a kapszaicin-ÉrzÉkeny ÉrzŐideg …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...a...

98
1 A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK AKTIVÁCIÓS MECHANIZMUSAINAK VIZSGÁLATA ÉS A FELSZABADULÓ NEUROPEPTIDEK MEGHATÁROZÁSA EGYETEMI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS Dr. Börzsei Rita Gyógyszertudományok Doktori Iskola Neurofarmakológia Program Doktori iskola vezető: Dr. Barthó Loránd Programvezető: Dr. Pintér Erika Témavezető: Dr. Helyes Zsuzsanna PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR FARMAKOLÓGIAI ÉS FARMAKOTERÁPIAI INTÉZET 2012.

Upload: leliem

Post on 09-Mar-2018

216 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

1

A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK

AKTIVÁCIÓS MECHANIZMUSAINAK VIZSGÁLATA ÉS A

FELSZABADULÓ NEUROPEPTIDEK MEGHATÁROZÁSA

EGYETEMI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

Dr. Börzsei Rita

Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Neurofarmakológia Program

Doktori iskola vezető: Dr. Barthó Loránd

Programvezető: Dr. Pintér Erika

Témavezető: Dr. Helyes Zsuzsanna

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR

FARMAKOLÓGIAI ÉS FARMAKOTERÁPIAI INTÉZET

2012.

Page 2: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

2

TARTALOMJEGYZÉK

TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................................... 2

I. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS, A KUTATÁS ELŐZMÉNYEI ...................... 6

I. 1. A KAPSZAICIN TÖRTÉNETE ÉS FARMAKOLÓGIAI JELENTŐSÉGE ............................................. 6 I. 2. A KAPSZAICIN RECEPTORA .................................................................................................................. 7 I.3. A LIPID RAFTOK FELÉPÍTÉSE ............................................................................................................ 11

I.3.1. A koleszterin szerepe a lipid raftokban .............................................................................................. 13 I.3.2. A lipid raftok funkciója ...................................................................................................................... 13

I. 4. A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK ÉS HÁRMAS FUNKCIÓJUK ............... 14 I. 5. A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ROSTOKBÓL FELSZABADULÓ SZENZOROS NEUROPEPTIDEK16

I.5.1. Fájdalom- és gyulladáskeltő hatású neuropeptidek .......................................................................... 16 I.5.2. Fájdalomcsillapító és gyulladásgátló hatású neuropeptidek ............................................................ 17

I. 6. RADIOIMMUNASSAY MÓDSZEREK JELENTŐSÉGE ...................................................................... 22 I.7. TÖMEGSPEKTROMETRIA .................................................................................................................... 24 I.8. VIZSGÁLATAINK INDOKOLTSÁGA ..................................................................................................... 25

II. CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................................... 28

III. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ............................................ 29

III. 1. ÁLLATOK .............................................................................................................................................. 29 III.2. IN VITRO KÍSÉRLETI MODELL: SZENZOROS NEUROPEPTID-FELSZABADULÁS KIVÁLTÁSA

ÉS BEFOLYÁSOLÁSÁNAK VIZSGÁLATA IZOLÁLT PATKÁNYTRACHEA ÉRZŐIDEG-

VÉGZŐDÉSEIBŐL ......................................................................................................................................... 29 III.3. ANALITIKAI VIZSGÁLATOK .............................................................................................................. 31

III.3.1. Biológiai minták előkészítése .......................................................................................................... 31 III.3.1.1. Szenzoros neuropeptidek meghatározása perfúziós kísérlet mintáiból:............................................................ 31 III.3.1.2. Humán minták (plazma, anyatej) előkészítése RIA mérésekhez ........................................................................ 31 III.3.1.3. Humán minták (plazma, anyatej) előkészítése tömegspektrometriás mérésekhez ........................................... 32 III.3.1.4. Kérődző állatfajok mintáinak (plazma, tej, emlőbiopszia) előkészítése RIA mérésekhez................................... 32

III.3.2. SOM, CGRP, SP és PACAP RIA leírása ....................................................................................... 33 III.3.2.1. SOM RIA ............................................................................................................................................................. 33 III.3.2.2. CGRP RIA ............................................................................................................................................................ 34 III.3.2.3. SP RIA: ................................................................................................................................................................ 34 III.3.2.4. PACAP-38 RIA ..................................................................................................................................................... 35 III.3.2.5. A radioimmunassay eljárások menete ............................................................................................................... 35

III.3.3. MALDI-TOF/TOF analízis ............................................................................................................ 36 III.3.4. PAC1 receptor immunhisztokémia ................................................................................................. 37

III. 4. IN VIVO KÍSÉRLETEK ........................................................................................................................ 38 III.4.1. Mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladás vizsgálata patkány lábháti bőrében ................. 38 III.4.2. Mustárolajjal kiváltott neurogén ödéma vizsgálata egérfülön ...................................................... 39 III.4.3. Mustárolajjal kiváltott nem neurogén gyulladás vizsgálata egér fülön ........................................ 40

III.5. STATISZTIKA: ...................................................................................................................................... 41

IV. EREDMÉNYEK .................................................................................................................... 42

IV.1. LIPID RAFTOK: AZ MCD KEZELÉS HATÁSA A SZENZOROS NEUROPEPTID

FELSZABADULÁSRA IZOLÁLT PATKÁNY TRACHEÁN ......................................................................... 42 IV.2. AZ ENDOMORFIN-1 HATÁSA SZENZOROS NEUROPEPTIDEK FELSZABADULÁSÁRA IN VITRO

ÉS AKUT GYULLADÁSOS FOLYAMATOKRA IN VIVO ............................................................................ 45 IV.2.1. Az EM-1 hatása az elektromos téringerléssel kiváltott SP és CGRP felszabadulásra................... 45 IV.2.2. Az EM-1 hatása a mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladásra patkányban ...................... 47 IV.2.3. Az EM-1 hatása a mustárolajjal kiváltott akut neurogén fülduzzadásra egérben ........................ 48 IV.2.4. Az EM-1 hatástalansága a mustárolajjal kiváltott késői gyulladásos reakciókra ......................... 49

IV.3. A PACAP6-38 AGONISTA HATÁSAI AZ ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEKEN ....................................... 52

Page 3: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

3

IV.3.1. A PACAP1-38 és PACAP6-38 hatásai az elektromos téringerléssel és kapszaicin ingerléssel kiváltott

szenzoros neuropeptidek felszabadulására izolált patkány tracheán ......................................................... 52 IV.4. A PACAP-38 KIMUTATÁSA KÜLÖNBÖZŐ FAJOK PLAZMÁJÁBAN ÉS ANYATEJÉBEN .......... 55

IV.4.1. PACAP-38 kimutatása humán mintákban ..................................................................................... 55 IV.4.1.1. A PACAP-38 kimutatása anyatejben és emberi plazmában tömegspektrometriás módszerrel ......................... 55 IV.4.1.2. PACAP-38-LI kimutatása anyatejből és emberi plazmából RIA módszerrel ....................................................... 56

IV.4.2. PACAP-38 kimutatása kérődző állatfajokban ................................................................................ 59 IV.4.2.1. PACAP-38 kimutatása RIA módszerrel kérődző állatok plazmájában és tejében ............................................... 59 IV.4.2.2. PACAP-38-LI meghatározása homgenizált juh tőgy biopsziából ........................................................................ 61 IV.4.2.3. PAC1 receptor immunlokalizációja juh emlőmirigyben ..................................................................................... 62

V. MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK ......................................................................... 64

V.1. LIPID RAFTOK SZEREPE A TRPV1 RECEPTOR AKTIVÁCIÓJÁBAN ............................................ 64 V.2. EM-1 HATÁSA AZ ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEKBŐL FELSZABADULÓ SZENZOROS

NEUROPEPTIDEKRE IN VITRO ÉS NEUROGÉN ÉS NEM-NEUROGÉN GYULLADÁSOS

FOLYAMATOKRA IN VIVO .......................................................................................................................... 65 V.3. PACAP1-38 ÉS PACAP6-38 HATÁSAINAK VIZSGÁLATA KAPSZAICINNEL, ÉS ELEKTROMOS

TÉRINGERLÉSSEL KIVÁLTOTT SZENZOROS NEUROPEPTID FELSZABADULÁSRA IZOLÁLT

PATKÁNY TRACHEÁN .................................................................................................................................. 68 V.4. PACAP-38-LI KIMUTATÁSA EMBERI ÉS KÉRŐDZŐ ÁLLATOK PLAZMA- ÉS TEJMINTÁIBAN69

VI. ÚJ EREDMÉNYEIM ÖSSZEFOGLALÁSA ..................................................................... 73

VII. IRODALOMJEGYZÉK...................................................................................................... 74

VIII. PUBLIKÁCIÓS LISTA: .................................................................................................... 91

VIII.1. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ EREDETI KÖZLEMÉNYEK: ..................................... 91 VIII.2. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBA KÖZVETLENÜL NEM ILLESZKEDŐ EGYÉB KÖZLEMÉNYEK:92 VIII.3. KÜLFÖLDI KONFERENCIASZEREPLÉSEK, FOLYÓIRATBAN MEGJELENT ABSZTRAKTOK: 93 VIII.4. HAZAI KONFERENCIASZEREPLÉSEK, FOLYÓIRATBAN MEGJELENT ABSZTRAKTOK: . 95

IX. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................................... 98

Page 4: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

4

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

12-HPETE: 12-hidroperoxi-eikozatetraénsav

Ab: antitest (Antibody)

ACTH: adrenocorticotrop hormon

AEA: N-arachidonoil-etanolamin (anandamid)

AMPA: 2-amino-3-metil-(3-hidroxi-5-metil-izoxazol-4-il)-propionsav

ATP: adenozin-trifoszfát

BSA: borjú szérum albumin (Bovine Serum Albumin)

cAMP: ciklikus adenozin-monofoszfát

CB: kannabinoid

CGRP: kalcitonin gén-rokon peptid (Calcitonin Gene-Related Peptide)

CID: ütközés indukálta fragmentálás (Collision Induced Decay)

CRLR: kalcitonin receptorszerű receptor (Calcitonin Receptor-Like Receptor)

Da: Dalton

DIG: detergens oldhatatlan glikolipid gazdag komplex

EDTA: etilén-diamin-tetraacetát

EFS: elektromos téringerlés (Electrical Field Stimulation)

EGF: epidermális növekedési faktor (Epidermal Growht Factor)

EM: endomorfin

GABA: -amino-vajsav (Gamma-Aminobutyric-Acid)

GH: növekedési hormon (Growth Hormone)

GHRH: növekedési hormon elválasztását serkentő hormon (Growth Hormone Releasing

Hormone)

GnRH: gonadotropin elválasztást serkentő hormon (Gonadotropin Releasing Hormone)

GPI: glikozil-foszfatidil-inozitol (Glykosyl-Phosphatidylinositol)

HPLC: nagy hatékonyságú folyadék kromatográfia (High Performance Liquid Chromatography)

i.m.: intramuszkuláris

i.p.: intraperitoneális

i.v.: intravénás

IFN-: interferon

Ig: immunglobulin

IGF: inzulinszerű növekedési faktor (Insulin-like Growth Factor)

IL: interleukin

m: tömeg

MALDI: mátrix közvetítésével végzett lézer deszorpciós ionizáció (Matrix Assisted Laser

Desorption/Ionization)

MCD: metil--ciklodextrin

MPO: mieloperoxidáz

MS: tömegspektrometria (Mass Spektrometry)

NADA: N-arachidonoil-dopamin

NAL: naloxon

NANC: nem-adrenerg, nem-kolinerg

NK: neurokinin

NK-sejt: természetes ölősejt (Natural Killer Cell)

NMLW: névleges molekulatömeg határérték (Nominal Molecular Weight Limit)

OD: optikai denzitás

PAC1: a PACAP specifikus receptora

PACAP: hipofízis adenilát cikláz-aktiváló polipeptid (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating

Polypeptide)

Page 5: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

5

PACAP-LI: PACAP-szerű immunreaktivitás (PACAP-Like-Immunoreaktivity)

PBS: foszfát-pufferelt sóoldat (Phosphate-Buffered Saline)

PFA: paraformaldehid

PK: protein kináz

PMF: „ujjlenyomat” keresési technika (Peptide Mass Fingerprintig)

PSD: ionforrás utáni fragmentálás (Post Source Decay)

PTH: parathormon

RAMP: receptor aktiválást módosító fehérje (Receptor Activation Modifier Protein)

RIA: radioimmunassay

RTX: reziniferatoxin

s.c.: szubkután alkalmazás

SEM: átlag standard hibája (Standard Error of Mean)

SOM: szomatosztatin

SP: P-anyag (Substance P) SRIF: szomatotropin felszabadulást gátló faktor (Somatotropine Release Inhibitory Factor)

sst: szomatosztatin receptor

TFA: trifluor-ecetsav (Trifluoroacetic Acid)

TOF: time of flight

TRH: thyreotrop hormon (Thyrotropin-Releasing Hormone)

TRP: tranziens receptor potenciál

TRPV1: tranziens receptor potenciál vanilloid 1

TSH: pajzsmirigy stimuláló hormon (Thyroid-Stimulating Hormone)

VIP: vazoaktív intesztinális peptid (Vasoactive Intestinal Peptide)

VPAC1 és VPAC2: a VIP és PACAP közös receptorai

VR1: vanilloid receptor 1

z: töltés

Page 6: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

6

I. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS, A KUTATÁS ELŐZMÉNYEI

Értekezésemben a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződésekből felszabaduló szenzoros

neuropeptidek specifikus és érzékeny radioimmunassay (RIA) módszerekkel történő

meghatározását mutatom be, amelyet saját laboratóriumunkban fejlesztettünk ki. Célunk ezek

segítségével a peptiderg mechanizmusok, neuro-immun interakciók felderítése volt

neurofarmakológiai vizsgálatok során. Tudományos diákkörös munkámat 2003-ban, másodéves

gyógyszerészhallgatóként kezdtem a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetben Dr. Helyes

Zsuzsanna témavezetésével, melynek során a szomatosztatin szerepét és az sst4 szomatosztatin

receptor jelentőségét vizsgáltam akut és krónikus gyulladásos folyamatokban, különös tekintettel

az érzőideg-végződések által közvetített neurogén gyulladásos mechanizmusokra. 2006-tól

gyógyszerész rezidensként és állami ösztöndíjas PhD hallgatóként folytattam a munkát, a

későbbiekben egyre inkább a peptidmeghatározás analitikai módszereire fókuszálva Dr. Németh

József és Bagoly Teréz vegyész kollégák segítségével. A disszertációban bemutatott eredmények

2008. és 2011. között megjelent közleményekben szerepelnek, elsősorban az endomorfin-1 és a

hipofízis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid patofiziológiai szerepére koncentrálva.

I. 1. A KAPSZAICIN TÖRTÉNETE ÉS FARMAKOLÓGIAI JELENTŐSÉGE

A kapszaicin, a paprika (Capsicum annuum és Capsicum frutescens) csípős anyaga, kémiai

szerkezetét tekintve alkaloid, 8-metil-N-vanillil-transz-6-nonénamid. Az 1870-es években

Hőgyes Endre volt az első, aki kísérletesen vizsgálta a kapszaicin hatásait és arra következtetett,

hogy az elsősorban az érzőidegekre hat (Hőgyes 1878).

A II. világháború után Jancsó Miklós szegedi farmakológus professzor gyulladásos

folyamatok vizsgálatával foglalkozott és ezzel kapcsolatban kezdte el használni a kapszaicint. Az

ő véletlen megfigyelése volt, hogy ez a fájdalmat okozó csípős irritáns anyag egy teljesen új

típusú fájdalomcsillapító hatással rendelkezik. Munkája alapján bizonyítást nyert, hogy a

kapszaicin nagy dózisainak ismételt adása kísérleti állatokban (egér, patkány, tengerimalac) az

analgézia egy speciális formáját váltja ki. Az érzőideg-végződések érzéketlenekké váltak a

legerősebb fájdalomkeltő kémiai ingerekkel szemben anélkül, hogy fizikai ingerekkel

(mechanikai vagy elektromos stimulusok) szembeni válaszkészségük változott volna. Ez az ún.

kapszaicin-deszenzibilizáció jelensége, amelynek hátterében álló folyamatok akkoriban

Page 7: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

7

tisztázatlanok maradtak. Ezekből az adatokból kiindulva a későbbiekben elektrofiziológiai

vizsgálatokkal világossá vált, hogy a fájdalomérző idegvégződések forró ingerekkel izgatható

csoportja az, amely a kapszaicinnel szelektíven aktiválható, illetve nagy dózisok ismételt adása

után ezek működése szelektíven károsítható (Jancsó 1960).

Jancsó Professzor 1966-ban bekövetkezett korai halála után tanítványa, Szolcsányi János

folytatta a kapszaicinnel kapcsolatos kutatásokat a professzor feleségével, Jancsó-Gábor

Arankával együttműködve. 1967-ben leírták, hogy patkány n. saphenusának és n. trigeminusának

izgatása arteriolás vazodilatációt, vaszkuláris permeabilitás-növekedést és plazmaproteinek

extravazációját eredményezi a bőrben a megfelelő beidegzési területeken. Nagy dózisú

kapszaicinnel történő előkezelést (deszenzibilizáció) követően ezen idegek sem ortodrómos

kémiai, sem antidrómos elektromos ingerlése után nem alakult ki gyulladásos reakció. E válaszok

hiányának alapján feltételezték, hogy a gyulladáskeltő mediátorok a kapszaicin-érzékeny

fájdalomérző idegvégződésekből, a nociceptorokból szabadulnak fel (Jancsó és mtsai. 1967).

A kapszaicin, mint potenciális farmakológiai eszköz a perifériás idegrendszer kutatásában,

elsősorban akkor került az érdeklődés középpontjába, amikor Jessell és munkatársai 1978-ban

publikálták, hogy a kapszaicin P-anyag (substance P: SP) kiáramlását okozza a primér szenzoros

idegvégződésekből anélkül, hogy befolyásolná e peptid felszabadulását az enterális és központi

idegrendszeri neuronokból (Jessell és mtsai. 1978). Egy évvel később Lembeck és Holzer

kimutatták, hogy a kapszaicin-érzékeny idegvégződésekből felszabaduló SP közvetíti a neurogén

plazmaprotein-extravazációt (Lembeck és Holzer 1979).

Napjainkban világszerte számos kutatócsoport foglalkozik a kapszaicinnel, a kapszaicin-

érzékeny elsődleges érzőneuronokkal és a velük kapcsolatba hozható neuropeptidekkel.

I. 2. A KAPSZAICIN RECEPTORA

Azt az elméletet, hogy létezik „kapszaicin receptor”, azaz hogy ez a csípős anyag egy

speciális molekulához kötötten fejti ki szelektív hatásait a szenzoros neuronokon, először

Szolcsányi János és Jancsó-Gábor Aranka vetették fel egy 1975-ös közleményükben. Ebben a

munkában a kapszaicin és más vanilloid struktúrájú vegyület nociceptív hatásait vizsgálták

patkányban, és a szerkezet-hatás összefüggések alapján arra a következtetésre jutottak, hogy a

kapszaicin receptoriális úton hat (Szolcsányi és Jancsó-Gábor 1975, 1976). Később patch clamp

vizsgálatokkal sikerült bizonyítani, hogy a kapszaicin és egy másik vanilloid struktúrájú növényi

eredetű vegyület, a reziniferatoxin (RTX), ugyanazt a kation csatornát nyitja az érzőneuronok

Page 8: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

8

plazmamembránján (Bevan és Szolcsányi 1990). A kapszaicin receptort expresszáló gén

azonosítása és a receptor szerkezetének megismerése 1997-ben Julius és munkacsoportja nevéhez

fűződik, akik klónozták a patkány Vanilloid 1 Receptort (VR1). Ezt az első elnevezést az

indokolta, hogy nemcsak kapszaicinnel, hanem más vanilloidokkal is aktiválható volt (Caterina

és mtsai. 1997). Később a receptorok szerkezetén alapuló nemzetközi nomenklatúra szerint ezt a

nevet megváltoztatták, e ligand-függő kation csatornát a Tranziens Receptor Potenciál (TRP)

nagycsaládba sorolták és a vanilloid család 1-es számú tagjaként Tranziens Receptor Potenciál

Vanilloid 1-nek (TRPV1) nevezték (Gunthorpe és mtsai. 2002). A később klónozott emberi

TRPV1 receptor 92%-os hasonlóságot mutat a patkány receptor szerkezetével (Hayes és mtsai.

2000; McIntyre és mtsai. 2001) (1. ábra).

A TRPV1 polimodális szenzor funkciójú ioncsatorna, többféle módon, fizikai vagy

kémiai ingerekkel aktiválható intra- és extracellulárisan is. A TRPV1 fájdalmas, 43ºC feletti

hőingerrel (Tominaga és mtsai. 1998) és pH 6 alatti proton-koncentrációval aktiválható (Nilius

2007). A kapszaicinen kívül számos növényi eredetű vanilloid struktúrájú vegyület, pl. egy

marokkói kutyatejfélében (Euphorbia resinifera) található reziniferatoxin (2. ábra), a

feketeborsban (Piper nigrum) lévő piperin, a gyömbérből (Zingiber officinale) kivonható

zingeron vagy a szegfűszeg (Syzygium aromaticum) egyik anyaga, az eugenol, is képes receptor

stimulációt okozni. Érdekes módon a kapszaicin, lipofil jellegéből adódóan átjut a

sejtmembránon, az intracellulár régióban kötődik a receptorhoz és így nyitja meg a csatornát (Oh

és mtsai. 1996).

Ezen kívül léteznek a receptornak endogén ligandjai is, mint az endokannabinoid N-

arachidonoil-etanol-amin (AEA) vagy más néven anandamid (Caterina és mtsai. 1997), a 12-

hidroperoxi-eikozatetraénsav (12-HPETE), az N-arachidonoil-dopamin (NADA), valamint a

protonok. A csatorna működését jelentős mértékben fokozzák a prosztaglandinok, pl. a

gyulladásos folyamatokban kulcsfontosságú prosztaglandin E2, vagy a prosztaciklin néven ismert

prosztaglandin I2 (Szállási és Blumberg 1999; Chuang és mtsai. 2001).

Page 9: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

9

1. ábra: A TRPV1 receptor szerkezete

A receptor aktiválására képes ingerek a fehérje eltérő pontjain hoznak létre

konformáció változást, amely a kation csatorna megnyílásához vezet. A szürke

pontokkal jelölt helyek a protein kinázok támadáspontjai, amelyek foszforilációja

a receptor érzékenységének fokozódásához vezet.

2. ábra: A kapszaicin és a reziniferatoxin szerkezete

Page 10: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

10

A receptor aktiválódásakor a sejtbe Na+- és Ca

2+a-ionok áramlanak, melyet K

+fion sejtből

való kiáramlása követ. A Na+-ion beáramlás elsősorban az akciós potenciál kialakulásáért felelős,

melynek következményeképpen kialakul a nocicepció, fájdalomérzet. A Ca2+

-ionok beáramlása

pedig a szenzoros neuropeptidek idegvégződésekből való felszabadulásához vezet. Tartós vagy

ismételt aktiváció hatására a sejtben felhalmozódó magas kation koncentráció a citoplazma és a

mitokondriumok duzzadását okozza, ennek hosszú távú következményeként a sejtek

energiaforgalma csökken, az idegvégződés működésképtelenné válik. Ez a folyamat adja a

molekuláris hátterét a nagy dózisú kapszaicinnel történő előkezelés hatására kialakuló

deszenzitizációnak (3. ábra), melynek következtében az érzőideg-végződések kémiai ingerekkel

szemben érzéketlenekké válnak anélkül, hogy fizikai ingerekkel szemben változna

válaszkészségük (Bevan és Szolcsányi 1990; Szolcsányi 1993; Helyes és mtsai. 2003).

3. ábra: A TRPV1 receptor aktivációjának és a csatornanyitás

sejtszintű következményeinek vázlata (forrás: Helyes és mtsai. 2003; módosítva)

A TRPV1 receptor nagy mennyiségben megtalálható a hátsó gyöki és a trigeminus

ganglionokban, specifikusan a kis és közepes átmérőjű szenzoros neuronokon (Caterina és mtsai.

1997; Tominaga és mtsai. 1998), vagyis a vékony mielinhüvelyes (A-) és a mielinhüvely nélküli

(C-) rostokkal rendelkező neuronok sejttestjein és végződésein fordul elő (Holzer 1991).

A TRPV1 receptort expresszáló polimodális nociceptorok funkcióinak vizsgálata a

kapszaicin szelektív izgató és ezt követő blokkoló hatásának megfigyelésével kezdődött. A nagy

Page 11: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

11

dózisú kapszaicin- vagy RTX-előkezeléssel kiváltott szenzoros neuron blokkolás, azaz

„deszenzibilizáció”, az egész végződés hosszantartó válaszképtelenségéhez vezet. A nociceptor

semmilyen kémiai stimulusra nem reagál, a többi afferens rost működése azonban nem változik,

az egyéb érzőfunkciók nem károsodnak (Szolcsányi 1977). A kapszaicin-érzékeny

idegvégződések fiziológiai/patofiziológiai folyamatokban betöltött szerepének vizsgálatára tehát

a „deszenzibilizáció” alkalmas, ezzel a módszerrel azonban a teljes idegvégződést inaktiváljuk

(Bevan és Szolcsányi 1990; Szolcsányi 1993; Helyes és mtsai. 2003), nemcsak izoláltan a

TRPV1 csatorna funkcióját.

