AAT tipa ZZ je relativno najcesci uzrok genetski uslovljenog oboljenja jetre kod dece i najcesca indikacija za transplataciju jetre kod oboljenja jetre kod dece i najcesca indikacija za transplataciju jetre kod dece. Supstitucija samo jedne AK dovodi do akumulacije AAT u ER. dece. Supstitucija samo jedne AK dovodi do akumulacije AAT u ER. Stepen akumulacije AAT u ER srazmeran stepenu ostecenja hepatocita.Stepen akumulacije AAT u ER srazmeran stepenu ostecenja hepatocita.

• Prema mehanizmu petlja-ploca uvlacenja, AAT moze da polimerizuje kada Prema mehanizmu petlja-ploca uvlacenja, AAT moze da polimerizuje kada se a.centar razlozene AAT molekule uvlaci u pukotinu susedne nativne se a.centar razlozene AAT molekule uvlaci u pukotinu susedne nativne AAT molekule. AAT molekule.

• Supstitucija lizina glutaminom kod Z varijante AAT dovodi do promene Supstitucija lizina glutaminom kod Z varijante AAT dovodi do promene naelektrisanja,a posledica ovoga je odsustvo uvlacenja petlje a.centra naelektrisanja,a posledica ovoga je odsustvo uvlacenja petlje a.centra u pukotinu ploce A u toku reakcije sa enzimom (slika 4a) i formiranja u pukotinu ploce A u toku reakcije sa enzimom (slika 4a) i formiranja inaktivne stabilne forme kao kod normalnih AAT varijanti.inaktivne stabilne forme kao kod normalnih AAT varijanti.

• Ovakva promena dovodi do povecane osetljivosti prema uvlacenju Ovakva promena dovodi do povecane osetljivosti prema uvlacenju petlje a.centra jedne molekule AAT u pukotinu A ploce susedne petlje a.centra jedne molekule AAT u pukotinu A ploce susedne molekule AAT (slika 4b,c).molekule AAT (slika 4b,c).Polimerizacija se desava spontano,ali je intezivnija prilikom Polimerizacija se desava spontano,ali je intezivnija prilikom minimalnih promena (porast telesne temperature i tokom inflamacije). minimalnih promena (porast telesne temperature i tokom inflamacije).

• Utvrdjeno je da se PiMM molekula savije za minut, a PiZZ Utvrdjeno je da se PiMM molekula savije za minut, a PiZZ mnogo sporije sto dovodi do povecane tedencije za petlja-mnogo sporije sto dovodi do povecane tedencije za petlja-ploca polimerizaciju.ploca polimerizaciju.

• Proucavana je sudbina PiZZ molekule tokom sekretornog Proucavana je sudbina PiZZ molekule tokom sekretornog puta u ER. puta u ER.

Shematski prikaz mehanizma ostecenja jetre prema konceptualnom modelu;Shematski prikaz mehanizma ostecenja jetre prema konceptualnom modelu;a)a) sekretorni put proteina u ER kod varijanti AAT sa normalnom koncentracijom; sekretorni put proteina u ER kod varijanti AAT sa normalnom koncentracijom; b)b) sekretorni put proteina u Esekretorni put proteina u ERR kod deficijentne PiZZ varijante AAT (smanjenje sekrecije iz ER i kumulacija u kod deficijentne PiZZ varijante AAT (smanjenje sekrecije iz ER i kumulacija u

celiji)celiji)

• AAT se moze prolazno vezati za saperone sve dok se ne savije u konformaciju koja je AAT se moze prolazno vezati za saperone sve dok se ne savije u konformaciju koja je pogodna za transport tokom sekretornog puta. Jedan deo novosintetisanih AAT se degradira pogodna za transport tokom sekretornog puta. Jedan deo novosintetisanih AAT se degradira u samom ER.u samom ER.

• Deficijentne AAT se takodje transportuju u lumen ER, ali zbog supstitucije jedne AK manje Deficijentne AAT se takodje transportuju u lumen ER, ali zbog supstitucije jedne AK manje efikasno se savija u oblik koji ne moze da se transportuje,tako da samo 15% efikasno se savija u oblik koji ne moze da se transportuje,tako da samo 15% novosintetisanih molekula napusta ER i ukljucuje se u sekretorni put. novosintetisanih molekula napusta ER i ukljucuje se u sekretorni put.

• Najveci deo novosintetisanog mutiranog AAT ostaje vezan u Najveci deo novosintetisanog mutiranog AAT ostaje vezan u ER i degradira se.ER i degradira se.

