EUROPOS SĄJUNGA

Europos socialinis fondas

KURKIME ATEITĮ DRAUGE!

Projektą remia Lietuvos respublika. Projektą iš dalies finansuoja

Europos Sąjunga.

BPD2004-ESF-2.5.0-03-05/0097

„Kauno tarpuniversitetinių

biomolekulinių mokslų magistrinių

studijų integracija“

Naujausių mokslinių pasiekimų, naujausių mokslinių tyrimo

metodų molekulinės biologijos srityje mokslinė studija

MOLEKULINĖ EKOLOGIJA

Prof. Aniolas Sruoga

Biologijos katedra

Vytauto Didţiojo universitetas

Kaunas – 2007

1. MOLEKULINĖ EKOLOGIJA: MOKSLO RAIDA IR TAIKYMAS

Šiuolaikinis poţiūris į populiacijas, kaip vienos rūšies organizmų genetiškai

skirtingų individų grupes, formavosi visą šimtmetį nuo XX a. pradţios. Kadangi

įvairių sričių specialistai akcentuoja skirtingas pupuliacijų savybes, būtina apibrėţti ką

mes vadiname gamtine populiacija – tai vienos rūšies individų grupė, užimanti tam

tikrą teritoriją arba erdvę, kurioje jie keičiasi genetine informacija, palaiko

atitinkamą gausumą ir turi tik tai grupei būdingus požymius.

Visi organizmai, nepriklausomai nuo jų evoliucijos, su aplinka ir tarpusavyje

yra susieti ekologiniais ryšiais. Organizmų tarpusavio sąveika yra tokia sudėtinga, kad

dar ir dabar maţai ţinoma apie konkrečius, tarpusavyje susijusius ir vienas nuo kito

priklausančius ekologinius procesus, vykstančius tarp įvairių individų, populiacijų,

biocenozių. Šių ryšių atskleidimas ir tyrimas – viena iš sudėtingiausių šiuolaikinės

biologijos problemų.

Be to dabartinėse sąlygose tai nėra tik natūraliai vykstantys procesai, nes

ţmogaus praktinė veikla griauna evoliuciškai susiklosčiusius, natūralius mechanizmus

ir pirmiausiai tuos, kurie saugo ir palaiko genetinę įvairovę ir vidinę organizacinę

struktūrą. Antropogeninis poveikis, stipriai keičiantis gamtą, neišvengiamai veikia

populiacijų genetinę struktūrą ir pasireiškia genų daţnių poslinkiu. Be to ţmogaus

poveikis landšaftui, keičia atrankos veiksnius, o tuo pačiu ir populiacijų struktūrą.

Nuo XX a. aštunto dešimtmečio stebimas klimato atšilimas bei pasikeitę

antropogeniniai veksniai turi poveikį ir Lietuvos gyvūnų populiacijoms. Pastebėti

migruojančių paukščių rūšinės sudėties pokyčiai, atskridimo-išskridimo laiko

skirtumai, nebūdingas ţiemojimas, ţuvų rūšinės sudėties, skaitlingumo, biomasės

pokyčiai, vabzdţių dinamikos pokyčiai, erkių pernešamų infekcinių ligų susirgimų

padaţnėjimas dėl klimato kaitos.

Populiacijų genetinė struktūra ir jos genetinis kintamumas yra vienas iš

rodiklių, atspindinčių individų pokyčius besikeičiant įvairiam gyvenimo sąlygų

kompleksui ir leidţiančių įvertinti vykstančių pokyčių mastą (Nei 1987, Ridley 2004,

Beebee 2005).

Genetinis kintamumas yra ir individų adaptacijos įvairioms gyvenimo

sąlygoms rodiklis, todėl jo tyrimas gali būti indikatorius ekologinių sąlygų įvertinimui

ir suteikti informaciją apie genofondo kitimą gamtinėse populiacijose (genų dreifą,

migraciją, aplinkos poveikį). Jo įvertinimas taip pat gali suteikti duomenų apie

migruojančių gyvūnų (pvz., paukščių perinčių bendroje teritorijoje, o ţiemojančių

skirtingose vietovėse, migruojančių į nerštavietes ţuvų) populiacijų genetinę

struktūrą, paukščių pernešamų parazitų kilmės vietą, platinimą; apie introdukuotų ir

reintrodukuotų gyvūnų prisitaikymo mechanizmus.

Nūdienos biomedicinos ir fizikiniuose moksluose tvirtai įsigali

tarpdisciplininė prieiga. Paskutinio XX šimtmečio pabaigoje pasiekti rezultatai

parodė, kad neįmanoma išanalizuoti zoologinių, botaninių, ekologinių, evoliucijos

problemų be genetikos, chemijos, matematikos, informacinių technologijų pasiekimų.

Susiformavo naujos tarpdisciplininės mokslo šakos – molekulinė biologija,

bioinformatika, biomodeliavimas. Molekulinių metodų panaudojimas populiacijų

ekologiniuose tyrimuose šiandien akivaizdus. Terminas “molekulinė ekologija”

pradėtas plačiai naudoti įvairiuose kontekstuose, apimančiuose biogeocheminių ciklų,

biologiškai aktyvių organinių junginių, ar ekotoksikologijos tyrimus po tarptautinio

ţurnalo Molecular Ecology pirmo numerio publikavimo 1992 m. Ţurnalo redkolegija

nurodo, kad leidinyje publikuojami rezultatai, kurie panaudoja molekulinę biologiją

įvairių ekologijos ar populiacijų biologijos aspektų analizei, ypatingą dėmesį skiriant

natūralių ir introdukuotų populiacijų bei jų aplinkos tyrimams panaudojant

molekulinę technologiją, o taip pat rekombinantinių organizmų (kitaip genetiškai

modifikuotų organizmų, GMO) išleidimo į aplinką studijoms. Šiandieninių požiūriu

molekulinė ekologija apibrėžiama kaip molekulinių genetinių žymenų

panaudojimas tiriant ekologijos ir evoliucijos problemas, apimančias genetinių

ryšių tarp individų, populiacijų ir/ar rūšių tyrimus, įvertinant kaip patelės

pasirenka patinus, populiacijų prisitaikymo prie kintančios aplinkos

mechanizmus, efektyvaus populiacijos dydžio svyravimo vaidmenį adaptacijos

procese, naujų rūšių formavimosi mechanizmus, introdukuotų ir reintrodukuotų

rūšių poveikį vietinėms populiacijoms, rūšims, antropogeninį poveikį populiacijų

struktūrai, skirtingų genotipų adaptacijai.

Nuo 1992 m. leidţiamas tarptautinis ţurnalas „Molecular ecology“.

2. TYRIMO METODAI MOLEKULINĖJE EKOLOGIJOJE

Šiandien, dėl ţymiai padidėjusios ţmogaus veiklos, ekosistemos pastoviai yra

veikiamos įvairių abiotinių ir biotinių veiksnių. Pagrindinis vaidmuo organizmų

prisitaikymui besikeičiančiose ekosistemose tenka konkrečioms organizmų

populiacijoms, jų sąveikai bendrijoje. Vertinant populiacijų kintamumo prieţastis ir

dinamiką bei konkrečios organizmų populiacijos genetinės struktūros pokyčius laike

ir erdvėje tam tikroje buveinėje, gali būti panaudoti daugelis metodų leidţiančių

nustatyti individų genotipus. Visus juos galima suskirstyti į keletą grupių: 1)

morfologiniai-biometriniai metodai; 2) citogenetiniai; 3) imunogenetiniai metodai; 4)

biocheminis baltymų polimorfizmas; 5) DNR polimorfizmas.

Kiekybinei genetinio kintamumo charakteristikai bei tyrimo metodams

keliami keletas reikalavimų: 1) fenotipiniai skirtumai, sąlygoti alelių pakitimais

atskirame lokuse, turi būti nustatomi skirtinguose individuose; 2) alelių pakitimai

viename lokuse turi būti atskiriami nuo alelių pakitimų kitame lokuse; 3) ţymi dalis

alelių pakitimų atskirame lokuse turi būti atskiriama viena nuo kitos; 4) tiriami

lokusai turi atspindėti atsitiktinę genų imtį pagal fiziologinį pasireiškimą ir

kintamumo laipsnį.

Kokius žymenis pasirinkti?

Pagrindinė populiacijų biologams iškylanti problema yra rasti tinkamiausius metodus

(Ecology: vol.79(2), 1998 p.372, table 3), kurie patikimai tiksliai atskleistu genetinį

kintamumą išsprendţiant konkrečias problemas, susijusias su:

mažiausiu mėginių kiekiu,

tyrimų išlaidos (santykinė kaina) ir

pavojus sveikatai

Priimtiniausi yra tie metodai, kurie leidţia nustatyti

Didelį alelių skaicių viename lokuse ir/arba

Daug lokusų su dviem ar daugiau dažnai aptinkamais aleliais

Morfologinių poţymių analizė tenkina pirmą ir antrą kriterijų, tačiau kitos

netenkinamos, kadangi tik dalis alelinių pakitimų sukelia morfologinius pakitimus.

Citogenetiniai metodai, plačiai taikomi antropogeninio poveikio

mutageniškumui įvertinti įvairiuose populiacijose, atspindi tik labai ryškius

chromosominius pakitimus – genomines ir chromosomines mutacijas, atsirandančias

dėl labai stipraus mutageninio poveikio organizmams. Nestiprūs veiksniai, sąveika

tarp skirtingų genotipų bendrijoje nėra registruojama.

Nors imunogenetiniai metodai plačiai taikomi gyvūnų selekcijoje (kaip

genetiniai ţymenys), evoliucinių ryšių nustatyme, tačiau vien tiktai kraujo grupių

analizė neduoda pilnos informacijos apie populiacijos kintamumo laipsnį, kadangi

monomorfinių lokusų skaičius tokio tyrimo atveju lieka neaiškus.

XX a. sparčiai vystantis molekulinei biologijai ir atradus baltymų ir DNR

polimorfizmą, pastarieji du metodai padarė perversmą populiacijų ekologijoje,

sudarydami galimybę įvertinti rūšių ir populiacijų genetinį kintamumą laike ir

erdvėje, tirti rūšis, paveiktas ne tik natūralių gamtinių sąlygų, bet ir ţmogaus veiklos

padarinių, neišimant individų iš gamtinės aplinkos, kas ypač svarbu tiriant retas ir

nykstančias rūšis.

2. 1. Baltymų polimorfizmas

Baltymų polimorfizmo analizė paremta baltymų elekrtocheminėmis

savybėmis: baltymų (taip pat ir fermentų) molekulių mišinys migruodamas gelyje ir

veikiamas elektrinio lauko išsiskiria į frakcijas priklausomai nuo krūvio, molekulinės

masės ir baltymų dydţio, kurį sąlygoja organizmo genotipas. Įvairių organizmų

audinių pavyzdţiai, norint išlaisvinti fermentus ir kitus baltymus iš ląstelių,

homogenizuojami (susmulkinami) įvairiuose ekstragavimo buferiuose,

centrifūguojami ir supernatanto (tirpios frakcijos) mėginiai uţnešami ant gelių.

Šiandien elektroforezėje panaudojami ivairiūs tvirti nešėjai – popierius, agaras,

agarozė, krakmolas, poliakrilamidas, acetatceliuliozė ir kt. geliai. Po to, per gelį keletą

valandų leidţiama pastovi elektros srovė, kurios veikiami baltymai juda gelyje.

Judėjimo greitis ir kryptis priklauso nuo pasirinkto elektroforezės metodo bei pačių

baltymų elektrocheminių savybių. Po elektroforetinio frakcionavimo, panaudojus

specifinius histocheminius fermentų daţymo metodus, geliuose vizualiai galima

nustatyti izofermentų išsidėstymą.

Izofermentai arba jų subvienetai tarnauja kaip ţymuo savo genui. Šiuo metu

biocheminės polimorfinės baltymų sistemos plačiai naudojamos molekulinės

ekologijos laboratorijose dėl kelių patogių prieţasčių:

1) izofermentus galima nustatyti maţame ekstrakto kiekyje;

2) tuo pačiu metu ir tokiomis pat sąlygomis galima analizuoti daug mėginių;

3) tyrimo metodika standartizuota daugelyje pasaulio laboratorijų;

4) nereikia daug laiko tiriamų pavyzdţių analizei;

5) aleliniai genai vienas kito nemaskuoja – išryškėja kodominantiškai;

heterozigotose dalyvauja abu tipai subvienetų, homozigotose viena;

6) galima išskirti nedideles mutacijas, nepastebimas vizualiai;

7) galima analizuoti iškart keletą atskirų lokusų, t.y. keletą skirtingų poţymių;

8) analizei reikalingi palyginti nebrangūs reagentai.

2.1.1. Izofermentai

Genetiniame lygmenyje populiacijos yra pakankamai stabilios sistemos, kurių

pastovumą uţtikrina genetinės įvairovės optimumas, bet koks nuokrypis – įvairovės

sumaţėjimas ar padidėjimas, sukelia nepalankias biologines pasekmes ir gali baigtis

populiacijos degradacija. Įprastinėje aplinkoje optimali genetinė įvairovė palaikoma

veikiant populiacinės dinamikos faktoriams – natūraliai atrankai, genų mutacijoms,

migracijai.

Genetinis baltymų polimorfizmas sudaro dalį genetinės įvairovės, stebimos

skirtingų rūšių gamtinėse populiacijose. Vykstant neutralioms mutacijoms alelinuose

genuose, formuojasi daugialypės baltymų formos. Kiekvienas individas tik jam

būdinga, unikalią baltymų sudėtį, todėl individų atsitiktinės imties polimorfizmo

tyrimai atspindi genetinio kintamumo procesus, kurie vyksta visoje populiacijoje.

Izofermentai gali būti panaudojami populiacinėje ir evoliucinėje genetikoje, taip pat

tiriant morfogeninius procesus, izofermentų spektro ekspresijos genetinius

mechanizmus (Glazko, 1985). Tiriant izofermentus galime:

1) Įvertinti vidurūšinį ir tarprūšinį genetinį kintamumą;

2) Išaiškinti filogenetinius ryšius tarp skirtingų taksoninių grupių;

3) Įvertinti genetinio kintamumo kiekį formuojantis rūšiai;

4) Tyrinėti mikroevoliucinio proceso pokyčius

Izofermentai – genėtinai ţymenys. Bet kuris polipeptidas yra ţymuo jį

koduojančiam genui, t.y. jei aptinkami kurio nors tipo subvienetai, tai tas genas yra

aktyviai ekspresuojamas. Populiacinės genetikos tyrimams daţniau pasirenkamos

izofermentinės sistemos, kadangi izofermentus lengviau aptikti dėl jiems būdingo

specifinio katalitinio aktyvumo. Juos patogu naudoti, nes izofermentus galima

nustatyti maţame ekstrakto kiekyje ir tuo pačiu analizuoti daug mėginių vienu metu

(Paulauskas ir kt., 2002).

