ader 5.1.5. ameliorarea şi consolidarea unui nucleu de ... · ader 5.1.5. ameliorarea şi...

30
ADER 5.1.5. Ameliorarea şi consolidarea unui nucleu de vaci de rasă Bălţată Românească de tip Fleckvieh prin selecţie şi utilizarea la reproducţie a celor mai performante structuri genetice în vederea creşterii eficienţei economice a activităţilor fermei Cod proiect: ADER 5.1.5. Tip proiect: PLAN SECTORIAL – ADER Faza: 2 – Aplicarea selecției asistate de markeri moleculari efectivelor incluse în studiu Coordonator proiect: Stațiunea de Cercetare-Dezvoltare pentru Creşterea Bovinelor Arad Director proiect: Drd. Ing. Neamţ Radu

Upload: others

Post on 22-Jan-2020

32 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

ADER 5.1.5.Ameliorarea şi consolidarea unui nucleu de vaci de rasă Bălţată Românească de tip Fleckvieh prin selecţie şi utilizarea la reproducţie a celor mai performante structuri

genetice în vederea creşterii eficienţei economice a activităţilor fermei

Cod proiect: ADER 5.1.5.

Tip proiect: PLAN SECTORIAL – ADER

Faza: 2 – Aplicarea selecției asistate de markeri moleculari efectivelor incluse în

studiu

Coordonator proiect:Stațiunea de Cercetare-Dezvoltare pentru

Creşterea Bovinelor Arad

Director proiect: Drd. Ing. Neamţ Radu

• Proiectul are ca scop îmbunătăţirea şi consolidareastructurii genetice a unui efectiv de rasă BălţatăRomânească de tip Fleckvieh, prin utilizarea lareproducţie a celor mai performante structurigenetice şi selecţia asistată de markeri moleculari, învederea obţinerii unor parametri productivi vizândcantitatea şi calitatea laptelui (grăsime și proteină),competitivi în contextul actual al pieţelor europene.

Obiectivul proiectului

Obiectivul fazei

• Selecția asistată de markeri moleculari pentrugenele de interes economic în vedereastabilirii frecvenței genelor și a genotipurilorfavorabile în efectivul de vaci incluse în studiu.

• Analiza gradului de corelare a genotipurilor cunivelul productiv.

• Stabilirea diferențelor productive în raport cugenotipul

Activități desfășurate în vederea realizării obiectivului fazei

• Activitatea 2.1 – Colectarea probelor biologice• Recoltarea probelor biologice individuale (sânge) de la vacile cu lactația curentă încheiată și

corectată prin aducerea la valoarea de echivalent maturitate (EM), în vederea stabiliriigenotipului deținut și a frecvenței genelor. În acest sens se va recolta o cantitate de 2 mlsânge în vacutainere cu EDTA depozitate la 4°C până în momentul izolării ADN.

•• Activitatea 2.2 – Izolarea ADN total genomic și analiza merkerilor moleculari.• Izolarea ADN‐ului genomic total din probele biologice (sânge);• Amplificarea prin reacţie PCR a genelor de interes;• Determinarea genotipurile individuale prin tehnica RFLP (care presupune restricţia

enzimatică a ampliconilor rezultaţi în urma amplificării);• Migrarea în gel de agaroză a produşilor PCR‐RFLP pentru evidenţierea genotipurilor;• Stabilirea frecvenței alelelor și a genotipurilor în efectiv.•• Activitatea 2.3.‐ Corelarea valorilor productive cu genotipul individual• Stabilirea nivelului productiv al vacilor cu lactația curentă încheiată, sub aspectul producției

de lapte (kg), grăsime (%, kg) și proteină (%, kg);• Corelarea valorile productive în raport cu genotipul individual;• Stabilirea valorilor productive privind producția de lapte, grăsime, proteină în raport cu

genotipul individual și testarea statistică a diferențelor.

Materialul biologic ‐ probe de sânge care au fost prelevate de laanimale de rasa Bălțată RomâneascăRecoltarea în condiţii aseptice, din vena caudală cu ajutorulvacumtainerelor cu anticoagulant (K3EDTA).