I.3. A LIPID RAFTOK FELÉPÍTÉSE

Singer-Nicolson-féle folyékony mozaik modell alapján úgy gondolták, hogy a

foszfolipidek és a plazmaproteinek random módon helyezkednek el a plazma membránban

(Singer és Nicolson 1972). Egy új elmélet szerint a plazma membránban mikrodomének

találhatók, melyek egyik típusát a lipid raftok képviselik. A lipid raft szó „lipid tutaj”-t jelent. A

tutaj elnevezés abból ered, hogy a komponensek közös régióvá összetömörülve helyezkednek el,

mely a plazma membránban kisebb mozgásokra, úszkálásra képes. A lipid raftok a plazma

membránban non-raft régiók között elhelyezkedő mikrodomének, melyek különböző

szfingolipidekből, koleszterinből és proteinekből épülnek fel (4. ábra).

4. ábra: Sejtmembrán sematikus ábrája lipid rafttal (forrás: www.publications.nigms.nih.gov)

Glikoszfingolipid

Koleszterin

Extracelluláris tér

Intracelluláris tér

Page 12: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

12

Sejttípusonként különböző arányban fordulnak elő a raft komponensek, ám mindegyikre

egyaránt jellemző, hogy koleszterinben és szfingolipidekben gazdag. A lipid kettősréteg a lipid

raftokon belül aszimmetrikus. Az extracelluláris tér felé szfingomielinben és glikoszfingolipidben

gazdag, míg az intracelluláris tér felé glicerolipidek fordulnak elő nagyobb számban. A

koleszterin mind az intra-, mind az extracelluláris tér irányából beépül a membránba, az

egymáshoz kapcsolódó szfingolipidek farki régiója közti hiányokat tölti ki, és interakcióba lép

velük (Simons és Ikohen 1997; Kobayaski és mtsai. 2006).

A fehérjék többféle módon kapcsolódhatnak a lipid raft komponensekhez: lehetnek

transzmembrán proteinek, glikozil-foszfatidil-inozitol (GPI)-kapcsolt proteinek, vagy

intracelluláris polipeptidláncok, mint például a tirozin-kinázok. Ezen proteinek közül számos

receptorként, vagy intracelluláris szignál mediátorként funkcionál. (Simons és Ikohen 1997;

Mishra és Joshi 2007). A lipid raftok a transzmembrán proteinek révén kapcsolatot létesítenek a

citoszkeletonnal.

Vizsgálatok során megfigyelték, hogy a lipid raftok 4 oC-on, Triton X-100 detergenssel

szemben oldhatatlanok, emiatt és a magas glikolipid tartalmuk miatt nevezték el a lipid raftokat

detergens oldhatatlan glikolipid gazdag komplexeknek (DIGs) (Simons és Ikohen 1997; Mishra

és Joshi 2007). Az oldhatatlanságért a koleszterin a felelős, melynek eltávolításával, a lipid raftok

kioldhatók a plazma membrán non-raft régiói közül Triton X-100 detergenssel. Ezzel a lipid

raftokban lévő fehérjék és lipidek különböző protein és lipid próbákkal azonosíthatók. Több

sejttípus esetén megfigyelték, hogy a lipid raftokban egy biokémiailag elkülöníthető hajtű-hurok

vagy palack alakú régió is megtalálható, amit caveolának neveztek el. Ezek a struktúrák szintén

gazdagok koleszterinben és szfingolipidekben, de emellett számos caveolin proteint is

tartalmaznak, amik egymással összekapcsoltan találhatók a plazma membránban. Ahogy a lipid

raftok, a caveolák sem oldhatók detergensekkel. Különböző élettani folyamatokban a caveolák és

a lipid raftok összekapcsolódnak és együttesen generálnak intracelluláris jelátviteli utakat.

(Simons és Ikohen 1997; Burger és mtsai. 2000; Tsui-Pierchalla és mtsai. 2002; Hanzal-Bayer és

Hancock 2007). A caveolák fontos szerepet játszanak az endocitózisban, a transzcitózisban és

feltételezik, hogy részt vesznek az onkogenezisben illetve a patogén baktériumok és bizonyos

vírusok felvételében. Több patogénről bebizonyosodott, például a Coxachie vírus A9-ről, illetve a

Plasmodium falciparumról (Samuel és mtsai. 2001), hogy az intracelluláris térbe való jutásukhoz

lipid raftokat, vagy caveolákat igényelnek.

Több tanulmány is rámutatott, hogy a TRP receptorcsalád számos tagjának működésében

szerepet kapnak a lipid raftok, melyekkel úgynevezett jelátviteli komplexet képeznek (Lockwich

és mtsai. 2000; Liu és mtsai. 2006). Részt vesznek még több ligandfüggő ioncsatorna, köztük az

Page 13: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

13

acetilkolin nikotin receptor (Zhu és mtsai. 2006), a 2-amino-3-metil-(3-hidroxi-5-metil-izoxazol-

4-il)-propionsav (AMPA) típusú glutamát receptor és a -amino-vajsav (GABA) receptor

működésében is. Emellett több G-proteinhez kapcsolt receptorról, mint például a kannabinoid 1

receptorról (CB1R), is bebizonyosodott a lipid raftokkal való szoros kapcsolata (Bari és mtsai.

2005).

I.3.1. A koleszterin szerepe a lipid raftokban

A koleszterin az egyik legfontosabb komponense a lipid raftoknak. Régóta köztudott,

hogy a koleszterin növeli a plazma membrán sűrűségét, csökkenti a permeábilitását, és részt vesz

a membrán fluiditásának a szabályozásában (Burger és mtsai. 2000). Számos kutatócsoport

vizsgálata derített fényt a koleszterin további szerteágazó szerepére. Fontos kapcsolatot tart fönn

a membrán zsírsavláncai közt, de nemcsak lipid-lipid, hanem protein-lipid, illetve protein-protein

interakcióban is részt vesz. Emellett jelentős szerepe van a lipid raftok detergens

oldhatatlanságának kialakításában. A metil--ciklodextrin (MCD) depletálja a membrán

koleszterintartalmát, ezáltal károsítja a lipid raftok funkcióját. E vegyületet számos kutatócsoport

alkalmazza a lipid raftok szerepének vizsgálatára (Simons és Ikohen 1997; Kobayaski és mtsai.

2006; Burger és mtsai. 2000), mi is ezt használtuk a szenzoros neuronok sejttestjén és perifériás

végződésén végzett kísérleteinkben.

I.3.2. A lipid raftok funkciója

A lipid raftok részt vesznek bizonyos sejtfunkciók szabályozásában. Szerepet játszanak az

endocitózisban a bennük található clathrin proteinek révén. Ez a fehérje alkotja ugyanis az

endocitózis során képződött vezikulák nagy részét (Simons és Ikohen 1997; Hanzal-Bayer és

Hancock 2007). Emellett nemcsak a sejtfelszínen játszódó folyamatokban van jelentőségük,

hanem a citoplazmatikus szignáltranszdukció szabályozásában is (Tsui-Pierchalla és mtsai.

2002).

A jelátviteli folyamatokban betöltött szerepükre az AEA TRPV1 receptorhoz való

kötődése során figyeltek fel. Az AEA apoptózist indukál idegsejteken és perifériás sejteken, mely

hatást a TRPV1 receptor aktivációja közvetíti. Ezzel szemben a kannabinoid 1 (CB1) receptorok

aktivációja megvédte a C6-os glioma sejteket az AEA apoptotikus hatásával szemben. Miután

bebizonyosodott, hogy a TRPV1 receptor is lipid raftokban foglal helyet, felvetődött a kérdés,

hogy a lipid raftok károsítása hogyan befolyásolja az anandamid ezen apoptotikus hatását.

Page 14: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

14

Kísérletsorozatok során kiderült, hogy a raftok károsítása az apoptotikus hatást csökkenti (Bari és

mtsai. 2005).

A raftokban elhelyezkedő proteinek közül több receptorként funkcionál. E molekulák

megfelelő működéséhez és így a receptoriális hatásokhoz a lipid raftok megfelelő integritása

szükséges. Számunkra a lipid raftok vizsgálatának legfontosabb aspektusa a TRPV1 receptorral

való kapcsolatának és ezen keresztül a gyulladásos útvonalra kifejtett hatásának felderítése volt.

I. 4. A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK ÉS HÁRMAS FUNKCIÓJUK

A klasszikus idegszabályozási elmélet szerint az érzőidegek a szenzoros stimulusokat és a

fájdalmat közvetítik a test különféle részeiről (bőr, ízületek, belső szervek) a központi

idegrendszer felé. A perifériás idegrendszer másik csoportja a befutó ingerekkel kiváltott reflexek

útján efferens, azaz mozgató vagy vegetatív működéseket lát el. A kapszaicin-érzékeny

érzőidegek perifériás végződései azonban nemcsak a klasszikus afferens működéssel

rendelkeznek, hanem egyben efferens funkciót is ellátnak. Közvetlenül, reflex nélkül, olyan

neuropeptidek szabadulnak fel belőlük, amelyek a beidegzési területen neurogén gyulladásos

folyamatokat indítanak el. A kapszaicin-érzékeny érzőidegekből a gyulladáskeltő

neuropeptideken kívül gátló hatású anyagok is felszabadulnak, a keringésbe kerülnek és a test

távolabbi pontjain jelentősen csökkentik a neurogén gyulladást.

A TRPV1-et expresszáló érzőideg-végződések különlegessége, hogy egyedülálló módon

hármas funkcióval rendelkeznek: afferens, valamint lokális és szisztémás efferens funkciójuk is

van. A klasszikus afferens működés során a kapszaicinnel vagy más stimulussal izgatott

szenzoros idegvégződések a központi idegrendszer felé közvetítenek idegaktivitást, ennek

következtében alakul ki a fájdalomérzet, a nocicepció. Emellett az aktivált perifériás

végződésekből olyan neuropeptidek szabadulnak fel, amelyek erőteljes értágulatot,

plazmafehérje-kiáramlást és gyulladásos sejtek aktivációját okozzák a beidegzési területen, ezt a

jelenséget összefoglalva neurogén gyulladásnak nevezzük (Szolcsányi 1988; Helyes és mtsai.

2003). Ezek a gyulladáskeltő mediátorok a kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP), amely

elsősorban vazodilatációt okoz, valamint a tachikininek, pl. a SP és a neurokinin A (NKA),

melyek a plazmaprotein-extravazációért felelősek. Ezek a folyamatok közvetítik a kapszaicin-

érzékeny afferensek lokális efferens funkciót (Szolcsányi 1984a,b; Maggi és Meli 1988). A

neurogén gyulladásnak jelentős szerepet tulajdonítanak számos betegség, pl. a rheumatoid

arthritis, az asztma, a pszoriázis, az ekcéma és a kontakt dermatitisz, valamint gyulladásos bél- és

Page 15: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

15

szembetegségek patomechanizmusában (Maggi 1995; Szolcsányi 1996). Jelenleg egyetlen olyan

gyógyszercsoport sem áll rendelkezésre, amely hatékonyan gátolná e betegségek neurogén

gyulladásos komponensét (Helyes és mtsai. 2003).

Ugyanezen aktivált szenzoros idegvégződésekből a gyulladáskeltő neuropeptideken kívül

szomatosztatin (SOM) is felszabadul, amely a keringésbe jutva szisztémás gyulladásgátló és

fájdalomcsillapító hatásokkal rendelkezik. Ez az érzőideg-végződések harmadik, szisztémás

efferens funkciója (Szolcsányi és mtsai 1998a,b; Helyes és mtsai. 2000, 2004), amit a

szomatosztatin endokrin és parakrin hatásainak mintájára Szolcsányi professzor szenzokrin

hatásnak nevezett el (Szolcsányi és mtsai. 2004) (5. ábra).

KapszaicinKapszaicin--

érzékenyérzékeny

érzőérző--

idegvégződésidegvégződés

3. Szisztémás 3. Szisztémás efferensefferens funkciófunkció

2. Lokális 2. Lokális efferensefferens

funkciófunkció

NeurogénNeurogén gyulladásgyulladás

VazodilatációVazodilatáció

PlaPlazzmama

fehérje fehérje kiáramláskiáramlás

Gyulladásos Gyulladásos

sejtek sejtek akkumulációjaakkumulációja

PP--anyaganyag

SSZZOMOMATOSZTATINATOSZTATIN

GyulladásgátlóGyulladásgátló hatáshatás

AntiAnti--nociceptívnociceptív hatáshatás

CGRPCGRP

NNeurokinineurokinin AA

1. 1. AfferensAfferens

funkciófunkció

5. ábra: A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas

funkciója

Page 16: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

16

I. 5. A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ROSTOKBÓL FELSZABADULÓ SZENZOROS NEUROPEPTIDEK

I.5.1. Fájdalom- és gyulladáskeltő hatású neuropeptidek

a.) Az aktivált kapszaicin-érzékeny szenzoros idegvégződésekből felszabaduló

neuropeptidek egyik csoportját a tachikininek alkotják. Ide sorolható a SP, valamint a

neurokinin A és B (NKA és NKB). Hatásaikat három G-proteinhez kapcsolt tachikinin

receptoron keresztül fejtik ki, amelyeket NK1, NK2 és NK3 receptornak nevezünk. A SP

érpermeabilitást fokozó hatását az NK1 receptor közvetíti, amely a posztkapilláris venulák

endothel sejtjein, makrofágok és limfociták membránján, polimorfonukleáris sejteken és

hízósejteken található (Regoli és mtsai. 1994; Cao és mtsai. 1999; Patacchini és Maggi 2001).

Ezekből adódóan a SP plazmaprotein-kiáramlást vált ki, stimulálja a limfociták proliferációját,

citokin termelését, a hízósejtek aktivációját, a T-sejtek kemotaxisát, valamint a neutrofil

granulociták akkumulációját is (Grant 2002). Az SP kationos peptid, így nem-receptor mediált

interakcióba is lép a hízósejtek membránjával. A degranuláció következtében felszabaduló

hisztamin a H1 receptorokon, a szerotonin pedig 5-HT3 receptorokon keresztül pozitív feedback

útján fokozza a neuropeptidek felszabadulását a szenzoros idegvégződésekből (Holzer 1988;

Szállási és Blumberg 1999). A gyulladásos érválasz korai fázisáért a felszabaduló neuropeptidek,

míg a későbbi fázisáért a hízósejtekből felszabaduló mediátorok (hisztamin, szerotonin,

prosztaglandinok, leukotriének stb.) felelősek (Holzer 1988).

Az NKA az NK2 receptorokhoz mutatja a legnagyobb affinitást, a SP-hez hasonlóan

erőteljes plazmafehérje-kiáramlást idéz elő, továbbá simaizom-kontrakciót vált ki és stimulálja a

gyulladásos sejteket (neutrofil granulocitákat, limfocitákat, makrofágokat) elsősorban a

periférián, de a központi idegrendszerben is (de Swert és Joos 2006). Az NKB-t kötő NK3

receptor főként a központi idegrendszerben található, de jelen van a perifériás idegvégződéseken

is (Frossard és Advenier 1991; Massi és mtsai 2000), e mechanizmusoknak azonban kisebb

jelentőséget tulajdonítanak a neurogén gyulladásos folyamatokban.

b.) A 37 aminosavból álló CGRP felfedezése Amara és munkatársai nevéhez fűződik

(Amara és mtsai. 1982). Egymástól kevéssé eltérő két formája az CGRP és a CGRP, melyek

biológiai hatásaikat a CGRP1 és CGRP2 receptorokon fejtik ki (van Rossum és mtsai. 1997). E

receptorok szerkezetileg egy CRLR egységből (calcitonin receptorszerű receptor) és egy RAMP-

1 egységből (receptor-aktiválást módosító fehérje 1) épülnek fel (Njuki és mtsai. 1993;

McLatchie és mtsai. 1998) és Gs-fehérjéhez kapcsolódnak. A CGRP –ahogy azt a neve is

Page 17: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

17

mutatja- egy családba sorolható a kalcitoninnal, az amilinnal és az adrenomedullinnal (Poyner és

mtsai. 2002). Erős vazodilatátor hatással rendelkezik, amely főképp a CGRP1 receptoron

keresztül valósul meg. A CGRP fokozza az adenilát-cikláz aktivitást, amelynek következtében

intracellulárisan megnő a cAMP mennyisége. Ez aktiválja a protein kináz A-t (PKA), a

foszforiláció hatására megnyílnak az ATP-függő K+-csatornák. A folyamat eredménye az érfali

simaizom relaxációja és erőteljes értágulat (Edvinsson és mtsai. 1985; Han és mtsai. 1990;

Hughes és Brain 1994). A CGRP érpermeabilitást fokozó hatását nem közvetlenül, hanem a SP

hatásának potencírozásával fejti ki (Cao és mtsai. 2000), amelyben az játszik elsődleges szerepet,

hogy gátolja a SP degradációjáért felelős neutrális endopeptidáz enzimet (Holzer 1988).

Mindemellett a CGRP komplex immunmodulátor funkciókkal is rendelkezik: csökkenti a

proinflammatorikus citokinek termelődését és fokozza az antinociceptív interleukin-10 (IL-10)

felszabadulását a makrofágból, azonban stimulálja a granulocita-akkumulációt (Barnes 2001).

I.5.2. Fájdalomcsillapító és gyulladásgátló hatású neuropeptidek

a.) A dolgozatban bemutatott kísérletek egy része az endomorfin-1 érzőideg-végződésekre

kifejtett hatásának vizsgálatára irányult. Az endomorfinok (endomorfin-1: EM-1 és endomorfin-

2: EM-2) 1997-ben felfedezett 4 aminosavból álló endogén opioid peptidek (Zadina és mtsai.

1997) (6. ábra). Különlegességük a többi opioid peptiddel összehasonlítva az eltérő kémiai

szerkezetük, valamint a receptorok iránti szelektivitásuk és rendkívül nagy affinitásuk

(Prewloczki és Prewloczka 2001). Emlős sejtekben a kódoló génjeik, illetve prekurzoraik nem

ismertek, valószínűleg de novo szintetizálódnak különféle stimulusok hatására. Az endomorfinok

megtalálhatók a perifériás és központi idegrendszerben, a kapszaicin-érzékeny afferensekben,

valamint nem-neurális sejtekben, pl. immunsejtekben (Horváth 2000). Neuroanatómiai

lokalizációjuk alapján számos fiziológiai és patofiziológiai folyamatban, mint pl. a fájdalom,

stresszválaszok, neuroendokrin funkciók, kognitív működések, szerepet játszanak. Az irodalmi

adatok többsége az EM-ok analgetikus, elsősorban a központi idegrendszeri hatásaira fókuszál

gyulladás- és neuropátia állatkísérletes modelljeiben, néhány adat azonban gyulladáscsökkentő

(Jessop 2006), vazodilatátor (Horváth 2000; Perlikowska és mtsai. 2009), és angiogenezist

elősegítő (Dai és mtsai. 2010) hatásokról is beszámol. Jessop és munkacsoportja osteo- és

rheumatoid arthritisben szenvedő betegekből származó mintákban vizsgálták az endomorfinok

jelenlétét és hatásait. Humán szinoviális szövet immunhisztokémiai vizsgálatával igazolták, hogy

az endomorfinok megtalálhatók T-sejtekben, makrofágokban és fibroblaszt sejtekben. Ex vivo

perfúziós rendszerben az EM-1 hatékonyan csökkentette a gyulladáskeltő citokinek (IL-6, IL-8)

Page 18: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

18

emberi szinoviális szövetmintából történő felszabadulását (Jessop és mtsai. 2010). Mások azt

találták, hogy carrageninnel kiváltott ízületi gyulladásban az EM-1 dózisfüggő módon

csökkentette a hiperalgéziát és 300 g/kg-os dózisban már elhúzódó hatást biztosított (Mécs és

mtsai. 2009). Mivel az endomorfinok hidrofilitásuknak köszönhetően nem jutnak át a vér-agy

gáton (Perlikowska és mtsai. 2009), a periférián szintetizálódó peptidek közvetlenül az érzőideg-

végződésekre kifejtett hatásainak vizsgálata különösen érdekes. Az EM-2 elsősorban a

gerincvelőben és számos agyterületen található, a periférián a szenzoros rostokban és az

immunsejtekben az EM-1 dominál (Jessop és mtsai. 2002). A perifériás gyulladásos és nociceptív

folyamatokban ezért elsősorban az EM-1 szerepe valószínűsíthető (Zadina és mtsai. 2002;

McDougall és mtsai. 2003; Jessop 2006; Fichna és mtsai. 2007).

Tyr-Pro-Trp-Phe−NH2 (endomorfin-1) Tyr-Pro-Phe-Phe−NH2 (endomorfin-2)

6. ábra: Az EM-1 és az EM-2 szerkezete

b.) A hipofízis adenilát cikláz-aktiváló polipeptidet, a PACAP-ot (pituitary adenylate

cyclase activating polypeptide) eredetileg birka hipotalamuszból izolálták (Miyata és mtsai.

1989) (7. ábra). A szekretin-glukagon-vazoaktív intesztinális peptid (VIP) család tagja, ugyanis

háromdimenziós vizsgálatok kimutatták, hogy alapvető szerkezeti rokonságot mutat a család

többi tagjával (Segre és Goldring 1993; Wray és mtsai. 1993). A legszorosabb, 68%-os egyezést

a VIP szerkezetével mutat, adenilát cikláz aktiváló hatása azonban legalább 1000-szer erősebb a

VIP-énél (Gottschall és mtsai. 1990; Sherwood és mtsai. 2000). Két formája létezik: az emlős

szervezetekben 90%-ban előforduló 38 aminosavból álló PACAP-38, és a 27 aminosavból álló

PACAP-27. Patkányban a legnagyobb koncentrációban a hipotalamuszban és a herében fordul

elő (Arimura és mtsai. 1991), de az endokrin mirigyekben (Vígh és mtsai 1993; Mikkelsen és

mtsai. 1995), az ivarszervekben (Shioda és mtsai. 1994, 1996), a gasztrointesztinális traktusban

(Hannibal és mtsai. 1998), a légzőrendszerben (Moller és mtsai. 1993), a bőrben (Odum és mtsai.

Page 19: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

19

1998) is expresszálódik. Szenzoros neuropeptidként tartják számon, mivel megtalálható a

gerincvelő hátsó szarvában (Dickinson és Fleetwood-Walker 1999; Dickinson és mtsai. 1999), a

hátsó gyöki ganglionokban (Moller és mtsai. 1993, 1994; Dun és mtsai. 1996; Parsons és mtsai.

2000), a kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronok perifériás végződéseiben (Zhang és mtsai.

1996; Fahrenkrug és Hannibal 1998), pl. az ízületi tokot ellátó afferensekben (Uddmann és mtsai.

1998), de a központi idegrendszer számos területén is (Mulder és mtsai. 1994).

7. ábra: A PACAP szerkezete (forrás: www.ichemistry.cn)

A PACAP rendkívül sokrétű hatást fejt ki, szabályozza a neurotranszmitterek

felszabadulását (May és mtsai. 2000), értágulatot, illetve bronchodilatációt okoz, fokozza a

bélmotilitást, növeli egyes hormonok koncentrációját a vérben (Hamelink és mtsai. 2002),

szabályozza a sejtproliferációt és gátolja az apoptózist (Vaudry és mtsai. 2002). Emellett számos

fiziológiai folyamatot is befolyásol, mint pl. a táplálkozás, reprodukció, hőszabályozás,

katekolamin szintézis és motoros aktivitás (Vaudry és mtsai. 2000). Szerepet játszik nemcsak a

központi idegrendszer, hanem a perifériás szervek fejlődésében is (Delgado 2009; Otto és mtsai.

2004; Shioda és mtsai. 2006; Somogyvári-Vigh és Reglődi 2004).