Taip pat svarbu paminėti, kad aleliai išryškėja kodominantiškai t.y.

heterozigotų atveju vienas kito nemaskuodami. Heterozigotose dalyvauja abu

izofermentų subvieneto tipai, homozigotose tik vienas. Apie genotipą galime spręsti

pagal fenotipų poţymį – izofermentų spektrą. Kodominavimas palengvina

elektrofotogramų išaiškinimą (iššifravimą), nes taip ypatingai patogu dirbti su

laukinėmis rūšims, kada hibridiologinė analizė yra apsunkinta arba visai neįmanoma.

Svarbus aspektas, kuris teikia izofermentams pranašumą, tai laikas, kadangi

tiriamų pavyzdţių analizė nereikalauja daug laiko bei rezultatai gaunami greitai bei

yra lengvai įvertinami, nereikia išskyrinėti DNR. Izofermentai leidţia aptikti

nedidelius genų mutacijas, nepastebimas vizualiai ir tuo pačiu metu analizuoti keletą

atskirų genų lokusų.

Šis metodas duoda pilna informaciją apie populiacijos kintamumo laipsnį.

Tačiau kaip ir kiekvienas metodas ir šis turi savotiškų trūkumų. Izofermentai pasiţymi

maţu gausumu bei ţemu polimorfizmo lygiu. Jų spektrus kartais sudėtinga

interpretuoti dėl susidarančių kompleksų, kurie atsiranda dėl genų poliploidijos arba

duplikacijos, bei integralinių heterodimerų susiformavimo.

Dirbant su izofermentais galimi netikslumai, kurie atsiranda pakitus

izofermentų sudėčiai skiriančioje terpėje. Be to, imant pavyzdţiui iš įvairių audimų ir

juos homogenizuojant, gali išsiskirti fiziologiškai aktyvios medţiagos, kurios sukelia

ryškius pakitimus tiriamo fermento molekulėje.

Analizuojant izofermentus elekroforeziniais metodais išryškinami tiktai tokie

aleliai, kurie sąlygoja izofermentų, besiskiriančių elektroforeziniu judrumu. Dalis

pasikeitusių aminorūgščių gali keisti polipeptido elektrinį krūvį netiesiogiai keičiant

fermento antrinę, tretinę arba ketvirtinę struktūrą. Taigi izofermentai parodo tik dalį

egzistuojančio biocheminio polimorfizmo. Be to, tas pats elektroforezinis alelis gali

turėti keletą genetinių variantų (Ţukas, 2005).

Baltymų polimorfizmo analizė paremta baltymų elektrocheminėmis

savybėmis: baltymų (taip pat fermentų) molekulių mišinys, migruodamas gelyje ir

veikiamas elektrinio lauko, išsiskiria į frakcijas priklausomai nuo krūvio, molekulinės

masės ir baltymų dydţio. Gauti rezultatai vadinami elektromorfais. Tai pastebėjo XX

amţiaus trečiajame dešimtmetyje A. Tisel. Priklausomai nuo subvienetų skaičiaus,

baltymai elektroforezės metu gali formuoti keletą elektromorfų tipų. Homozigotų

baltymai, koduojami vienodų vieno lokuso alelių, formuoja vieną frakciją.

Kartais elektromorfai, vienodai judantys gelyje, gali būti koduojami skirtingų

alelių, nes: 1) genetinis kodas yra išsigimęs – viena amino rūgštis gali būti koduojama

keliomis nukleotidų sekomis; 2) pakeitus kai kurias amino rūgštis, elektroforezinis

viso baltymo judrumas gali nepasikeisti; 3) gali atsirasti netikslumų dėl baltymo

sudėties pokyčių ruošiant medţiagą.

2.1.2. Izobaltymai

Polimorfizmas būdingas ne tik fermentams, bet ir daugeliui nekatalitinių

baltymų Hemoglobinas, mioglobinas, feritinas, aktinas ir miozinas turi po keletą

izoformų, kadangi yra oligomerai, jie sudaryti iš dviejų arba daugiau subvienetų tipų.

Nefermentinių baltymų daugybinės formos ištirtos maţiau nei fermentai, kadangi dėl

specifinių katalitinių savybių fermentus lengviau aptikti grubiuose ekstraktuose

(Ţukas, 2005). Heterogeniškumo atveju, izobaltymams būdingos tos pačios genetinės

ir negenetinės prieţastys. Kadangi baltymų polimorfinėms sistemoms būdingas

nesudėtingas išskyrimas, stabilumas, informatyvumas ir paprasta genetinė kontrolė,

jos plačiai naudojamos populiaciniuose tyrimuose.

Nespecifinio baltymo elektromorfuose išsiskiria makroglobulinai,

postransferinai, transferinai, pretransferinai, postalbuminai, albuminai ir

prealbuminai. Ţmogaus ir gyvūnų kraujo plazmoje elektroforezės būdu geriausiai

išsiskiria albuminai, α1 - ,α2 -, β1-, β2- ir γ – globulinai ir transferinai.

Albuminai sudaro 54-58 % visų plazmos baltymų. Jie dalyvauja įvairių

medţiagų, turinčių hidrofobines savybes transporte bei osmosinio slėgio reguliacijoje

(Шубин, Ефимцева, 1988). Jų polimorfiškumas yra aprašomas remiantis daugeliu

naminių gyvūnų tyrimais: arklio, didelių raguotų galvijų, oţkų ir kiaulių. Baltymą

formuoja viena polipeptidinė grandinė.

Transferinai išskirti iš daugelio organizmų yra polimorfiniai, kontroliuojami

autosominio lokuso polialelinės sistemos.

2.1.3. Baltymų elektroforezė ir jos metodika

Elektroforezė yra vienas iš svarbiausių baltymo polimorfiškumo tyrimo

metodų. Elektroforezės tyrimų pradininku laikomas švedų mokslininkas Tisel (1937

m.), kuris nustatė, kad panaudojus elektroforezę laisvame tirpale kraujo serumo

globulinus galima išskaidyti į keletą frakcijų – elektromorfų. Elektroforezės metodas

pirmą aprašytą tiriant esterazių heterozigotiškumą (Market, Hunter, 1957). Krakmolo,

poliakrilamido gelių panaudojimas, histocheminio daţymo metodikos įsisavinimas

atvėrė plačiai duris augalų bei gyvūnų genetinio kintamumo tyrimui ir įvertinimui ne

tik tarp atskirų rūšių bet ir rūšies viduje. 1966 metais Harry, Johson, o ypač Lewontin

ir Hubby publikacijos elektroforezės srityje, tapo bendru metodu gamtinių populiacijų

struktūrai .

Tyrinėjant gamtinių populiacijų genetinę struktūrą, ţymenimis naudojami

įvairūs baltymai ir fermentai, elektrofotogramose matomi histochemiškai daţant

gelius po elektroforezės. Baltymai, kaip ir juos sudarančios amino rūgštys, yra

amfoteriniai elektrolitai (gali būti anijonais ir katijonais priklausomai nuo pH). Dėka

baltymo dalelių judėjimo elektros lauke baltymų mišinius galima frakcionuoti. Per

tirpalą leidţiant elektros srovę, įelektrintos molekulės bei jonai juda elektrodo,

turinčio priešingą elektros krūvį link. Judėjimo greitis priklauso nuo judančios dalelės

krūvio dydţio, jos formos ir molekulinės masės, tirpiklio savybių, temperatūros ir kitų

veiksnių (Glemţa, 1987). Dėl šių skirtumų elektrinio lauko veikiamos elektringos

dalelės tirpale yra atskiriamos. Tai ir sudaro elektroforezės pagrindą. (Mickevičius,

1999)

Prie kitų veiksnių, veikiančių judrumą priklauso :

Elektrinis laukas. Jo įtaka dalelių atskyrimui priklauso nuo

nuolatinės srovės stiprumo, įtampos ir varţos. Jonų pernešimo greitis yra

proporcingas srovės stiprumui, o nueitas kelias – srovės laidumo laikui. Migracijos

greitis yra atvirkščiai proporcingas varţai. Aukštos įtampos naudojamos

ţemamoliniams junginiams frakcionuoti. Išskiriant šilumai šie dydţiai kinta, todėl

būtina šaldymo sistema.

Buferis palaiko ir stabilizuoja pH, įtakodamas medţiagos

migracijos greitį. Pradinės buferinių tirpalų savybės: joninė jėga, pH ir buferinė talpa.

Padidėjus joninei jėgai, keičiasi ir suminė srovė, todėl padidėja ir išskiriamos šilumos

kiekis. Jei naudojame buferines sistemas su ţema jonine jėga, srovė ir išsiskiriantis

šilumos kiekis sumaţėja, bet padidėja difuzija. Labai svarbu įvertinti buferio pH, nes

priklausomai nuo jo keičiasi judančių junginių kryptis ir dydis. Buferinė talpa

pasiţymi didesniu ar maţesniu sugebėjimu neutralizuoti elektrolizės produktus,

susidarančius elektroforezės metu.

Absorbcija – (pavyzdţio molekulių sulaikymas ant nešėjų)

Didţiausia absorbcija pasiţymi popierius, todėl maţėja metodo skiriamoji geba.

Elekroosmozė – (krūvio atsiradimas tarp buferinio tirpalo vandens

molekulių ir nėšejaus paviršiaus). Iššaukia H30 susidarymą, kuris pagreitina katijonų

judrumą.

Be to, pirminės fermento struktūros pasikeitimas dėl paveldimoje medţiagoje

įvykusios mutacijos, daţnai nors ne visada, įtakoja ir suminį makromolekulės krūvį.

Todėl fermento molekulės, koduojamos skirtingų to paties geno alelių, daţniausiai

elektriniame lauke judės skirtingu greičiu ir uţims skirtingas pozicijas po

elektroforezės (Aлтyхob, 1983).

Elektroforezių tipai:

1. Su judama riba – makromolekulės yra visame tirpalo tūryje. Tai

analitinis metodas, naudojamas nustatant baltymų judrumą ir izoelektrinį tašką;

2. Zoninė – tirpalas uţnešamas dėmių arba juostų pavidalu.

Naudojama švarumo nustatymui, judrumo ir konformacijos analizavimui, taip pat

gryninimui.

3. Nepertraukiama – pavyzdţių uţnešimas nepertraukiamose zonose

Elektroforezė gali būti atliekama skystoje terpėje. Šis metodas pagrįstas

skiriamųjų ribų tarp baltymų ir buferinio tirpalo pastebėjimu ir fiksavimu. Tokiu būdu

nustatoma ar baltymų tirpalas yra vienalytis. Šiuo metodu nustatyta sudėtinga kraujo

baltymų struktūrą ir daugelio fermentų elektroforezinis grynumas.

Tvirtuose nešikliuose: popieriaus, celiuliozės acetato, plonos silikagelio

aliuminio oksido arba celiuliozės sluoksnių, krakmolo, agaro bei poliakilamido.

Bendra visų šių nešiklių ypatybė yra ta, kad atskiriamos medţiagos juda aiškiomis

zonomis ir jose susitelkusias medţiagas po to lengva nustatyti kitais analizės metodais

(Mickevičius, 1999). Dėl gelių cheminių savybių (juose beveik nepasireiškę sorbcija

nei elekroosmozė), baltymų zonos neišsiplečia. Elektroforezė geliuose atliekama

daţniausiai tada, kai reikia analizuoti, o ne preparatyviai aiškinti baltymus (Glemţa,

1987).

Agaro gelis daţniausia naudojamas kai reikia analizuoti nedidelius medţiagų

kiekius. Elektroforezė acetilceliuliozėje naudojama klinikiniuose tyrimuose, kai reikia

greitai diagnozuoti kai kuriuos susirgimus, pasireiškiančius eritrocitų ir kraujo serumo

izofermentų spektrų pokyčiais. Elektroforezę krakmolo gelyje kraujo serumo baltymų

analizei pirmasis panaudojo Smith, 1959 metais. Jis patogu naudoti dirbant su

nepatvariais fermentais, kurių aktyvumo išsaugojimas elektroforezės metu susijęs su

tam tikrais sunkumais.

Vienas iš daţniausiai naudojamų gelių yra poliakrilamido, kuri pasiţymi

geromis fizinėmis ir cheminėmis savybėmis. Pirmasis šį gelį panaudojo Riamond su

kolegomis 1950 metais. Gelis gaunamas maišant ir polimerizuojant akrilamidą su N,

N′-metil-bis-akrilamidu terpėje, kurioje yra katalizatorius. Katalizatorius , kaip laisvų

radikalų šaltinis, naudojamas oksidacinės-redukcinės sistemos. Pavyzdţiui:

1. Amonio persulfatas -N,N,N,N′- tetrametiletilendiamidas (TEMED)

2. Amonio persulfatas 3 dimetilaminproprio-nitrilas ir kt.

Svarbiausia, kad katalizatorių sistemos neturi veikti nei buferinių tirpalų, nei

gelio elertolaidumo bei klampumo. Gelio klampumas, elastingumas ir tvirtumas

priklauso nuo poliakrilamido polimerizacijos laipsnio (nuo grandinių ilgio) ir nuo

susiuvimo laipsnio, t.y. nuo pridėto N, N′-metil-bis-akrilamido kiekio

Poliakrilamidinis gelis yra stabilus ir inertiškas, labilios struktūros (tai sudaro

galimybę gauti gelius su norimo dydţio poromis). Poliakrilamidinis gelis

neatsorbuojasi, neturi elektooosmozės, atsparus pH ir temperatūros kitimais, netirpsta

daugelyje tirpikliuose.

Atilikus elektroforezę fermentai yra daţomi. Specifiškumą apsprendţia

daţančio tirpalo sudėtyje esantis specifinis analizuojamam fermentui substratas ir

daţančios druskos, kurios reaguoja su fermento kanalizuojamos reakcijos produktu

(Aйaлa, 1984, Harry , Hopkinson, 1977).