• Nije poznat mehanizam kojim retencija AAT u ER dovodi do Nije poznat mehanizam kojim retencija AAT u ER dovodi do ostecenja hepatocita.ostecenja hepatocita.

• Eksperimentalno dokazano da misevi sa humanim PiZZ Eksperimentalno dokazano da misevi sa humanim PiZZ genomom imaju ozbiljna ostecenja jetre slicno kao kod dece genomom imaju ozbiljna ostecenja jetre slicno kao kod dece u neonatalnom periodu.u neonatalnom periodu.

• Zakljucak: Retencija AAT u ER i redukcija degradacije bi Zakljucak: Retencija AAT u ER i redukcija degradacije bi moglo da bude objasnjenje za razvoj ozbiljnih poremecaja moglo da bude objasnjenje za razvoj ozbiljnih poremecaja jetre u podpopulaciji deficijentnih PiZZ osoba.jetre u podpopulaciji deficijentnih PiZZ osoba.

• Genetski faktori i faktori sredine mogu predisponirati PiZZ Genetski faktori i faktori sredine mogu predisponirati PiZZ osobu za pojavu oboljenja jetre.osobu za pojavu oboljenja jetre.

• Ovi faktori mogu povecati sintezu AAT, smanjiti interakciju Ovi faktori mogu povecati sintezu AAT, smanjiti interakciju AAT sa saperonima u ER, smanjiti nivo degradacije AAT u AAT sa saperonima u ER, smanjiti nivo degradacije AAT u ER ili smanjiti nivo sekrecije i onih 15% koji su dobro ER ili smanjiti nivo sekrecije i onih 15% koji su dobro savijeni i presli u Goldzi aparat. savijeni i presli u Goldzi aparat.

• Eksperimentima in vitro sa rekombinantnim PiZZ AAT Eksperimentima in vitro sa rekombinantnim PiZZ AAT molekulima sa ili bez oboljenja jetre uveden je pojam molekulima sa ili bez oboljenja jetre uveden je pojam “osetljivih domacina” i “zasticenih domacina”.“osetljivih domacina” i “zasticenih domacina”.Oni pokazuju da se kod nekih PiZZ osoba javljaju oboljenja Oni pokazuju da se kod nekih PiZZ osoba javljaju oboljenja jetre, a kod drugih ne, sto dokazuje da jos neki faktori osim jetre, a kod drugih ne, sto dokazuje da jos neki faktori osim smanjenja degradacije mutiranog AAT u ER i njegovog smanjenja degradacije mutiranog AAT u ER i njegovog akumuliranja u ER determinisu osetljivost jetre. akumuliranja u ER determinisu osetljivost jetre.

• Istrazena je uloga kalneksina- saperon koji ima kljucnu Istrazena je uloga kalneksina- saperon koji ima kljucnu ulogu u ER i pripada familiji fosdoproteina koji vezuju ulogu u ER i pripada familiji fosdoproteina koji vezuju kalcijum.kalcijum.Kod “zasticenih domacina”- mutirani PiZZ AAT ostaje vezan Kod “zasticenih domacina”- mutirani PiZZ AAT ostaje vezan za kalneksin u ER.za kalneksin u ER.Kod “osetljivih domacina”- ta interakcija je manja, posledica Kod “osetljivih domacina”- ta interakcija je manja, posledica je promena u procesu degradacije mutiranog AAT zbog je promena u procesu degradacije mutiranog AAT zbog promene u funkciji i strukturi kalneksina.promene u funkciji i strukturi kalneksina.

Predlozeni model degradacije PiZZ varijante u ERPredlozeni model degradacije PiZZ varijante u ER

• Pretpostavka naucnika je da kod “osetljivih domacina” mnoge Pretpostavka naucnika je da kod “osetljivih domacina” mnoge molekule kalneksina nisu vezane za PiZZ milekule i nisu molekule kalneksina nisu vezane za PiZZ milekule i nisu raspolozive za ubikvitinaciju i ne podlezu degradaciji sa raspolozive za ubikvitinaciju i ne podlezu degradaciji sa proteazomima.proteazomima.

• Kod drugih ”osetljivih domacina” – vezivanje AAT za kalneksin, Kod drugih ”osetljivih domacina” – vezivanje AAT za kalneksin, ali je degradacija isuvise spora, a defekt je ili u kalneksinu ili u ali je degradacija isuvise spora, a defekt je ili u kalneksinu ili u proteazomima zbog sprecene ubikvitinacije.proteazomima zbog sprecene ubikvitinacije.