Ezek a hatások speciális receptorokon keresztül valósulnak meg. Két kötőhely típust

mutattak ki PACAP- és VIP-kötő képességük alapján. Az I-es típusú kötőhelyhez a PACAP

mindkét formája nagy affinitással kötődik, a VIP viszont csak alig (Gottschall és mtsai. 1990;

Lam és mtsai. 1990; Suda és mtsai. 1992). A II-es típusú kötőhelyhez a PACAP és a VIP is

hasonló affinitással kötődik, ezen belül viszont két altípust is elkülönítenek a szekretinhez való

affinitás alapján (Tatsuno és mtsai. 1990; Vaudry és mtsai. 2000). A receptorokat később a

kötőhelyek szerkezete alapján klónozták, és PAC1, valamint VPAC1 és VPAC2 receptoroknak

Page 20: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

20

nevezték el (Harmar és mtsai. 1998). Mindhárom receptor neuronokon, simaizom sejteken és

számos gyulladásos sejten megtalálható, stimulációjuk Gs/q-proteinhez kapcsolt

mechanizmusokat indít el, ezen keresztül aktiválódik az adenilát-cikláz, illetve foszfolipáz C

rendszer (Dickinson és Fleetwood-Walker 1999; Vaudry és mtsai. 2000; Zhou és mtsai. 2002;

Somogyvári-Vígh és Reglődi 2004).

c.) A szomatosztatin, vagy más néven szomatotropin felszabadulását gátló faktor

(Somatotropine Release Inhibitory Factor, SRIF, SOM) 14 illetve 28 aminosavból álló ciklikus

peptid (8. ábra), mely számos helyen előfordul a szervezetben (Brazeau 1986). A kapszaicin-

érzékeny érzőideg-végződéseken kívül megtalálható a központi és a perifériás idegrendszerben

(Parsons és mtsai. 1976; Reichlin 1983), a gasztrointesztinális traktus neuroendokrin sejtjeiben, a

hasnyálmirigyben, a vesében, a mellékvesében, a pajzsmirigyben, gyulladásos sejtekben,

ivarszervekben (Hofland és Lamberts 1996; Reubi és mtsai. 1999; ten Bokum és mtsai. 2000). Az

ízületekben az aktivált szinoviális sejtek és az immunsejtek is szekretálnak szomatosztatint,

amely autokrin vagy parakrin módon fejti ki hatását (Pintér és mtsai. 2006). A szomatosztatin

gátolja számos hormon (pl. növekedési hormon: GH, glukagon, inzulin, gasztrin, szekretin,

kolecisztokinin, motilin, pankreatikus polipeptid, prolaktin, pajzsmirigy stimuláló hormon: TSH)

szekrécióját, a gasztrointesztinális motilitást és az emésztőnedvek termelését. Gátolja a

tumorsejtek proliferációját, valamint erős immunmodulátor hatással rendelkezik. Csökkenti a B-

limfociták IgA, IgM és IgE szekrécióját, gátolja a T-limfociták IL-2, IL-4, IL-10 és interferon γ

(IFNγ) termelését, a neutrofil granulociták kemotaxisát, a makrofágok fagocita, és a természetes

ölősejtek (NK sejtek) killer aktivitását (ten Bokum és mtsai. 2000; Krantic és mtsai. 2004). A

szomatosztatinnak a központi idegrendszerben neuromodulátor szerepe van, gátolja más

neurotranszmitterek (glutamát, szerotonin, acetilkolin) és neurohormonok (growth hormone

releasing hormone, GHRH) felszabadulását. Befolyásolja a lokomotoros aktivitást és a kognitív

funkciókat, jelentőségét számos pszichiátriai és neurológiai kórképben igazolták (Vécsei és

Widerlöv 1988).

A szomatosztatin az idegelemek közül elsősorban a kapszaicin-érzékeny, TRPV1

receptort expresszáló szenzoros neuronokban szintetizálódik és tárolódik. Számos kísérletben,

állatkísérletes modellben és különböző fájdalomkórképekben kimutatták, hogy a kívülről beadott

szomatosztatin csökkenti a fájdalmat (Lembeck és mtsai. 1982; Chrubasik 1991; Karalis és mtsai.

1994; Fioravanti és mtsai. 1995). Munkacsoportunk számos bizonyítékot szolgáltatott már arra,

hogy a kapszaicin-érzékeny rostok aktiválását követően az idegvégződésekből felszabaduló

Page 21: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

21

szomatosztatin a keringésbe jut, ahol szisztémás gyulladáscsökkentő és antinociceptív hatást fejt

ki (Szolcsányi és mtsai. 1998a, b; Thán és mtsai. 2000; Helyes és mtsai. 2000, 2001, 2004).

8. ábra: A szomatosztatin-14 és szomatosztatin-28 szerkezete (forrás: Weckbecker és mtsai. 2003.)

A SOM hatásait saját receptoraihoz kötve fejti ki. Eddig öt Gi-proteinhez kapcsolt

szomatosztatin receptort klónoztak egérben, patkányban, illetve emberben, melyeket sst1, sst2,

sst3, sst4 és sst5 névvel illettek (Patel és mtsai. 1995). Ez az öt sst receptor szintetikus

szomatosztatin analóg-kötő képességük alapján két csoportra osztható. A SRIF1 csoporthoz

tartoznak az sst2, sst3 és sst5 receptorok, amelyek nagy affinitással kötnek oktapeptid analógokat

(pl. az oktreotidot), míg a SRIF2 csoportba sorolt sst1 és sst4 receptorok alacsony oktapeptid

analóg-kötő képességgel rendelkeznek (Hoyer és mtsai. 1995; Pintér és mtsai. 2006). Számos

irodalmi adat bizonyítja, hogy az endokrin hatásokat a SRIF1 csoportba tartozó receptorok

közvetítik (Raynor és Reisine 1992). Elsősorban munkacsoportunk eredményei mutatják, hogy a

fájdalomcsillapító és gyulladáscsökkentő hatás a másik csoporthoz, vagyis az sst1 és sst4

receptorokhoz köthető (Helyes és mtsai. 2001; Pintér és mtsai. 2002; Szolcsányi és mtsai. 2004;

Pintér és mtsai. 2006).

Az endogén szomatosztatin terápiás alkalmazását akadályozza annak rendkívül sokrétű

előfordulása a szervezetben, széles hatásspektruma és nagyon rövid (3 percnél kevesebb) plazma

eliminációs féléletideje (ten Bokum és mtsai. 2000). Stabil, szelektív sst4 agonisták azonban új

terápiás lehetőséget nyújthatnak a gyulladáscsökkentésben és a fájdalomcsillapításban. E

Page 22: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

22

vegyületek nagy előnye, hogy nem rendelkeznek a szomatosztatin sst2, sst3 és sst5 receptorai által

közvetített endokrin hatásokkal.

I. 6. RADIOIMMUNASSAY MÓDSZEREK JELENTŐSÉGE

A radioimmunassay (RIA) az 1960-as évek óta elterjedt izotópdiagnosztikai eljárás. Olyan

anyagok (antigének) meghatározására alkalmazzák, melyek alacsonyabb koncentrációban

(pmol/l) vannak jelen a vérben, vizeletben, vagy egyéb testnedvekben. Ilyenek lehetnek a

peptidhormonok (ACTH, TSH, GH, gonadotrop hormonok, PTH, inzulin) szteroidhormonok,

különböző gyógyszerek és egyéb anyagok (B12–vitamin). A módszer előnye, hogy egyszerű,

olcsó és alacsony koncentrációk rutinszerű, nagyszámú mintából történő mérésére alkalmazható.

A RIA módszer egy specifikus antigén-antitest kötésen alapuló versengéses módszer,

mely során a rendszerhez 125

I-al radioaktívan jelölt, azaz meleg antigént adunk, mely verseng

jelen lévő nem jelölt, azaz hideg antigénekkel az antitesthez való kötésért. A specifikusan

kötődött radioaktivitás mérése után egy kalibrációs görbe alapján tudjuk meghatározni a kísérlet

során felszabadult neuropeptid, esetünkben a SP, CGRP, SOM vagy PACAP-38 szintjét.

A RIA nagy érzékenysége (fmol/ml) abból adódik, hogy egyesíti az immunkémiai

(antigén-antitest) reakciók specificitását és a radiokémiai mérés nagyfokú detektálhatóságát.

A RIA során három alapvető komponenst mérünk össze a reakcióelegybe. A mérendő

anyagot tartalmazó oldatot (L), a mérendő anyag radioaktívan jelzett változatát (L∗) és a mérendő

anyag elleni antitestet (antibody = Ab). Az elegybe összemért anyagok között a következő

reakció játszódik le:

L+L∗+Ab↔LAb+L∗Ab

A tömeghatás törvényének megfelelően a kötési reakció bizonyos idő elteltével

egyensúlyi állapotot ér el. Minél több a mérendő anyag (L) a reakcióelegyben, annál több LAb,

és annál kevesebb L∗Ab komplex keletkezik.

Különválasztjuk a kötött (L∗Ab) és a kötetlen (L∗) jelzett anyagot. (Ezzel természetesen a

jelöletlen összetevők szétválasztása is megtörténik, de azok a sugárzásmérés eredményét nem

befolyásolják.). A szeparáció leggyakrabban csapadékképzéssel, a szabad frakció megkötésével

(pl.: aktív szénnel), vagy az első antitest ellen termeltetett második antitest hozzáadásával, majd

az ezt követő ülepítéssel, centrifugálással történik.

Mérjük a kötött, vagy a szabad, esetleg mindkét frakció sugárzását, majd meghatározzuk a

mért beütésszám és a koncentráció közötti összefüggést a mérési sorozatba betett ismert

Page 23: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

23

koncentrációjú minták segítségével. A kapott kalibrációs görbe a kötött frakció mérése esetén

szigorúan monoton csökkenő, a szabad frakció mérése esetén szigorúan monoton növekvő lesz.

A kalibrációs görbe segítségével minden egyes ismeretlen minta beütésszámához megkeressük a

hozzá tartozó koncentrációt.

A mérésekhez használt jelölt antigének előállítása a SP kivételével intézetünkben történt.

A 125

I a leggyakrabban használt gammasugárzó izotóp (így könnyen mérhető) a peptidhormonok

jelölésére. Az eljárás lényege egy oxidációs folyamat, mely során a 125

I-→

125I+ átalakulást

oxidálószer hozzáadásával idézzük elő. A legszélesebb körben alkalmazott oxidáló ágensek a

következők: klóramin-T, hidrogén-peroxid és iodogén. A iodogént (1,3,4,6-tetrakloro-3α,6α-

difenil glikoluril) Fraker és Speck (1978) használta először oxidálószerként, és segítségével nyúl

immunglobulin G-t és csirke lizozimot jelölt. A keletkezett 125

I+ izotóp iont már az adott

neuropeptidhez tudjuk kapcsolni, mivel az könnyen szubsztituálódik a fehérje vagy polipeptid

lánc tirozin, hisztidin aminosavaira. A reakció feltétele tehát e két aminosav jelenléte a peptidben.

A tirozin aromás gyűrűjéhez kapcsolódó orto helyzetű hidroxil csoport elektronszívó jellege miatt

a két szomszédos szénatom egyike, vagy akár mindkettő elektrondonor tulajdonságú lehet pH 7-8

kémhatású oldatban. Ilyen körülmények között ezek az atomok elektronleadással aktiválódnak, és

alkalmassá válnak arra, hogy részt vegyenek elektrofil szubsztitúciós reakciókban. Így

egyesíthetjük a 125

I+ izotóp iont a tirozinnal, vagyis a tirozin-tartalmú peptiddel. Hasonló módon a

hisztidin imidazol gyűrűjében lévő két nitrogénatom tulajdonságaiból adódóan a közös C2-es

szénatom is lehet elektrondonor 9-es pH-n. Utolsó lépésként a monojódozott, RIA méréshez

alkalmas peptidet el kell választani a többi komponenstől (a di-jódozott peptidtől, a jelöletlentől,

a be nem épült jód ionoktól (125

I-,

125I+), az oxidatívan károsodott termékektől). A szeparáció

reverz fázisú nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) módszer segítségével

valósítható meg a legoptimálisabban (Németh és mtsai., 2002).

A perfúziós kísérletek során a szervfürdőkből kapott minták SOM, SP, CGRP és PACAP-

38 koncentrációinak meghatározását végeztük az intézetben kifejlesztett specifikus és érzékeny

RIA módszerekkel (Lsd. Módszerek fejezet).

Page 24: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

24

I.7. TÖMEGSPEKTROMETRIA

A RIA módszerrel történő mennyiségi meghatározást megelőzően tömegspektrometriai

mérésekkel bizonyítottuk, hogy a PACAP-38 jelen van a biológiai mintáinkban. A

tömegspektrometria (mass spectrometry, MS) szervetlen és szerves komponensekből képződött

ionok fajlagos tömegének (töltésegységre eső tömegük: m/z) csökkentett nyomáson, elektromos,

vagy mágneses mezők segítségével történő detektálása. Az elválasztott ionok intenzitását mérve

eredményül az ionáram intenzitás és fajlagos tömeg függvénykapcsolatot kapjuk meg, amit

másként tömegspektrumnak hívunk. Ez a tömegspektrum a minőségi információ alapja, ugyanis

ez olyan egyedi, mint az ember esetében az ujjlenyomat. Nincs két olyan szerves vegyület,

amelyiknek a tömegspektruma, pontosabban a legintenzívebb ion intenzitására normált ún.

karakterisztikus tömegspektruma, azonos lenne. Mindezek által érthető, hogy az MS, mint

technika, alkalmas széles tömeg- és polaritás-tartományban a nagy molekulatömegű, nem

illékony biopolimerek, peptidek, fehérjék, valamint szintetikus rendszerek tömegének és

szerkezetének komplex tanulmányozására. Annak köszönhetően, hogy a technika kiválóan

kombinálható az elválasztás-technikában használatos módszerekkel, lehetőséget teremt már fmol

(10-15

mol) anyagmennyiségű minták megbízható, pontos, gyors és olcsó analízisére.

Fehérjék vagy fehérjetöredékek mennyiségi és minőségi analízisére különböző

módszereket alkalmaznak. Napjainkban az egyik leggyakrabban használt fehérjeazonosítási

technika a mátrix-, vagy hordozódeszorpción alapuló ionizációs tömegspektrometria (matrix-

assisted laser desorption/ionization, MALDI). Ennek egyik legfőbb oka, hogy jelentősen

csökkenti a vizsgálathoz szükséges anyagmennyiséget és növeli a tömegmérés pontosságát (3-10

ppm), ami a kísérleti adatok megbízhatóságához vezet (Debreczeni és Kovács 2008). Ennek

alapján érthető, hogy sok esetben elegendő a fehérje néhány fragmensének tömegét megmérnünk

ahhoz, hogy a genom ismerete, és megfelelő számítógépes program alapján nagy biztonsággal

meg lehessen mondani, melyik fehérjével van dolgunk. E vizsgálatokat sok esetben az enzimes

hidrolízisből előállított bonyolultabb összetételű minták (pl.: testfolyadékok) fehérje szeparálása

előzi meg. Proteineknél a kíméletes reakciókörülmények biztosítása, illetve a jó felbontóképesség

miatt általánosan elterjedt a kétdimenziós poliakrilamid-gél elektroforézis alkalmazása. Különféle

anyagokat tartalmazó minták alkotórészei közül a fehérjék elválasztása elsősorban a proteinek

eltérő mérete, töltése és esetenként specifikus, nagy affinitású kötődése alapján valósítható meg.

A MALDI eljárás esetében lézersugárral a mátrix molekulák alkotóit bombázzák, a

célmolekulát csak áttételesen ionizálják, illetve párologtatják (Debreczeni és Kovács 2008). Az

eljárás előnye, hogy akár több százezres molekulatömegű makromolekulák molekulatömeg

Page 25: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

25

meghatározását teszik lehetővé, közel fmol, néha attomol (10-18

mol) kimutatási határig. A

korábbi eljárásoktól eltérően tehát a MALDI MS elég érzékeny, és elég széles molekulatömeg-

tartományban mér ahhoz, hogy akár célfehérjékkel kölcsönható kofaktorok, inhibitorok,

poliszacharidok, oligonukleotidok és különböző bimolekuláris komplexek is vizsgálhatóvá

váljanak. Napjainkban a tömegspektrométerek méretének és árának jelentős csökkenése nagyban

elősegíti e technika elterjedését, így jelenleg ez az egyik legtöbbször alkalmazott analitikai eljárás

a fizikai, kémiai, biológiai és orvosi kutatások fejlesztésében.

A MALDI módszer egy olyan “fotoionizációs” megoldás, mely kiválóan szabályozható

ionizációt biztosít a műszerben, és lehetővé teszi a termikusan igen érzékeny anyagok, pl.

enzimek, hormonok, vagy akár több százezer dalton (Da) tömegű biomolekulák, fehérje

szekvenciák, stb. MS vizsgálatát. A könnyen irányítható lézerforrásból származó gerjesztő

energiát egy mátrix veszi fel és közvetíti a vizsgálandó molekulák felé. A mátrix megfelelő

megválasztásával kíméletes energia átadás érhető el a kondenzált fázisban lévő molekulára nézve.

A keletkezett ionokat azután egy nagy térerejű gyorsító rendszer (60-100 kV) kiszívja,

deszorbeálja a kondenzált fázisból, s többnyire egy gyors analizátorhoz illesztve (pl.: time-of-

flight, TOF) mérhetővé válnak az egészen nagy tömegű (akár 105-10

6 Da) ionok is. Ez a

kombináció a MALDI TOF (Burger 1999; Debreczeni és Kovács 2008). Az elektrotechnika

fejlődésével lehetővé vált igen kicsiny időkülönbségek pontos észlelése is, amely a repülési időn

alapuló elválasztás alapját képezi. A TOF készülékekkel ma már igen jó felbontóképesség és

széles mérési tartomány érhető el. Viszonylag egyszerűek és olcsók; megfelelő ionforrással

(MALDI) kombinálva a nagyobb biomolekulák vizsgálatában nélkülözhetetlenek.

I.8. VIZSGÁLATAINK INDOKOLTSÁGA

A perifériás peptiderg érzőideg-végződések és a TRPV1 ioncsatornák működésének

elemzésére, a lipid raftok TRPV1 aktivációban betöltött szerepének felderítésére, valamint a

szenzoros neuropeptid-mediálta hatások analízisére jól meghatározható mechanizmusokkal

működő in vitro rendszerünkben és akut in vivo gyulladásmodellekben végeztünk kísérleteket.

Számos –elsősorban immunhisztokémiai és molekuláris biológiai- irodalmi adat

bizonyítja, hogy a szomatosztatinon kívül még más gátló hatással rendelkező neuropeptid mint

pl. a PACAP-38, az opioid peptidek vagy a galanin is megtalálható a kapszaicin-érzékeny

idegvégződésekben (Helyes és mtsai. 2009). Annak érdekében, hogy komplex képet kapjunk a

Page 26: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

26

gátló neuropeptiderg mechanizmusokról, érdekesnek tűnt megvizsgálni az endomorfin-1 hatásait

azokban a kísérleti elrendezésekben, amelyekben a szomatosztatinra és az sst4 receptor

agonistákra vonatkozóan már voltak korábbi adataink.

A PACAP jelenlétét morfológiai és molekuláris biológiai módszerekkel leírták különféle

fajok kapszaicin-érzékeny neuronjaiban (Moller és mtsai. 1993; Mulder és mtsai. 1994), a

felszabadulására és funkcióira vonatkozóan azonban nagyon kevés adat áll rendelkezésre. Az

irodalomban PACAP felszabadulást írtak le 10-5

M kapszaicin hatására sertés antrumból (Tornoe

és mtsai. 2001), valamint elektromos idegingerlésre nyúl szemben (Wang és mtsai. 1995, 1997).

In vivo kapszaicinnel kiváltott PACAP felszabadulást találtak a gerincvelőben (Zhang és mtsai.

1997), azonban nem vizsgálták a felszabadulását a szisztémás keringésben.

A PACAP nem-neurogén gyulladásos komponensekre kifejtett hatásaira több irodalmi

adat is rendelkezésre áll, amelyek gyulladásgátló hatásokat bizonyítanak (Ganea és Delgado

2002; Abad és mtsai. 2006), azonban elsősorban krónikus modellekben és a gyulladásos sejtek

funkcióira vonatkozóan. A PACAP i.p. injekciója egér kollagén-arthritis modellben csökkentette

a gyulladásos tüneteket (lábduzzadás, bőrpír, sejtes akkumuláció) a citokinszintézis/felszabadulás

gátlásán keresztül (Abad és mtsai. 2001), valamint az autoimmun enkefalitisz súlyosságát az

antigén-prezentáló sejtek funkciójának gátlásával (Kato és mtsai. 2004). Pszoriázisos betegek

bőrmintáin nyert eredmények is arra utalnak, hogy a PACAP szerepet játszik gyulladásos és

immun-mediált folyamatokban (Steinhoff és mtsai. 1999). Ezekkel az eredményekkel ellentétben

azonban arra is vannak adatok, hogy lokálisan alkalmazott PACAP gyulladáskeltő hatásokat,

értágulatot és plazmafehérje-kiáramlást okoz nyúl szemben (Wang és mtsai. 1997). Intradermális

PACAP injekció (10-14

-10-9

M) hasonló akut gyulladásos válaszokat okozott patkány és nyúl

bőrében a hízósejtekből történő hisztamin-felszabadításon keresztül (Warren és mtsai. 1993;

Cardell és mtsai. 1997). A PACAP a trachea és a bronchusok területén simaizom relaxációt okoz

(Foda és mtsai. 1995; Shigyo és mtsai. 1998), de a nyáktermelésre és a plazmafehérje-

kiáramlásra kifejtett gátló hatásairól is beszámoltak (Shigyo és mtsai. 1998; Khawaja és mtsai.

1999). Shigyo és munkatársai több mint 10 éve leírták, hogy a PACAP csökkenti a n. vagus

ingerlésével kiváltott nem-adrenerg nem-kolinerg tracheakontrakciókat, de a kívülről beadott SP

hatását nem befolyásolja (Shigyo és mtsai. 1998). E megfigyelés alapján a szerzők feltételezték,

hogy a PACAP gátolja az idegvégződésekből történő SP felszabadulást, konkrét kísérleti adataik

azonban nem voltak erre vonatkozóan.

Különféle exogén opioid receptor agonisták neurogén gyulladást gátló hatásairól

évtizedekkel ezelőtt beszámoltak (Barthó és Szolcsányi 1981). Az endomorfinok olyan endogén

opioid peptidek, amelyek nagyfokú szelektivitást mutatnak a opioid receptorokhoz (Zadina és

Page 27: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

27

mtsai. 1997; Przewlocki és Przewlocka 2001). Az EM-1 a központi idegrendszerben főként az

agyban található, míg az EM-2 lokalizációját és primér afferens rostokból való felszabadulását

elsősorban a gerincvelőben írták le, és egyik fontos szerepének ezért a fájdalomtranszmisszió

centrális gátlását tartották (Martin-Schild és mtsai. 1997; Horváth 2000). Mivel az EM-1

intraplantáris adás után dózisfüggően, naloxonnal kivédhető módon gátolta a carrageninnel

kiváltott gerincvelői c-Fos expressziót, hatásaiban perifériás -opioid receptor-közvetítette

antinociceptív folyamatok is jelentős szerepet játszhatnak (Jin és mtsai. 1999). Arra is vannak

azonban adatok, hogy az EM-ok neuronokon kívül immunsejtekben is termelődnek, és

immunmodulátor, valamint gyulladásgátló hatásokkal rendelkeznek (Jessop 2006). Morfológiai,

molekuláris biológiai és elektrofiziológiai módszerekkel mindhárom opioid receptor (, és )

jelenlétét kimutatták a primér szenzoros neuronok sejttestjén és perifériás végződésein (Stein és

mtsai. 1990). A bőrben kiváltott gyulladás hatására a -opioid receptorok száma megnő a

peptiderg afferenseken, azonban a neuronális EM koncentráció nem változik. Ez az eredmény

elsősorban a gyulladásos sejtekből felszabaduló endomorfinok nocicepcióban és neurogén

gyulladásban betöltött jelentőségére utal (Mousa és mtsai. 2002). Az EM-1 lokális alkalmazása

csökkentette akut térdízületi gyulladásban a szinoviális vérátáramlást és a plazmafehérje-

extravazációt patkányban (Barin és McDougall 2003; McDougall és mtsai. 2004). Arra is vannak

irodalmi adatok, hogy az EM-1 gátolja a n. ischiadicus antidrómos elektromos ingerlésével és az

intradermális SP-vel kiváltott plazmafehérje-kiáramlást patkány lábháti bőrében. Mivel a

gyulladáscsökkentő hatás mértéke jelentősen kisebb volt az utóbbi esetben, a hatásban szenzoros

idegvégződéseken kifejtett prejunkcionális gátló mechanizmusokat is feltételeztek (Khalil és

mtsai. 1999). Az EM-1 gyulladásgátló hatásait tehát valószínűleg több támadásponton fejti ki, ezt

az elméletet azonban csak kevés, indirekt adat támasztotta alá (Przewlocki és Przewlocka 2001).

Page 28: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

28

II. CÉLKITŰZÉSEK

1. Megvizsgáltuk, hogy a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések membránjában lévő lipid

raftok koleszterin deplécióval történő módosítása hogyan befolyásolja az idegvégződéseken

lévő TRPV1 ioncsatornák működését. Az elemzéshez az idegvégződésekből felszabaduló

szenzoros neuropeptidek mérését használtuk.

2. A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződésekben megtalálható endogén opioid peptid, az

endomorfin-1, gyulladáscsökkentő hatásaira vonatkozóan volt néhány irodalmi adat. Arra

azonban, hogy e hatásokat milyen sejtes támadáspontokon, milyen mechanizmussal fejti ki,

nem voltak közvetlen bizonyítékok. Első kísérletsorozatunkban arra kerestük a választ, hogy

az EM-1 milyen hatást fejt ki prejunkcionális (szenzoros idegvégződés) és posztjunkcionális

(granulociták, makrofágok) szinten a neurogén, illetve nem-neurogén gyulladásos

folyamatokra.

3. A PACAP-38 jelenlétét kimutatták a kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronokban.

Felszabadulására, valamint perifériás gyulladásgátló és analgetikus funkcióira vonatkozóan

munkacsoportunk szolgáltatott eredményeket korábban. A PACAP6-38 fragmens számos

kutatócsoport irodalmi adatai alapján a PAC1/VPAC2 receptorok hatékony antagonistája

különféle kísérleti rendszerekben. Saját korábbi munkánk szerves folytatásaként jelen

célkitűzésünk az volt, hogy a PACAP6-38 hatásait vizsgáljuk a perifériás afferensekből

történő neuropeptid-felszabadulásra in vitro modellünkben.

4. Kísérleteink célja volt továbbá, hogy a PACAP-38 jelenlétét kimutassuk humán, valamint

néhány kérődző állatfaj plazmájában és anyatejében egyaránt. Vizsgálni kívántuk, hogy a

terhesség, a szülés, a laktációs periódus milyen hatással vannak a plazmában, illetve a tejben

lévő PACAP-38 koncentrációkra.