Colectarea probelor biologice

Izolarea ADN din probe de sânge

Materiale necesare: vacumtainere cu anticoagulant K3EDTA; pipete automate şi vârfuri (10, 100 şi 1000 µl); tuburi Eppendorf sterile de 1,5 ml; kitul Wizard Genomic DNA; izopropanol; etanol 70%; termobloc; microcentrifugă; vortex ;

Micropipete automate  Termobloc

Microcentrifugă (max.4.000 rpm)Vortex

Protocolul de lucruIzolarea ADN din probe de sânge ‐ kitulWizard Genomic DNA Purification (Wizard™ Genomic DNA Purification Kit)

Etapele extracţiei ADN din sânge Etapa I. Liza celulară300 μl sânge se pun într‐un tub Eppendorf de 1,5 ml;se adaugă 900 μl soluţie de liză celulară şi se amestecă prin răsturnare apoi se incubează 10 min la temperatura camerei;se centrifughează la 13000xG, 20 secunde;se îndepărtează supernatantul lăsându‐se deasupra sedimentului o cantitate de 10 µl lichid rezidual şi apoi se vortexează timp de 20 secunde;

Etapa II. Liza nucleilor şi precipitarea proteinelorse adaugă 300 μl soluţie de liză a nucleilor şi se pipetează de 5‐6 ori;se adaugă 100 μl soluţie de precipitare a proteinelor şi apoi se vortexează 20 secundese centrifughează la 13000XG, 3 minute pentru colectarea  resturilor proteice 

Etapa III. Precipitarea şi rehidratarea ADNse transferă supernatantul în izopropanol 300 μl centrifugare la 13000XG,1 minut;se îndepărtează supernatantul, se adaugă 300 μl etanol 70% şi se centrifughează la 13000XG,1minut;se aspiră etanolul şi se lasă la uscat 10‐15minute;se rehidratează ADN în 50 µl de soluţie de rehidratare timp de o oră la 650C.

Aprecierea probelor de ADN extrasePuritatea probelor de ADN extrase a fost apreciată pe baza raportului A260/A280 iarconcentraţia probelor a fost calculată automat cu softwareul spectofotometrului NanoDrop2000

Graficul spectrelor de absorbanță pentru probele de ADN

Electroforeza în gel de agarozăDeterminarea integrităţii ADN extras (gradul de fragmentare al probelor)

ADN genomic total migrat în gel de agaroză de 0,8%

Amplificarea in situ a fragmentelor de ADN, specificegenelor de interes, prin intermediul tehnicii PCR

Materiale necesare: pipete automate şi vârfuri (10, 100 şi 1000 µl);tuburi sterile de 0,2; 0,5 şi 1,5 ml; ADN matriţă; primeri sens şiantisens specifici genelor de interes; Mastermix 2 x; microcentrifugăpentru tuburi; vortex; PCR thermocycler

Etape de lucru:‐amplificarea in situ a fragmentelor de ADN, specifice genelor de interes, prin intermediul tehnicii PCR;‐vizualizarea ampliconilor (produşilor PCR) în gel de agaroză;‐restricţia produşilor de amplificare cu endonucleaze specifice, cu ajutorul tehnicii RFLP şi vizualizarea fragmentelor de restricţie de lungimi diferite, utilizând tehnica de electroforeză în gel de agaroză; 

Amplificarea sectoarelor de ADN pentru k‐cazeină

1) κ‐cazeina (κ‐CN)Simbolul genei: CSN3ID‐ul genei: 281728Locus: AC_000163Secventa amplificată:ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAGAAAAATCAGGATAAAACAGAAATCCCTACCATCAATACCATTGCTAGTGGTGAGCCTACAAGTACACCTACCATCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAGCTACTCTAGAAGCTTCTCCAGAAGTTATTGAGAGCCCACCTGAGATCAACACAGTCCAAGTTACTTCAACTGCGGTCTAAATACTCTAAGGAGACATCAAAGAAGACAACGCAGGTAAATAAGCAAAATGAATAACAGCCAAGATTCATGGACTTATTAATAAAATCGTAACATCTAAACTAGCGTAGATGGATAAATTAAATCTGTTACAGAGAAGGCGAAATGGGC