• Ovakva istrazivanja imaju dvostruku ulogu:Ovakva istrazivanja imaju dvostruku ulogu:1. Potvvrda kljucne uloge kalneksina u ER.1. Potvvrda kljucne uloge kalneksina u ER.2. Pronalazenje terapije za osetljive grupe homozigota sa 2. Pronalazenje terapije za osetljive grupe homozigota sa ozbiljnim ostecenjem jetre.ozbiljnim ostecenjem jetre.

• Abnormalni AAT se akumulira i u ER makrofaga i celijskim Abnormalni AAT se akumulira i u ER makrofaga i celijskim linijama izvedenim transferom.linijama izvedenim transferom.

Klinicke manifestacije kod homozigota ZZKlinicke manifestacije kod homozigota ZZ

Kod novorodjencadi:Kod novorodjencadi: Opstruktivna zutica, porast Opstruktivna zutica, porast transaminaza u serumu, hepatomegalija= klinicka slika transaminaza u serumu, hepatomegalija= klinicka slika neonatalnog hepatitis sindroma.neonatalnog hepatitis sindroma.Oko 10 % novorodjencadi ima teske komplikacije sa sintetskom Oko 10 % novorodjencadi ima teske komplikacije sa sintetskom funkcijom jetre, krvarenjima, rastom i unosom hrane. U kasnijoj funkcijom jetre, krvarenjima, rastom i unosom hrane. U kasnijoj dobi se mogu javiti naduvenost stomaka sa dobi se mogu javiti naduvenost stomaka sa hepatosplenomegalijom ili krvarenja u jednjak.hepatosplenomegalijom ili krvarenja u jednjak.

Kod odraslih:Kod odraslih: Sumnja na deficijenciju AAT se postavlja kod Sumnja na deficijenciju AAT se postavlja kod pacijenata sa neobjasnjenim hronicnim hepatitisom, pacijenata sa neobjasnjenim hronicnim hepatitisom, cirozom,portalnom hipertenzijom.cirozom,portalnom hipertenzijom.Nemoguce je samo na osnovu klinicke slike razlikovati AAT Nemoguce je samo na osnovu klinicke slike razlikovati AAT deficijenciju od autoimunog hepatitisa, hepatitisa izazvanog deficijenciju od autoimunog hepatitisa, hepatitisa izazvanog lekovima, hronicnog virusno hepatitisa i Wisonove bolesti.lekovima, hronicnog virusno hepatitisa i Wisonove bolesti.

Klinicki znacaj podtipova AATKlinicki znacaj podtipova AAT

Elektroforetskim tehnikama je otkriveno najmanje 4 razlicita M Elektroforetskim tehnikama je otkriveno najmanje 4 razlicita M alela,od M1-M4.alela,od M1-M4.

Njihovom kombinacijom nastaju PiM podtipovi koji imaju Njihovom kombinacijom nastaju PiM podtipovi koji imaju normalnu antigensku koncentraciju u plazmi.normalnu antigensku koncentraciju u plazmi.

Reakcija akutne fazeReakcija akutne faze

U raznim malignim i inflamatornim stanjima IL-1, IL-6 i TNF U raznim malignim i inflamatornim stanjima IL-1, IL-6 i TNF stimulisu jetru da sintetise proteine akutne faze.stimulisu jetru da sintetise proteine akutne faze.

Jedan od tih proteina je Jedan od tih proteina je AAT,jedini protein akutne faze koji AAT,jedini protein akutne faze koji moze da mutira i da izaziva nasledno moze da mutira i da izaziva nasledno oboljenje,najmanji je i lako se rasprostire u sve oboljenje,najmanji je i lako se rasprostire u sve ekstravaskularne delove i sekrete.ekstravaskularne delove i sekrete.

IL-6 IL-6 osnovni modulator hepaticne ekspresije AAT genaosnovni modulator hepaticne ekspresije AAT gena

NE NE regulise sintezu AAT u makrofagamaregulise sintezu AAT u makrofagama

AAT AAT inhibira vezivanje transferina za transferinske receptore inhibira vezivanje transferina za transferinske receptore na membrane humane placente i celijama eritroidne loze-na membrane humane placente i celijama eritroidne loze-pojava anemija kod hronicnih oboljenjapojava anemija kod hronicnih oboljenja