Page 29: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

29

III. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

III. 1. ÁLLATOK Kísérleteinkhez hím Wistar patkányokat (250-300 g) és Balb/c (20-25 g) egereket

használtunk, amelyeket a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Központi

Állatházában szaporítottunk és tartottunk standard körülmények között. Minden kísérleti eljárás

és vizsgálat megfelelt a Helsinki Nyilatkozatban foglalt ajánlásoknak és eleget tett az

állatkísérletek végzéséről szóló 243/1998 (XII. 31.) számú kormányrendelet előírásainak. A

kísérleti protokollokat a Pécsi Tudományegyetem Állatkísérletes Etikai Bizottság javaslatára a

Baranya Megyei Állategészségügyi és Élelmiszer-ellenőrzési Főosztály engedélyezte (szám:

BA02/2000-11-2006, BA02/2000-16/2006). Humán vizsgálatainkat a Pécsi Orvostudományi és

Egészségtudományi Központ Regionális Kutatás-Etikai Bizottság engedélyével végeztük (3362,

3116, 3117/2008.01.28).

III.2. IN VITRO KÍSÉRLETI MODELL: SZENZOROS NEUROPEPTID-FELSZABADULÁS KIVÁLTÁSA ÉS BEFOLYÁSOLÁSÁNAK VIZSGÁLATA IZOLÁLT PATKÁNYTRACHEA ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEIBŐL

Thiopentállal (50 mg/kg i.p.) altatott patkányokból eltávolítottuk a tracheákat, majd

megtisztítottuk őket a zsírtól és a hozzá kapcsolódó kötőszövettől. A trachea azért jó modellszerv

szenzoros neuropeptid-felszabadulás vizsgálatára, mert nagyon gazdag kapszaicin-érzékeny

innervációval rendelkezik és a végződések közel vannak a felszínhez, így könnyen stimulálhatók.

Az izolált patkány tracheákat (1,8 ml fürdőnként 2-2 szerv) 37°C-on temperált, 7,2 pH-jú,

oxigenizált Krebs-oldattal 60 perces ekvilibrációs periódus alatt perfundáltuk. A lipid raftok

vizsgálatakor a tracheákat 30 percig Krebs oldatban majd 30 percig MCD jelenlétében

inkubáltuk. Az átáramlás leállítása után a kamrákban lévő oldatot 8 percenként lecserélve három

frakciót gyűjtöttünk. Az első 8 perces frakcióból meghatározott neuropeptid-mennyiség jelenti az

ingerlés előtti bazális peptidfelszabadulást. A második periódusban (ingerelt frakció) történt a

trachea afferens idegvégződéseinek stimulációja elektromos téringerléssel (1200 impulzus: 40 V;

0.1 ms; 10 Hz; 120 s-on keresztül a frakció 5. percétől kezdve) vagy kémiai úton 10-6

M

kapszaicinnel illetve 10 nM koncentrációjú RTX oldattal. Az elektromos téringerlés során

szelektíven az idegelemeken lévő feszültség függő, gyors Na+-csatornák is megnyílnak

(Birmingham és Wilson 1963; Szolcsányi és Barthó 1982; Németh és mtsai. 2003), így a TRPV1

receptortól független mechanizmussal is felszabadulnak neuropeptidek. Kapszaicin, vagy RTX

Page 30: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

30

alkalmazása során viszont csak a TRPV1 receptorok aktiválásával szabadulnak fel a

neuropeptidek. A harmadik periódusban (ingerlés utáni frakció) már nem történt stimuláció,

ebből a frakcióból az ingerlés utóhatásaként jelentkező peptidfelszabadulást mértük.

A vizsgált anyagokat (EM-1, naloxon, PACAP1-38, PACAP6-38) minden periódus elején

adtuk az inkubációs médiumhoz. A szervfürdőkből vett, majd jégbe hűtött mintákból a SP,

CGRP, SOM koncentrációkat RIA módszerek segítségével határoztuk meg, a peptidek

mennyiségét fmol/mg nedves szövetsúlyra vonatkoztatva fejeztük ki (Németh és mtsai. 1996,

Helyes és mtsai. 1997; Németh és mtsai. 1998; Helyes és mtsai. 2001). Az MCD-vel történt

előkezelések esetén kiszámoltuk az ingerlés hatására felszabadult teljes peptidmennyiséget is,

amit úgy kaptunk, hogy a stimuláció alatt és után felszabadult CGRP mennyiségéből levontuk a

stimuláció előtti, bazális peptidmennyiséget és a két értéket összeadtuk. (9. ábra).

9. ábra: A trachea-perfúziós rendszer vázlatos rajza

Perisztaltikus pumpa (1 ml/perc)

Izolált trachea

EElleekkttrroommooss

ttéérriinnggeerrllééss::

4400 VV,, 00..11 mmss,,

1100 HHzz,, 112200

sseecc,, 11220000 iimmpp..

3377 ooCC vvíízzffüürrddőő

9955%% OO22

55%% CCOO22

Kapszaicin (10-6

M)

RTX (10 nM)

Krebs oldat

Page 31: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

31

III.3. ANALITIKAI VIZSGÁLATOK

III.3.1. Biológiai minták előkészítése

III.3.1.1. Szenzoros neuropeptidek meghatározása perfúziós kísérlet mintáiból:

A RIA vizsgálatokhoz a bemérés közvetlenül történt: SOM, SP, és CGRP esetén 200-200

l mintánként.

III.3.1.2. Humán minták (plazma, anyatej) előkészítése RIA mérésekhez

A humán vérmintákat cubitális vénából gyűjtöttük. A kontroll csoportot 20-40 év közötti

egészséges önkéntesek (n=19) alkották, akik között a nemek aránya egyenlő megoszlású volt. Az

egyik vizsgálati csoportba 20-35 év közötti kismamákat válogattunk, akiktől minden trimeszter

végén és a szülés után 3 nappal vérmintát vettünk (n=30). Vizsgáltuk a magzati vér PACAP-38

koncentrációját is, ezért háromnapos újszülöttek felszíni temporális vénájából, valamint a vena

umbilicalisból és az arteria umbilicalisból is gyűjtöttünk mintát (n=10). A másik vizsgálati

csoportba pedig olyan 20 és 35 év közötti szoptatós kismamákat választottunk, akik laktációs

ideje 1 és 6 hónap közötti volt. A szoptatós kismamáktól vérmintákat (n=31) és anyatej mintákat

(n=31) is gyűjtöttünk.

A vért olyan jégbe hűtött csövekbe gyűjtöttük, melyek 3,7 mg etilén-diamin-tetraacetátot

(EDTA) és 240 U aprotinint (peptidázgátló) tartalmaztak. A levett vért a mintavételt követően

azonnal centrifugáltuk (1000 rpm, 10 perc, majd 4000 rpm, 10 perc, 4°C), majd a plazmákat

leszívtuk és -80°C-on tároltuk további feldolgozás céljából. A PACAP-38-LI RIA-val történő

meghatározásához 3 ml plazmához kétszeres mennyiségű abszolút alkoholt és 20 l 96%-os

ecetsavat adtunk. A plazmában lévő nagy molekulák, fehérjék ennek hatására kicsapódtak,

amiket centrifugálással (3000 rpm, 20 perc, 4°C) ülepítettünk. A felülúszót üvegcsövekbe

gyűjtöttük és nitrogén gáz alatt szárazra pároltuk. A mintákat a RIA meghatározás előtt 300 l

assay pufferben oldottuk, mellyel tízszeres koncentrációnövekedést értünk el.

A tej mintákat jégbe hűtött csövekbe gyűjtöttük. A minta-előkészítés során 1 ml tejhez 10

l 96%-os ecetsavat adtunk és 40°C-os vízfürdőben 5 percig rázogattuk, melynek hatására a

tejben lévő fehérjék kicsapódtak. A hűtés és a centrifugálás hatására (4000 rpm, 10 perc, 4°C) a

minták tetején vastag zsírréteg jelent meg, középen volt a vizes fázis (savó) és alul a kicsapódott

Page 32: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

32

fehérjék. A leszívott, ám még mindig zavaros savót ismét centrifugáltuk (10 0000 rpm, 10 perc,

4°C), majd a felülúszót használtuk a RIA meghatározásokhoz.

III.3.1.3. Humán minták (plazma, anyatej) előkészítése tömegspektrometriás mérésekhez

A plazmamintákat centrifugális ultraszűrővel tisztítottuk (Amicon Ultra-4 10000 MWCO,

Millipore Kft., Budapest), ami alkalmas arra, hogy híg (ng/ml és µg/ml koncentráció tartományú)

makromolekulás oldatokból (pl. vérplazma) nagy hatásfokkal, különböző szűrési határértékkel

(nominal molecular weight limit, NMWL) válasszon el kisebb és nagyobb molekulákat. Minden

minta esetében 1 ml szérumot mértünk be egy speciális membránnal ellátott centrifugacsőbe,

majd 30 percen keresztül, 20 °C-on 3000 g-n centrifugáltuk. A minta nem kívánatos részét a

membrán pórusméretének köszönhetően eltávolítottuk. Ezt követően a filtrátumokat liofilizáltuk,

majd 200 l 0,1%-os trifluor-ecetsavban (TFA, Sigma-Aldrich) visszaoldottuk. További tisztítás

céljára C18-as bevonatú ZIP-TIP pipettahegyet (Millipore) használtunk. A PACAP-38

megkötődött a ZIP-TIP felszínén, majd 50%-os acetonitril és 0,1%-os TFA 1:1 arányú

keverékével történő leoldás után a peptidet közvetlenül detektálhattuk.

Az anyatej minták esetében a fent leírt tisztítás után nem volt szükség további minta-

előkészítési eljárásra, a PACAP-38 közvetlenül mérhető volt.

III.3.1.4. Kérődző állatfajok mintáinak (plazma, tej, emlőbiopszia) előkészítése RIA mérésekhez

A mintagyűjtés áprilistól júliusig tartott. Az állatok szoptatós időszakban lévő 4-5 év

közötti Holstein Fríz tehenek, Merino juhok és Tejelő Barna Magyar kecskék (fajonként 10-10

példány) voltak. Az állatokat télen istállóban tartották. A juhok és a kecskék áprilistól legeltek,

míg a tehenek a teljes vizsgálati periódus alatt ridegtartásban voltak. A vér, tej és szövetmintákat

reggelente 8 és 10 óra között gyűjtöttük.

A vérmintákat (10 ml állatonként) a jugularis vénából vettük és jégbe hűtött EDTA-t (18

mg) valamint Trasylolt (1200 U) tartalmazó üvegcsövekbe gyűjtöttük. A minta-előkészítés ezután

a humán mintákkal azonos módon folytatódott.

A reggeli fejéskor vettük ugyanezen állatoktól a tej mintákat is, melyek RIA analízishez

történő előkészítése a fent leírt módszerrel történt. A vér és tej mintákat a postpartum időszak

hetedik, harmincadik és kilencvenedik napján gyűjtöttük.

A tőgybiopsziákat a szülést követő hetedik és harmincadik napon vettük laktáló Merino

juhokból olyan technikával, mely minimálisan invazív (Bard Magnum rendszer: 130 mm hosszú,

Page 33: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

33

15 mm penetrációs mélységű biopsziás tűkkel). Mintavétel előtt az állatot stabilan rögzítettük, a

tőgyét megtisztítottuk és lidocainnal helyi érzéstelenítést alkalmaztunk. Minden állat mintájának

egyik részét azonnal folyékony nitrogénbe helyeztük, a laboratóriumba szállítottuk és -80°C-on

tároltuk, míg a másik részét 4% (v/v) formalintartalmú foszfát pufferben fixáltuk.

III.3.2. SOM, CGRP, SP és PACAP RIA leírása

III.3.2.1. SOM RIA

Az általunk használt SOM antiszérumot az SST-14-marha thyroglobulin antigén ellen

termeltették birkában (Dr. Görcs Tamás, Semmelweis Orvostudományi Egyetem, Anatómiai

Intézet, Budapest). A „775/7”-es számú antiszérum, 1: 600000 higításban bizonyult a

legeredményesebbnek a RIA kifejlesztése során. Jellemzője, hogy C-terminális érzékenységű,

azaz mind az SOM-28, mind az SOM-14 C-terminálisához kötődik, és mivel ez a régió

megegyezik mindkettőben, így teljes plazma SOM koncentrációt tudunk mérni. A módszer

kifejlesztése során dr. Németh József és munkatársai a megfelelő antiszérum higítási arány

meghatározásához kötéspróbát végeztek, mely olyan RIA mérés, amiben különböző

koncentrációjú antiszérumot használnak azzal a célzattal, hogy meghatározzák azt a

koncentrációt, amely 50%-os hatásfokkal köti a jelölt anyagot. Így jutottak az 1: 600000

higításhoz (Németh és mtsai. 1996), melyet most is alkalmaztunk.

A 125

I izotóppal jelölt Tyr(1)-somatostatin-14 (Sigma) előállítása iodogén felhasználásával

történt, majd a monojódozott peptidet reverz fázisú HPLC oszlopon választottuk el a többi

fragmenstől.

Egy polipropilén jódozó csőben 20 μg iodogént frissen oldottunk 100 μl diklórmetánban,

majd nitrogén gáz alatt szárazra pároltuk. Ezt követően, 18,5 MBq/5 μl nátrium-jodiddal (Na125

I)

együtt 0,25 mol/l (pH 7,4) foszfát puffert (75 μl) és szintetikus Tyr(1)-somatostatin-14-et adtunk

hozzá. Maga a jelölés folyamata szobahőmérsékleten 4 percig tart. Annak érdekében, hogy

megelőzzük a peptid további oxidatív károsodását, 0.1 % (v/v) TFA (400 μl) hozzáadásával

leállítottuk a reakciót. Rögtön ezután a keveréket reverz fázisú HPLC oszlopra (Lichrospher RP-

18, 25x4 mm2, Merck) vittük, és szeparáltuk (Németh és mtsai. 2002).

A RIA mérés során somatostatin-14 (Sigma) peptidet használtunk standardként 0-1000

fmol/ml tartományban (Németh és mtsai. 1996).

Page 34: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

34

A SOM és CGRP RIA méréseket 1 ml végtérfogatú 0,02 mol/l koncentrációjú (pH 7,4)

foszfát pufferben végeztük. Az assay puffer 0,75 % (v/v) marha szérum albumin-t (BSA) (22%-

os oldatból (Ortho)), 0.1 mol/l nátrium-kloridot (NaCl), 0,1 % EDTA-t és 0,05 % nátrium-azidot

(NaN3) tartalmazott (Németh és mtsai. 1996; 1998).

III.3.2.2. CGRP RIA

A CGRP antiszérumot az α-CGRP-marha thyroglobulin antigén ellen termeltették

nyúlban (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). A „C1012” számút találtuk a legalkalmasabbnak

a RIA-hoz, az előzetes kötéspróba alapján az 1: 350000 hígításút (Németh és mtsai. 1998).

A 125

I izotóppal jelölt patkány Tyr-α-CGRP (23-37) (Bachem) peptidet szintén iodogénnel

készítettük, majd a monojódozott peptidet elválasztottuk a többi származéktól HPLC oszlopon

(Merck) (Németh és mtsai. 1998).

Frissen oldottunk 25 μg iodogént 100 μl diklórmetánban, majd szárazra pároltuk nitrogén

gáz alatt. Ezután hozzáadtunk 0,25 mol/l (pH 7,4) foszfát puffert (75 μl) és szintetikus patkány

Tyr-α-CGRP (23-37) (9 nmol/20 μl) peptidet, valamint 18,5 MBq/5 μl Na125

I-ot.

Szobahőmérsékleten 5 percig tart a jelölés. Az oxidációs folyamatot 0,1 % (v/v) TFA (400 μl)

hozzáadásával szüntettük meg, majd szeparáltunk HPLC oszlopon (Németh és mtsai. 2002).

Patkány Tyr-α-CGRP (23-37) (Bachem) peptidet alkalmaztunk standardként a RIA-hoz

0-100 fmol/ml tartományban. (Németh és mtsai. 1998).

III.3.2.3. SP RIA:

SP antiszérumunk az „L83”-as, melyet oly módon állítottak elő, hogy glutáraldehiddel

BSA-hoz kötöttek szintetikus SP-t, amivel nyulakat immunizáltak (Prof. G. J. Dockray

University of Liverpool, UK) (Németh és mtsai. 1999).

A 125

I-SP előállításának komplikáltsága miatt (közvetlenül nem tudjuk az izotópot a

fehérjéhez kapcsolni), ezt nem a laboratóriumban készítettük, hanem az Amersham cégtől

vásároltuk.

Szintetikus SP (Sigma) volt a RIA standard 0-1000 fmol/ml tartományban. (Németh és

mtsai. 1999).

SP és PACAP-38 méréséhez 1 ml 0,05 mol/l koncentrációjú (pH 7,5) foszfát puffert

használtunk, mely 0,25 % (w/v) BSA-t, 0,1 mol/l NaCl-ot és 0,05 % (w/v) NaN3-ot tartalmazott

(Németh és mtsai. 1999).

Page 35: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

35

III.3.2.4. PACAP-38 RIA

A „88111-3” PACAP-38 antiszérumot (A. Arimura, Tulane University, New Orleans,

USA) úgy állították elő, hogy nyulakat immunizáltak olyan marha thyroglobulinnal, melyhez

szintetikus peptideket kötöttek carbodimiddel (Arimura és mtsai. 1991). Az így nyert antitest

nagy specificitású és a PACAP-38 C-terminálisára érzékeny, amit keresztreakciós vizsgálatokkal

igazoltak. Az antitest sem a PACAP-27-tel, sem más neuropeptiddel (VIP, glukagon, szekretin)

nem mutatott keresztreakciót (Jakab és mtsai. 2004).

A mérésekhez használt 125

I-dal jelölt PACAP-38 antigént laboratóriumunkban állítottuk

elő. Frissen oldottunk 30 μg iodogént 100 μl diklórmetánban, majd szárazra pároltuk nitrogén gáz

alatt. Ezután hozzáadtunk 0,25 mol/l (pH 7,4) foszfát puffert (100 μl) és PACAP (24-38) (525

mol/20 μl) peptidet, valamint 18,5 MBq/4 μl Na125

I-ot. Szobahőmérsékleten 5 percig tart a

jelölés. Az oxidációs folyamatot 0,1 % (v/v) TFA (400 μl) hozzáadásával szüntettük meg, majd a

monojódozott peptidet HPLC oszlopon szeparáltuk (Jakab és mtsai. 2004.)

A kalibrációs görbe elkészítéséhez szintetikus peptidet használtunk, melyet 0-1000

fmol/ml koncentrációban mértünk az inkubációs oldatokba.

A kimutatási határ 2 fmol/ml (Jakab és mtsai. 2004).

III.3.2.5. A radioimmunassay eljárások menete

A polipropilén RIA csövekbe (Merck) duplikációban mértünk standardot (100 μl) vagy a

mérni kívánt/ismeretlen mintát (200 l), 100 μl antiszérumot, 100 μl (kb. 5000cpm) 125

I izotóppal

jelölt antigént, majd az inkubációs elegyet a megfelelő assay pufferrel 1 ml térfogatra

egészítettük ki.

A mintákat az összekeverést követően 4°C-on 48-72 óráig inkubáltuk. Ezután az

antitesthez kötött jelölt antigén frakciót elválasztottuk a szabad jelölt peptidektől oly módon,

hogy csövenként 100 μl szeparáló oldatot (100 g mosott szén (Norit A, Serva), 1g dextrán (Serva,

molekulasúly: 50000-75000), 0,2 g zsírmentes tejpor, 100 ml desztillált víz) mértünk hozzá. A

mintákat 4°C-on 20 percig 3000 rpm-en centrifugáltuk, majd a felülúszót leöntöttük. A szénhez

kötött szabad peptidfrakció radioaktivitását gamma számlálóval mértük NZ310 típusú

spektrométeren. Ebből következtettünk az ellenanyaghoz kötött radioaktivitás értékére, majd a

kalibrációs görbéről leolvastuk az ismeretlen minta neuropeptid koncentrációját.

Page 36: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

36

III.3.3. MALDI-TOF/TOF analízis

A széles tömegtartomány mérésére kiválóan alkalmas Bruker Autoflex II. típusú MALDI

TOF/TOF tömegspektrométer segítségével végeztük méréseinket. A készülékkel megvalósítható

a tandem tömegspektrometria (TOF/TOF), mely során az ionforrásból kilépő részecskéket két

módon tudjuk fragmentálni: közvetlenül az ionforrás után (post source decay, PSD) vagy

argongáz segítségével az erre a célra kialakított ütközési cellában (collision induced decay, CID).

A műszerben két detektort alkalmazunk: a kis tömegű ionokat a nagyobb úthosszt biztosító

iontükrös (reflektoros) detektorban, míg a nagyobb tömegűeket lineáris módban mérjük. A

műszer kimutatási tartományának alsó határa fmol nagyságrendű (10. ábra).

10. ábra: MALDI TOF/TOF tömegspektrométer

A mintáink, illetve a PACAP-38 vizes oldatú standardjának (Sigma-Aldrich) 1–1 μl-ét

felvittük a Bruker rozsdamentes acél mintatartó tálcára (MTP 384 massive target T, Bruker

Daltonics, Bremen, Germany). Az elemzéshez ideális mátrixot a molekula típusának,

polaritásának, és tömegének figyelembevételével választottuk ki. Ennek megfelelően

vizsgálataink során mátrixként α–ciano–4–hidroxi–fahéjsav (CHCA) telített 0,1 %-os TFA –

acetonitril (2/1 V/V) oldatát alkalmaztuk, melyből mintáinkhoz 1-1 l-t csepegtettünk. Kalibráló

oldatként minden esetben a Bruker Peptidkalibráló Standardot alkalmaztuk (#206195 Peptide

Calibration Standard; Bruker Daltonics). A minták beszáradását követően az elemzéseket a már

Page 37: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

37

fent említett Bruker Daltonics Autoflex II típusú MALDI TOF/TOF tömegspektrométerrel

reflektor detektálási módban végeztük el. Az ionizáláshoz 337 nm-es nitrogén lézert

alkalmaztunk (MNL-205MC model; LBT- Lasertechnick Berlin GmbH.; Berlin; Németország),

ennek frekvenciája 50 Hz, a gyorsító feszültség 20 kV és a késleltetési idő pedig 120 ns volt. A

tömegspektrumokat pozitív ionizációs módban 1000 és 10000 m/z tartomány között regisztráltuk.

Minden minta esetében a peptidkeverékre jellemző tömegspektrumokat (1000 lövés/minta)

összesítettük. A műszer ellenőrzését Bruker FlexContol 2.4 szoftverrel, az értékelést pedig

Bruker FlexAnalysis 2.4 szoftverrel végeztük. A megfelelő matematikai átalakítások után, az

eredményeinket fehérje szekvenciát tartalmazó adatbázisokba küldtük (Mascot kereső szoftver és

NCBInr, SwissProt és MSDB adatbázisok). Az adatbázisokból úgynevezett ujjlenyomat-keresési

technika (Peptide Mass Fingerprinting, PMF) segítségével kaptuk meg az adott tömegspektrum

által meghatározott fehérjéket.

III.3.4. PAC1 receptor immunhisztokémia

Indirekt immunhisztokémiai vizsgálatainkhoz 1 órás 4%-os paraformaldehides (PFA)

fixálást követően az emlő mintákat 6x10 percig mostuk 0,1 M-os foszfát pufferben (PBS), majd 1

órán át inkubáltuk 10%-os szacharózos-PBS-oldatban (Sigma). A kriosztáttal történő metszésig a

preparátumokat 20%-os szacharózos-PBS-oldatban tároltuk 4°C-on. A kriosztátos (Leica,

Németország) metszés során kriosztát-médiumba (Shandon Cyromatrix, Thermo Scientific)

ágyazva, fagyasztva [(­25)-(­28)˚C] metszettük le a mintákat. A 10 µm-es metszeteket

zselatinozott tárgylemezekre (Superfrost, Spektrum-3D) vettük fel. A metszeteket az

immunhisztokémiai eljárás kivitelezéséig -20˚C-on tároltuk.

Az immunhisztokémiai protokol során primer antitestként PAC1-R (1:100, anti-nyúl;

Sigma) antitestet, szekunder antitestként Alexa Fluor „568” (1:1000, anti-nyúl; Southern

Biothech) fluoreszcens markert alkalmaztunk.

A kétlépcsős („szendvics-technika”) immunhisztokémiai eljárás során a -20˚C-on tárolt

metszeteket szobahőmérsékleten állni hagytuk, hogy átvegyék a labor hőmérsékletét. Nedves

kamrában 6x5 percig mostuk 1%-os Triton-X-100-as (Spektrum3D) PBS-sel, ezután 1 órán át

inkubáltuk (100 µl/tárgylemez) az aspecifikus reakciók blokkolása érdekében normál kecske

szérumban (NGS; Sigma), amelyet a megfelelő koncentrációjú primer antitestben (100

µl/tárgylemez) egy éjszakán át tartó inkubáció követett. A második napon 6x5 percig mostuk a

metszeteket 0,2 M-os PBS-ben, majd 2 órán át szekunder antitesttel (100 µl/tárgylemez)

Page 38: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

38

inkubáltuk a mintákat. Ezt 3x5 perces 0,2 M-os PBS-es mosás követte, majd a metszeteket

Fluoromount-G (Southern Biotech) géllel fedtük.