Amplificarea sectoarelor de ADN pentru β‐lactoglobulina 

2) β‐lactoglobulina (BLG)Simbolul genei: BLG/LGB/PAEPID‐ul genei: 280838Locus: AC_000168Secventa amplificată:TGTGCTGGACACCGACTACAAAAAGTACCTGCTCTTCTGCATGGAGAACAGTGCTGAGCCCGAGCAAAGCCTGGTCTGCCAGTGCCTGGGTGGGTGCCAACCCTGGCTGCCCAGGGAGACCAGCTGTGTGGTCCTCGCTGCAACGGGGCCGGGGGGGACGGTGGGAGCAGGGAGCTTGATTCCCAGGAGGAGGAGGGATGGGGGGTCCCCGAGTCCCGCCAGGAGAGGGTGGTCATATACCGGGAGC

Amplificarea sectoarelor de ADN pentru α‐lactalbumina

3) α‐lactalbuminaSimbolul genei: LALBA/alfaLA/a‐LACTA/ID‐ul genei: 281894Locus: AC_000162Secventa amplificată:CTCTTCCTGGATGTAAGGCTTGATGCCAGGGCCCCTAAGGCTTTTTCCACAAATAAAAGGAGGTGAGCAGTGTGGTGACCCCATTTCAGAATCTTGGGGGGTAACCAAAATGATGTCCTTTGTCTCTCTGCTCCTGGTAGGCATCCTATTCCATGCCACCCAGGCT

Locus Secventa primerilor Lungime amplicon

κ‐CN 5’‐ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG‐3’

3’‐GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA‐5’

350

β‐LG 5’‐TGTGCTGGACACCGACTACAAAAAG‐3’

5’‐GCTCCCGGTATATGACCACCCTCT‐3’

247

α‐LA 5’‐CTCTTCCTGGATGTAAGGCTT‐3’

5’‐AGCCTGGGTGGCATGGAATA‐3’

166

Primerii utilizaţi pentru amplificarea genelor de interes

Etapele reacției  PCR κ‐CN β‐LG α‐LA

Denaturarea iniţială 95oC ‐ 5 min 95oC ‐ 5 min 95oC ‐ 5 min

Denaturarea 95oC ‐ 30 sec 95oC ‐ 30 sec 95oC ‐ 30 sec

Alipire primeri 60oC ‐ 30 sec 63oC ‐ 30 sec 55oC ‐ 30 sec

Extensie 72oC ‐ 30 sec. 72oC ‐ 30 sec. 72oC ‐ 30 sec.

Extensie finală 72oC ‐ 5 min 72oC ‐ 5 min 72oC ‐ 5 min

Parametrii reacţiei de amplificare

Vizualizarea ampliconilor în gel de agarozăMateriale necesare: pipete automate şi vârfuri (10 sau 100 µl); produs PCR; tampon electrolitic 1X TBE; agaroză; balanţă analitică; cuptor cu microunde sau baie de apă; colorant Bromură de Etidiu sau Midori Green; echipament de electroforeză ; aparat transiluminator ; sistem de fotodocumentare a gelurilor 

Sistem de electroforeză orizontală (Consort)

Transiluminator pentru vizualizarea în lumină UV a fragmentelor de ADN.

Sistem de fotodocumentare al gelurilor (Vilber Loumart Print II Systems)

Protocolul de lucru

Pentru migrarea produşilor PCR s‐a folosit un gel de agaroză de 3% şi untampon electrolitic TBE (Tris 0,089M; acid boric 0,089M; EDTA 0,002M; pH8,3). Gelul de agaroză a fost colorat în prealabil cu 5l Midori Green/ 100mlgel sau 10l Bromură de etidiu/100ml gel. După solidificarea gelului, în fiecaregodeu s‐au introdus 6l produs PCR iar probele au fost migrate la 90 V şi 50mA pentru aproximativ 40 minute. Analiza imaginii din gel a fost făcută sublumină UV. Dimensiunea ampliconilor a fost apreciată în funcţie de distanţaparcursă faţă de benzile unui ADN standard de greutate moleculară.Pentru analiza şi interpretarea rezultatelor, gelurile de agaroză au fostfotografiate în ultraviolet folosind sistemul de fotodocumentare al gelurilorVilber Loumart Print II Systems.