Toje vietoje kur tiriamasis fermentas, vyksta cheminė reakcija :

Substratas → Produktas+ druska → spalvota substancija

Ilgesniam gelių saugojimui agaro, acetilceliuliozės ir krakmolo gelio

pavyzdţiai dţiovinami, o poliakrilamido laikomi 7% acto rūgštyje po to dţiovinami.

Elektroforezės svarbiausi privalumai:

1. Analizuojamas sudėtingas baltymų mišinys. Naudojant specifinius

histocheminius daţymo metodus, nebereikia papildomai jų frakcionuoti

2. Yra galimybė tyrinėt švieţiai išskirtą iš įvairių audinių medţiagą

3. Analizės paprastumas ir gaunamų rezultatų informatyvumas.

Amino rūgščių skirtumų išskyrimas baltymuose priklauso nuo biologinių ir

biocheminių elektroforezės sąlygų, tokių kaip tiriamas audinio ir gelio tipas. Jei ne

visada vienodi visiems individams ir laboratorijoms, kuriose yra atliekama genetinio

kintamumo analizė. Skirtumai sąlygose gali įtakoti kai kuriuos baltymų polimorfizmo

išskyrimo skirtumus (Глазко, 1993).

Tačiau ir baltymų polimorfizmas atspindi tik dalį visų skirtumų DNR

nukleotidų sekose, nes 1) skirtumai tarp sinoniminių kodonų nekeičia koduojamų

aminorūgščių; 2) 90% ar net daugiau DNR, kuriai priklauso intronai ir vieną nuo kito

geno skiriančios nukleotidų sekų dalys, yra netransliuojamos. Todėl paskutiniame

dešimtmetyje plačiai tiriamas DNR polimorfizmas.

2.2. DNR polimorfizmas

Įvertinti DNR polimorfizmo dydį pagal nukleotidus galima keliais būdais:

tiesioginiais DNR sekvenavimo metodais nustatant konkrečios genomo dalies

nukleotidų sekos įvairovę skirtinguose individuose, ir netiesioginiu pagal DNR

restricinių fragmentų ilgio polimorfizmą (RFIP), panaudojus Southern blotingo

metodą; itin variabilias DNR sekas, sutrumpintai ţymimos VNTR, dar vadinami

hipervariabilūs minisatelitai (DNR “pirštų atspaudai”, angl. fingerprints); labai

trumpas pasikartojančios sekos STR, pavadintos mikrosatelitais, kurias galima

identifikuoti genų introninėse dalyse arba speiserinėje DNR. Hipervariabilių sekų

tyrimui pakanka labai nedaug pradinės DNR kiekio, nes panaudojus polimerazinės

grandininės reakcijos (PGR) metodą, specifiniai DNR fragmentai pagal atitinkamus

pradmenis yra padauginami (amplifikuojama) iki tokio kiekio, kurio uţtenka

elektroforezinei DNR analizei, nudaţius etidţio bromidu ar sidabro nitratu.

Naudojant įvairias restrikcines endonukleazes ir DNR ţymes, nustatytas daug

didesnis kintamumas nei pagal kraujo grupes, izofermentus ir kitus poţymius,

paveldimus pagal Mendelio dėsnius.

2.3. Rezultatų įvertinimas

Gautiems molekulinės ekologijos rezultatams įvertinti šiandien plačiai

naudojamas kompiuterinis duomenų apdorojimas. Izofermentinių sistemų analizės

rezultatų apskaičiavimui ir genetiniams panašumams bei skirtumams įvertinti

naudojamos kompiuterinės programos Biosys-1, Biosys-2 ir DNR - PopGene32,

TREECON. Statistiniams duomenų apdorojimams taip pat panaudojamos

kompiuterinės programos PRIMER 5.0, STATISTICA 6.0, taikomos tiek vienmatės

tiek daugiamatės analizės: Kruskalo-Voliso testas; dispersinės analizės (ANOVA,

MANOVA/MANCOVA), diskriminantinė analizė, multidimensinio skirstymo (MDS)

analizė bei RELATE ir 2STAGE analizės – pastarosios naudotos skaičiuojant

koreliaciją tarp dviejų matricų arba tarp daugiau nei dviejų atstumų matricų.

Dendrogramų sudarymui naudojamas UPGMA grupavimo metodas.

3. POPULIACIJOS, POPULIACINĖ GENETIKA

3.1 Populiacijos samprata ir tipai

Populiacija (lot. populiatio, populus – liaudis, minia) – tai vienos rūšies

genetiškai skirtingų individų grupė, užimanti tam tikrą teritoriją arba erdvę, kurioje

jie keičiasi genetine informacija. Populiacija yra elementari rūšies egzistavimo forma.

Populiacijų ekologijos terminą pirmą kartą panaudojo C. Elton (1927) savo

knygoje “Gyvūnų ekologija” teigdamas, kad populiacija yra svarbiausias ekologinis

vienetas, nes populiacijoje gausiai atsiskleidţia rūšies santykiai su aplinka ir

adaptacinės galimybės.

Populiacijų ekologijos (demekologijos) kūrėjais laikomi A. Macfelden (1965)

ir S. Švarc. Jie tvirtino, kad nėra kitos ekologijos, tik populiacijų ekologija, ir kad tik

populiacijų ekologijos pagalba galima išspręsti visų lygių ekologines problemas. Tik

tada, kai E. Odum (1983, 1986) pateikė ekosistemų mokslo koncepciją, tapo aišku,

kad populiacijų ekologija nėra visaapimantis mokslas.

Biologinių sistemų hierarchijoje rūšis yra aukščiau uţ populiaciją. Kiekviena

rūšis gali sudaryti daug populiacijų. Pavyzdţiui, ţmonių populiacijų yra labai daug, o

rūšis viena – Homo sapiens.

Skirtumai tarp tos pačios biologinės rūšies populiacijų nėra dideli. Tos pačios

rūšies skirtingų populiacijų individai skiriasi morfologiškai. Gyvūnai skiriasi kūno

dydţiu, plaukų, akių spalva, augalai – stiebo forma, lapų, ţiedų ir vaisių dydţiu,

forma bei spalva. Esminiai yra vidiniai skirtumai, slypintys genofonde. Kiekviena

populiacija turi savo genofondą. To paties genofondo individai yra genetiškai

nevienodi ir individualaus vystymosi metu nevienodai prisitaiko prie aplinkos sąlygų.

Tos pačios rūšies skirtingų populiacijų individai gali tarpusavyje kryţmintis ir keistis

genetine informacija.

Populiacijoje vyksta vienokia ar kitokia panmiksija – įvairių tipų gametų

kryţminimasis populiacijos viduje. Tarp skirtingų rūšių biologinių savybių,

gyvybingumo, sugebėjimo prisitaikyti vienokiose ar kitokiose sąlygose.

Populiacijų tipai nėra grieţti. Pagal uţimamas teritorijos dydį ir individų

skaičių populiacijos skirstomos į geografines, ekologines ir elementariąsias arba

mikropopuliacijas.

Geografinės populiacijos uţima didţiausias teritorijas ir yra didţiausios

individų skaičiumi. Pavyzdţiui, septyntaškė boruţė, uţimanti didelį arealą Europoje,

Azijoje ir Šiaurės Amerikoje, sudaro keturias geografines populiacijas, kurios skiriasi

aktyvaus periodo trukme. Didţioji zylė sudaro penkias geografines populiacijas, kai

kurios iš jų net tarpusavyje nesikryţmina.

Ekologinės populiacijos – tai vietinės biotopinės populiacijos, gyvenančios

konkrečioje teritorijoje ar erdvėje. Pagal uţimamą teritoriją ir pagal individų skaičių

jos daug maţesnės uţ geografines populiacijas ir silpnai izoliuotos.

Elementariosios arba mikropopuliacijos nėra savarankiška rūšies egzistavimo

forma. Jos skiriasi viena nuo kitos morfologiniais ir fiziologiniais poţymiais, tačiau

tarp jų vyksta pilna genetinės informacijos kai俯a.

Visos populiacijos yra dinamiškos. Kintant populiacijos individų skaičiui ir

uţimamos teritorijos dydţiui, populiacijos tipas gali keistis.

Nuolat keliaujančių ar klajojančių rūšių, pavyzdţiui, šiaurės elnių,

populiacijos yra labai didelės, bet jų maţai. Sėslioms rūšims būdinga daug smulkių

populiacijų.

Pagal gebėjimą savarankiškai daugintis populiacijos skirstomos į

nepriklausomas, iš dalies priklausomas, priklausomas, pseudopopuliacijas ir laikinas

populiacijas.

Nepriklausomos arba pastovios populiacijos gali daugintis savarankiškai, be

kitų tos pačios rūšies individų imigracijos.

Iš dalies priklausomos populiacijos gali daugintis savarankiškai, bet individų

imigracija padidina populiacijos gausumą ir gyvybingumą.

Priklausomos populiacijos yra tokios, kuriose gimstamumas nekompensuoja

mirtingumo. Jeigu į tokią populiaciją neimigruoja kitų tos pačios rūšies populiacijų

individai, ji maţėja, degraduoja ir išnyksta.

Pseudopopuliacijos nesugeba savarankiškai reguliuoti savo narių skaičiaus ir

visiškai priklauso nuo individų imigracijos iš kitų populiacijų.

Laikinos arba periodiškos populiacijos susiformuoja iš nuo kitų populiacijų dėl

klimatinių ir mitybos veiksniu poveikio atskilusių individų.

Kiekvieną populiaciją apibūdina šie rodikliai:

gausumas;

tankumas;

vidinė struktūra;

gimstamumas;

mirtingumas;

augimo greitis;

migracija.

Populiacijos gausumas yra bendras populiacijos individų skaičius jos

uţimamoje teritorijoje.

Populiacijos tankumas tai populiacijos individų skaičius jos uţimamos

teritorijos ploto (km2, m

2, ha) arba erdvės tūrio (m

3) vienete. Aukštesniųjų gyvūnų bei

ţmonių populiacijų tankumas paprastai vertinamas individų skaičiumi kvadratiniame

kilometre.

Populiacijos gausumą ir tankumą reguliuoja aplinkos veiksniai: klimato

sąlygos, dirvoţemio derlingumas, konkuruojančių rūšių poveikis, parazitai, plėšrūnai

ir kt. Vienos populiacijos koncentruojasi nedidelėse teritorijose, pavyzdţiui olandai,

japonai, kitos pasklinda plačiai, uţimdamos dideles teritorijas (rusai). Įsisavindamos

naujas teritorijas ir didėdamos individų skaičiumi, populiacijos pretenduoja iš

elementarių pereiti į ekologines.

Populiacijos struktūra priklauso nuo abitinių, biotinių ir antropogeninių aplinkos

veiksnių visumos. Dėl morfologinių, fiziologinių, biocheminių, genetinių procesų,

populiacijos individų lyties, išsidėstymo uţimamoje teritorijoje, amţiaus, dauginimosi

ypatumų, konkurencijos susiformuoja sudėtinga vidinė populiacijos struktūra.

3.2. Populiacinė genetika

Populiacinė genetika yra genetikos mokslo šaka, tirianti paveldimumo ir

kintamimo dėsningumus organizmų grupėse, t.y. populiacijose, kurie išreiškiami genų

daţnių paskirstymu ir kitimu įvairiose populiacijose.

Populiacija (lot. populatio – minia, liaudis) – tai istoriškai susiklosčiusi,

vienos biologinės rūšies genetiškai skirtingų individų grupė, gyvenanti tam tikroje

ribotoje rūšies arealo erdvėje ar teritorijoje ir turinti savybių, įgalinančių jai ilgai

egzistuot.

Populiacinėje genetikoje daugiausia dėmesio skiriama lokalaus inbrydingo

grupėms (kuo didesnėms ir geografiškai struktūrizuotoms) – demams, lokaliomis

populiacijomis, Mendelio populiacijoms. Būtent šiose grupėse ir vyksta sisteminiai

alelinių genų daţnių pasikeitimai.

Populiacija, kurioje bet kuris populiacijos narys gali atsitiktinai poruotis su bet

kuriuo kitu populicijos nariu (manoma, kad paprastai jie yra skirtingų lyčių) vadinama

Mendelio populiacija. Aukščiausio rango Mendelio populiacija yra rūšis.

Atsitiktinis kryžminimas – kryţminimas kai poprų susidarymui neturi įtakos

genetinė konstitucija. Asortatyvinis kryžminimas – porų susidarymą sąlygoja

genotipas.

Vienos biologinės rūšies individų grupė, gyvenanti tam tikroje ribotoje rūšies

arealo erdvėje ar teritorijoje dar vadinama lokalinė populiacija.

Organizmų pasiskirstymas rūšies areale nera vienalytis – organizmai jungiasi į

šeimynines grupes (po 4-10 individų). 20-40 šeimyninių grupių gyminystės ryšiais

susijungia į demus, o apie 4% kryţminimų įvyksta tarp organizmų iš skirtingų

lokalinės populiacijos demų.

Genofondu vadinama visų populiacijos individų genotipų visuma. Diploidinių

organizmų populiacijos, sudarytos iš n individų, genofondas susideda iš 2n genomų,

t.y. iš 2n kiekvieno lokuso genų ir n porų homologinių chromosomų.

3.3 Populiacijos genetinė struktūra: fenotipų, genotipų, alelių dažnių įvertinimas

populiacijoje

Populiacijos genetinę struktūrą ir genofondo kitimą nusako atskirų lokusų

alelių daţnis arba genotipų daţnis.

Vienetas, kuriuo operuoja populiacinė genetika, yra genas - fizinis vienetas,

kuris reprodukcijos procese yra perduodamas iš tėvų vaikams ir kuris nulemia pačias

įvairiausias organizmo savybes. Genui būdingos kelios alternatyvios savybės,

būsenos. Todėl tokie genai vadinami aleniniais. Molekuliniu poţiuriu aleniniai genai

– tai skirtinga nukleotidų seka lokalizuota toje pačioje DNR atkarpoje.

Populiacinėje genetikoje laikoma , kad bet kuriame genetiniame lokuse yra

bent du aleliniai genai (genomas diploidinis). Jei jų nukleotidų seka yra identiška,

laikoma, kad individas pagal šį geną yra homozigotas, jei ne – heterozigotas, o

kartais sudėtinis (compound) heterozigotas.

Fenotipų dažnis – tai konkretaus feno daţnio pasireiškimas konkrečioje

individų grupėje, lygus individų pagal šį feną skaičiaus santykiui su tirtų individų

skaičiumi (n).