AATAAT in vitroin vitro modulator fibrinogeze modulator fibrinogeze

Stanja hronicne inflamacije-inaktivacija AAT od strane NE , Stanja hronicne inflamacije-inaktivacija AAT od strane NE , kolagenaze i slobodnih kiseonicnih radikala-stvara se kolagenaze i slobodnih kiseonicnih radikala-stvara se hipohlorna kiselinahipohlorna kiselina koja predstavlja koja predstavlja “Ahilovu petu u “Ahilovu petu u antiproteaznoj odbrani”antiproteaznoj odbrani”

Ostale bolestiOstale bolesti

Autoimune bolesti:Autoimune bolesti: Sistemski lupus erithematosus, ulcerativni Sistemski lupus erithematosus, ulcerativni panikulit, psorijaza, reumatodni arthritispanikulit, psorijaza, reumatodni arthritis

ANCA-pozitivni vaskulitisANCA-pozitivni vaskulitisAktiviraju se neutrofili pod dejstvom ANCA-antitela,oslobadjaju se Aktiviraju se neutrofili pod dejstvom ANCA-antitela,oslobadjaju se

elastaza i proteaza 3 ciji je osnovni inhibitor u cirkulaciji AAT.elastaza i proteaza 3 ciji je osnovni inhibitor u cirkulaciji AAT.Degradacija zida arterija se objasnjava mehanizmom narusavanja Degradacija zida arterija se objasnjava mehanizmom narusavanja

ravnoteze ravnoteze proteaze-antiproteaze-proteaze-antiproteaze-aneurizma aneurizma

Laboratorijska dijagnostika nasledne deficijencije Laboratorijska dijagnostika nasledne deficijencije AATAAT

Metoda izbora je izoelektrofokusiranjeMetoda izbora je izoelektrofokusiranjePomocna metoda je odredjivanje koncentracije AAT u serum (nulta Pomocna metoda je odredjivanje koncentracije AAT u serum (nulta

varijanta)varijanta)Fenotipizacija i analiza DNKFenotipizacija i analiza DNKMonoklonska antitela specificno prepoznaju PiZ AAT –ELISA metodaMonoklonska antitela specificno prepoznaju PiZ AAT –ELISA metoda

Merenje koncentracije AAT u serumuMerenje koncentracije AAT u serumu

Nefelometrija, turbidimetrija i radijalna imunodifuzijaNefelometrija, turbidimetrija i radijalna imunodifuzija..

Fenotipizacija AATFenotipizacija AAT

Poceci-Poceci-Elektroforeza na skrobnom gelu i celuloza acetateElektroforeza na skrobnom gelu i celuloza acetateDanas- Danas- Izoelektrofokusiranje na poliakrilamidu na gradijentu Izoelektrofokusiranje na poliakrilamidu na gradijentu

pH koji je uskog opsega-pH koji je uskog opsega-8 frakcija .8 frakcija .Promene u sastavu AK uticu na naelektrisanje molekule Promene u sastavu AK uticu na naelektrisanje molekule

AAT,menja se pokretljivost varijanti prema katodi ili anodiAAT,menja se pokretljivost varijanti prema katodi ili anodiJedini nacin za detektovanje nultog alela je ispitivanje clanova Jedini nacin za detektovanje nultog alela je ispitivanje clanova

porodice pacijenta sa snizenom koncentracijom AAT u porodice pacijenta sa snizenom koncentracijom AAT u serumu (iskustvo potrebno ).serumu (iskustvo potrebno ).

Razdvajanje pri pH gradijentu 4,2 – 4,9 , dobro se vide frakcije, Razdvajanje pri pH gradijentu 4,2 – 4,9 , dobro se vide frakcije, nespecificna boja nespecificna boja Comassie brilliant blue R-250 Comassie brilliant blue R-250

(Slika 7 ).(Slika 7 ).

Merenje funkcionalne aktivnosti AATMerenje funkcionalne aktivnosti AAT Tripsin inhibitorni kapacitetTripsin inhibitorni kapacitet-sintetski supstrat BAPNA-sintetski supstrat BAPNAElastaza inhibitorni kapacitet- Elastaza inhibitorni kapacitet- sintetski supstrat STAPNAsintetski supstrat STAPNA

Specificna inhibitorna aktivnost AAT Specificna inhibitorna aktivnost AAT

Funkcionalna aktivnost proteina po gramu Funkcionalna aktivnost proteina po gramu imunoreaktivnog proteinaimunoreaktivnog proteina

Prema tripsinu –odnos antigenske koncentracije AAT i tripsin Prema tripsinu –odnos antigenske koncentracije AAT i tripsin inhibitornog kapacitetainhibitornog kapaciteta

Prema elastazi-analognoPrema elastazi-analogno

HVALA NA PAHVALA NA PAŽŽNJINJI !!