Rezultatele amplificării genelor de interes

Produși de amplificare PCR de 350 pb pentru gena din locusul κ-CN

Produși de amplificare PCR de 247 pb pentru gena din locusul β-LG

Produși de amplificare PCR de 166 pb pentru gena din locusul α-LA

Restricţia produşilor de amplificare cu endonucleaze specifice, cu ajutorul tehnicii RFLP şi vizualizarea fragmentelor de restricţie de lungimi diferite, utilizând tehnica de electroforeză în gel de agaroză

Materiale necesare: pipete automate şi vârfuri (10 sau 100 µl); tuburi sterile de 1,5 ml; produs PCR; enzime de restricţie HindIII, HaeIII și MnlI, tampon de reacţie al enzimei de restricţie10X; H2O bidistilată sterilă; termobloc.

Protocolul de lucruDeterminarea genotipurilor existent la nivelul genelor de interes s‐a realizatprin scindarea specifică a ampliconilor cu enzimele de restricţie HindIII (κ‐CN),HaeIII (β‐LG) și MnlI (α‐LA). Aceaste restrictaze scindează molecula de ADN(ampliconii) la nivelul unor regiuni specifice, dând naştere fragmentelor derestricţie de lungimi diferite.Probele au fost incubate timp de 2 h, la temperatura optimă de activitate aenzimelor (37oC). După incubare produşii PCR‐RFLP au fost vizualizaţi în gel deagaroză de 3,5% și fotografiați în ultraviolet folosind sistemul defotodocumentare al gelurilor Vilber Loumart Print II Systems.Produşii de restricţie de lungimi diferite au fost ulterior apreciaţi, din punctde vedere al dimensiunii, cu ajutorul unui ADN standard de greutatemoleculară

Locus Lungime amplicon Enzima restrictie Genotip

(pb)

AA AB BB

κ‐CN 350 HindIII 350 350

219

131

219

131

β‐LG 247 HaeIII 148

99

148

99

74/74

99

74/74

α‐LA 166 MnlI

78

52

36

114

78

52

36

114

52

Lungimea produsilor PCR-RFLP

Rezultatele PCR‐RFLP (k‐CN)

Produși PCR‐RFLP pentru gena din locusul κ‐CN obținuți prin digestia ampliconilor de 350 pb cu enzima HindIII

Rezultatele PCR‐RFLP (β‐LG )

Produși PCR‐RFLP pentru gena din locusul β‐LG obținuți prin digestia ampliconilor de 247 pb cu enzima HaeIII

Rezultatele PCR‐RFLP (α‐LA )

Produși PCR-RFLP pentru gena din locusul α-LA obținuți prin digestia ampliconilor de 166 pb cu enzima MnlI

Corelarea valorilor productive cu genotipul vacilorParametri productivi incluși în studiu ‐producția de lapte (Kg);‐producția de grăsime (%);‐producția de grăsime (Kg);‐producția de proteină (%);‐producția de proteină (Kg).

Rangul lactației Producție lapte Producție grăsime

1 1,229 1,204

2 1,133 1,118

3 1,067 1,057

4 1,024 1,019

5 1,002 1

6 1 1

7 1,018 1,019

Coeficienții de corecție pentru aducerea la echivalent maturitate a producțiilor în raport cu rangul lactației

Aprecierea productivă a efectivului

Parametru de analizat Lapte (kg) Grăsime (%) Grăsime (kg) Proteină (%) Proteină (kg)