Jei ţinomas ryšys tarp genotipų ir juos atitinkančių fenotipų, tai pagal

stebimus fenotipų daţnius galima apskaičiuoti genotipų dažnius. Konkretaus

genotipo daţnis randamas padalijus atitinkamų genotipų skaičių imtyje iš viso imties

genotipų skaičiaus n.

Fenotipų daţnis ne visada lygus genotipų daţniui. Jis lygus tik recesyvinių ir

kodominuojančių alelių genotipų daţniui.

Alelinis dažnis – tai tam tikro alelinio geno daţnis konkrečioje individų

grupėje. Bet kurio alelinio geno daţnis (p) tiriamoje individų grupėje yra lygus

dvigubo homozigotų (Hm) pagal šį alelinį geną skaičiaus (kadangi kiekvienas

homozigotas turi du tuos pačius alelinius genus) ir heterozigotų (Ht) pagal šį alelinį

geną skaičiaus sumai padalintai iš dvigubo individų skaičiaus (n) tiriamoje grupėje

(nes kiekvienas individas turi du alelinius genus), t. y.

p=(2 Hm+Ht)/2 n (3.1.1)

Abiejų alelinių genų daţnių suma populiacijoje visada lygi vienetui, t.y. (p+q=1).

Taip nustatytas alelinio geno daţnis yra tik empirinis ir gali skirtis nuo tikrosios šio

geno daţnio reikšmės konkrečioje populiacijoje. Todėl imtyje tiriamų individų

skaičius turi būti pakankamas (ne maţesnis 20).

Retais aleliniais genais vadinami tokie genai, kurių daţnis tiriamoje

populiacijoje yra maţesnis uţ 0,05. Daugelis retų alelinių genų yra ţalingi ir dėl to

populiacijoje daţniausiai palaikomi tik pasikartojančių mutacijų.

Genų ir genotipų dažniai

Genotipų daţnis yra pakankamai pastovus populiacijos poţymis, o genų daţniams

neaptinkama ypatinga populiacinė specifika (Benedictis de, 1978)

Genofondų kintamumas gali būti aprašomas tiek genų, tiek ir genotipų daţniais. Imtis

turi būti reprezentacinė visos populiacijos individų atţvilgiu.

Genofondas – visų populiacijos individų genotipų visuma. Diploidiniams

organizmams jis lygus 2N, kur N – individų skaičius. Kiekviename genome yra

uţkoduota visa genetinė informacija, kurią tas individas gavo iš vieno iš tėvų.

Populiacijos genofondas – susideda iš 2N kiekvieno lokuso genų ir N homologinių

chromosomų porų, kur N – individų skaičius. Išimtis: lytinės chromosomos ir su

lytimi sukibę genai, kurie, kiekviename heterogametiniame organizme, egzistuoja po

vieną egzempliorių.

Genų daţniai:

A=(2*A) + AB, B=(2*B) +AB – alelių skaičius, išskaičiuojamas iš fenotipų;

Bendras alelių skaičius – 2n, nes kiekvienas individas neša po du vieno alelio

variantus;

Alelio A daţnis : a=A/2n, n – individų skaičius.

Polialelinių sistemų atveju skaičiavimų principas išlieka tas pats: homozigotiniai

individai neša po du tuos pačius alelius, heterozigotiniai – po vieną skirtingų tipų.

Viena prieţasčių, kodėl populiacinėje genetikoje daţniau genetinis kintamumas

aprašomas naudojant genų o ne genotipų daţnius yra ta, kad alelinių variantų yra

ţymiai maţiau nei genotipų. {jei skirtingų alelių skaičius lokuse yra k, tai įmanomų

genotipų skaičius yra k(k+1)/2} (Altūhov)

Sudėtingumas aprašant paveldimos informacijos visuma atsiranda dėl didelio

segreguojančių lokusų skaičiaus genome. Bet kokiu atveju, vienintelis būdas aprašyti

paveldimą informaciją – alelinių genų daţnių nustatymas kiekvienam lokusui. Ţinant

šį dydį ir stebint jo pokyčius laike (erdvėje) atsiranda galimybė įvertinti genetinio

proceso vyksmus populiacijoje veikiant įvairiems išoriniams ir vidiniams faktoriams.

Kodominantinio paveldimumo atveju: genų daţnių įverčių patikimumas priklauso nuo

laukinės populiacijos imties dydţio. Būtinas imties dydis priklauso nuo populiacijos

genetinės struktūros ir turi būti nustatomas preliminarių tyrimų metu.

Tarkim, kad iš N diploidinių individų N1 turi alelį A, N2 – heterozigotos AB, N3 –

homozigotos BB; visų N1,2,3, suma lygi bendram individų skaičiui N. tokiu atveju

bendras genų skaičius yra 2N. kiekviena homozigota AA turi du A genus, kiekviena

heterozigota AB, po vieną A ir B geną. Bendras A genų skaičius populiacijoje A =

2N1+N2, o šio geno daţnumas: pA= (2N1+N2)/2N = (N1+1/2N2)/N. taip pat aprašomas

ir B alelio daţnumas qB. Tuomet q + p = 1. Tokiu pat principu skaičiuojama ir

polialelinėms sistemoms.

Pav. Ryšys tarp alelių ir genotipų daţnio pagal Hardy-Weinbergo pusiausvyrą

3.4. Populiacijos kintamumas

Genetinis kintamumas yra veiksnys padedantis prisitaikyti prie aplinkos

sąlygų pokyčio. Genetiniai procesai dalyvauja populiacijų dydţio reguliavime ir

kituose ekologiniuose procesuose. Atsiradę pakitimai gali nepasireikšti palikuonių

fenotipe, būti recesyvinėje arba heterozigotinėje formose. Tokiems pakitimams

pasireiškiant fenotipe, galima natūrali atranka, dėl kurios gali susiformuoti ir nauja

rūšys ( Aлтyхob, 1983).

Genetinis kintamumas plačiai paplitęs gamtinėse populiacijose, dėl ko yra palankios

sąlygos evoliuciniam kintamumui. Įvairių organizmų genetinis kintamumas yra

skirtingas (1 lentelė).

1 lentelė. Kai kurių gyvūnų ir augalų genetinis kintamumas gamtinėse populiacijose

(Ayala, 1984)

Organizm

ai

Rūšių

skaičius

Vidutinis

lokusų

skaičius

rūšyje

Vidutinis

polimorfizmas

(P)

Vidutinis

heterozigotiškumas(H)

Bestubur

iai

Drosophil

a

2

8 24 0,529 1,15

Vapsvos 6 15 0,243 0,062

Kiti

vabzdţai 4 18 0,531 0,151

Jūrinai

bestuburiai

1

4 23 0,439 0,124

Sausumos sraigės 5 18 0,437 0,15

Stuburin

iai

Ţuvys

1

4 21 0,306 0,078

Varlagyvi

ai

1

1 22 0,336 0,082

Ropliai 9 21 0,231 0,047

Paukščiai 4 19 0,145 0,042

Ţinduolia

i

3

0 28 0,206 0,051

Augalai

Svidulkin

iai

1

2 15 0,231 0,033

Kryţmad 5 17 0,344 0,078

ulkiai

Vidurkis

Bestuburi

ai

5

7 22 0,496 0,134

Stuburini

ai

6

8 24 0,247 0,06

Augalai

1

7 16 0,264 0,046

Pagrindinai genetinio kintamumo parametrai yra polimorfizmo lygis (P) ir

vidutinis (faktinis) individų heterozigotiškumas (Ho) bei alelių skaičius lokuse (A).

Šie parametrai naudojami atliekant skirtingų ar pakankamai tarpusavyje nutolusių

gyvūnų taksonominių grupių genetinio kintamumo lyginamąją charakteristiką.

Evoliucijos eigoje dėka mutacijų keičiasi genai ir populiacijoje sutinkami

nevienodoje, o keliose formose. Tokie genai kurie sudaryti daugiau nei iš vieno alelio

vadinami polimorfinais. Polimorfinai aleliai yra apsprendţiami dviejų ar daugiau,

ryškiai besiskiriančių formų koegzistavimą.

Populiacijų analizę galima vykdyti naudojant bet kokį polimorfinių sistemų

kiekį. Aišku, didinant baltymų sistemų kiekį padidėja ir galimybė aptikti skirtumus

tarp populiacijų.

Daug geresnis genetinio kintamumo matas gali būti vidutinis individų

heterozigotiškumas. Skirtingai nuo polimorfizmo šis matas pasiţymi tuo, kad jame

nėra laisvumo ir netikslumo. Populiacijos heterozigotiškumas skaičiuojam dviem

etapais. Pirma susumuojama heterozigotus h pagal kiekvieną genetinį lokusą j, o po to

gautą skaičių padalijus iš tirtų individų skaičiaus n bei tirtų lokusų skaičiaus k vidurkį:

Polimorfiniu laikomas toks lokusas, kuriame esančio daţniausiai

pasitaikančio alelinio geno daţnis yra maţesnis uţ 0,95.

Lokusas, kuriame neaptikta skirtingų alelių nėra polimorfinis, jis vadinamas

monomorfiniu.

Populiacijos polimorfiškumas (polimorfinių lokusų dalis) nustatumas polimorfinių

lokusų skaičių dalijant iš tirtų lokusų skaičiaus k :

P = polimorf. lok. / k

Vidutinis heterozigotiškumas (faktinis) Ho nustatytas sumuojant

heterozigotus h pagal kiekvieną genetinį lokusą j ir gautą skaičių dalijant iš tirtų

individų skaičiaus n bei vidurkinant pagal tirtų lokusų skaičių:

k

Ho = 1/k Hj (3.2.1)

j

Hj = h/n (3.2.2)

kur, Hj – heterozigotiškumas j lokuse

Yra teigiama polimorfizmo dydţio ir heterozigotiškumo laipsnio koreliacija. Vidutinė

P reikšmė yra lygi 0,26 + 0,15; vidutinė H reikšmė lygi 0,07 + 0,05. Ţmonėms

būdingos tos pačios H ir P reikšmės kaip ir kitiems ţinduoliams. Ištyrus europiečius

pagal 87 genetinius lokusus pateikti tokie įverčiai: P = 0,38; H = 0,07.

Genetinio kintamumo įvertinimas.

Tradiciniai genetinės analizės metodai genetinio kintamumo populiacijų lygmenyje

neparodo, todėl vertinant genetinį kintamumą reikia:

- Nustatyti koks yra polimorfinių genų įnašas populiacijoje. Kadangi negalim

ištirti visų lokusų organizme (mes net neţinome tiksliai kiek tų lokusų ten yra), reikia

pasirinkti lokusų imtį, kuri turi būti atsitiktinė. Tokiu atveju rezultatus galima

pritaikyti visos populiacijos mastu. Norint įvertinti polimorfinių lokusų dalį, reikia

išanalizuoti nedidelį skaičių genų, kurie atstovauja nepriklausomą imtį iš visų lokusų

rinkinio. Naudojant tradicinės genetikos metodus tai yra neįmanoma, kadangi geno

buvimo faktas pas individą yra nustatomas atliekant kryţminimą tarp individų

pasiţyminčių skirtingu fenotipu pagal to geno koduojamą poţymį. Tuomet F1

nustačius kokią dalį uţima individai su skirtingais fenotipais, galima išsiaiškinti, kiek

– vienas ar daugiau, genų dalyvauja jo formavime.

Tokiais metodais galima aptikti tik tuos genus kurie pasiduoda genetiniam

kintamumui. Tokiu atveju negalim gauti nepriklausomų genų imties duotajam

genomui, kadangi genai pagal kuriuos nevyksta kintamumas į imtį nepakliūna.

Išeitis atsirado panaudojus molekulinės biologijos metodus. Genetinė informacija

uţkoduota DNR struktūrinių genų nukleotidinėse sekose, transliacijos metu

perduodama aminorūgščių sekai, susidaro polipeptidai.

Tyrimams imama baltymų imtis nieko neţinant apie jos populiacinį kintamumą.

Tokia imtis – tai nesimaišanti, visų duotojo organizmo struktūrinių genų, imtis.

Jei vienas ar kitas baltymas yra vienodas pas visus individus, vadinasi šis genas

nepasiduoda populiaciniam kintamumui. Jei stebimi skirtingi baltymo variantai –

genas pasiţymi populiaciniu kintamumu.

Šiuo atfveju galima įvertinti ir genetinio kintamumo lygį t.y. nustatyti tiriamo baltymo

variacijų skaičių ir daţnį, kuriuo jos sutinkamos populiacijoje.

Polimorfinių lokusų dalis populiacijoje – P; neigiamos įverčio savybės – negrieţtas

pasirinkimas ir netikslumas;

Polimorfinių lokusų skaičius priklauso nuo ištirtų individų skaičiaus. Kad išvengti

imties įtakos P įverčiui taikomi keli kriterijai: 0,95, 0,99 ir pan. Naudojant skirtingus

kriterijus gaunami skirtingi P įverčiai: jei lokusas monomorfinis pagal 95% kriterijų,

tai jis gali būti polimorfinis pagal 99% kriterijų ir pan.

Be viso šito P yra netikslus genetinio kintamumo įvertis – t.y. dėl, to, kad silpnai

polimorfiniai lokusai su labai ţemu visų alelių daţniu priskiriami, pagal P, kaip

lygiaverčiai lokusams, kuriuose yra tik keli aleliai, pasiţymintys normaliais daţniais.

Pvz.: 1 lokusas – a – 0,95; b – 0,05; 2 lokusas – 20 alelių su daţniais 0,05 . 2 lokusas

yra ţymiai polimorfiškesnis, bet pagal 95% kriterijų abu lokusai patampa

lygiaverčiais.

Tikslesnis įvertis – H – heterozigotinių individų skaičius populiacijoje. Nėra

neigiamų P savybių.

Patikimumui H turi būti skaičiuojamas ne mažiau kaip 4 lokusams. {% išraiška}

Tai patikimas kintamumo įvertis, nes atspindi tikimybę, kad dvi duotojo lokuso alelės,

atsitiktinai paimtos iš genofondo, pasirodys esančios skirtingos.

Bet, H neatspindi genetinio kintamumo lygį populiacijose, kuriose vyksta giminingas

kryţminimąsis (“kraujomaiša”). Čia homozigotų bus daugiau nei populiacijose,

kuriose vyksta atsitiktinis kryţmiimąsis, nors alelių daţniai butų tokie patys abiejose

populiacijose. Šito išvengimui skaičiuojamas teorinis heterozigotiškumas, kuris

nustatomas pagal alelių daţnius, darant prielaidą, kad vyksta atsitiktinis

kryţminimąsis.