A metszetek specifikus jeleit megfelelő hullámhosszon (568 nm) Nikon Eclipse 80i

mikroszkóppal detektáltuk, SPOT Basic 4.04 program segítségével. Valamennyi antitest

alkalmazásakor készítettünk ún. negatív kontrollokat is, amelyekkel ellenőriztük, hogy

önmagában a primer, és szekunder antitestek adnak-e aspecifikus jelet.

A standardizálás érdekében minden egyes marker vizsgálata során a metszetvastagság, az

inkubációs idők, valamint az alkalmazott koncentrációk azonosak voltak valamennyi vizsgált

csoport esetében. Valamennyi csoportból származó mintákat párhuzamosan reagáltattuk a korrekt

összehasonlítás érdekében. Ugyanez elmondható a fényképezés folyamatáról is, a különböző

kísérleti csoportok metszeteinek kiértékelésekor a SPOT Basic program teljesen azonos

beállításai mellett készültek a fotók, így az egyes csoportok közötti eltérések valódi

különbségeknek tudhatók be.

A bemutatott fotók szerkesztése Adobe Photoshop 7.01 programmal történt.

III. 4. IN VIVO KÍSÉRLETEK Az EM-1 érzőideg-végződésekre kifejtett hatásainak vizsgálatakor az in vitro modellrendszer

mellett élő állatokban is végeztünk kísérleteket.

III.4.1. Mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladás vizsgálata patkány lábháti bőrében

A mustárolaj (allil-izotiocianát) szelektíven aktiválja a kapszaicin-érzékeny

idegvégződéseket a Tranziens Receptor Potenciál A1 (TRPA1) ioncsatornán keresztül (Jordt és

mtsai. 2004), így kizárólag neurogén mechanizmussal hoz létre gyulladást (Inoue és mtsai. 1997;

Bánvölgyi és mtsai. 2004).

Nembutallal altatott (40 mg/kg i.p.) patkányok mindkét oldali n. saphenusát és n.

ischiadicusát átvágtuk 30 perccel a kísérlet előtt, hogy megakadályozzuk a mustárolaj nociceptív

hatásából adódó reflexválaszokat. A baloldali végtag lábháti bőrét 1%-os mustárolajjal kentük, az

ellenoldalon kontrollként paraffinolajat alkalmaztunk. A plazmafehérje kiáramlás mértékét az

Evans kék akkumuláció módszerével határoztuk meg. Tíz perccel a mustárolajjal történő kenés

előtt i.v. 50 mg/kg Evans kék festéket adtunk, amely erősen kötődik albuminhoz és a plazma

extravazáció helyén akkumulálódik a gyulladt szövetekben (11. ábra). Húsz perccel a gyulladás

kiváltása után az állatokat elvéreztettük és a kimetszett bőrterületek festéktartalmát formamidban

Page 39: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

39

extraháltuk 72 órán keresztül. Az oldat optikai denzitását, amely a gyulladás intenzitásával

egyenesen arányos, spektrofotométerrel (Labsystem Multiskan RC, InterLabsystem Kft.,

Magyarország) határoztuk meg 620 nm-en. A kapott értékekből kalibrációs görbe segítségével

határoztuk meg a festék mennyiségét (g) 1 g nedves szövetre vonatkoztatva. A mustárolajjal

bekent lábak eredményeiből az ellenoldali lábak eredményeit levontuk. Az EM-1-et (1, 10 és 100

g/kg i.p.) 10 perccel a gyulladás kiváltása előtt adtuk. Az egyik vizsgálati csoportban az

állatokat 15 perccel az EM-1 adás előtt -opioid receptor antagonista naloxonnal (3 mg/kg s.c.,

Campos és mtsai. 2000) előkezeltük. A kontroll csoportban az EM-1 oldószerét, fiziológiás

sóoldatot használtunk a naloxon előkezelést követően. A vizsgálatokat 14-15-ös elemszámú

csoportokkal végeztük.

Megvizsgáltuk, hogy az EM-1 okoz-e toleranciát ebben a modellben. 10 napon át naponta

háromszor 10 g/kg i.p. dózisban adtuk az opioid receptor agonistát, majd megismételtük a

gyulladásos kísérletet.

11. ábra: Evans kék akkumuláció patkány lábháti bőrében

III.4.2. Mustárolajjal kiváltott neurogén ödéma vizsgálata egérfülön

Balb/c egerek fülére altatásban (ketamin 100 mg/kg i.p. és xylazin 10 mg/kg i.m.) 10 μl

1%-os mustárolajat kentünk és 3 órán keresztül mikrométerrel mértük a fülvastagságot (12.

ábra). A kialakult fülödémát a kezdeti értékhez viszonyított százalékban adtuk meg. Az EM-1-et

15 perccel a mustárolajjal történő kezelés előtt adtuk 1, 10 és 100 g/kg i.p. dózisban. A kontroll

csoportban az EM-1 oldószerét, fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk. Megvizsgáltuk, hogy ebben a

modellben a -opioid antagonista naloxon kivédi-e az EM-1 fülduzzadásra gyakorolt hatását,

ezért az egyik vizsgálati csoportban az egereket 15 perccel az EM-1 adás előtt naloxonnal

Page 40: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

40

kezeltük. A kontroll csoportban az EM-1 oldószerét, fiziológiás sóoldatot használtunk a naloxon

előkezelést követően. A vizsgálatokat 8-10-es elemszámú csoportokkal végeztük.

12. ábra: Fülduzzadás mérése egéren mikrométerrel

III.4.3. Mustárolajjal kiváltott nem neurogén gyulladás vizsgálata egér fülön

Altatott Balb/c egerek fülét 10 l 1%-os mustárolajjal kentük. Granulocita akkumuláció

elérése érdekében a 6 órás vizsgálati periódus alatt a kezelést minden órában megismételtük

(Bánvölgyi és mtsai. 2004). Minden mustárolajjal történő kezelés előtt 10 perccel EM-1-et

adtunk (100 g/kg i.p.) abban a dózisban, mely az előző kísérletben hatékonyan gátolta a

fülduzzadást. A kontroll csoportban a kezeléseket fiziológiás sóoldattal (EM-1 oldószere) és

paraffin-olajjal (mustárolaj oldószere) ismételtük. A kísérletek végén az állatokat leöltük.

Szövettani vizsgálatokhoz az egerek jobb fülét 4%-os formalin tartalmú pufferben

fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk. A metszeteket (6 m) kloroacetát-észterázzal festettük.

Az állatok bal fülét lemetszettük és -80 °C-on tároltuk myeloperoxidáz (MPO) aktivitás

mérés céljából. A fagyasztott füleket apró darabokra vágtuk és 1 ml 0,5% hexadecil-trimetil-

ammonium-bromid tartalmú 50 mM-os kálium pufferben homogenizáltuk (pH 6). Centrifugálást

(10000Xg, 4°C, 10 perc) követően a felülúszót felhasználva mértük a minták MPO aktivitását. A

neutrofil akkumuláció mértékére úgy következtettünk, hogy a minták MPO enzim aktivitását

standard humán MPO (Sigma) preparátumhoz hasonlítottuk. Az optikai denzitást (OD) 620 nm-

en mértük 5 perces intervallumokban 30 percen át microplate leolvasóval (Labsystems).

Kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg a minták MPO aktivitását (Bánvölgyi és mtsai.

2004).

Page 41: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

41

III.5. STATISZTIKA: A kapott eredményeket átlag ± SEM formbán fejeztük ki az adott csoportokra vonatkoztatva. In

vivo vizsgálataink során a vizsgált anyagok hatásait kontroll értékekhez viszonyítottuk, melyhez

Bonferroni-féle t-tesztettel kiegészített egyutas variancia analízist (ANOVA) használtunk. A

mustárolajjal kiváltott egérfülduzzadás modellben az idő függvényében ábrázolt százalékos

duzzadásgörbék alatti területeket számoltuk és elemeztük egyutas ANOVA teszttel. A perfúziós

kísérletek szervfürdőiben és a különböző biológiai mintákban mért immunreaktivitas és MPO

enzimaktivitás adatokat egymintás, és kétmintás Student-féle t-teszttel hasonlítottuk össze.

Minden esetben a különböző mérési eredmények összehasonlításakor a *p<0,05; **p<0,01 és

***p<0,001 értékeket határoztuk meg szignifikánsnak.

Page 42: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

42

IV. EREDMÉNYEK

IV.1. LIPID RAFTOK: AZ MCD KEZELÉS HATÁSA A SZENZOROS NEUROPEPTID FELSZABADULÁSRA IZOLÁLT PATKÁNY TRACHEÁN

Az itt leírt, idegvégződéseken nyert peptidfelszabadulási adatainkat közlésre

előkészítettük. A párhuzamosan sejttesten végzett kísérleteink eredményeit egy 2010-ben

megjelent közleményünkben publikáltuk (Szőke É, Börzsei R, Tóth DM, Lengl O, Helyes Z,

Sándor Z, Szolcsányi J: Effect of lipid raft disruption on TRPV1 receptor activation of trigeminal

sensory neurons and transfected cell line. Eur J Pharmacol. 628(1-3):67-74, 2010., Szőke É. és

Börzsei R. megosztott első szerzők), amely Tóth Dániel Márton PhD hallgató kollégám

értekezésének alapját képezi, ezért itt nem kerül bemutatásra.

A táblázatban a kapszaicin ingerléssel kiváltott teljes neuropeptid felszabadulást

ábrázoltam, amit úgy kaptam, hogy a stimuláció alatt és után felszabadult CGRP mennyiségéből

levontam a stimuláció előtti, bazális peptidmennyiséget és a két értéket összeadtam. A kontroll

csoportban 1 μM kapszaicin hatására tehát 13,83 fmol CGRP szabadult fel, amit 100 M

koncentrációjú MCD szignifikánsan, 40%-ra csökkentett. Érdekes módon az MCD sem kisebb,

sem nagyobb koncentrációban nem volt jelentős gátló hatással a neuropeptid felszabadulásra,

koncentráció-hatás összefüggés nem volt tapasztalható: 10 M esetén 67%-ra, 1 mM és 10 mM

alkalmazásakor pedig egyaránt 74%-ra csökkent a CGRP koncentrációja az inkubációs

médiumban, azonban ezek statisztikailag nem bizonyultak szignifikánsnak (1. táblázat). Az

egyes frakciókban felszabadult neuropeptid mennyiségeket a 13. ábra oszlopai külön-külön

szemléltetik. Látható, hogy az MCD előkezelés egyik koncentrációban sem befolyásolta az

ingerlés előtti, bazális CGRP szinteket (13. ábra).

1. táblázat: MCD hatása a kapszaicinnel kiváltott CGRP felszabadulásra

CGRP mennyisége (fmol/mg nedves szövet) Teljes CGRP

felszabadulás az ingerlés alatt és után (fmol/mg nedves szövet

MCD %-os gátlása a teljes CGRP

felszabadulásra ingerlés előtt ingerlés alatt ingerlés után

kontroll 0,93 ± 0,19 10,26 ± 1,39 5,45 ± 0,50 13,85 ± 0,75

10 M 0,54 ± 0,08 7,39 ± 0,59 2,96 ± 0,34 * 9,27 ± 0,32 66,96

100 M 0,67 ± 0,03 3,81 ± 0,88 * 3,15 ± 0,84 5,62 ± 0,57 40,54 *

1 mM 0,47 ± 0,50 8,43 ± 1,06 2,83 ± 0,38 * 10,32 ± 0,59 74,49

10 mM 0,41 ± 0,06 7,06 ± 2,46 4,04 ± 0,70 10,28 ± 1,07 74,23

Page 43: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

43

13. ábra: Az MCD hatása a kapszaicin által indukált CGRP

felszabadulásra izolált patkány tracha érzőideg-végződéseiből (n=6 kísérlet (6x2 trachea); átlag±SEM; *p<0,05 vs. kontroll megfelelő frakciója)

RTX ingerléssel kiváltott teljes CGRP felszabadulás a kezeletlen csoportban 11,58

fmol/mg nedves szövet volt, ezt vettük 100%-nak. 100 M MCD alkalmazása 29%-ra

csökkentette a felszabadult neuropeptid koncetrációját (2. táblázat). Kapszaicin ingerléssel

végzett kísérleteinkhez hasonlóan az MCD itt sem volt hatással kisebb vagy nagyobb

koncentrációban a CGRP szintekre. RTX ingerléskor a kapszaicinhez képest a reakciókinetikában

figyeltünk meg változást, miszerint az ingerlés utáni, harmadik 8 perces frakcióban a CGRP

koncentráció nem csökkent a második frakcióhoz képest. A legnagyobb CGRP felszabadulás az

ingerlés utáni, harmadik frakcióban volt mérhető. Érdekes eredmény az is, hogy a 100 M MCD

koncentráció alkalmazásakor mindhárom frakcióban szignifikánsan csökkent a CGRP

mennyisége, vagyis a kapszaicinnal történt ingerléskor tapsztalttal ellentétben az MCD a bazális

peptidmennyiséget is szignifikánsan csökkentette. (14. ábra).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

* **

MCD

10 mM

MCD

10 M

MCD

100 M MCD

1 mM

Kapszaicin 1 M

CG

RP

-LI

(fm

ol/

mg

) ingerlés elõtt

ingerlés alatt

ingerlés után

kontroll

Page 44: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

44

2. táblázat: MCD hatása az RTX ingerléssel kiváltott CGRP felszabadulásra

CGRP mennyisége (fmol/mg nedves szövet) Teljes CGRP

felszabadulás az ingerlés alatt és után (fmol/mg nedves szövet)

MCD %-os gátlása a teljes CGRP

felszabadulásra ingerlés előtt ingerlés alatt ingerlés után

kontroll 0,37 ± 0,037 2,86 ± 0,566 9,46 ± 2,237 11,58 ± 1,035

100 M 0,08 ± 0,007 * 0,77 ± 0,194 * 2,81 ± 0,642 * 3,42 ± 0,315 29,52 *

1 mM 0,39 ± 0,058 5,58 ± 1,338 7,18 ± 0,769 11,97 ± 0,752 103,39

14. ábra: Az MCD hatása az RTX által indukált CGRP

felszabadulásra izolált patkány tracheán (n=6 kísérlet (6x2 trachea); átlag±SEM; *p<0,05 vs. kontroll megfelelő

frakciója)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

*

*

ingerlés elõtt

ingerlés alatt

ingerlés után

kontroll MCD 1 mM

RTX 10 nM

*

MCD 100M

CG

RP

-LI (f

mo

l/m

g)

Page 45: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

45

IV.2. AZ ENDOMORFIN-1 HATÁSA SZENZOROS NEUROPEPTIDEK FELSZABADULÁSÁRA IN VITRO ÉS AKUT GYULLADÁSOS FOLYAMATOKRA IN VIVO EREDETI KÖZLEMÉNY: Börzsei R, Pozsgai G, Bagoly T, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J,

Helyes Zs.: Inhibitory action of endomorphin-1 on sensory neuropeptide release and neurogenic

inflammation in rats and mice. Neuroscience 152(1):82-88, 2008.

IV.2.1. Az EM-1 hatása az elektromos téringerléssel kiváltott SP és CGRP felszabadulásra

Az EM-1 (5-2000 nM) koncentrációfüggő módon gátolta mindkét gyulladáskeltő szenzoros

neuropeptid stimuláció következtében történő felszabadulását, az alap, ingerlés nélküli

peptidkiáramlást azonban nem befolyásolta (3. táblázat, 15. ábra). A szigmoid koncentráció-hatás

görbék analízise azt mutatta, hogy az EM-1 maximális gátló hatása 80,4% volt a SP és 85,2% a

CGRP esetében. A hatáserősségre utaló EC50 érték 39,48 nM volt a SP és 10,83 nM a CGRP

vonatkozásában (16. ábra). A -opioid receptor antagonista naloxon (1 M) a 100 nM EM-1 gátló

hatását mindkét peptid esetében kivédte, önmagában a naloxon nem volt hatással sem a bazális, sem

az ingerléssel kiváltott peptidfelszabadulásra (3. táblázat).

SP-LI (fmol/mg)

Frakció Kezelés

Kontroll EM-1 Naloxon Naloxon+EM-1

Ingerlés előtti 2,08±0,22 2,72±0,53 1,94±0,32 2,03±0,21

Ingerelt 4,17±0,85* 3,44±0,62 3,97±0,99 3,98±0,7

Ingerlés utáni 3,45±0,72 2,77±0,46 3,21±0,41 3,53±0,86

CGRP-LI (fmol/mg)

Frakció Kezelés

Kontroll EM-1 Naloxon Naloxon+EM-1

Ingerlés előtti 0,14±0,01 0,15±0,009 0,11±0,01 0,17±0,03

Ingerelt 0,29±0,02** 0,18±0,009##

0,38±0,02 0,40±0,05

Ingerlés utáni 0,21±0,02 0,15±0,008 0,20±0,04 0,23±0,02

3. táblázat: A -receptor antagonsita naloxon teljes mértékben kivédte az EM-1

(100 nM) téringerléssel kiváltott SP és CGRP felszabadulásra gyakorolt gátló

hatását (n=6/csoport; átlag±SEM; *p<0,05, **p<0,01 ingerelt vs. ingerlés előtti frakció, egymintás Student-

féle t-teszt; ##

p<0,01 EM-1 vs. kontroll megfelelő frakciója, kétmintás Student-féle t-teszt)

Page 46: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

46

0,00

1,25

2,50

3,75

5,00

6,25

7,50

*

100

EM-1 koncentráció (nM)

5 20 2000

Su

bs

tan

ce

P-

LI

(fm

ol/

mg

)

Ingerlés elõtt

Ingerlés alatt

Ingerlés után

Kontroll

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Kontroll 2000

****

####

10020

EM-1 koncentráció (nM)

5

CG

RP

-LI

(fm

ol/

mg

)

Ingerlés elõtt

Ingerlés alatt

Ingerlés után

15. ábra: EM-1 hatása elektromos téringerléssel kivátott SP és CGRP

felszabadulásra izolált patkány tracheán (n=6/csoport (6x2 trachea); átlag±SEM; *p<0,05, **p<0,01 ingerelt vs. ingerlés előtti

frakció, egymintás Student-féle t-teszt; ##

p<0,01 EM-1 ingerelt frakció vs. kontroll

ingerelt frakció, kétmintás Student-féle t-teszt)

Page 47: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

47

-10 -9 -8 -7 -6 -50

10

20

30

40

50

60

70

80

90

SP

CGRP

EM-1 koncentráció (M)

Fels

zab

ad

ulá

s g

átl

ása (

%)

16. ábra: Koncentráció-hatás (peptidfelszabadulás-gátlás) görbék,

melyek az EM-1 gátló hatását mutatja az elektromos téringerléssel

kiváltott SP és CGRP felszabadulásra Az adatpontok az endomorfinnal kiváltott százalékos gátlást mutatják kontroll

csoporthoz viszonyítva (n=6/csoport)

IV.2.2. Az EM-1 hatása a mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladásra patkányban

Az EM-1 (1, 10 és 100 g/kg, i.p.) dózisfüggően gátolta az 1%-os mustárolajjal kiváltott

plazmafehérje-kiáramlást patkány lábháti bőrében. A két nagyobb dózis esetén 49,1%-os és

55,4%-os csökkenést tapasztaltunk. A naloxon előkezelés (3 mg/kg s.c.) teljesen kivédte a 100

g/kg EM-1 gátló hatását, de önmagában nem befolyásolta a gyulladást (17. ábra). A szigmoid

dózis-hatás görbe analízisével nyert maximális gátlás 58,4%, az ED50 érték 1,13 g/kg volt, tehát

az EM-1 jelentős hatékonysággal és nagy hatáserősséggel rendelkezik ebben a modellben.

A 10 g/kg dózis 10 napon keresztül napi 3-szor történő i.p. injekciója a gyulladás

kiváltása előtt nem csökkentette a gátló hatást az egyszeri alkalmazáskor tapasztalthoz

viszonyítva, az EM-1 tehát nem okoz deszenzibilizációt ebben a kísérleti elrendezésben.

Page 48: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

48

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

1 100 10

**

NAL + NaCl (1g/kg)

NAL (1g/kg) + EM-1 (100g/kg)

g

Eva

ns k

ék

/g n

ed

ves

szö

vet

**

Oldószer (NaCl)

EM-1 (g/kg)

17. ábra: Az EM-1 hatása a mustárolajjal kiváltott akut

neurogén gyulladásra patkány lábháti bőrén

A kontroll csoportban fiziológiás só oldatot alkalmaztunk, ami az EM-1 oldószere

volt. Külön vizsgálati csoportban a -receptor antagonista naloxont (3 mg/kg s.c.)

15 perccel az EM-1 injekció vagy fiziológiás só oldat előtt adtuk. (n=14-

15/csoport; átlag±SEM; **p<0,01 EM-1 vs. oldószeres csoport, egyutas ANOVA

+ Bonferroni-féle módosított t-teszt)

IV.2.3. Az EM-1 hatása a mustárolajjal kiváltott akut neurogén fülduzzadásra egérben

Az EM-1 (1, 10 and 100 g/kg, i.p.) a patkánymodellben tapasztaltakhoz hasonlóan

dózisfüggően gátolta a neurogén duzzadást. Az 1 órás mérésnél mindhárom dózis hatása

szignifikánsnak bizonyult, a teljes mérési periódus alatt azonban csak a legnagyobb, 100 g/kg

dózis esetében tapasztaltunk szignifikáns gátlást. A naloxonnal történő előkezelés kivédte a 100

g/kg EM-1 ödémagátló hatását, a naloxon önmagában hatástalan volt (18. ábra). A maximális

gátlás 63,2%, az ED50 érték 1,02 g/kg volt ebben a modellben, ami nagyon hasonló a

patkánykísérletekben tapasztaltakhoz.

Page 49: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

49

0 1 2 3

0

10

20

30

40

50

***

Oldószer (NaCl)

EM-1 (1 g/kg)

EM-1 (10 g/kg)

EM-1 (100 g/kg)

NAL + NaCl

NAL + EM-1 (100 g/kg)

*

*

*

ldu

zza

dás m

ért

ék

e (

%)

Idõ (óra)

*

18. ábra: Az EM-1 hatása mustárolajjal kiváltott akut neurogén fülduzzadásra

egérben A kontroll csoportban fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk, mely az EM-1 oldószere volt. Külön vizsgálati

csoportban a -receptor antagonista naloxont (3 mg/kg s.c.) 15 perccel az EM-1 injekció vagy

fiziológiás só oldat előtt adtuk. Minden adatpont n=8-10/csoport átlagát ± S.E.M. mutatja a kiindulási

fülvastagsághoz viszonyított százalékban. *p<0,05 és ***p<0,001 EM-1 vs. oldószeres csoport; egyutas

ANOVA + Bonferroni-féle módosított t-teszt)

IV.2.4. Az EM-1 hatástalansága a mustárolajjal kiváltott késői gyulladásos reakciókra

A mikrométerrel mért adatok és a szövettani metszetek alapján jól látható, hogy a

mustárolaj-kenés hatására a fülduzzadás 2-3 óra múlva éri el maximumát, 6 órával a gyulladás

kiváltása után már csak kb. 20-30%-os. Ekkorra kialakul a sejtes gyulladásos reakció, erőteljes

granulocita akkumuláció jellemző. Az EM-1 kezelés (100 g/kg i.p.) az első 3 órában tapasztalt

ödémagátló hatással ellentétben, 6 órával az első mustárolaj alkalmazás után nem befolyásolta a

neutrofil sejtek szöveti felhalmozódását, amelyet az MPO aktivitás azonos mértékű növekedése

mutat (19. ábra). Mindezt alátámasztják a szövettani metszetek is, amelyeken látható, hogy EM-

1-gyel történt kezelés nem befolyásolta a mustárolajjal kiváltott késői, nem-neurogén, sejtes

Page 50: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

50

gyulladásos mechanizmusokat: a kötőszövetben lévő granulociták száma közel megegyező. A

duzzadás mértéke ekkor már csökken a korábbi időpontokhoz viszonyítva, és azonos az EM-nal

és oldószerrel kezelt egerek fülmintáinak szövettani metszetein is (20. ábra).

19. ábra: Az EM-1 hatástalansága a mustárolajjal kiváltott MPO aktivitásra

egérfülben

A granulociták szöveti akkumulációját 1 %-os mustárolajjal történő ismételt kezeléssel értük el. A 6

órás mérési periódus alatt óránként kentük be az állatok fülét. Kontroll csopost esetén fizológiás só

(EM-1 oldószere) oldatot alkalmaztunk i.p. A vizsgálatot paraffin olajjal is megismételtük (mustárolaj

oldószere). (n=8/csoport; átlag±SEM; **p<0,01 EM-1 vs. paraffin olaj, kétmintás Student-féle t-teszt)

Page 51: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

51

20. ábra: Az EM-1 hatástalansága a mustárolajjal kiváltott

granulocita akkumulációra (A: paraffin olaj; B: mustárolaj + oldószer; C: mustárolaj + EM-1)

(P-porc szövet, a nyilak granulocitákat mutatják) Mustárolaj hatására ödéma és

granulocita felhalmozódás mutatkozik a szövetekben (A, B). Látható, hogy az EM-1

nem befolyásolta sem a duzzadás mértékét, sem a neutrofil granulocita akkumulációt az

oldószerrel kezelt csoporthoz képest (B, C)

P P

P

→ → →

→ →

____ 200 m

____ 200 m

____ 200 m

Page 52: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

52

IV.3. A PACAP6-38 AGONISTA HATÁSAI AZ ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEKEN

EREDETI KÖZLEMÉNY: Reglődi D, Börzsei R, Bagoly T, Boronkai A, Rácz B, Tamás A, Kiss P,

Horváth G, Brubel R, Németh J, Tóth G, Helyes Zs.: Agonistic behavior of PACAP6-38 on

sensory nerve terminals and cytotrophoblast cells. J. Mol. Neurosci. 36(1-3):270-278, 2008.