Efectiv 82 82 82 82 82

Media productivă 5868 4,04 237,06 3,38 198,33

±S.E.M. 90,64 0,04 5,99 0,02 4,04

V% 17,79 9,1 18,17 6,43 17,73

Minim 2496 3,19 79,62 2,82 70,38

Maxim 7759 5,05 391,82 3,95 306,48

Valorile medii și indicii de dispersie privind parametri productivi aferenți F1

Frecvența genelor și a genotipurilor pentru generația F1 

Locus Genotip Frecvenţa genotipului Frecvenţa alelelor

κ‐CN

AA 0,646pA‐0,81

qB‐0,19

ᵪ=0,0016

AB 0,329

BB 0,025

β‐LG

AA 0,281pA‐0,61

qB‐0,39

ᵪ=0,008

AB 0,658

BB 0,061

α‐LA

AA 0pA‐0

qB‐1

ᵪ=1

AB 0

BB 1

Polimorfismul din locusul genelor de interes în efectivul F1 studiat

Frecvența genelor și a genotipurilor pentru generația F2 (rezultate parțiale

Locus Genotip Frecvenţa genotipului Frecvenţa alelelor

κ‐CN

AA 0,625pA‐0,75

qB‐0,25

ᵪ=0,009

AB 0,25

BB 0,125

β‐LG

AA 0,406pA‐0,593

qB‐0,407

ᵪ=0,037

AB 0,375

BB 0,219

α‐LA

AA 0pA‐0

qB‐1

ᵪ=1

AB 0

BB 1

Polimorfismul din locusul genelor de interes în efectivul F2 studiat (rezultate parțiale)

Caracterizarea productivă a generației F1 în raport cu genotipul asociat locusului k‐CN

Genotip AA AB BB AA/AB AA/BB AB/BB

Lapte (kg) 5887,76±115,7 5839,37±117,8 5619±86,34 p>0,37 p≤0,003 p≤0,007

Grăsime (%) 4,19±0,05 4,08±0,06 4,01±0,02 p≤0,04 p≤0,001 p≤0,008

Grăsime (Kg) 246,68±6,83 238,24±9,1 225,32±4,69 p>0,63 p≤0,018 p≤0,022

Proteină (%) 3,27±0,03 3,29±0,03 3,4±0,02 p>0,81 p≤0,012 p≤0,036

Proteină (KG) 192,52±4,12 192,11±6,6 191,04±3,61 p>0,66 p>0,24 p>0,39

Valorile medii și indicii de dispersie privind producțiile de lapte, grăsime și proteină a generației F1 în raport cu genotipul deținut pentru locusul k-cazeinei

Diferențe semnificative statistic la p≤0,05

Caracterizarea productivă a generației F1 în raport cu genotipul asociat locusului β‐lactoglobulinei

Genotip AA AB BB AA/AB AA/BB AB/BB

Lapte (kg) 5809±117,58 5906,54±166,76 5812±115,11 p≤0,033 p>0,79 p≤0,038

Grăsime (%) 4,17±0,06 4,2±0,08 4,23±0,06 p≤0,017 p≤0,003 p≤0,006

Grăsime (Kg) 242,23±9,96 248,07±5,93 245,84±7,71 p>0,42 p>0,16 p>0,31

Proteină (%) 3,31±0,04 3,34±0,05 3,33±0,01 p>0,57 p>0,39 p>0,081

Proteină (KG) 192,27±5,43 197,27±6,19 193,53±3,94 p>0,44 p>0,73 p>0,55

Valorile medii și indicii de dispersie privind producțiile de lapte, grăsime și proteină a generației F1 în raport cu genotipul deținut pentru locusul β-lactoglobulinei

Diferențe semnificative statistic la p≤0,05

Activități desfășurate în cadrul fazei

‐ S‐au recoltat probele biologice;‐ S‐au determinat genotipurile individuale prin tehnica PCR‐RFLP;‐ S‐a stabilit frecvența genotipurilor și alelelor;‐S‐a determinat nivelul productiv al vacilor sub aspectulproducției de lapte, grăsime și proteină și s‐a efectuat corelareaacestuia cu genotipul individual;‐ S‐au calculat și testat din punct de vedere statistic diferențeleproductive privind producția de lapte, grăsime, proteină în raportcu genotipul individual.

CONCLUZII‐Pentru locusul k‐cazeinei, genotipul homozigot AA este asociatunor producții superioare de lapte și grăsime dar și unorproducții reduse de proteină.‐Producțiile asociate genotipului homozigot BB pentru K‐cnsunt caracterizate de valori ridicate ale conținutului de proteinăîn lapte.‐Pentru locusul β‐lactoglobulinei genotipul BB este asociat uneiproducții ridicate de grăsime în lapte.‐Valori semnificativ ridicate pentru cantitatea de lapte șiproteină au fost înregistrate în cazul genotipului heterozigot ABal β‐lactoglobulinei .‐Genotipul homozigot AA al β‐lactoglobulinei este asociat unorvalori productive foarte reduse pentru toate caracterele incluseîn studiu, producție de lapte, grăsime % și kg, proteină % și kg.