Įvertinant heterozigotiškumą reikia: 1) ištirti pakankamai didelį skaičių individų,

kad imties dydţiu apsprendţiamas nuokrypis būtų minimalus; 2) ištirti lokusus,

koduojančius skirtingas funkcijas; 3) Tyrimus būtina vykdyti kik galima didesniam

lokusų skaičiuje (15 – 50 lokus ). Tyrinėjant heterozigotiškumą, svarbiausia ne ištirtų

individų skaičius, bet ištirtų lokusų skaičius. Kuo jis didesnis, tuo paklaida būna

maţesnė. Kiekybiškai genetinio kintamumo analizei turi būti ne mažiau kaip 14

lokusų.

3.5 KASTLO - HARDY - WAINBERGO DĖSNIS

1903 m.W. Kastlas (W.E. Castle), o 1908 m. G.H.Hardy ir W.Weinberg’as,

nepriklausomai vienas nuo kito, suformulavo alelių pusiausvyros dėsnį

panmiksinėms populiacijoms, pagal kurį matematiškai įvertinami fenotipų, genotipų ir

alelių daţniai populiacijose:

jei populiacija tenkina panmiksinės populiacijos sąlygas

1. Organizmai tiriamoje populiacijoje yra diploidiniai;

2. Populiacijos reprodukcija vyksta lytiniu keli;

3. Kartos populiacijoje nesutampa;

4. Kryţminimasis populiacijose yra atsitiktinis;

5. Populiacija yra labai didelė;

6. Migracijos poveikis nereikšmingas;

7. Ignoruojamas mutacinio proceso poveikis;

8. Tiriamo genetinio lokuso neveikia natūrali atranka

tai 1) keičiantis kartoms alelinių genų (p ir q) dažnis nesikeičia ir jų suma yra

lygi vienetui

kadangi p+q=1, tai p2+pq=p (p+q)=p (3.3.1)

2) bet kurios kartos genotipų AA, Aa ir aa pusiausvyriniai dažniai

nesikeičia iš kartos į kartą ir yra atitinkamai lygūs p2, 2pq ir q

2 ; jų daţnumų

reikšmės gaunamos alelių daţnumų sumą pakėlus kvadratu:

(p+q)2=p

2+2pq+q

2=1 (3.3.2)

3) genotipų dažnumas pusiausvyrą pasiekia per vieną palikuonių kartą.

Hardy - Wainberg’o- Kastlo dėsningumai teisingi bet kuriam alelių skaičiui k.

(p+q+r)2=p

2+2pq+q

2+2pr+2rq+r

2=1

(p+q+...+z)2=p

2+2pq...+q

2+2pz+2zq+z

2=1

Molekulinė ekologija tiria populiacijų genetinės struktūros išsilaikymo ir kitimo

erdvėje ir laike dėsningumus. H-W taisyklė atspindi panmiksinės populiacijos,

neapribotos individų skaitlingumu ir egzistuojančios ne specifinėje terpėje, genetinės

struktūros stabilumo būseną. Tokioje populiacijoje genotipų proporcijos įgyja

pusiausvyrą jau pirmoje laisvai besikryţminančioje palikuonių kartoje. Kadangi

laisvas kryţminimas tai atsitiktinis gametų apsijungimas, p2+2pq+q

2 =1, kai p+q=1.

Jei nėra neigiamų faktorių veikiančių į populiaciją, tai genotipų ir genų daţnių

charakteristikos skaitlingumas išlieka nepakitęs neribotoje kartų kaitoje, t.y. genetinė

dinamika lygi 0. Tai idealus atvejis ir gamtoje praktiškai nesutinkamas, nes visada yra

natūralūs faktoriai (genų dreifas, migracijos, mutacijos, natūrali atranka), kurie išveda

populiaciją iš pusiausvyros ir paţeidţia populiacijos stabilumą. Tai evoliucijos

veiksniai.

Hardy-Wainbergo-Kastlo dėsnio taikymas

A. Genų ir genotipų skaičiavimas, kai ne visi genotipai identifikuojami dėl

dominavimo poveikio

Pvz. Ţmogaus albinizmas populiacijoje aptinkamas 1/10 000 daţnumu.

Pagal H-W-K dėsnį genotipo aa daţnumas

q2=0,0001, alelio a daţnumas q=(0,0001)

1/2=0,01

alelio A – p=1-0,01=0,99 , o genotipo AA daţnumas p2=0,99

2=0,98

genotipo Aa daţnumas 2pq=2x0,99x0,01 0,02

Išvada: retas alelis populiacijoje egzistuoja heterozigotinėje , o ne homozigotinėje

būsenoje

Jei 2pq / q2

= p / q kai q , o p = 1 – q , tai

2pq / q2 = p / q 1 / q vadinasi, kuo maţesnis q, tuo didesnis

heterozigotų skaičius populiacijoje.

Palikuonių kartų skaičius t = 1 / qt - 1 / qo

B. Genų ir genotipų skaičiavimas, kai genai sukibę su lytimi

Homogametinės lyties (moters, drozofilos patelių, paukščių patinų) palikuonių

genotipų daţnumas sutampa su pusiausvyriniais autosominių genų ir genotipų

daţnumais:

Jei A p ir a q, tai AA – p2 , Aa – 2pq , aa – q

2

Hemizigotinės lyties (vyrų, drozofilos patinų, paukščių patelių) palikuonių genotipų

daţnumas sutampa su genų daţnumais buvusiais pas homogametinę lytį:

A - p ir a - q,

Kai recesyvinis geno daţnumas q, tai hemizigotinio fenotipo daţnumas bus q,o

homogametinio - q2, tada

q / q2 = 1 / q

ir kuo maţesnis q (q ) , tuo hemizigotinio fenotipo daţnumas bus didesnis.

Išvada: Fenotipai, sąlygoti recesyvinių genų, pas hemizigotas populiacijoje aptinkami

daţniau nei pas homozigametas

Pvz. Daltonizmo genas ţmogaus populiacijose paplitęs daţnumu q=0,08.

Kadangi q / q2

= 1 / q = 1/0,08 = 12,5 , todėl vyrai 12,5 karto daţniau serga

daltonizmu nei moterys.

Problemos.

Hemofilijos genas ţmogaus populiacijose paplitęs daţnumu q=0,0001. Kokiu

daţnumu hemofiliza pasireikš pas moteris?

4 ELEMENTARŪS EVOLIUCIJOS PROCESAI

Alelių daţnumą keičiantys procesai:

1. Genetinį kintamumą sąlygojantys procesai

a) Mutacijos

b) Rekombinacijos

2. Procesai padedantys genetinį kintamumą perduoti iš kartos į kartą

a) Naturali atranka

b) Migracija

c) Genų dreifas

Genotipų daţnumas keičiasi ir dėl asortatyvinio (neatsitiktinio) porų susidarymo

4.1 Natūrali atranka

Naturali atranka molekulinėje ekologijoje – pagrindinis evoliucijos veiksnys,

iššaukiantis adaptacinius pokyčius populiacinėje struktūroje.

Wt – populiacijos prisitaikymas t.t. laiko momentu.

Wt=Nt/No t.y. prieš tai buvusios kartos ir ateinančios kartos skaitlingumų santykiai;

Wt>1, populiacija auga;

Wt <1, maţėja;

Wt =1, nekinta

Genetinis populiacijos krūvis (Muller, 1950): silpno letalumo genai sugeba atnešti

populiacijai ţymiai didesnį nuostolį, nei mutantiniai genai, pasiţymintys stipriu

letalumu. Maksimalų genetinį krūvį viename dialeliniame lokuse populiacija neš

tuomet, kai abi homozigotos letalios; tokiu atveju kiekvienoje kartoje ţūva 50%

palikuonių.

Atranka heterozigotų naudai

Atranka kai homozigotos turi ţemesnį nei heterozigotos prisitaikymą vadiname

superdominavimu arba heteroze

AA Aa aa viso a daţnumas

pradinis zigotų

daţnumas

p2 2pq q

2 1 q

Prisitaikymas, w 1-s 1 1-t

kiekvieno genotipo

indėlis į F1

p2(1-s) 2pq q

2(1-t) 1-sp

2-tq

2

normalizuotas

daţnumas

p2(1-s)/

(1-sp2-tq

2)

2pq/

(1-sp2-tq

2)

q2(1-t)/

(1-sp2-tq

2)

1 q1 = (q-tq2)/

(1-sp2-tq

2)

Alelio daţnumo pasikeitimas:

q = pq(sp-tq)/(1-sp2-tq

2)

Gamtinė atranka heterozės atveju sąlygoja stabilios polimorfinės pusiausvyros

susidarymą

q = 0 , kai pq(sp-tq) = 0

bet kai populiacijoje egzistuoja du aleliai, t.y. p ir q 0 , pusiausvyra nusistovi kai

sp=tq s(1-q) = tq s=q(s + t)

q=s/(s+t) ir p=t/ (s+t)

Pusiausvyriniai daţnumai heterozės atveju apsprendţiami santikinėmis atrankos

koeficientų reikšmėmis, bet ne apsoliutinėmis

Pvz. Ţmogaus heterozė pjautuvinės anemijos atveju

HbAHbA AbAHbS HbSHbS

Maliarijai imlūs maliarijai atsparūs ţūsta nesulaukę

lytinės brandos

w 0,88 1 0,13

IŠVADA: genotipų prisitaikymas priklauso nuo aplinkos sąlygų

ATRANKA PRIEŠ HETEROZIGOTAS

Pvz. Įvykus translokacijoms heterozigotos maţiau prisitaikiusios uţ homozigotas dėl

ţemesnio vaisingumo

AA Aa aa viso a daţnumas

pradinis zigotų

daţnumas

p2 2pq q

2 1 q

Prisitaikymas, w 1 1-s 1-t

kiekvieno geno-

tipo indėlis į F1

p2 2pq(1-s) q

2 1-2spq

normalizuotas

daţnumas

p2

(1-2spq)

2pq(1-s)//

(1-2spq)

q2/

(1-2spq)

1 q1 = (q-spq)/

(1-2spq)

Alelio daţnumo pasikeitimas:

q = spq(q-p)/(1-2spq)

q = 0 , kai p=q,

(tai teisinga kai alelių homozigotų w vienodi)

tačiau pusiausvyra nestabili

kai q > p, q teigiamas q didės kol A eliminuosis

kai q < p, q neigiamas, o a artės prie 0

T.y. a) jei populiacija gamtinės atrankos pradţioje nėra tiksliai pusiausvyroje,

populiacija tols nuo pusiausvyros kol alelio a daţnumas, buvusio ţemiaiu

pusiausvyros, nebus lygus 0 ,o alelis pašalintas iš populiacijos

b) jei populiacija yra pusiausvyroje, tai atsitiktinis nukrypimas nuo

pusiausvyros (genų dreifas ar kitos prieţastys) prives iki to, kad vienas ar kitas alelis

bus išstumtas iš populiacijos. (Ši gamtinės atrankos savybė bali būti panaudota kovai

prieš vabzdţius-ligų pernešejus.)

Bendras atrankos pagal vieną lokusą modelis

Genotipas: A1A1 A1A2 A2A2 viso a daţnumas

pradinis zigotų

daţnumas

p2 2pq q

2 1 q

Prisitaikymas, w w1 w2 w3

kiekvieno geno

tipo indėlis į F1

p2w1 2pqw2 q

2 w3 w =

p2w1+2pqw2+

q2w3

normalizuotas

daţnumas

p2w1

w

2pqw2

w

q2w3

w

1 q1 =

q(pw2+qw3)

w

Alelio daţnumo pasikeitimas:

q = pq (p(w2-w1)+q(w3-w2) / w

kur w = p2w1+-2pq w2+ q

2w3 vidutinis populiacijos prisitaikymas

Atranka priklausanti nuo genotipų dažnumo

Taip pat palaiko ir atveda populiaciją prie stabilaus genetinio polimorfizmo

Gamtinė atranka priklauso nuo genotipų daţnumo, kai genotipų prisitaikymas keičiasi

priklausomai nuo jų daţnumo

1) Pw atranka didelė kai genotipas retas ir maţa, kai genotipas labai paplitęs

populiacijoje. Jei egzistuoja daţnumas kai abiejų alelių genotipų w vienodas, bus

pasiekta subalansuota popimorfinė pusiausvyra, net nesant heterozei.

Pvz. pupelės Phaseolus lumetus trijų genotipų SS, Ss, ss prisitaikymas w kečiasi iš

kartos į kartą, keičiantis genotipų daţnumui. WSs

2) Nuo daţnumo priklausanti lytinė atranka atsiranda kai kryţminimosi

tikimybė priklauso nuo genotipo daţnumo. (Pvz. Šiaurės tautelių papročiai).

Vidurţemio vyrams labiau patinka blondinės, skandinavams – briunetės: pirmenybė

teikiama retų (populiacijoje) alelių nešiotojams

Išvada: a) nuo daţnumo priklausanti atranka retų genotipų naudai yra vienas iš

mechanizmų palaikančių genetinį polimorfizmą populiacijose, kadangi genotipo

prisitaikymas w didėja, maţėjant genotipo daţnumui;

b) nuo daţnumo priklausanti lytinė atranka gali būti ypač reikšminga esant

migracijai, nes nauji genai, atnešti į populiaciją, išlaikomi.

4.2 MUTACIJOS IR MIGRACIJOS

Mutacija – nekryptingi atsitiktiniai genetinės medţiagos pokyčiai, vykstantys

spontaniškai arba veikiant ypatingiems fiziniams, cheminiams ar biologiniams

faktoriams. Spontaninis atsiradimas – tai pagrindas naujoms alelėms, padidinančioms

populiacijos genetinį kintamumą.

Dauguma atsirandančių mutacijų yra ţalingos organizmui (Muller, 1950), bet naujai

atsiradusi alelė, nedaranti ţalos heterozigotinėje būsenoje, palaipsniui gali įsitvirtinti

rūšies genofonde. Homozigotinių ţalingų alelių atveju veikia natūrali atranka.

Vyksta ir neutralios mutacijos ir šis procesas gali nukreipti populiacijos struktūrą nuo

HdyWnb pusiausvyros (Kimura, 1985).

Naujai atsiradusios mutacijos praradimas – negrįţtamas procesas ir jos neįsitvirtina

populiacijoje.