IV.3.1. A PACAP1-38 és PACAP6-38 hatásai az elektromos téringerléssel és kapszaicin

ingerléssel kiváltott szenzoros neuropeptidek felszabadulására izolált patkány tracheán

Kapszaicin ingerlés (10-6

M) hatására a bazális, ingerlés előtti értékekhez viszonyítva 2,5-

szeres, 11-szeres és 3-szoros SP, CGRP és SOM felszabadulást mértünk izolált patkány tracheán.

Elektromos téringerléssel (1200 impulzus) szintén 3-szoros, 3,5-szeres és 2,5- szeres neuropeptid

kiáramlás érhető el. A PACAP1-38, melyet 400 és 2000 nM koncentrációban adtunk a szervfürdő

mindhárom frakciójához, szignifikánsan gátolta mind a kémiai, mind az elektromos téringerléssel

kiváltott neuropeptid felszabadulást. A PACAP6-38 2000 nM-os dózisban szintén gátolta a SP és

a CGRP felszabadulását, bár kisebb mértékben, mint a PACAP1-38. A szomatosztatin

felszabadulás során is hasonló eredményeket kaptunk, de az elektromos téringerléssel kiváltott

SOM kiáramlást a PACAP6-38 még a PACAP1-38-nál is nagyobb mértékben gátolta. Sem a

PACAP1-38 sem a PACAP6-38 nem volt hatással a szenzoros neuropeptidek bazális szintjeire.

Amikor a két vegyületet együtt adtuk az inkubációs médiumhoz, a PACAP1-38 által kiváltott

gátló hatás nem változott, vagy még kifejezettebb lett (21-22. ábra).

Page 53: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

53

0

1

2

3

4

5

6

7

*****

************

******

2000 2000

2000

400

+ 2000

400

EFS (1200 imp.)

Kontroll

2000

PACAP 1-38 (nM)

PACAP 6-38 (nM)

400

+ 2000

400

Kapszaicin (10-6 M)

Su

bsta

nce P

-L

I (f

mo

l/m

g)

Ingerlés elõtt

Ingerlés alatt

Ingerlés után

Kontroll

0

1

2

3

******

**

***

******

******

2000 20002000 2000

400

+ 2000

400 Kontroll

EFS (1200 imp.)

PACAP 1-38 (nM)

PACAP 6-38 (nM)

400

+ 2000

400

Kapszaicin (10-6 M)

CG

RP

-LI

(fm

ol/

mg

)

Ingerlés elõtt

Ingerlés alatt

Ingerlés után

Kontroll

21. ábra: PACAP 1-38 és PACAP 6-38 hatása kapszaicinnel és

EFS-sel kiváltott SP és CGRP felszabadulásra izolált patkány

tracheán (n=6 kísérlet (6x2 trachea); átlag±SEM; *p<0,05, **p<0,01 és ***p<0,001 vs.

ingerlés alatti kontroll frakció)

Page 54: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

54

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

***

*

***

*********

***

***

2000 2000

2000 2000 400

+ 2000

400 Kontrol

EFS (1200 imp.)

PACAP 1-38 (nM)

PACAP 6-38 (nM)

400

+ 2000

400

Kapszaicin (10-6 M)

SO

M-L

I (f

mo

l/m

g)

Ingerlés elõtt

Ingerlés alatt

Ingerlés után

Kontroll

22. ábra: PACAP 1-38 és PACAP 6-38 hatása kapszaicinnel és

EFS-sel kiváltott SOM felszabadulásra izolált patkány tracheán (n=6 kísérlet (6x2 trachea); átlag±SEM; *p<0,05, **p<0,01 és ***p<0,001 vs.

ingerlés alatti kontroll frakció)

Page 55: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

55

IV.4. A PACAP-38 KIMUTATÁSA KÜLÖNBÖZŐ FAJOK PLAZMÁJÁBAN ÉS ANYATEJÉBEN IV.4.1. PACAP-38 kimutatása humán mintákban

EREDETI KÖZLEMÉNYEK:

Börzsei R, Márk L, Tamás A, Bagoly T, Bay C, Csanaky K, Bánki E, Kiss P, Váczy A, Horváth G,

Németh J, Szauer E, Helyes Z, Reglődi D.: Presence of pituitary adenylate cyclase activating

polypeptide-38 in human plasma and milk. Eur J Endocrinol. 2009 Apr;160 (4):561-565. 2009.

Reglődi D, Gyarmati J, Ertl T, Börzsei R, Bodis J, Tamás A, Kiss P, Csanaky K, Bánki E, Bay C,

Németh J, Helyes Zs: Alterations of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-like

immunoreactivity in the human plasma during pregnancy and after birth. J Endocrinol

Invest.;33(7):443-445 2010.

IV.4.1.1. A PACAP-38 kimutatása anyatejben és emberi plazmában tömegspektrometriás

módszerrel

A PACAP-38 jelenlétét humán szérumban és anyatejben tömegspektrometriás méréssel

bizonyítottuk. Az összehasolításhoz PACAP-38 standard oldatot használtunk. A PACAP-38

kvázi-molekula ionját (MW: 4535 Da) a standardban (23. ábra, A kép), a szérumban (23. ábra,

C kép), és az anyatejben (23. ábra, E kép) is sikeresen detektáltuk. Ezt követően az összes minta

esetében elvégeztük a MALDI TOF/TOF mérést. Először a standardnál hajtottuk ezt végre, ahol

megkaptuk (23. ábra, B kép) a PACAP-38 szülő ion főbb y fragmenseit az aminosav

szekvenciáikkal együtt, majd az eljárást elvégeztük a szérum (23. ábra, D kép) és az anyatej (23.

ábra, F kép) minták esetében is. Így kapott eredményeink (az összes tömegspektrumon a

PACAP-38-ra jellegzetesen megjelenő csúcsok, fragmensek láthatóak) egyértelműen bizonyítják

a PACAP-38 jelenlétét humán szérumban és anyatejben egyaránt.

Page 56: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

56

23. ábra: A PACAP-38 tömegspektruma A PACAP-38 protonált kvázi molekula ionját (M+H

+) láthatjuk a (A) standardban, (C) humán

szérumban és (E) humán anyatejben. Ezt követően MALDI TOF/TOF mérés eredményeként

megkaptuk ezek fragmenseit és azok aminosav szekvenciáját (B, D, F)

IV.4.1.2. PACAP-38-LI kimutatása anyatejből és emberi plazmából RIA módszerrel

A PACAP-38-LI pontosan és megbízhatóan mérhető humán plazmában, ugyanis

kismértékű eltéréseket tapasztaltunk egészséges önkéntesek körében (mindkét nem, 20-40 év

közötti életkor). Vizsgálataink szerint az életkor, a nem és nők esetében a hormonális ciklus sem

befolyásolja a PACAP-38-LI plazmaszintjét (adatok nincsenek feltüntetve). Kismamák körében

végzett méréseink azt igazolták, hogy szoptatás alatt a plazmában a PACAP-38-LI kismértékben,

de szignifikánsan megemelkedik egészséges önkéntesekhez viszonyítva (24. ábra).

Page 57: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

57

0

200

400

600

800

3500

4000

4500

anyatejplazmák

PA

CA

P-3

8-L

I (f

mo

l/m

l)

Egészséges önkéntesek plazmája

Szoptatós kismamák plazmája

Anyatej savó

*

24. ábra: PACAP-38 kimutatása humán plazmában és anyatejben

RIA módszerrel

(átlag±SEM; *p<0,05 vs. egészséges önkéntesek n=19; ###

p<0,001 vs. kismamák

plazmája n=31; kétmintás és egymintás Student-féle t-teszt)

A plazma mintákhoz hasonlóan érzékeny és specifikus RIA módszert alkalmaztunk az

anyatejben lévő PACAP-38-LI meghatározásához is. Ebben a vizsgálatban a szoptatós kismamák

plazmájában és anyatejében lévő PACAP-38-LI szinteket hasonlítottuk össze. Látható, hogy az

anyatejben rendkívüli módon, akár 20-szorosára is megemelkedett a peptidkoncentráció a

plazmához képest. A PACAP-38-LI-t azonban sem a szoptatás időtartama (újszülött életkora),

sem a gyakorisága nem befolyásolta az első 6 hónapos periódus alatt (adatok nincsenek

feltüntetve).

Terhes kismamák körében végzett vizsgálataink eredményéből látható, hogy a plazmában

a PACAP-38-LI a terhesség második és harmadik trimeszterében enyhén, de szignifikánsan

megemelkedik az egészséges önkéntesekhez és a terhesség első trimeszteréhez képest. Ezzel

ellentétben szülés alatt szignifikánsan, több mint 70%-kal, csökken a plazma PACAP-38-LI-a.

Méréseinkből az is tisztán látszik, hogy a szülést követő harmadik napra a vér PACAP-38

koncentrációja a normál tartományba tér vissza (25. ábra).

Page 58: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

58

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

**

**

szülés után

(1-3 nap)

szülés

alatt1. 2. 3.

trimeszter

egészséges

önkéntesek

PA

CA

P-L

I (f

mol/m

l p

lazm

a)

25. ábra: PACAP-38-szerű immunreaktivitás (PACAP-LI) változása

a terhesség, szülés és szoptatás során Az oszlopok a következő csoportok plazmájában mért PACAP-LI értékek átlag±SEM

adatait mutatják: egészséges, reproduktív korban lévő nők (n=18), várandós kismamák

(n=12), kismamák szülés alatt és után 1-3 nappal (n=10) (*p<0,05 és **p<0,01 vs.

egészséges önkéntesek n=18, kétmintás Student-féle t-teszt)

Három napos újszülöttekben a perifériás vér PACAP-38 koncentrációja megegyezik az

egészséges felnőttekben mért szinttel. Ezzel ellentétben azokban a mintákban, melyeket

közvetlenül szülés után vettünk a vena és arteria umbilicalisból, jelentősen alacsonyabb PACAP-

38-LI-t mértünk.

A köldökvénában szignifikánsan alacsonyabb volt a peptidkoncentráció, mint

köldökartériában (26. ábra).

Page 59: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

59

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

#

**

**

vena

umbilicalis

arteria

umbilicalis

újszülött

perifériás vér

PA

CA

P-3

8-L

I

26. ábra: PACAP-38-LI újszülött perifériás vérben, a.

umbilicalisban és v. umbilicalisban

(n=10, átlag±SEM; **p<0,01 vs. perifériás vér, kétmintás Student-féle t-

teszt; #p<0,05 vs. a. umbilicalis, egymintás Student-féle t-teszt)

IV.4.2. PACAP-38 kimutatása kérődző állatfajokban

EREDETI KÖZLEMÉNY: Czeglédi L, Tamás A, Börzsei R, Bagoly T, Kiss P, Horváth G, Brubel

R, Németh J, Szalontai B, Szabadfi K, Jávor A, Reglődi D, Helyes Zs. J.: Presence of pituitary

adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in the plasma and milk of ruminant animals.

Comp Endocrinol. 172(1):115-119, 2011.

IV.4.2.1. PACAP-38 kimutatása RIA módszerrel kérődző állatok plazmájában és tejében

Mivel anyatejben ilyen jelentős PACAP-38-LI emelkedést tapasztaltunk, megvizsgáltuk,

hogy kérődző állatok esetén (juh, kecske, tehén) milyen eltéréseket találunk. Humán

eredményeinkhez hasonlóan juhok és kecskék tejsavójában mért peptidkoncentráció jelentősen,

10-szer magasabb volt, mint ugyanezen állatok plazmájában. A mintákat az ellést követő 3

hónapos laktációs periódusban gyűjtöttük, és ezalatt az idő alatt a PACAP-38-LI-ben nem volt

szignifikáns eltérés (27. ábra).

Page 60: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

60

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000******

***

***

***

***

PA

CA

P-L

I (f

mo

l/m

l) Plazma

Tej

7 30 90

JuhKecske

7 30 90

27. ábra: PACAP-38-LI mérése RIA módszerrel kecske és juh

mintákban (plazma és tej) az ellést követő hetedik, harmincadik

és kilencvenedik napon (n=8-10 állat/csoport, átlag±SEM, ***p<0,001 vs. plazma, egymintás Student-

féle t-teszt)

Tehéntejben ugyancsak megtalálható a PACAP-38, melyet RIA módszerrel

bizonyítottunk. A peptid szérum/tej aránya hasonló volt, mint a másik két kérődző állatfaj esetén.

Mivel fajtól függetlenül (kecske, juh, humán minták) a laktációs periódus hossza nem

befolyásolta a peptidszinteket, ebben a modellben nem vizsgáltuk a PACAP-38 szintjének

változását a laktációs periódus függvényében (28. ábra).

Page 61: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

61

28. ábra: PACAP-LI tehén plazmában és tejben (n=8-10 állat/csoport, átlag±SEM, ***p<0,001 vs. plazma,

egymintás Student-féle t-teszt)

IV.4.2.2. PACAP-38-LI meghatározása homgenizált juh tőgy biopsziából

Az emlőmirigyekből vett mintákat homogenizáltuk és RIA módszerrel meghatároztuk a

szövetek PACAP-38 koncentrációját. Azt találtuk, hogy ellés után hét nappal a mirigyekben mért

PACAP-38-LI 21,07±3,39 fmol volt 1 mg nedves szövetre vonatkoztatva. A 30. napra a

peptidkoncentráció 12,92±4,07 fmol/mg-ra csökkent, ám ez nem bizonyult statisztikailag

szignifikánsnak a nagy szórás miatt (29. ábra).

Plazma

Tej

Plazma Plazma

Page 62: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

62

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

ellés után

30 nappal

Szö

ve

ti P

AC

AP

-LI (f

mo

l/m

l)

ellés után

7 nappal

29. ábra: PACAP-38-LI kimutatása RIA módszerrel

homogenizált juh tőgymintából az ellést követő hetedik és

harmincadik napon (n=4 állat/csoport, átlag±SEM)

IV.4.2.3. PAC1 receptor immunlokalizációja juh emlőmirigyben

Az immunfestés eredményeként egyértelműen látszik, hogy az ellést követő hetedik és

harmincadik napon is megtalálható a PACAP-specifikus PAC1 receptor a laktáló juhok

emlőmirigyének hámsejtjein. Primér antitest nélkül festett negatív kontrollok (n=10) nem

mutattak specifikus immunpozitivitást (30/A ábra).

A jelölés segítségével az látható, hogy a mirigy hámsejtjei jelentős és intenzív PAC1

receptor immunpozitivitást mutatnak, különösen a sejtmembránban, de a citoplazmában is

detektálható a szemcsés festődés (30/B-D ábra). Ezzel ellentétben az interlobuláris

kötőszövetben és a kivezetőcsövekben nem kimutatható a receptor (30/C ábra).

Page 63: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

63

30. ábra: PAC1 receptorok immunlokalizációja laktáló juh

emlőmirigyben A. primér antitest nélküli negatív kontroll; B, C: 7 nappal ellés után; D: 30 nappal

ellés után; mérték-szakaszok hossza: 50 m az A, C, D ábrán és 20 m a B ábrán)

hámsejtek

kivezetőcsövek

Page 64: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

64

V. MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK

Munkánk gyakorlati jelentőségét hangsúlyozza az a tény, hogy a tachykininek és a CGRP,

valamint az általuk közvetített neurogén gyulladásos komponensek számos krónikus gyulladásos

betegség, mint pl. az asztma, a rheumatoid arthritis vagy a pszoriázis patomechanizmusában

fontos szerepet játszanak. E proinflammatorikus szenzoros neuropeptideknek a neurogén

gyulladás közvetítésén kívül mind a periférián, mind a gerincvelőben nagy jelentőségük van a

nociceptív folyamatokban is, elsősorban neuropátiás állapotokban (Helyes és mtsai. 2003, 2009).

Jelenleg egyetlen olyan gyulladáscsökkentő gyógyszer sincs, amelyik a neurogén komponenst

megbízhatóan tudná gátolni és nem létezik olyan analgetikum, amely közvetlenül az érzőideg-

végződéseken hatna (Helyes és mtsai. 2003; Szolcsányi 2004). Bár a kapszaicin-érzékeny

afferensek izgatásának következtében kialakuló szisztémás gyulladásgátló és

antinociceptív/antihiperalgetikus hatásokban a belőlük felszabaduló szomatosztatin szerepét több

oldalról bizonyítottuk, egyéb gátló hatású szenzoros neuropeptidek hasonló hatásainak felderítése

is szükséges.

V.1. LIPID RAFTOK SZEREPE A TRPV1 RECEPTOR AKTIVÁCIÓJÁBAN

A lipid raftok TRPV1 receptor aktivációjára kifejtett szerepének vizsgálatakor érdekes

megfigyelés volt, hogy a kontroll kísérletekben a kapszaicin és az RTX eltérő dinamikával

rendelkező CGRP-felszabadulást eredményezett: a kapszaicin a stimulált, míg az RTX a

stimuláció utáni 8 perces frakcióban váltotta ki a maximális peptidkiáramlást. Ez a két agonista

esetében a receptor-aktiváció eltérő időtartamával magyarázható. A koleszterin depléció TRPV1

receptor működésére gyakorolt hatását a kapszaicin-érzékeny szenzoros idegvégződésekből

felszabaduló neuropeptidek mérésével vizsgáltuk izolált patkány tracheán in vitro. Eredményeink

egybevágnak más kutatók eredményeivel, melyek szerint a koleszterin depléció és ezáltal a lipid

raftok károsítása jelentős csökkenést vált ki a kapszaicin által létrehozott TRPV1 receptor

aktivációban (Liu és mtsai. 2006). Eredményeink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a

TRPV1 receptorok koleszterin gazdag mikrodoménekben helyezkednek el a plazma

membránban, és ezen mikrodomének integritása elengedhetetlen a receptor működésében. Így

egy újabb kísérleti módszer segítségével sikerült alátámasztanunk azt a korábbiakban más

kutatócsoportok által is felvetett nézetet, miszerint a TRPV1 receptorok a lipid raftokban

foglalnak helyet. Mindkét TRPV1 receptor agonistával kiváltott felszabadulást szignifikánsan

Page 65: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

65

csökkentette a koleszterin-depléció, de koncentráció-hatás összefüggést nem találtunk. Mind a

kapszaicin, mind az RTX esetében csak a 100 M MCD koncentráció okozott szignifikáns gátló

hatást. Egy másik kísérleti elrendezésünkben, amelyben izolált patkány trigeminus

ganglionsejteken lévő natív TRPV1 receptorokat vizsgáltunk, megfigyeltük, hogy mind az RTX-

szel, mind a kapszaicinnel kiváltott kalcium-beáramlásban ugyancsak szignifikáns gátló hatása

volt az MCD kezelésnek. A koleszterin depléció és a lipid raftok integritásának megbomlása

tehát nemcsak az érzőneuronok perifériás végződésein, hanem a sejttesten is szignifikánsan

gátolja a TRPV1 kémiai aktivációját (Szőke és mtsai. 2010).

Kísérletsorozatunkban megfigyeltük, hogy mind a kapszaicin, mind az RTX által kiváltott

CGRP felszabadulást gátolta a 100 M koncentrációban alkalmazott MCD előkezelés. Ezzel

szemben a kisebb, illetve a nagyobb koncentrációk érdekes módon már nem befolyásolták a

neuropeptid felszabadulást. A CGRP felszabadulás kinetikája eltérő volt a kapszaicin és az RTX

indukálta receptor aktiváció során. Azon megfigyelésünk, miszerint az RTX alkalmazásakor az

ingerlés utáni frakcióban mért CGRP mennyiség nagyobb volt, mint a stimuláció alattiban,

szintén megerősítheti a feltevést, miszerint az RTX és a kapszaicin a TRPV1 receptoron más-más

helyhez kötődve fejti ki hatását.

V.2. EM-1 HATÁSA AZ ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEKBŐL FELSZABADULÓ SZENZOROS NEUROPEPTIDEKRE IN VITRO VALAMINT NEUROGÉN ÉS NEM-NEUROGÉN GYULLADÁSOS FOLYAMATOKRA IN VIVO

Eredményeink elsőként igazolták, hogy az endogén -opioid receptor agonista

endomorfin-1 (5-2000 nM) a szomatosztatinhoz/sst4 agonistákhoz és a PACAP-hoz hasonlóan

ugyancsak képes szignifikánsan, koncentráció-függő módon csökkenteni a szenzoros

neuropeptidek felszabadulását a kapszaicin-érzékeny idegvégződésekből (Helyes és mtsai. 1997;

Helyes és mtsai. 2001; Németh és mtsai. 2006). Elektromos téringerléssel kiváltott neuropeptid

felszabadulást 1 M tetrodotoxinnal valamint 25 mM lidokainnal gátoltak (Birmingham és

Wilson 1963; Coburn és Tomita 1973; Szolcsányi és Barthó 1982), mely igazolja, hogy

szelektíven az idegelemeken expresszálódó feszültség-függő gyors Na+ csatornák aktivációja

felelős ezen neuropeptidek felszabadulásáért (Németh és mtsai. 2003). Annak ellenére, hogy

EM-1 jelenlétében nem tapasztaltunk szignifikánsan kisebb SP felszabadulást a kontroll csoport

középső, ingerelt frakciójához képest, az elektromos téringerlés nem eredményezett jelentős

neuropeptid felszabadulást a bazális koncentrációhoz viszonyítva. Ezzel szemben az EM-1 100

Page 66: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

66

nM és 2000 nM koncentrációban jelentősen gátolta a CGRP felszabadulást, és a bazális, ingerlés

előtti frakcióhoz viszonyítva még a legkisebb, 20 nM-os koncentráció hatására sem alakult ki

szignifikáns neuropeptid felszabadulás. A különbség, mely az EM-1 SP-re és CGRP-re gyakorolt

gátló hatásában megnyilvánul azzal magyarázható, hogy a szenzoros idegvégződésekben a

neuropeptidek ko-lokalizációja nem teljesen egyforma. Számos kísérleti eredmény számol be

arról, hogy a szenzoros ganglionokban a neuronok jelentős része csak CGRP-t tartalmaz (Ju és

mtsai. 1987). Nem áll rendelkezésünkre adat arra vonatkozólag, hogy a különböző neuronális

elemeken a -opioid receptorok milyen eloszlást mutatnak, de vizsgálataink azt jelzik, hogy a

receptorok nagyobb számban találhatók meg azon idegvégződéseken, melyek csak CGRP-t

tartalmaznak.

A maximális gátló hatás a SP és a CGRP estében is 80-85%, az EC50 érték pedig nagyon

alacsony, nanomólos koncentrációtartományban volt. Az EM-1 100 nM-os koncentrációja

80,1%-os gátlást fejtett ki a SP és 82,3%-ost a CGRP felszabadulásra, míg ugyanez a nociceptin

koncentráció csak 63,1%-os és 44,1%-os csökkenést eredményezett (Helyes és mtsai. 1997), az

EM-1 tehát a nociceptinnél hatékonyabbnak bizonyult.

Az EM-1 akut neurogén gyulladást gátló hatásait patkányban és egérben ugyancsak

sikerült igazolnunk in vivo. Érdemes kihangsúlyozni, hogy 10 napig történő, ismételt adás után

sem csökkent ez a hatás az egyszeri alkalmazáskor tapasztalttal összehasonlítva, tehát ebben a

modellben az EM-1 tartós alkalmazása nem okoz toleranciát. Mindkét fajban a mustárolajjal

kiváltott neurogén gyulladást gátló hatás maximuma 55-60%, az ED50 megközelítőleg az 1 g/kg

i.p. dózis volt. Mivel ugyanazok a patológiai folyamatok állnak mind az egér fülön kiváltott

ödéma, mind a patkány bőrön indukált plazmaprotein-kiáramlás hátterében, ezért két rágcsáló

fajon végzett, ám egyenértékű neurogén gyulladásos modellnek tekinthetők. Az egérfülduzzadás

mérése gyors, megbízható, technikailag egyszerű és széles körben használt neurogén gyulladásos

modell, mely jól reprodukálható eredményeket biztosít és kismértékű hibalehetőséggel jár (Inoue

és mtsai. 1997; Gabor 2003; Bánvölgyi és mtsai. 2004; Helyes és mtsai. 2006). Patkány esetén a

fülduzzadás mérése nem alkalmazható a fül nagy mérete miatt, de a lábháti bőrön mustárolajjal

kiváltott plazmaprotein-kiáramlást Evans-kék akkumulációs módszerrel rutinszerűen használják

mint tisztán neurogén gyulladásos modellt (Donnerer és mtsai. 1991; Amann és mtsai. 2000;

Helyes és mtsai. 1997, 2001). A mustárolaj 5%-os koncentráció alatt hízósejtkiáramlás nélküli

(Inoue és mtsai. 1997; Szolcsányi és mtsai. 1998b), tiszta neurogén gyulladást okoz azáltal, hogy

szelektíven a kapszaicin érzékeny szenzoros idegvégződéseket stimulálja (Jancsó és mtsai. 1967).