Mutacijos nuolat, kiekvienoje kartoje atsiranda iš naujo, ir neatmetama tikimybė, kad

taip vadinamos naujos mutacijos nebuvo atsiradusios anksčiau.

Kuomet alelio daţnis populiacijoje yra maţas, jo mutavimo į kitą aleli aptikti

praktiškai neįmanoma.

Analizuojant mutacijų įtaką į populiacijų genetinę pusiausvyrą, reikia atsiţvelgti į tai,

kad:

1. tiesioginių genetinių mutacijų greitis yra viena eile didesnis nei grįţtamų

2. nors mutacijų tempas yra skirtingas kiekviename lokuse, tačiau alelio A virtimo į

a greitis yra pakankamai ţemas – vidutiniškai 10-5

-10-6

eilės (genui/per karta).

Migracijos – labai svarbus populiacinės dinamikos faktorius, kadangi kiekviena

populiacija gamtoje egzistuoja ne tik pati sau, bet taip pat sąveikauja ir su kitomis

populiacijomis (nebent yra pilna izoliacija). Vyksta genų kaita. Jei inmigrantai skiriasi

genetiškai, jie gali iššaukti atitinkamus alelių daţnių pokyčius jau pirmoje kartoje. Jei

genų imigracija ir emigracija yra vienodoi intensyvumo, populiacijoje nusistovi

stacionarus procesas.

4.3 ATSITIKTINIS GENŲ DREIFAS.

Atsitiktinis genų dreifas tai stochastinis genų daţnių pokytis sekančiose kartose

vykstantis dėl riboto, bet kurios realios populiacijos skaitlingumo.

Alelių daţnių kitimas, vykstant kartų kaitai, iššaukiamas atsitiktinių prieţasčių, pvz.:

maţu populiacijos skaitlingumu. Tai visiškai atsitiktinis procesas, kuris priklauso t.t.

reiškinių klasei, vadinamai imties klaida. Kuo maţesnė imtis, tuo didesnė paklaida,

t.y. kuo maţiau individų kryţminasi tarpusavyje, tuo daugiau pokyčių, nulemiamų

genų dreifo, vyks alelių daţniuose. Kuo didesnis skaičius individų dalyvauja sukuriant

kitą kartą, tuo artimesnis teoriniam yra alelių daţnis.

Čia svarbiausia yra efektyvioji populiacijos dalis, kuri ir duoda pradţią sekančiai

kartai.

Kadangi alelių daţnių pokyčiai vyksta visomis kryptimis, tendencija alelio daţnio

sumaţėjimui/padidėjimui visada gali pakisti į priešingą pusę, kol alelio daţnis

nepasiekia 1 arba 0. Jei alelis prarandamas (0) arba fiksuojamas (1), procesas baigiasi.

Alelių daţnis nebekinta tol, kol dėka atsitiktinės mutacijos neatsiranda naujas alelis.

Jei ţinom tėvinių individų skaičių bazinėje populiacijoje ir alelių daţnį jame, galim

išskaičiuoti tikimybė gauti vienus ar kitus alelių daţnius F1 kartoje. Variansa –

kintamumo įvertis, gaunamas lyginant dvi imtis. Jei yra du aleliai su daţniais p ir q,

tėvinių individų skaičius lygus N (bazinės populiacijos genų skaičius bus 2N), tuomet

alelių daţnių variansa pirmoje kartoje: s2=pq/2N, o standartinis nuokrypis s – šaknis iš

pq/2N. šios formulės atspindi atvirkštinė priklausomybę tarp imties dydţio (2N) ir

teoriškai tikėtino alelių daţnio kintamumo.

Kumuliatyvinis efektas – atsitiktinio genų dreifo metu atsirandančių pokyčių kaupimo

efektas, kuris veda prie to, kad aleliai fiksuojasi populiacijose.

Tuo atveju kai alelių daţnių duotajame lokuse neveikia jokie kiti procesai (mutacijos,

migracijos ar atranka), evoliucija priveda prie to, kad vienas alelių bus fiksuojamas, o

visi kiti alternatyvūs – eliminuojami. Jei populiacijoje vyksta tik genų dreifas, tai

tikimybė kad duotasis alelis galiausiai fiksuosis yra lygi to alelio pradiniam daţniui.

Jei įvyksta naujo alelio atsiradimas (mutacija) tai jo daţnis 1/2N ir tai tokia tikimybė,

kad jis kada nors įsitvirtins toje populiacijoje.

Vertinant atsitiktinį genų dreifą labai svarbu įvertinti Ne – genetiškai efektyvią

populiacijos dalį.

Homozigotų sukaupimas vykstant genų dreifui parodo jo tiesioginį ryšį su inbrydingu,

t.y. apribotoje skaitlingumu populiacijoje yra sukaupiama neatsitiktinė gametų

asociacija. Toks nuokrypis nuo panmiksijos – stiprėja; išauga “kraujo” giminystės

lygis tarp populiacijos individų. {eiti į inbrydingą}.

4.4 INBRYDINGO KOEFICIENTAS

Hardy-Weinbergo dėsnis teisingas tik tuo atveju, kai vyksta atsitiktinis

kryţminimasis. Jam nesant, vyksta asortatyvinis kryžminimasis, t.y. individai su

tam tikrais genotipais tarpusavy susieina daţniau, nei tikėtina atsitiktinio

kryţminimosi atveju. Asortatyvinis kryţminimas nekeičia genų daţnių, bet keičia

genotipų daţnį. Asortatyvus kryţminimasis vyksta tada, kai daţniau kryţminasi

panašių fenotipinių bruoţų individai Disasortatyvus kryžminimasis vyksta tada, kai

tarpusavyje daţniau kryţminasi skirtingų fenotipų individai

Kryžminimasis ir genotipai

Inbrydingas yra genetiškai susijusių individų kryţminimasis

Outbrydingas yra genetiškai nesusijusių individų kryţminimasis

Nesant kitų evoliucijos veiksnių, inbrydingas ar outbrydingas nekeičia alelių daţnio,

tačiau dėl tokio kryţminimosi yra paţeidţiamas genotipų balansas ir jis nebeatitinka

Hardy-Weinbergo pusiausvyros

Labai įdomi asortatyvinio kryţminimo forma – inbrydingas: kryţminimąsis giminingų

individų tarpe yra daţnesnis nei galima tikėtis atsitiktinio kryţminimosi atveju.

Kadangi giminingi individai yra labiau genetiškai panašūs tarpusavyje, nei

negiminingi, tai inbrydingas veda prie homozigotų padidėjimo ir heterozigotų

sumaţėjimo, lyginant su teoriniais duomenimis atsitiktiniam kryţminimui, nors ir

nekeičia alelių daţnio.

Inbrydingas padidina ţalingų recesyvinių alelių pasireiškimo tikimybę.

Inbrydingo koeficientas – F – tikimybė, kad kurio nors individo duotame lokuse

atsiras dvi alelės, identiškos pagal savo kilmę (t.y. tikslios protėvinio alelio kopijos).

Dvi alelės, identiškos pagal savo struktūrą, nebūtinai yra identiškos ir pagal kilmę, ir

gali būti paveldėtos iš protėvių, neturinčių jokių giminystės ryšių.

Jei kiekvienoje kartoje naudojamas vienas ir tas pats inbrydinio kryţminimo tipas, tai

inbrydingo koeficientas auga sulig kiekviena karta. Kas kiekviena karta F išauga puse,

prieš tai buvusios kartos, heterozigotų daţnio įverčiu. Inbrydingo rezultate,

homozigotų daţnis populiacijoje išauga heterozigotinių individų sąskaita. Atsitiktinio

kryţminimosi populiacijose, kuriose aptinkami aleliai A ir a su daţniais p ir q,

heterozigotų daţnis bus 2pq. Populiacijose, kuriose yra inbrydingo koeficientas F,

heterozigotų daţnis bus (1-F) nuo jų daţnio atsitiktiniai besikryţminančioje

populiacijoje.

Kai F=0, inbrydingo nėra, genotipų daţniai atitinka HdyWnb pusiausvyrą.

F atspindi individų, homozigotinių pagal kurį nors lokusą, perteklių populiacijoje; taip

pat atspindi homozigotinių lokusų dalies padidėjimą atskirų individų genotipuose.

Inbrydingo koeficientas taip pat vadinamas fiksacijos koeficientu. Tai

paaiškina simbolį F. Fiksacijos koeficientas yra tikimybė, kad alelis populiacijoje bus

fiksuotas homozigotinėje būsenoje

Į populiaciją kurioje vyksta inbrydingas galima ţiūrėti kaip į dviejų dalių

bendruomenę, iš kurių vienoje yra visiškas inbrydingas, o kita – visiškai panmiksinė.

Tokiu atveju, dviejų gametų A apsijungimo tikimybė: laisvo kryţminimosi

bendruomenėje yra p2, o esant inbrydingui turi būti didesnė kaţkokiu teigiamu dydţiu

ε t.y. p2+ε (yra daugiau homozigotinių individų )

gametų a apsijungimo tikimybe: q2+ε;

gametų a ir A – 2pq -2ε

Genetinės pusiausvyros atveju inbrydingo koeficientas (lygys koreliacijos koeficientui

tarp apsijungiančių gametų):

F= ε/pq t.y. ε = Fpq

Tokiu atveju zigotų dalis: AA: Q1 = p2+Fpq ; Aa: Q2 = 2pq(1-F); AA: Q3 = q

2+Fpq

Kai Q1+Q2+Q3 =1.

Jei didelė populiacija yra padalinta į k panmiksinių grupių, tai tokioje visumoje yra

stebimas efektas, panašus į inbrydingo pasekmes esančias nepadalintoje populiacijoje:

homozigotų dalis išauga tarpopuliacin\ės genų daţnių variansos dydţiu, heterozigotų

dalies sumaţėjimo sąskaita. Li (1978): “populiacijų padalijimas į atskiras

besikryţminančias grupes formaliai ekvivalentiškas inbrydingo poveikiui visos

populiacijos mastu”. Tokios diferenciacijos laipsnis tiesiogiai susijęs su

tarpopuliacinių genų daţnių pločiu (variansa) – kuo stipriau genetiškai skiriasi

subpopuliacijos, tuo didesnė variansos Vq vertė.

Wright’o F-statistika (1943,1951) – nustatė keletą F-koeficientų, kurie apibūdina

genetinę diferenciaciją:

1. FIT – individo inbrydingo koeficientas visos populiacijos atţvilgiu

2. FIS – individo inbrydingo koeficientas subpopuliacijos, kuriai jis priklauso,

atţvilgiu

3. FST- subpopuliacijos inbrydingo koeficientas visos padalintos populiacijos

atţvilgiu

FST=Vq/vid.q(1-vid.q),

q-geno daţnis padalintoje populiacijoje

Santykis tarp šių koeficientų: FIT =F ST+(1-F ST)F IS

Visi šie indeksai rodo nuokrypį nuo panmiksijos atsirandantį dėl apsijungiančių

gametų koreliacijos ir, galiausiai, nustatomi homozigotinių ir heterozigotinių genotipų

santykiu.

FST labai svarbi biologinė prasmė: stacionariomis sąlygomis atspindi populiacijų

genofondų diferenciacijos ir integracijos procesų balansą.

GST (Nei,75): F-statistikos ekvivalentas, surišantis bendrą (H) ir vidupopuliacinę (H)

genų įvairovę tokia formule:

GST= (HT -vid.HS )/HT,

kur HT =1-Σvid.pi2

vid.Hs =1/nΣHs

Hs=1-ΣpIS2,

kur pIS - i-ojo alelio daţnis S subpopuliacijoje, o

vid.pi – vidutinis i-ojo alelio daţnis visoje padalintoje populiacijoje,

kurią sudaro n subpopuliacijų.

Vid.Hs-vidutinis subpopuliacijos heterozigotiškumas;

- HT - visos padalintos populiacijos heterozigotiškumas, laikant kad ta

populiacija atstovauja vieningaim panmiksinei bendruomenei

Inbrydingo koeficientas skaičiavimas

Inbrydingo koeficientas (F) gali būti suskaičiuotas genealogijoje analizuojant

giminingumo laipsnį.

Inbrydingo koeficientas skaičiuojamas taip:

1. Nustatomas bendrų protėvių skaičius

Bendras protėvis yra tas, kuris yra bendras abiems individo tėvams

IV-1 turi vieną bendrą protėvį I-2

2. Nustatomas inbrydingo kelių skaičius

Inbrydingo kelias = trumpiausias genealogijos kelias, jungiantis abudu tėvus ir

bendrą protėvį.

Kiekvieno inbrydingo kelio ilgis suskaičiuojamas sudedant visus individus,

sudarančius kelią, išskyrus tiriamąjį individą

Pateiktame pavyzdyje yra tik vienas kelias:

IV-1 III-2 II-2 I-2 II-3 III-3

Jį sudaro penki nariai.

Pav. Ţmogaus genealoginis medis, rodantis inbrydingą

3. Skaičiavimams naudojat formulę

F = Σ (1/2)n(1 + FA)

Kur F yra tiriamojo individo inbrydingo koeficientas,

n yra individų kiekis inbrydingo kelyje (išskyrus inbredinį individą),

FA yra bendro protėvio inbrydingo koeficientas,

Σ rodo sumą dydţių (1/2)n(1 + FA), paskaičiuotų kiekvienam inbrydingo

keliui

Pateiktame pavyzdyje yra tik vienas bendras protėvis. Kadangi nieko neţinoma apie

jo paveldėjimą, daroma prielaida, kad FA=0

F = Σ (1/2)n(1 + 0)

F= (1/2)5 = 1/32

F = 3.125%

(F = 3.125%) Rodo geno homozigotiškumo tikimybę individe IV-1. Tai atsitinka dėl

paveldėjimo iš bendro protėvio I-2

Inbrydingo pasekmės gali būti įvertintos ir populiacijoje.

Tegul alelių A ir a daţnis yra p ir q. Tada genotipų daţniai bus nusakomi taip

p2 + Fpq atitinka AA daţnį

2pq(1 – F) atitinka Aa daţnį

q2 + Fpq atitinka aa daţnį

Tegul p = 0.8, q = 0.2 ir F = 0.25, tada genotipų daţniai bus

AA = p2 + Fpq = (0.8)2 + (0.25)(0.8)(0.2) = 0.68

Aa = 2pq(1 – F) = 2(0.8)(0.2)(1 – 0.25) = 0.24

aa = q2 + Fpq = (0.2)2 + (0.25)(0.8)(0.2) = 0.08

Esant inbrydingui bus: 68% AA homozigotų, 24% heterozigotų, 8% aa homozigotų

Nesant inbrydingo (t.y., F=0) bus: p2 = 64% AA homozigotų, 2pq = 32%

heterozigotų, q2 = 4% aa homozigotų

Išvada: Taigi, inbrydingas didina homozigotų dalį ir maţiną heterozigotų dalį.

Gamtinėse populiacijose inbrydingo koeficientas didėja, maţėjant populiacijos

dydţiui.

Inbrydingas gali turėti tiek teigiamų, tiek ir neigiamų pasekmių populiacijai.

Teigiamos pasekmės stebimos ţemės ūkio kultūrose - inbrydingas gali padidinti

proporciją homozigotų, turinčių reikalingą poţymį. Kaip neigiama pasekmė yra tai,

kad padidėja paveldimų recesyvinių ligų - inbrydingas padidina homozigotiškumo,

tuo pačiu ir ligos, tikimybę.

Inbrydinė depresija ir heterozė.

Selekcijos metu siekiama išvesti linijas pasiţyminčias pačiomis geriausiomis

savybėmis, todėl tėviniai individai atrenkami su ryškiausiais poţymiais. Vyksta

dirbtinė atranka. Daţnai vykdomas sistemingas inbrydingas, padidinantis

homozigotiškumą…bet…inbrydingas daţnai priveda prie labai svarbių gyvybiškų

savybių, kaip reprodukcija, gyvybingumas, suprastėjimo pas palikuonis. Tai

vad(inama inbrydine depresija. Ji atsiranda dėl letalių recesyvinių alelių

homozigotiškumo.

Heterozės efektas – priešingas inbrydinei depresijai. Pasiekiamas kryţminant

nepriklausomų inbrydinių linijų atstovus. Hibridai pasiţymi geresnėmis savybėmis.

Inbrydinės linijos daţnai būna homozigotinės pagal kurį nors reikiamą “teisingą”

alelį, todėl jas sukryţminus, homozigotiškumas pagal dirbtinai atrinktus poţymius

išlieka, o “neteisingi” aleliai pereina į heterozigotinę būseną.

5 GENETINIS PANAŠUMAS I IR DISTANCIJA D

Turint daugiau nei dvi imtis, ir analizuojant kelias polimorfines sistemas reikia

įvertinti genetinio panašumo indeksą (I).

Molekulinėje ekologijoje labai svarbu ţinoti koks skaičius genų sutampa ir koks

yra skirtingas tarpe dviejų tiriamų populiacijų. Tokios ţinios duotų atsakymą į

klausimą, kokio kiekio reikia genų pakaitalų, kad dvi palikuonių linijas atpaţinti kaip

naujas rūšis. Išanalizavus ryšį tarp genų ar DNA cheminės struktūros ir baltymus

sudarančių amino rūgščių segmentų atsirado galimybė studijuoti genetinius skirtumus

analizuojant baltymų amino rūgščių seką. Daugelis tyrėjų analizavo to paties baltymo

amino rūgščių segmentų skirtumus pas skirtingus organizmus ir nustatė amino rūgščių

ir genų pakitimų per t.t. laiko vienetą konstantas. Šis metodas labai pasitarnavo tiriant

ilgalaikę evoliuciją, kaip šeimų, eilių ir klasių evoliuciją. Rūšių ir porūšių lygyje šis

metodas nėra labai sėkmingas, kadangi genetiniai pokyčiai šiame lygmenyje per

metus yra per maţi. Kad šis metodas būtų naudingas analizuojant rūšių evoliucija turi

būti ištiriama labai daug baltymu sistemų, o amino rūgščių sekų tyrimai yra

pakankamai brangus.

Galimas ir kitas metodas kuris yra greitesnis tačiau ne toks tikslus. Grubus

panašumo įvertinimas gali būti gaunamas analizuojant baltymų elektroforetinį

judrumą. Šis metodas buvo panaudotas Hubbio ir Throckmortono studijose

analizuojant genetines distancijas tarp dvieju skirtingų Drosophila rušių. Išanalizavus

didelį kiekį baltyminių sistemų buvo parodyta kad sibsams budinga didesnis kiekis

bendrų baltymu negu ne-sibsams, bei morfologinių poţymių koreliacija su baltymų ir

genų skirtumais. Kadangi amino rūgščių pakitimai per metus pasirodė besą konstanta

ir būdinga daugeliui skirtingų rūšių, pasiūlyta išvada kad sibsams būdinga didesnė

divergencija vieniem nuo kitų, nei ne-sibsams.

M. Nei pasiūlė patogų būdą, pagal kurį, turint elektroforezinius duomenis

galima įvertinti populiacijoje vykstančią genetinę diferenciaciją. Naudojami du

įverčiai:

Genetinis panašumas (I), įvertinantis struktūrinių genų dalį, kurie identiški

abiejose populiacijose.

Genetinė distancija (D), įvertina vidutinišką alelinių pokyčių skaičių

kiekviename lokuse, įvykusių šių populiacijų atskiros evoliucijos metu.

Aleliniai pokyčiai atsiranda tuomet, kai alelinių mutacijų vykstančių atskiruose

lokusuose metu, alelis yra pakeičiamas kitu aleliu arba pasikeis visas alelinių genų

rinkinys iš karto.

Šis metodas įvertina tai, kad alelių pakeitimas gali būti nepilnas, t.y. kaţkurioje

populiacijos dalyje naujas alelis gali pakeisti seną, kuris, su didesniu ar maţesniu

daţniu, vis tiek yra aptinkamas populiacijoje.

0<I<1, 0- lyginamose populiacijose nėra bendrų alelių; 1- alelių daţniai yra

vienodi abiejose populiacijose;

0<D<∞, 0 - nėra jokių alelinių pokyčių. Ši reikšmė gali būti didesnė uţ 1

kadangi evoliucinio proceso metu, vykstančio ilgą laiką, kiekvieno lokuso aleliai gali

būti ne vieną kartą pilnai pakeičiami.

Ik=∑ai bi / √∑ai2 ∑ bi

2,

k- lokusas kurio atţvilgiu populiacija yra polimorfinė pagal i skirtingų alelių; A

ir B – dvi populiacijos; ai ir bi, i-ojo alelio daţniai atitinkamai A ir B (laisvai

besikryţminančios) populiacijose. Jei abi populiacijos monomorfinės pagal tą patį

alelį lokuse, t.y. a ir b lygūs 1, gemnetinis panašumas irgi lygus 1, t.y. populiacijos yra

tapačios pagal šį lokusą; jei lokusas monomorfinis pagal skirtingus alelius (a-0, b-1), I

bus 0, t.y. nėra visiškai jokio tapatumo. ___

Kelių lokusų atveju

Iab=Σaibi, Ia=Σai, Ib=Σbi, tada I=Iab/√IaIb

O genetinė distancija

D= - lnI

Jei nevyksta selekcija ir alelės atsiranda dėl protėvinėje populiacijoje įvykusios

mutacijos Ia,

Ib yra lygūs Wright’o inbrydingo koeficientui.

Genetinės distancijos ir panašumo įvertinimui užtenka 3 lokusų (min)

Pvz.: I-0,525, D-0,644, dviejų populiacijų nepriklausomos evoliucijos eigoje

kiekviename iš 100 lokusų vidutiniškai įvyko 64,4 aleliniai pakitimai (0,64 pakitimai

vienam lokusui).

Taikant Wehrhahns’o(1975) {šis išrado tikimybinį metodą, kuriuo yra tiriami

homologinių baltymų tarpe atsirandantys krūvių pokyčiai; minusas – daryta prielaida,

kad populiacija prasideda nuo vieno alelio.} populiacinės divergencijos numerinius

apskaičiavimus Nei (1972) distancijos patikrinimui, buvo parodyta, kad ši D

išskaičiuota iš elektroforezinių duomenų yra maţdaug 10% maţesnė nei tikėtinas

aminorūgščių pakitimų, iššaukiančių krūvio pokyčius ankstyvojoje populiacijų

divergencijos stadijoje, skaičius ir tai gali nulemti nepakankamų įverčius lyginant dvi

rūšis.

Individų imtis įvertinant vid.H gali būti labai maţa, jei yra išanalizuojamas

didelis lokusų skaičius ir vid.H yra ţemas. Individų skaičius D įvertinimui taip pat

gali būti labai maţas jei D yra didelė, o vidH tarp dviejų lyginamų rūšių yra ţemas.

Paišant dendrogramas, remiamasi D skirtumais tarp skirtingų rūšių porų. Jei šie

skirtumai maţi, D turi būti išstudijuota preciziškiau. Tokiu atveju turi būti ištirtas

pakankamai didelis individų skaičius kiekvienam tiriamam lokusui. Jei skirtumai labai

dideli, net vieno individo gali uţtekti, kad nustatyti jo tikslią dendrogramos

topologiją. Organizmuose, kuriuose vidH didesnis uţ 0,1 turi būti išanalizuotas

sąlyginai dielis individų skaičius, kad dendrograma būtų teisinga.

Nei unbiased vidH ir D įverčius galima taikyti bet kokiam individų skaičiui, ir

tie įverčęiai bus kokybiški, nepriklausomai nuo to kiek lokusų yra išanalizuota.

Skirtumai tarp biased ir unbiased įverčių yra labai maţi kai ištirtų individų skaičius

yra labai didelis (50 ir daugiau).

MinD=-ln [vidGab/√vidGavidGb],

vidGa ir vidGb vidurkinės reikšmes (2naIa-1)/(2na-1) ir (2nbIb-1)/(2nb-1) per visus

ištirtus lokusus r, atitinkamai, o vidGab = Iab. n – individų skaičius (A(a) ir B(b)

populiacijose). Ga ,Gb ir Gab yra Σpi2,Σqi

2, Σ piqi reikšmės per visus lokusus genome.

Ia , Ib ir Iab individų geno identiškumas: Σai2,Σbi

2, Σ aibi vidurkinės reikšmės r

ištirtiems lokusams.

UnbH naudojama jei yra maţas individų skaičius, ir nedidelis skaičius lokusų

išanalizuotas (normoje turi buti atliekama min50 lokusų analizė). Pavyzdţių variansa

įvertina ytarplokusinę ir vidulokusinę variansas.

Genetinis polimorfizmas stebimas gamtinėse populiacijose yra įvairių

evoliucinių jėgų ilgalaikio poveikio rezultatas. Tokiu atveju, teorija aiškinanti

genetinio polimorfizmo esmę turėtų paaiškinti ir evoliucinius pokyčius populiacijoje

vykusius praeityje. Li ir Nei (1975): laikantis mutacijų dreifo hipotezės, tikėtina kad

H koreliacija silpnėja greičiau, nei genetinis I, iklgejant evoliucijos laikui.

Kitų autorių formulės

Cavalli-Sfoza et al(1967):

greičiausiai, ją reik naudoti kai analizuojama populiacijų divergencija rūšies

viduje veikiant atsitiktiniam genų dreifui.

I=(2√2/π)√(1-r),

m

kur r=Σ√piqi, r<1; r=1, kai lyginamos populiacijos yra identiškos.

i=1

Edwards (1971):

8(1-r)/ (1+Σ√pi/m)(1+ Σ√qi/m)

m – suminis alelių skaičius lyginamose populiacijose.

________________________

Nei (1972)

m m m

I=Σ(piqi)/ √ ((Σpi2 )(Σqi

2)),

i=1 i=1 i=1

gali blogai įvertinti panašumą, jei populiacija ryškiai skiriasi pagal retus alelius

(20%). Jei A ir B populiacijose sutampa 20% alelių tai I rodo visišką panašumo

nebuvimą.

_________________

Sokal, Sneath, 1963:

I=Σpiqi, kuo polimorfiškesnės identiškos populiacijos tuo maţesnė I reikšmė.

_______________________

Rogers (1972):

D=√Σ(pi -qi)2,

Kuo polimorfiškesnės lyginamos populiacijos tuo rodo maţesnę D

2. lentelė. Genų daţnumų p, q bei genotipų daţnumų p2, 2pq, q

2 reikšmės.

p p2 2pq q

2 q p p

2 2pq q

2 q

.01 .0001 .0198 .9801 .99 .26 .0676 .3848 .5476 .74

.02 .0004 .0392 .9604 .98 .27 .0729 .3942 .5329 .73

.03 .0009 .0582 .9409 .97 .28 .0784 .4032 .5184 .72

.04 .0016 .0768 .9216 .96 .29 .0841 .4118 .5041 .71

.05 .0025 .0950 .9025 .95 .30 .0900 .4200 .4900 .70

.06 .0036 .1128 .8836 .94 .31 .0961 .4278 .4751 .69

.07 .0049 .1302 .8649 .93 .32 .1024 .4352 .4624 .68

.08 .0064 .1472 .8464 .92 .33 .1089 .4422 .4489 .67

.09 .0081 .1638 .8281 .91 .34 .1156 .4488 .4356 .66

.10 .0100 .1800 .8100 .90 .35 .1225 .4550 .4225 .65

.11 .0121 .1958 .7921 .89 .36 .1296 .4608 .4096 .64

.12 .0144 .2112 .7744 .88 .37 .1369 .4662 .3969 .63

.13 .0169 .2262 .7569 .87 .38 .1444 .4712 .3844 .62

.14 .0196 .2408 .7396 .86 .39 .1521 .4758 .3721 .61

.15 .0225 .2550 .7225 .85 .40 .1600 .4800 .3600 .60

.16 .0256 .2688 .7056 .84 .41 .1681 .4838 .3481 .59

.17 .0289 .2822 .6889 .83 .42 .1764 .4872 .3364 .58

.18 .0324 .2952 .6724 .82 .43 .1849 .4902 .3249 .57

.19 .0361 .3078 .6561 .81 .44 .1936 .4928 .3136 .56

.20 .0400 .3200 .6400 .80 .45 .2025 .4950 .3025 .55

.21 .0441 .3318 .6241 .79 .46 .2116 .4968 .2916 .54

.22 .0484 .3432 .6084 .78 .47 .2209 .4982 .2809 .53

.23 .0529 .3542 .5929 .77 .48 .2304 .4992 .2704 .52

.24 .0576 .3648 .5776 .76 .49 .2401 .4998 .2601 .51

.25 .0625 .3750 .5625 .75 .50 .2500 .5000 .2500 .50

6. MOLEKULINĖS EKOLOGIJOS LABORATORINIAI DARBAI

. Baltymų įvairovės tyrimas

Tikslas: Nustatyti tam tikros vietovės gyvūnų izofermentinį kintamumą.