Az EM-1 gyulladásgátló hatásában feltételezett prejunkcionális mechanizmusokra (Khalil

és mtsai. 1999), vagyis az érzőideg-végződéseken történő gátló hatásra, eredményeink

Page 67: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

67

egyértelmű, közvetlen bizonyítékokat szolgáltattak. Mivel a naloxon mindhárom modellben

kivédte az EM-1 gátló hatásait, e tetrapeptid ismert -opioid receptor agonista hatása (Fischer és

Undem 1999; Patel 1999; Lippl és mtsai. 2001; Fichna és mtsai. 2007) jól magyarázza

eredményeinket, más, nem specifikus mechanizmusok nem játszanak benne szerepet.

Vizsgálataink tehát bizonyították, hogy a szenzoros idegvégződéseken lévő -opioid receptorok

aktivációja felelős -legalábbis részben- az EM-1 neurogén gyulladást csökkentő hatásaiért, amit

SP és CGRP felszabadulás gátlásával ér el.

Korábbi adataink alapján ismert, hogy a mustárolaj az alkalmazását követően 6 órával

granulociták beáramlását is kiváltja, ebben a késői gyulladásos reakcióban azonban nem-

neurogén, szenzoros neuropeptidektől független mechanizmusok játszanak szerepet (Bánvölgyi

és mtsai. 2004). Az EM-1 hatékony ödémagátló hatásával ellentétben nem csökkentette a

mustárolajjal kiváltott gyulladás késői, sejtes fázisát, a granulocitákra tehát nincs hatása. Számos

mechanizmust részletesen leírtak, amelyekkel perifériás gyulladásos körülmények között az

opioidok hatásai fokozódnak. A primér szenzoros neuronok perifériás végződésein az opioid

receptorok száma megnövekszik (Zhang és mtsai. 1998; Pol és Puig 2004), fokozódik az opioid

receptorok Gi-protein aktiváló képessége, amely csökkenő intracelluláris cAMP-koncentrációhoz

vezet (Zöllner és mtsai. 2003). Fokozódik továbbá az opioid peptidek felszabadulása a gyulladt

területre beáramló gyulladásos és immunsejtekből (Stein és mtsai. 1990; Stein és Yassouridis

1997; Stein és mtsai. 2001; Machelska és mtsai. 2002; Mousa és mtsai. 2002). A gyulladásos

stimulusok serkentik a -opioid receptorok szintézisét a primér szenzoros neuronok sejttestjeiben

a hátsó gyöki ganglionokban, valamint fokozódik e receptorok perifériás végződés felé történő

axonális transzportja (Stein és mtsai. 1990; Cain és mtsai. 1997; Stein és Yassouridis 1997; Stein

és mtsai. 2001; Mousa és mtsai. 2002; Nagakura és mtsai. 2003; Puehler és mtsai. 2004). E

folyamatok következtében megnövekedik a opioid receptorok expressziója a perifériás

érzőideg-végződéseken, ami jelentős szerepet játszik a gyulladásos körülmények között nagy

mennyiségben -elsősorban a leukocitákból- felszabaduló opioid peptidek fokozott endogén

analgetikus és gyulladásgátló hatásaiban, de az exogén opioid receptor agonisták terápiás

hatásaiban is (Mousa és mtsai. 2002; Ballet és mtsai. 2003; Puehler és mtsai. 2004; Shaqura és

mtsai. 2004). A -opioid receptorok perifériás idegvégződéseken történő stimulációja tehát

ugyancsak ígéretes új perspektívákat jelenthet a neurogén gyulladás gátlására tolerancia

kialakulásának veszélye nélkül.

Page 68: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

68

V.3. PACAP1-38 ÉS PACAP6-38 HATÁSAINAK VIZSGÁLATA KAPSZAICINNEL, ÉS ELEKTROMOS TÉRINGERLÉSSEL KIVÁLTOTT SZENZOROS NEUROPEPTID FELSZABADULÁSRA IZOLÁLT PATKÁNY TRACHEÁN

Bár a PACAP jelenlétét kimutatták a kapszaicin-érzékeny neuronokban (Moller és mtsai.

1993; Mulder és mtsai. 1994), a mi korábbi eredményeink az elsők arra vonatkozóan, hogy a

PACAP-38 felszabadul a patkány légutakat beidegző afferensekből mind alacsony koncentrációjú

(10-6

M) kapszaicin, mind elektromos téringerlés hatására (Helyes és mtsai. 2007). A PACAP

más szenzoros neuropeptidek felszabadulását gátló hatásának leírását ugyancsak úttörő

eredménynek tekinthetjük. Az izolált trachea preparátumon nyert adataink közvetlen bizonyítékot

szolgáltattak arra, hogy a PACAP-38 koncentráció-függő módon csökkenti a SP, CGRP és SOM

kiáramlását, a maximális gátlás 70-90%. A PACAP-38 EC50 értéke 20-90 nM között volt, ami az

sst4 agonisták hatáserősségéhez hasonló (Helyes és mtsai. 1997; Helyes és mtsai. 2001). Az

általunk bizonyított SP és CGRP felszabadulást gátló mechanizmus jól magyarázza azokat az

adatokat, hogy a PACAP a trachea és a bronchusok területén simaizom relaxációt okoz (Foda és

mtsai. 1995; Shigyo és mtsai. 1998), gátolja a nyáktermelést és a plazmafehérje-kiáramlást

(Shigyo és mtsai. 1998; Khawaja és mtsai. 1999).

A PACAP6-38-ról több vizsgálat is igazolta (Racz és mtsai. 2006; Laburthe és mtsai.

2007; Monagham és mtsai. 2008), hogy PAC1/VPAC2 receptor antagonista. Azonban már több

közleményben felmerült a parciális agonista lehetősége is: Chen és munkatársai (2005) leírták,

hogy a PACAP1-27 és a PACAP6-27 önmagában adva is képes enyhe hasnyálmirigy gyulladást

kiváltani, ám a PACAP6-27 növeli a PACAP1-27 hatását ceruleinnel kiváltott akut pancreatitis

modellben. Viselkedési tesztben igazolták, hogy újszülött patkányok PACAP1-38-cal és

PACAP6-38-cal történő hosszútávú kezelése ugyanazon mechanizmussal változtatja meg a

felderítő viselkedési mintázatot (Kiss és mtsai. 2007). Egy másik vizsgálat szerint a PACAP6-38

ugyanolyan hatású fagocitózis esetén, mint a PACAP1-38 (Ichinose és mtsai. 1995). Kísérleteink

elsőként mutattak rá a PACAP6-38 agonista hatására, melyet izolált patkány tracheán szenzoros

neuropeptidek felszabadulására gyakorolt in vitro. A PACAP1-38-hoz hasonlóan a PACAP6-38

önmagában is szignifikánsan gátolta mind a kémiai, mind az elektromos téringerléssel kiváltott

szenzoros neuropeptid felszabadulást. A kapszaicin szelektíven az idegvégződéseken lévő

TRPV1 receptorokat aktiválja, míg az általunk alkalmazott elektromos téringerlés igazoltan a

gyors Na+ csatornákat nyitja meg, melyek specifikusan a peptiderg afferenseken expresszálódnak

(Szolcsányi és Barthó 1982). Ebből következően biztosak lehetünk benne, hogy az alkalmazott

ingerlési paraméterekkel szelektíven a tracheában lévő kapszaicin-érzékeny szenzoros rostokat

stimuláljuk. 2000 nM-os koncentrációban alkalmazott PACAP1-38 és PACAP6-38 közül a

Page 69: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

69

PACAP6-38 által kifejtett gátló hatás kisebb mértékű volt a legtöbb esetben, amiből arra

következtethetünk, hogy a fragmentum parciális agonista. Ugyanakkor a két peptid együttes

adása nagyobb gátló hatást eredményezett a kapszaicin ingerléssel kiváltott szomatosztatin, és az

elektromos téringerléssel kiváltott SP felszabadulásra, mint amikor a PACAP1-38-at önmagában

alkalmaztuk. Mindez azonban nem támasztja alá, hogy a PACAP6-38 parciális agonista lenne.

Azt mondhatjuk tehát, hogy ebben a modellben a PACAP6-38 tiszta agonistaként viselkedik.

Korábbi közlemények és jelen eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a PACAP6-38

hatása szövet-és célsejt specifikus.

V.4. PACAP-38-LI KIMUTATÁSA EMBERI ÉS KÉRŐDZŐ ÁLLATOK PLAZMA- ÉS TEJMINTÁIBAN

Eredményeink elsőként igazolták, hogy a PACAP-38 jelen van az emberi plazmában és

koncentrációja, melyet specifikusan mértünk RIA módszerrel, 20-40 év közötti egészséges

önkéntesek körében viszonylag állandó. Az életkor, a nem, a táplálkozás vagy nők esetében a

hormonális ciklus változásai nem befolyásolják a plazma PACAP-38 szintjét. Ugyanakkor

mérsékelt, de szignifikáns koncentráció-emelkedést tapasztaltunk olyan kismamák szérumában,

akiknek 1-6 hónapos gyermekeik voltak. Nem ismert, hogy a PACAP honnan kerül pontosan a

plazmába, de nagy valószínűséggel idegi és/vagy endokrin eredetű. Előzőleg igazoltuk már, hogy

a kapszaicin-érzékeny rostok szisztémás in vivo stimulációja következében a PACAP-38

koncentrációja szignifikánsan megemelkedik a keringésben (Helyes és mtsai. 2007).

Elsőként igazoltuk, hogy a PACAP-38 ilyen magas koncentrációban megtalálható az

emberi anyatejben, és koncentrációja 5-20-szor magasabb tej savóban, mint ugyanezen egyének

plazma mintáiban.

Vizsgálataink kimutatták továbbá, hogy a PACAP-38 kérődző állatok tejében is

megtalálható az emberi anyatejhez hasonló koncentrációban. Szignifikánsan magasabb

peptidszinteket mértünk juhok és kecskék tejében, mint tehéntejben. Továbbá, az emberben mért

adatokhoz hasonlóan a tejben mért PACAP-38 koncentráció 5-20-szor magasabb, mint

ugyanazon állatok plazmájában. Az, hogy a tehéntej kevesebb PACAP-38 peptidet tartalmaz,

összhangban van azokkal a vizsgálatokkal, melyek kimutatták, hogy a tehéntej kisebb

mennyiségű növekedési faktort tartalmaz, mint a kecsketej vagy akár az ember anyateje (Wu és

mtsai. 2005).

A tej különböző hormonokat, növekedési faktorokat, peptideket tartalmaz, mint a

bombesin, az YY peptid, a neurotenzin, a gasztrin, a kolecisztokinin és a peptid hisztidin

Page 70: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

70

metionin (Grosvernor és mtsai. 1992; Koldovszky 1996). A tejben található gasztrointesztinális

peptidek feltételezhetően szerepet játszanak a növekedés szabályozásában és az újszülöttek

gyomor-bél rendszerének érésében is (Berseth és mtsai 1990). Néhány növekedési faktor

nagyobb koncentrációban található az anyatejben, mint a plazmában. Ilyen például a

gonadotropin elválasztást serkentő hormon (GnRH), a thyreotrop hormon (TRH), a VIP, a

szomatosztatin, a növekedési hormon elválasztást serkentő hormon (GHRH), a relaxin, az

inzulinszerű növekedési faktor-1 (IGF-1), az epidermális növekedési faktor (EGF) és a

prosztaglandinok (Grosvernor és mtsai. 1992). Ezen bioaktív vegyületek valószínűleg szerepet

játszanak az emlőmirigyek növekedésében, a különböző tápanyagok szállításában valamint az

újszülött szöveteinek differenciálódásában és fejlődésében.

A PACAP anyatejben betöltött szerepéről egyenlőre csak feltételezéseink vannak. Az a

tény, hogy ilyen magas koncentrációban van jelen az anyatejben, arra utal, hogy a PACAP

elengedhetetlenül szükséges az újszülött egészséges növekedése és fejlődése szempontjából.

Kimutatták, hogy a PACAP fontos szerepet játszik a különböző szervek fejlődésében, különös

tekintettel az idegrendszerre (Vaudry és mtsai. 2000; Somogyvári-Vigh és Reglődi 2004). A

PACAP, mint neurotrofikus faktor befolyásolja az idegrendszer fejlődésének korai szakaszát, a

neurogenezist, majd a születés után az asztrocitogenezisre, mielinizálódásra, az agy fejlődésére és

a neuronális migrációra van nagy hatással. Az anyatej multifunkcionális összetevői védelmet

nyújtanak különböző patogénekkel szemben és serkentik a természetes immunmechanizmusok

kialakulását (Grosvernor és mtsai. 1992; Koldovsky 1996). A PACAP bizonyos immunmoduláns

hatással is rendelkezik, szabályozza az immunrendszer fejlődését, valamint a limfociták és

makrofágok érését (Ganea és Delgado 2002).

Az emlőmirigyek fejlődésében és növekedésében is fontos szerepet játszhat. A PACAP

antiapoptotikus és sejtciklus szabályozó hatásai régóta ismertek (Vaudry és mtsai. 2000;

Somogyvári-Vigh és Reglődi 2004). Az apoptózis komoly jelentőséggel bír a emlőmirigyek

fejlődésében (Green és Streuli 2004). A növekedési faktorok és antiapoptotikus molekulák

expressziója szabályozza a laktáció során az emlőmirigyek növekedését és fejlődését, majd az ezt

követő nagymértékű sejtpusztulásban az apoptózis jut komoly szerephez.

Felmerül a kérdés, hogy a tejből származó PACAP milyen orális biohasznosulással

rendelkezhet. A PACAP lebontásáért a dipeptidil peptidáz IV a felelős, mely a biológiailag aktív

peptidek féléletidejét döntően befolyásoló faktor (Bourgault és mtsai. 2008). Kimutatták, hogy a

PACAP és a hozzá hasonló peptidek féléletideje a testnedvekben viszonylag rövid, percekben

mérhető csupán (Bourgault és mtsai. 2008). Az emlőmirigyek termelnek proteáz inhibitorokat,

melyek a tejben lévő különböző fehérjék és peptidek stabilitásáért felelősek. Az újszülöttekben

Page 71: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

71

emellett a proteolitikus aktivitás kisebb mértékű, a dipeptidil peptidáz IV enzimük még éretlen, és

a bélhámsejtek makromolekulákkal szemben nagyobb permeábilitást mutatnak, ami lehetővé

teszi fehérjék és peptidek nagyobb arányú felszívódását (Grosvernor és mtsai. 1992).

Egészséges kismamák körében végzett vizsgálataink elsőként mutatták ki, hogy a

PACAP-38 plazmaszintje a terhesség második és harmadik trimeszterében folyamatosan

növekszik, a szülés alatt jelentősen csökkent, és a szülést követő harmadik napon újra normál

értékek mérhetők. Újszülöttekben a PACAP-38 koncentrációja a periférián hasonló, mint

felnőttekben, azonban az umbilicalis erekből nyert vér alacsonyabb PACAP koncertrációt

tartalmazott. A vena umbilicalisban szignifikánsan kevesebb PACAP volt mérhető, mint az

artériás oldalon. Ezen adatok alapján ugyan nem vonható le messzemenő következtetés a PACAP

fiziológiai folyamatokban betöltött szerepére vonatkozóan, azonban méréseink bizonyítják, hogy

az endogén PACAP szintek érzékenyen reagálnak olyan hormonális változásokra, mint a

terhesség, szülés, szoptatás. Érdekes az az eredmény, miszerint az arteria umbilicalisban mérhető

PACAP koncentráció magasabb, mint a vénában, ami arra utal, hogy a magzati szervekben aktív

peptidszintézis zajlik. A PACAP jelenléte a fejlődés nagyon korai szakaszában már kimutatható

egérben és zebrahalban is. PACAP hiányos egerekben igazolták, hogy a peptid hatással van

számos fejlődési folyamatra a kisagy fejlődésétől a viselkedési mintázatok kialakulásáig (Vaudry

és mtsai. 2009).

A PACAP egy pleiotropikus és többfunkciós neuropeptid, melyről ma már több

bizonyíték is rendelkezésre áll, hogy fontos szerepet játszik a női hormonháztartás

szabályozásában, tehát hatással van a terhességre, a fertilitásra ugyanúgy, mint a méhizomzat

kontraktilitására és ezáltal a keringésére is (Huang és Pan 1996; Steenstrup és mtsai. 1996; Lee és

mtsai. 1999; Murck és mtsai. 2007; Isaac és Sherwood 2008; Tohei és mtsai. 2009; Levy és

mtsai. 2010). A terhesség késői szakaszában (második trimeszter után) mért PACAP

koncentráció magasabb volt, ami azt mutatja, hogy a placentában és/vagy más anyai szervekben

az átlagosnál nagyobb mértékű peptidszintézis folyik. Mindez összhangban van azzal a

megállapítással, hogy a placenta PACAP tartalma a terhesség során folyamatosan növekszik

(Brubel és mtsai 2010). Ezen eredmények alapján feltételezhetjük, hogy a PACAP komoly

fiziológiai szerepet játszik a terhességben, de a különböző folyamatok és mechanizmusok

pontosabb megismeréséhez további vizsgálatok szükségesek.

Ma már számos kísérleti bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozólag, hogy a PACAP

fontos szabályozó faktor a terhesség során. Például PACAP hiányos egerekben csökkent a

fertilitás, ami főleg az elégtelen decidualizációnak köszönhető (Isaac és Sherwood 2008). Egy

másik vizsgálat kimutatta, hogy a PACAP mRNS átmenetileg expresszálódik a decidualizáció és

Page 72: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

72

a terhesség alatt az anyai föto-placentális egységben, amely az emlősök terhességében betöltött

szerepére utal (Spencer és mtsai. 2001). A peptid mindkét formája (PACAP-27 és PACAP-38)

relaxálja a méhizomzatban lévő artériákat (Steenstrup és mtsai. 1996). A PACAP utero-

placentális egységben betöltött vazokonstrikciót szabályozó szerepe magyarázatot adhat a szülés

során tapasztalt hirtelen PACAP szint csökkenésre.

Bár további vizsgálatok szükségesek ahhoz, hogy pontosan ismerjük a PACAP emberi

prenatális és postnatális fejlődésben betöltött funkcionális jelentőségét, jelen eredmények

alapvetően fontosak, hogy e területen további kutatások induljanak.

Page 73: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

73

VI. ÚJ EREDMÉNYEIM ÖSSZEFOGLALÁSA

1. Igazoltuk, hogy a TRPV1 receptorok koleszterin gazdag mikrodoménekben helyezkednek el az

érzőideg-végződések membránjában, és ezen mikrodomének integritása elengedhetetlen a

receptor aktivációjához.

2. Kimutattuk, hogy az endogén opioid peptid, az endomorfin-1, képes szignifikánsan

csökkenteni a szenzoros neuropeptidek kapszaicin-érzékeny afferensekből történő felszabadulását

és a neurogén mechanizmussal létrejövő akut plazmafehérje-kiáramlást. Ezzel szemben a

mustárolajjal kiváltott gyulladásos folyamat késői, nem-neurogén vaszkuláris és sejtes

komponenseire nincs hatása.

3. Bizonyítottuk, hogy a számos modellrendszerben PAC1/VPAC2 receptor antagonistaként

használt PACAP6-38 fragmentum bizonyos sejteken, jelen esetben az érzőideg-végződéseken a

PACAP1-38-hoz hasonlóan agonistaként viselkedik: koncentráció-függő peptidfelszabadulás-

gátlást eredményez. A PACAP6-38 által közvetített hatások tehát szövet és sejtspecifikusak.

Mivel a gátló hatás nem magyarázható a PACAP receptorainak eddig ismert Gs és Gq proteinhez

kapcsolt jelátviteli mechanizmusaival, egy jelenleg még nem azonosított receptor vagy splice

variáns jelenlétét valószínűsítjük az idegvégződéseken.

E mechanizmus további vizsgálata, a célmolekula azonosítása, és a jelátviteli folyamatok

analízise jövőbeli kísérleteink tárgyát képezi.

4. Elsőként mutattuk ki a PACAP-38 jelenlétét emberi és kérődző állatoktól származó plazmában

és anyatejben, valamint változásait terhesség és szülés alatt. Megállapítottuk, hogy a PACAP-38

plazma koncentrációja terhesség során fokozatosan növekszik az anyában, majd szülés alatt

jelentősen csökken és viszonylag gyorsan, három napon belül normalizálódik. Mind anyatejben,

mind kérődző állatok tejében 5-20-szor magasabb PACAP szinteket mértünk. Ezen érdekes

eredmények funkcionális jelentőségének felderítése, és annak eldöntése, hogy a PACAP milyen

szerepet játszik az újszülött fejlődésében, növekedésében, illetve az emlőállomány

proliferációjában és a tejtermelés folyamatában, további vizsgálatokat igényel.

Page 74: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

74

VII. IRODALOMJEGYZÉK

1. Abad C, Gomariz RP, Waschek JA (2006). Neuropeptide mimetics and antagonists in the

treatment of inflammatory disease: focus on VIP and PACAP. Curr. Top. Med. Chem. 6:

151-163.

2. Abad C, Martinez C, Leceta J, Gomariz RP, Delgado M (2001). Pituitary adenylate

cyclase-activating polypeptide inhibits collagen-induced arthritis: an experimental

immunomodulatory therapy. J. Immunol. 167: 3182-3189.

3. Amann R, Egger T, Schuligoi R (2000) The tachykinin NK1 receptor antagonist

SR140333 prevents the increase of nerve growth factor in rat paw skin induced by

substance P or neurogenic inflammation. Neuroscience 100:611–615.

4. Amara SG, Jonas V, Rosenfeld MG, Ong ES, Evans RM (1982). Alternative RNA

processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different

polypeptide products. Nature 298: 240-244.

5. Arimura A, Somogyvári-Vígh A, Miyata A, Mizuno K, Coy DH, Kitada C (1991). Tissue

distribution of PACAP as determined by RIA: Highly abundant in the rat brain and testes.

Endocrinology 129: 2787–2789.

6. Ballet S, Conrath M, Fischer J, Kaneko T, Hamon T, Cesselin F (2003). Expression and

G-protein coupling of mu-opioid receptors in the spinal cord and dorsal root ganglia of

polyarthritic rats. Neuropeptides 37: 211-219.

7. Bánvölgyi Á, Pozsgai G, Brain SD, Helyes Zs, Szolcsányi J, Ghosh M, Melegh B, Pintér

E (2004). Mustard oil induces a transient receptor potential vanilloid 1 receptor-

independent neurogenic inflammation and a non-neurogenic cellular inflammatory

component in mice. Neuroscience 125: 449-459.

8. Bari M, Battista N, Fezza F, Finazzi-Agrò A, Maccarrone M (2005). Lipid rafts control

signaling of type-1 cannabinoid receptors in neuronal cells: implications for anandamide-

induced apoptosis. J. Biol. Chem. 280, 12212-12220.

9. Barin AK, McDougall JJ (2003). Endomorphin-1 causes synovial hypoaemia in rat knee

joints via a capsaicin-sensitive neural pathway. Neurosci. Lett. 344: 21-24.

10. Barnes PJ (2001). Potential novel therapies for chronic obstructive pulmonary disease.

Novartis Found. Symp. 234: 255-267.

11. Barthó L, Szolcsányi J (1981). Opiate agonists inhibit neurogenic plasma extravasation in

the rat. Eur. J. Pharmacol. 73: 101-104.

Page 75: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

75

12. Berseth CL, Michener SR, Nordyke CK, Go VL (1990). Postpartum changes in pattern of

gastrointestinal regulatory peptides in human milk. Am. J. Clin. Nutr. 51, 985-990.

13. Bevan S, Szolcsányi J (1990). Sensory neuron-specific actions of capsaicin: mechanisms

and applications. Trends Pharmacol. Sci. 11: 330-333.

14. Birmingham AT, Wilson AB (1963). Preganglionic and postganglionic stimulation of the

guinea pig isolated vas deferens preparation. Br. J. Pharmacol. 21: 569-580.

15. Bourgault S, Vaudry D, Botia B, Couvineau A, Laburthe M, Vaudry H, Fournier A

(2008).Novel stable PACAP analogs with potent activity towards the PAC1 receptor.

Peptides 29: 919-32.

16. Brazeau P (1986). Somatostatin: a peptide with unexpected physiologic activities. Am. J.

Med. 81: 8-13.

17. Brubel R, Boronkai A, Reglődi D, Racz B, Nemeth J, Kiss P, Lubics A, Toth G, Horvath

G, Varga T, Szogyi D, Fonagy E, Farkas J, Barakonyi A, Bellyei S, Szereday L, Koppan

M, Tamas A (2010). Changes in the expression of pituitary adenylate cyclase activating

polypeptide in the human placenta during pregnancy and its effects on survival of JAR

choriocarcinoma cells. J. Mol. Neurosci. 42: 450-8.

18. Burger K (1999). A mennyiségi analízis alapjai: Kémiai és műszeres elemzés.

Semmelweis Kiadó, Budapest

19. Burger K, Gimpl G, Fahrenholz F (2000). Regulation of receptor function by cholesterol.

Cell. Mol. Life Sci. 11: 1577-92.

20. Cain CK, Francis JM, Plone MA, Emerich DF, Lindner MD (1997). Pain-related

disability and effects of chronic morphine in the adjuvant-induced arthritis model of

chronic pain. Physiol. Behav. 62: 199-205.

21. Campos ML, Casalino-Matsuda SM, Linares JA, Goldraij A (2000). Effects of morphine

and naloxone on glucose metabolism in uterine strips from ovariectomized and non-

ovariectomized restricted diet rats. Arch. Physiol. Biochem. 108: 422–428.

22. Cao T, Gerard NP, Brain SD (1999). Use of NK1 knockout mice to analyze substance P-

induced edema formation. Am. J.Physiol. 277: 476-481.