Tyrimo medžiaga. Baltymų elektroforezės metodu tyrimui naudojama po 20-

30 individų iš 4 (ar daugiau) rajonų, 4-8 skirtingų biotopų, audinių (kraujo, raumenų

ar kepenų) mėginiai.

Homogenizavimas: Atšildytas kepenų audinio gabaliukas homogenizuojamas

stikliniame homogenizatoriuje pridedant 0,6 ml homogenato tirpalo.

Homogenizavimo terpė ruošiama iš:

1% Tritonas X–100 -1 ml

MgCl2 x 6H2O – 0,4 g

0,2 M Tris – HCl buferis pH 8 - iki 100 ml

(Tris – 0,6 g; 1 N HCl - 27,5 ml; vanduo iki 100ml)

Saugant biologinius pavyzdţius nuolat vyksta natyvios baltymų struktūros

pakitimai, dėl:

denatūracijos (polipeptidinių grandinių struktūriniai pokyčiai);

agregacijos (kelių molekulių susijungimo);

dezagregacijos į subvienetus (ketvirtinės struktūros praradimas);

polipeptidinių grandinių degradacijos (pirminės struktūros pokyčiai

dėl proteolitinių fermentų veikimo).

Visi išvardyti procesai nulemia baltymų biologinių savybių praradimą

(fermentinį aktyvumą ir kt. funkcijas) ir tuo įtakoja jų elektroforezinį paslankumą.

Paruoštus homogenatus iki bandymų ir tarp jų laikomi -20°C temperatūroje,

kad fermentai nedegraduotų, neapsikrėstų bakterijomis ir grybeliais, įnešančius

papildomo proteazių aktyvumo.

Centrifugavimas: Jo metu pavyzdţiai paruošiami tyrimui. Centrifugavimo

greitis priklauso nuo pavyzdţio savybių. Centrifuguojama 15 sek. 1,5 tūkst.

apsisukimų per minutę greičiu.

Elektroforezė poliakrilamidiniame gelyje (PAAG)

Aparatūra:

Nespecifinių baltymų ir izofermentų elektroforezei PAAG gelio bloke buvo

naudojama vertikalios gel-elektroforezės aparatai „HIMFILL“, Tallin (4 pav.),

kuriuos sudaro:

- Nejudrūs plieno ir platininis elektrodai

- Kameros buferiui. Suformuojamos įstačius rėmelius nešėjui.

- Rėmeliai nešėjui, kurį kiekvieną sudaro korpusas ir du stiklai

(115x120x1,5 mm).

- Standartinės „šukutės“ pavyzdţių uţnešimo vietoms („šulinėliams“)

formuoti gelyje.„Šukutės“ sudaro 13 „šulinėlius“ formuojančių plokštelių

- Tekančio vandens principu veikianti šaldymo sistema ( palaikoma

+4ºC temperatūra)

Darbo metu naudojami 2301 Mcrodrive 1 Power Supply ir УИП-1

maitinimo šaltiniai.

4 pav. Vertikalios gel-elektroforezės aparatai

PAAG bloko paruošimas:

Elektroforezė, priklausomai nuo tiriamos izofermentų sistemos, buvo

atliekama dvisluoksniame vertikaliame 5 / 7,5 % ir vienasluoksniame 5 % PAA

gelyje. Geliai ruošiami remiantis Harry ir Hopkinson (1975) metodinėmis

rekomendacijomis su kai kuriomis modifikacijom.

Pirmiausiai buvo paruošiama 20% AKA:

Akrilamidas 96g

Bis 4g

Dist.vanduo iki 500ml

Paruoštas tirpalas nufiltruojamas ir laikomas tamsoje prie 3-4ºC

temperatūroje.

Tai monomerų tirpalas naudojamas akrilamido linijų polimerų susiuvimui.

Nuo jo santykio priklauso gelio elastingumas ir poringumas.

Taip pat reikia pasiruošti gelinį buferį (Tris-glicininis buferis, pH 8,3):

0,0495 M Tris 6g

0,383 M Glicininas 28,8g

Dist.H2O iki 1000ml

Tris- EDTA-H3BO3 buferis, pH ~8,3 – 8,4 (Peacock et al., 1965)

0,9 M Tris 109,3 g

0,025 M Na2EDTA* 2 H2O (trilonas B) 9,30 g

0,89 M H3BO3 55,04 g

H2O dist. iki 1000 ml

Darbinis buferis:

Tris- EDTA-H3BO3 buferis, pH 8,3 -8,4 200 ml

H2O dist. iki 2000 ml

Gelinis buferis palaiko ir stabilizuoja nešėjo pH, taip įtakodamas medţiagos

migracijos greitį. Be to jis taip pat naudojamas kaip tiriamo pavyzdţio tirpiklis.

Naudojant didelės joninės jėgos buferius, pavyzdţių migracijos greitis maţėja,

sumarinė srovė didėja, išsiskiria šilumos kiekis. Maţinant buferio joninę jėgą

migracijos greitis didėja, sumarinė srovė ir išsiskiriantis šilumos kiekis maţėja, didėja

difuzija ir maţėja skiriamoji geba.

Paruošiami PAAG su skiriamosiomis AKA koncentracijomis:

TEMED (N,N,N,N′- tetrametiletilendiamidas) naudojamas kaip polimerazinės

reakcijos katalizatorius.

PCA naudojamas kaip polimerizacijos iniciatorius.

Ruošiant dvisluoksnį PAAG, koncentruojantis sluoksnis sudaro 1/3-1/4

bendro galutinio tirpalo, o skiriantysis 2/3-3/4. MDH (Malato dehidrogenazė), ME

(Malik fermentas) ir G6PDG (Gliukozė-6- fosfato dehidrogenazė) sistemas tiriant

Komponent

ai Gelio koncentracija

5% 7,50%

20 % AKA 20 ml 30 ml

Pagrindinis buferis 8 ml 8 ml

TEMED 0,08 ml 0,08 ml

Dist.H2O iki 75 75 ml

PCA 0,08 g 0,08 g

Galutinė išeiga 80 ml 80 ml

buvo naudojam vienasluoksnis 5 % PAA gelis, o NB (Nespecifinis baltymas) ir EST

(Esterazės) dvisluoksnius 5 % / 7,5% PAA gelius.

Pagrindinės savybės suteikiančios PAAG privalumą prieš kitus nešėjus:

Pagal porų dydį galima varijuoti plačiose ribose. Gelio

procentingumas pasirenkamas empiriškai, atsiţvelgiant į frakcionuoto objekto

molekulinę masę.

Naudojamo buferio pH neturi ryškios įtakos gelio

polimerizacijos procesui, kas suteikia galimybę eksperimento metu pasirinkti pačias

palankiausias sąlygas.

PAAG būdinga ţemo laipsnio absorbcija ir elektroendoosmozė,

dėl ko makromolekulių migracijos metu daţniausiai išvengiama šalutinių efektų.

Makromolekulių frakcionavimo laikas PAAG yra sąlyginai

trumpas lyginant su kitais nešėjais.

Prieš sustingstant geliui į jį įdedama „ šukutės“kurios prieš eksperimentą

išimamos ir formuoja „kišenes“ į kurias įnešamas tiriamas homogenatas. Gelių

polimerizacija trunka apie 15-20 minučių.

Elektroforezės paruošimas:

Kamera elektroforezei buvo paruošta sekant nurodymus instrukcijoje.

Elektrodiniai indai uţpilami atitinkamu elektrodiniu buferiu. Naudojam šaldymo

sistema, kuri elektroforezės kamerose palaiko 3-5ºC temperatūrą. Elektroforezės metu

bloko pašildymas gali sukelti fermentų inaktyvaciją bei rezultatų iškraipymą.

Paleidţiama preelektroforezę (160V, 30 minučių), kurios metu iš gelių išvaromas

PCA (nes jis yra vienintelis kenksmingas komponentas, kuris veikia fermentus, todėl

prieš pradedant frakcionavimą pašalinamas iš gelio preelektroforezės būdu).

Prieš eksperimentą buvo pasiruošiama dešimt bandinių su 7 µl 40 %

sacharozės tirpalo, kuris suteikia klampumą ir neleidţia pavyzdţiui išplaukti

apsaugodamas nuo išplaukimo efekto pavyzdţių uţnešimo į „kišenes“ metu. Taip pat

įlašinama lašas bromfenolio mėlynojo. Tai vadinamas lyderinis daţas (angl. tracker

dye) kurio migracijos greitis yra didesnis nei frakcionuojamų sistemų, todėl pagal jį

stebima elektroforezės eiga. Taip pat imama 10 µl bandinio ir sumaišius su sacharoze

bei bromfenolio mėlynuoju uţnešama individualiai į jam skirtą „kišenę“.

Elektroforezė vykdoma tokiu reţimu:

I etapas: Pavyzdţių išėjimas iš „kišenių“ (40mA, 20 minučių). Šio etapo metu

baltymai koncentruojasi buferio/gelio riboje ir glaustesnėje formoje patenka į gelį.

II etapas: Darbinis reţimas. Srovė pakeliama iki 250V ir frakcionavimas

atliekamas 1-2 valandų.

Baltymų dažymas

Daţymo principas:

Po elektroforezės izofermentų lokalizacija nustatoma daţymo metu.

Specifiškumą apsprendţia daţančio tirpalo sudėtyje esantis specifinis analizuojamam

fermentui substratas ir druskos, kurios reaguoja su fermento kanalizuojamos reakcijos

produktu :

Substratas + fermentas → produktas+ druska → spalvota substancija

Nespecifinio baltymo ir esterazių daţymo metu spalvota substancija susidaro

vykstant druskų kondensacijai su aromatiniu diazotiniu komponentu (FBRR, CBB).

Nespecifinės esterazės (EST) pasiţymi labai didele genetine įvairove.

Dehidrogenazių daţymo metu, vyksta tetazolio (NBT) oksidacijos - redukcijos

reakcija, susidaro formazanas, netirpus tamsiai mėlynos-violetinės spalvos junginys.

Daţai gaminami prieš pat daţymą. Bandymo metu buvo daţomi šie fermentai:

MDH ( Malato dehidrogenazė);

ME (Malik-fermentas);

G6PDG ( Gliukozė-6- fosfato dehidrogenazė);

NSP ( Nespecifinis baltymas)

EST ( Esterazės)

LDH ( Laktato dehidrogenazė)

XDH ( Ksantino dehidrogenazė)

Daţų paruošimas:

Malik-fermentas [ME, E.C. 1.1.1.40

Pagal Ayala et. (1972), Cross et al..(1979) metodikas su tam tikromis

modifikacijomis:

0,05 M Tris-HCl buferis, pH 8,5 100 ml ( 25 ml 0,2 M Tris + 15 ml 0,1 N HCl

+ dist. H2O iki 100ml) arba ( 0,6 g Tris į 25 ml H2O + 15 ml 0,1 N HCl + dist. H2O

iki 100ml)

Malic acid Na2 salt 0,1 g

MgCl2 ∙ 6 H2O 0,025 g

PMS 0,002 g

NBT 0,03 g

NADP 0,04 g

Inkubuojama 37ºC temperatūroje tamsoje 2-4 valandas. ME izofermentai

daţosi tamsiai violetine spalva.

Reakcija: Malic acid Na2 salt + NADP ↔ piruvatas + CO2+ NADPH + H

Malato dehidrogenazė [MDH, E.C. 1.1.1.37]

Pagal Brewer ( 1970) metodika su tam tikromis modifikacijomis:

0,05 M Tris-HCl buferis, pH 8,5 100 ml ( 25 ml 0,2 M Tris + 15 ml 0,1 N HCl

+ dist. H2O iki 100ml) arba ( 0,6 g Tris į 25 ml H2O + 15 ml 0,1 N HCl + dist. H2O

iki 100ml)

Natrio malatas 0,1 g

NAD 0,03 g

NBT 0,03 g

PMS 0,002 g

Inkubuojama 37ºC temperatūroje tamsoje 2 valandas. MDH izofermentai

daţosi tamsiai violetine spalva.

Reakcija: Natrio malatas +NAD ↔ oksalacetatas +NADH +H

Glukozo-6-fosfato dehidrogenazė [G6PDH, E.C. 1.1.1.49]

Pagal Brewer ( 1970) metodika su tam tikromis modifikacijomis:

0,5 M Tris-HCl, pH 7,1 25 ml (1,2g Tris + 45 ml 0,1 N HCl iki pH7 + dist.

H2O iki 100ml)

NADP 0,03 g

NBT 0,02 g

PMS 0,002 g

D-glucose-6-phosphate disodium salt 0,2 g

H2O iki 90ml

Gelis inkubuojamas 37ºC temperatūroje tamsoje apie 1 valandą. Aktyvumas

pasireiškę tamsiai mėlynomis juostomis.

Esterazės [EST, nespecifinės]

Pagal Brewer ( 1970) metodika su tam tikromis modifikacijomis:

α-Naftilacetato tirpalas 0,06 g

Acetonas 3 ml

FBRR ( angl. Fast blue RR salt) 0,06 g

H2O iki 100ml

Inkubuojama 30 minučių. Esterazės pasireiškia rausvos- rudos spalvos

zonomis, naudojant α- izomera – tamsiai rudos spalvos.

Nespecifinis baltymas [NSP]

Comasie blue G-250 arba R-250 0,2 g

HClO4 17,5 ml

H2O iki 500ml

Inkubuojama kambario temperatūroje apie vieną parą. Baltymų frakcijos

nusidaţo tamsiai mėlyna spalva.

Laktato dehidrogenazė [LDH, E.C. 1.1.1.27]

0,05 M Tris-HCl buferis, pH 7,5 100ml

Na laktatas 0,2 g

PMS 0,005 g

NBT 0,03 g

NAD 0,02 g

Inkubuojama prie 37ºC temperatūroje tamsoje apie valandą. daţosi tamsiai

mėlyna spalva.

Ksantino dehidrogenazė [XDH, E.C. 1.1.1.204] monomeras arba dimeras.

0,05 M Tris- HCl buferis, pH 8,5 100ml

Hypoxanthine 0,1 g

NAD 0,03 g

NBT 0,02 g

PMS 0,002 g

Inkubuojama prie 37ºC temperatūroje tamsoje.

Po daţymo geliai fiksuojami 7% acto rūgšties tirpale ir įdedami į uţdaromą

maišelį.