23. Cao T, Pintér E, Al-Rashed S, Gerard NP, Hoult R, Brain S (2000). Neurokinin-1 receptor

agonists are involved in mediating neutrophil accumulation in the inflamed, but not

normal, cutaneous microvasculature: an in vivo study using neurokinin-1 receptor

knockout mice. J. Immunol. 164: 5424-5429.

24. Cardell LO, Stjärne P, Wagstaff SJ, Agustí C, Nadel JA (1997). PACAP-induced plasma

extravasation in rat skin. Regul Pept. 71:67-71.

Page 76: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

76

25. Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D (1997). The

capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 389: 816-824.

26. Chen YD, Zhou ZG, Wang Z, Gao HK, Yan WW, Wang C, Zhao GP, Peng XH.. (2005).

Pituitary adenylate cyclase activating peptide and its receptor antagonist in development

of acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology 11: 538–544.

27. Chrubasik J (1991). Somatostatin and chronic pain management. In: Contemporary issues

in chronic pain management (ed: Parris WCV), pp. 87-96.

28. Chuang HH, Prescott ED, Kong H, Shields S, Jordt SE, Basbaum AI, Chao MV, Julius D

(2001). Bradykinin and nerve growth factor release the capsaicin receptor from

PtdIns(4,5)P2-mediated inhibition. Nature 411: 957-962.

29. Coburn RF, Tomita T (1973) Evidence for nonadrenergic inhibitory nerves in the guinea

pig trachealis muscle. Am. J. Physiol. 224: 1072–7080.

30. De Swert KO, Joos GF (2006). Extending the understanding of sensory neuropeptides.

Eur. J. Pharmacol. 533: 171-181.

31. Debreczeni L, Kovács LG (2008). Gyakorlati laboratóriumi medicina. Literatura Medica

Kiadó, Budapest

32. Delgado M (2009). Generating tolerogenic dendritic cells with neuropeptides. Hum.

Immunol. 70: 300-307.

33. Dickinson T, Fleetwood-Walker SM (1999). VIP and PACAP: very important in pain?

Trends Pharmacol. Sci. 20: 324-329.

34. Dickinson T, Mitchell R, Robberecht P, Fleetwood-Walker SM (1999). The role of

VIP/PACAP receptor subtypes in spinal somatosensory processing in rats with an

experimental peripheral mononeuropathy. Neuropharmacology 38: 167-180.

35. Donnerer J, Amann R, Lembeck F (1991). Neurogenic and non-neurogenic inflammation

in the rat paw following chemical sympathectomy. Neuroscience 45: 761–765.

36. Dun EC, Huang RL, Dun SL, Dun NJ (1996). Pituitary adenylate cyclase-activating

polypeptide-immunoreactivity in human spinal cord and dorsal root ganglia. Brain Res.

721: 233–237.

37. Edvinsson L, Fredholm BB, Hamel E, Jansen I, Verrecchia C (1985). Perivascular

peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine

monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the

cat. Neurosci. Lett. 58: 213-217.

Page 77: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

77

38. Fahrenkrug J, Hannibal J (1998). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide

immunoreactivity in capsaicin-sensitive nerve fibres supplying the rat urinary tract.

Neuroscience 83: 1261-1272.

39. Fichna J, Janecka A, Costentin J, Do Rego JC (2007). The endomorpin system and its

evolving neurophysiological role. Pharmacol. Rev. 59: 88-123.

40. Fioravanti A, Govoni M, La Montagna G, Perpignano G, Tirri G, Trotta F, Bogliolo A,

Ciocci A, Mauceri MT, Marcolongo R (1995). Somatostatin 14 and joint inflammation:

evidence for intraarticular efficacy of prolonged administration in rheumatoid arthritis.

Drugs Exp. Clin. Res. 21: 97-103.

41. Fischer A, Undem BJ (1999). Naloxone blocks endomorphin-1 but not endomorphin-2

induced inhibition of tachykinergic contractions of guinea-pig isolated bronchus. Br. J.

Pharmacol. 127: 605-608.

42. Foda HD, Sharaf HH, Absood A, Said SI (1995). Pituitary adenylate cyclase-activating

peptide (PACAP), a VIP-like peptide, has prolonged airway smooth muscle relaxant

activity. Peptides 16: 1057-1061.

43. Frossard N, Advenier C (1991). Tachykinin receptors and the airways. Life Sci. 49: 1941-

1953.

44. Gabor M (2003). Models of acute inflammation in the ear. Methods Mol. Biol. 225: 129–

137.

45. Ganea D, Delgado M. (2002). Vasoactive intestinal peptide (VIP) and pituitary adenylate

cyclase-activating polypeptide (PACAP) as modulators of both innate and adaptive

immunity. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 13: 229-237.

46. Gottschall PE, Tatsuno I, Miyata A, Arimura A (1990). Characterization and distribution

of binding sites for the hypothalamic peptide, pituitary adenylate cyclase-activating

polypeptide. Endocrinology 127: 272-277.

47. Grant A (2002). Leukocytes and neurogenic inflammation. Inflammopharmacology 9:

403-420.

48. Green KA, Streuli CH (2004). Apoptosis regulation in the mammary gland. Cell Mol Life

Sci. 61: 1867-1883.

49. Grosvernor CE, Picciano MF, Baumrucker CR (1992). Hormones and growth factors in

milk. Endocr. Rev. 14: 710-728.

50. Gunthorpe MJ, Benham CD, Randall A, Davis JB (2002). The diversity in the vanilloid

(TRPV) receptor family of ion channels. Trends Pharmacol. Sci. 23: 183-191.

Page 78: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

78

51. Hamelink C, Tjurmina O, Damadzic R, Young WS, Weihe E, Lee HW, Eiden LE (2002).

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is a sympathoadrenal neurotransmitter

involved in catecholamine regulation and glucohomeostasis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

99: 461-466.

52. Han SP, Naes L, Westfall TC (1990). Calcitonin gene-related peptide is the endogenous

mediator of nonadrenergic-noncholinergic vasodilation in rat mesentery. J. Pharm. Exp.

Ther. 255: 423-428.

53. Hannibal J, Ekblad E, Mulder H, Sundler F, Fahrenkrug J (1998). Pituitary adenylate

cyclase-activating polypeptide (PACAP) in the gastrointestinal tract of the rat: distribution

and effects of capsaicin or denervation. Cell Tissue Res. 291: 65–79.

54. Harmar AJ, Arimura A, Gozes I, Journot L, Laburthe M, Pisegna JR, Rawlings SR,

Robberecht P, Said SI, Sreedharan SP, Wank SA, Waschek JA (1998). International

Union of Pharmacology. XVIII. Nomenclature of receptors for vasoactive intestinal

peptide and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Pharmacol. Rev. 50: 265–

270.

55. Hayes P, Meadows HJ, Gunthorpe MH, Harries MH, Duckworth DM, Cairns W, Harrison

DC, Clarke CE, Ellington K, Prinjha RK, Barton AJ, Medhurst AD, Smith GD, Topp S,

Murdock P, Sanger GJ, Terrett J, Jenkins O, Benham CD, Randall AD, Gloger IS, Davis

JB (2000). Cloning and functional expression of a human orthologue of rat vanilloid

receptor-1. Pain 88: 205-215.

56. Hazal-Bayer MF, Hancock JF (2007). Lipid rafts and membrane traffic. FEBS Lett. 11:

2098-104.

57. Helyes Zs, Németh J, Pintér E, Szolcsányi J (1997). Inhibition by nociceptin of

neurogenic inflammation and the release of SP and CGRP from sensory nerve terminals.

Br. J. Pharmacol. 121: 613-615.

58. Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Kéri Gy, Thán M, Oroszi G, Horváth A, Szolcsányi J

(2001). Anti-inflammatory effect of synthetic somatostatin analogues in the rat. Br. J.

Pharmacol. 134: 1571-1579.

59. Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Sándor K, Elekes K, Szabó Á, Pozsgai G, Keszthelyi D,

Kereskai L, Engström M, Würster S, Szolcsányi J (2006). Effects of the somatostatin

receptor subtype 4 selective agonist J-2156 on sensory neuropeptide release and

inflammatory reactions in rodents. Br. J. Pharmacol. 149: 405-415.

Page 79: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

79

60. Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Szolcsányi J (2003). Pharmacological targets for the

inhibition of neurogenic inflammation. Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents in

Curr. Med. Chem. 2: 191-218.

61. Helyes Zs, Pintér E, Szolcsányi J (2009). Regulatory role of sensory neuropeptides in

inflammation. In: Neuropeptides and peptide analogs (eds.: Kovács M, Merchenthaler I),

pp. 111-141., Research Signpost, Kerala India.

62. Helyes Zs, Pozsgai G, Börzsei R, Németh J, Bagoly T, Márk L, Pintér E, Tóth G, Elekes

K, Szolcsányi J, Reglődi D (2007). Inhibitory effect of PACAP38 on acute neurogenic

and non-neurogenic inflammation in the rat. Peptides 28 1847-1855.

63. Helyes Zs, Szabó Á, Németh J, Jakab B, Pintér E, Bánvölgyi Á, Kereskai L, Kéri Gy,

Szolcsányi J (2004). Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released

from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic

arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50: 1677-1685.

64. Helyes Zs, Thán M, Oroszi G, Pintér E, Németh J, Kéri Gy, Szolcsányi J (2000). Anti-

nociceptive effect induced by somatostatin released from sensory nerve terminals and by

synthetic somatostatin analogues in the rat. Neurosci. Lett. 278: 185-188.

65. Hofland LJ, Lamberts SW (1996). Somatostatin receptors and disease: role of receptor

subtypes. Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. 10: 163-176.

66. Holzer P (1988). Local effector functions of capsaicin-sensitive sensory nerve endings:

involvement of tachykinins and other neuropeptides. Neuroscience 86: 389-98.

67. Holzer P (1991). Capsaicin: cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin

sensory neurons. Pharmacol. Rev. 43: 143-201.

68. Horváth G (2000). Endomorphin-1 and endomorphin-2: pharmacology of the selective

endogenous mu-opioid receptor agonists. Pharmacol. Ther. 88: 437-463.

69. Hoyer D, Bell GI, Berelowitz M, Epelbaum J, Feniuk W, Humphrey PP, O'Carroll AM,

Patel YC, Schonbrunn A, Taylor JE (1995). Classification and nomenclature of

somatostatin receptors. Trends Pharmacol. Sci. 16: 86-88.

70. Hőgyes A (1878). Beitrage zur physiologischen Wirkung der Bestandteile des Capsicum

annuum. Arch. Exp. Pathol. Pharmacol. 9: 117-130.

71. Huang SK, Pan JT (1996). Stimulatory effects of vasoactive intestinal peptide and

pituitary adenylate cyclase activating peptide on tuberonfundibular dopaminergic neuron

activity in estrogen treated ovariectomiyed rats and their correlation with prolactin

secretion. Neuroendocrinology 64: 208-214.

Page 80: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

80

72. Hughes SR, Brain SD (1994). Nitric oxide-dependent release of vasodilator quantities of

calcitonin gene-related peptide from capsaicin-sensitive nerves in rabbit skin. Br. J.

Pharmacol. 111: 425-430.

73. Ichinose M, Asai M, Imai K, Sawada M (1995). Enhancement of phagocytosis in mouse

macrophages by pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and related

peptides. Immunopharmacology 30: 217–224.

74. Inoue H, Asaka T, Nagata N, Koshihara Y (1997). Mechanism of mustard oil-induced

skin inflammation in mice. Eur. J. Pharmacol. 333: 231-240.

75. Isaac ER, Sherwood NM (2008). Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide

(PACAP) is important for embryo implantation in mice. Mol. Cell. Endocrinol. 280: 13-9.

76. Jakab B, Reglődi D, Józsa R, Hollósy T, Tamás A, Lubics A, Lengvári I, Oroszi G,

Szilvássy Z, Szolcsányi J, Németh J (2004). Distribution of PACAP-38 in the central

nervous system of various species determined by a novel radioimmunoassay. J Biochem

Biophys Methods. 61:189-98.

77. Jancsó N (1960). Role of nerve terminals in the mechanism of inflammatory reactions.

Bull. Millard Fillmore Hosp. Buffalo N.Y. 7: 53-77.

78. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J (1967). Direct evidence for neurogenic

inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br. J.

Pharmacol. Chemother. 31: 138-151.

79. Jessell TM, Iversen LL, Cuello AC (1978). Capsaicin-induced depletion of substance P

from primary sensory neurones. Brain Res. 152: 183-188.

80. Jessop DS (2006). Endomorphins as agents for the treatment of chronic inflammatory

disease. BioDrugs 20: 161-166.

81. Jessop DS, Richards LJ, Harbuz MS (2002). Opioid peptides endomorphin-1 and

endomorphin-2 in the immune system in humans and in a rodent model of inflammation.

Ann. NY Acad. Sci. 966: 456-463.

82. Jin S, Lei L, Wang Y, Da D, Zhao Z (1999). Endomorphin-1 reduces carrageenan-induced

fos expression in the rat spinal dorsal horn. Neuropeptides 33: 281-284.

83. Jordt SE, Bautista DM, Chuang HH, McKemy DD, Zygmunt PM, Hogestatt ED, Meng

ID, Julius D (2004). Mustard oil and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the

TRP channel ANKTM1. Nature 427: 260-265.

84. Ju G, Hökfelt T, Brodin E, Fahrenkrug J, Fischer JA, Frey P, Elde FP, Brown JC (1987).

Primary sensory neurons of the rat showing calcitonin gene-related peptide

immunoreactivity and their relation to substance P-, somatostatin-, galanin-, vasoactive

Page 81: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

81

intestinal polypeptide- and cholecystokinin-immunoreactive ganglion cells. Cell Tissue

Res. 247: 417–431.

85. Karalis K, Mastokaros G, Chrousos GP, Tolis G (1994). Somatostatin analogues suppress

the inflammatory reaction in vivo. J. Clin. Invest. 93: 2000-6.

86. Kato H, Ito A, Kawanokuchi J, Jin S, Mizuno T, Ojika K, Ueda R, Suzumura A (2004).

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) ameliorates experimental

autoimmune encephalomyelitis by suppressing the functions of antigen presenting cells.

Mult. Scler. 10: 651-659.

87. Khalil Z, Sanderson K, Modig M, Nyberg F (1999). Modulation of peripheral

inflammation by locally administered endomorphin-1. Inflamm. Res. 48: 550-556.

88. Khawaja AM, Liu Y, Rogers DF (1999). Effect of non-peptide tachykinin NK(1) receptor

antagonists on non-adrenergic, non-cholinergic neurogenic mucus secretion in ferret

trachea. Eur J Pharmacol. 384:173-81.

89. Kiss P, Hauser D, Tamás A, Horváth Z, Lengvári I, Reglődi D (2007). Effects of perinatal

PACAP and PACAP antagonist treatment on novelty-seeking behavior in adolescent rats.

Journal of Molecular Neuroscience 33: 340.

90. Kobayashi T, Takahashi M, Nagatsuka Y, Hirabayashi Y (2006). Lipid Rafts: New tools

and a new component. Biol. Pharm. Bull. 29: 1526-1531.

91. Koldovsky O (1996). The potential physiological significance of milk-borne hormonally

active substances for the neonate. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 1: 317-323.

92. Krantic S, Goddard I, Saveanu A, Giannetti N, Fombonne J, Cardoso A, Jaquet P,

Enjalbert A. (2004). Novel modalities of somatostatin actions. Eur. J. Endocrinol. 151:

643-655.

93. Laburthe M, Couvineau A, Tan V (2007). Class II G-protein-coupled receptors for VIP

and PACAP: structure, models of activation and pharmacology. Peptides 28: 1631-1639.

94. Lam HC, Takahashi K, Ghatei MA, Kanze SM, Polak JM, Bloom SR (1990). Binding

sites of a novel neuropeptide pituitary-adenylate-cyclase-activating polypeptide in the rat

brain and lung. Eur. J. Biochem. 193: 725–729.

95. Lee J, Park HJ, Choi HS, Kwon HB, Arimura A, Lee BJ, Choi WS, Chun SY (1999).

Gonadotropin stimulation of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP)

messenger ribonucleic acid in the rat ovary and the role of PACAP as a follicle survival

factor. Endocrinology 140: 818-26.

Page 82: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

82

96. Lembeck F, Donnerer J, Barthó L (1982). Inhibition of neurogenic vasodilation and

plasma extravasation by substance P antagonists, somatostatin and [D-Met2, Pro

5]-

enkephalinamide. Eur. J. Pharmacol. 85: 171-176.

97. Lembeck F, Holzer P (1979). Substance P as neurogenic mediator of antidromic

vasodilation and neurogenic plasma extravasation. Naunyn Schmiedebergs Arch.

Pharmacol. 310: 175-183.

98. Levy G, Goldberg D, Jackson K, Degani G. (2010.) Association between pituitary

adenylate cyclase activating polypeptide and reproduction in the blue gourami. Gen.

Comp. Endocrinol. 166: 83-93.

99. Lippl F, Schusdziarra V, Allescher HD (2001). Effect of endomorphin on somatostatin

secretion in the isolated perfused rat stomach. Neuropeptides 35: 303-309.

100. Liu M, Huang W, Wu D, Priestley JV (2006). TRPV1, but not P2X3, requires cholesterol

for its function and membrane expression in rat nociceptors. Eur. J. of Neurosci. 24: 1-6.

101. Lockwich TP, Liu X, Singh BB, Jadlowiec J, Weiland S, Ambudkar IS, (2000). Assembly

of TRP1 in a signaling complex associated with caveolin scaffolding lipid raft domains. J.

Biol. Chem. 275: 11934-11942.

102. Machelska H, Mousa SA, Brack A, Schopohl JK, Rittner HL, Schafer M, Stein C (2002).

Opioid control of inflammatory pain regulated by intracellular adhesion molecule-1. J.

Neurosci. 22: 5588-5596.

103. Maggi CA (1995). Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-

transmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Prog. Neurobiol. 45: 1-

98.

104. Maggi CA, Meli A (1988). The sensory-efferent function of capsaicin-sensitive sensory

neurons. Gen. Pharmacol. 19: 1-43.

105. Martin-Schild S, Zadina JE, Gerall AA, Vigh S, Kastin AJ (1997). Localization of

endomorphin-2-like immunoreactivity in the rat medulla and spinal cord. Peptides 18:

1641-1649.

106. Massi M, Panocka I, de Garo G (2000). The psychopharmacology of tachykinin NK-3

receptors in laboratory animals. Peptides 21: 1597-1609.

107. May V, Beaudet MM, Parsons RL, Braas KM (2000). PACAP modulates rat sympathetic

neuron depolarization through IP3. Ann.N.Y. Acad. Sci. 921: 186-194.

108. McDougall JJ, Baker CL, Hermann PM (2004). Attenuation of knee joint inflammation by

peripherally administered endomorphin-1. J. Mol. Neurosci. 22: 125-137.

Page 83: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

83

109. McDougall JJ, Barin AK, McDougall CM (2004). Loss of vasomotor responsiveness to

the mu-opioid receptor ligand endomorphin-1 in adjuvant monoarthritic rat knee joints.

Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 286:R634-41.

110. McIntyre P, McLatchie LM, Chambers A, Phillips E, Clarke M, Savidge J, Toms C,

Peacock M, Shah K, Winter J, Weerasakera N, Webb M, Rang HP, Bevan S, James IF

(2001). Pharmacological differences between the human and rat vanilloid receptor 1

(VR1). Br. J. Pharmacol. 132: 1084-1094.

111. McLatchie LM, Fraser NJ, Main MJ, Wise A, Brown J, Thompson N, Solari R, Lee MG,

Foord SM (1998). RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-

receptor-like receptor. Nature 393: 333-339.

112. Mikkelsen JD, Hannibal J, Fahrenkrug J, Larsen PJ, Olcese J, McArdle C (1995).

Pituitary adenylate cyclase-activating peptide-38 (PACAP-38), PACAP-27, and PACAP

related peptide (PRP) in the rat median eminence and pituitary. J. Neuroendocrin. 7: 47–

55.

113. Mishra S, Joshi PG (2007). Lipid raft heterogeneity: an enigma. J. Neurochem. 103: 135-

142.

114. Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minamino N, Uehara A, Jiang L, Culler MD, Coy DH

(1989). Isolation of a novel 38 residue-hypothalamic polypeptide which stimulates

adenylate cyclase in pituitary cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 567-574.

115. Moller K, Zhang YZ, Hakanson R, Luts A, Sjölund B, Uddman R, Sundler F (1993).

Pituitary adenylate cyclase-activating peptide is a sensory neuropeptide:

Immunocytochemical and immunochemical evidence. Neuroscience 57: 725–732.

116. Monaghan TK, MacKenzie CJ, Plevin R, Lutz EM (2008). PACAP-38 induces neuronal

differentiation of human SH-SY5Y neuroblastoma cells via cAMP-mediated activation of

ERK and p38 MAP kinases. J. of Neurochemistry 104: 74–88.

117. Mousa SA, Machelska H, Schafer M, Stein C (2002). Immunohistochemical localization

of endomorphin-1 and endomorphin-2 in immune cells and spinal cord in a model of

inflammatory pain. J. Neuroimmunol. 126: 5-15.

118. Mulder H, Uddman R, Moller K, Zhang YZ, Ekblad E, Alumets J, Sundler F (1994).

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide expression in sensory neurons.

Neuroscience 63: 307–312.

119. Murck H, Steiger A, Frieboes RM, Antonijevic IA (2007). Pituitary adenylate cyclase

activating peptide affects homeostatic sleep regulation in healthy young men. Am. J.

Physiol. Encorinol. Metab. 292: E853-857.

Page 84: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

84

120. Nagakura Y, Okada M, Kohara A, Kiso K, Toya T, Iwai A, Wanibuchi F, Yamaguchi T

(2003). Allodynia and hyperalgesia in adjuvant-induced arthritic rats: time course of

progression and efficacy of analgesics. J. Pharmacol. Exp. Ther. 306: 490-497.

121. Németh J, Görcs T, Helyes Zs, Oroszi G, Kocsy T, Pintér E, Szolcsányi J (1998).

Development of a new sensitive CGRP radioimmunoassay for neuropharmacological

research. Neurobiology (Bp) 6:473-475.

122. Németh J, Helyes Zs, Görcs T, Gardi J, Pintér E, Szolcsányi J (1996). Development of

somatostatin radioimmunoassay for the measurement of plasma and tissue contents of

hormone. Acta Physil. Hung. 84: 313-315.

123. Németh J, Helyes Zs, Oroszi G, Jakab B, Pintér E, Szilvássy Z, Szolcsányi J (2003). Role

of voltage-gated cation channels and axon reflexes in the release of sensory neuropeptides

by capsaicin from isolated rat trachea. Eur. J. Pharmacol. 458: 313-318.

124. Németh J, Oroszi G, Jakab B, Magyarlaki M, Szilvássy Z, Röth E, Farkas B (2002). 125

I–

labelling and purification of peptide hormones and bovine serum albumin. J. of

Radioanal. and Nuclear Chem. 251: 29-133.

125. Németh J, Oroszi G, Thán M, Helyes Zs, Pintér E, Farkas B, Szolcsányi J (1999).

Subtance P radioimmunoassay for quantitative charaterisation of sensory neurotransmitter

release. Neurobiology 7: 437-444.

126. Németh J, Reglődi D, Pozsgai G, Szabó Á, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs

(2006). Effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 on sensory

neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice. Neuroscience 143:

223-230.

127. Njuki F, Nicholl CG, Howard A, Mak JC, Barnes PJ, Girgis SI, Legon S (1993). A new

calcitonin-receptor-like sequence in rat pulmonary blood vessels. Clin. Sci. (Lond.) 85:

385-388.

128. Odum L, Petersen LJ, Skov PS, Ebskov LB (1998). Pituitary adenylate cyclase activating

polypeptide (PACAP) is localized in human dermal neurons and causes histamine release

from skin mast cells. Inflamm. Res. 47: 488–492.

129. Oh U, Hwang SW, Kim D (1996). Capsaicin activates a nonselective cation channel in

cultured neonatal rat dorsal root ganglion neurons. J. Neurosci. 16: 1659-1667.

130. Parsons JA, Erlandsen SL, Hegre OD, McEvoy RC, Elde RP (1976). Central and

peripheral localization of somatostatin. Immonuemzyme immunocytochemical studies. J.

Histochem. Cytochem. 24: 872-882.

Page 85: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

85

131. Parsons RL, Rossignol TM, Calupca MA, Hardwick JC, Brass KM (2000). PACAP

peptides modulate guinea pig cardiac neuron membrane excitability and neuropeptide

expression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 921: 202-210.

132. Patacchini R, Maggi CA (2001). Peripheral tachykinin receptors as targets for new drugs.

Eur. J. Pharmacol. 429: 13-21.

133. Patel YC (1999). Somatostatin and its receptor family. Front Neuroendocrinol. 20: 157-

198.

134. Pintér E, Helyes Zs, Németh J, Pórszász R, Pethő G, Thán M, Kéri Gy, Horváth A, Jakab

B, Szolcsányi J (2002). Pharmacological characterisation of the somatostatin analogue

TT-232: effects on neurogenic and non-neurogenic inflammation and neuropathic

hyperalgesia. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 366: 142-150.

135. Pintér E, Helyes Zs, Szolcsányi J (2006). Inhibitory effect of somatostatin on

inflammation and nociception. Pharmacol. Ther. 112: 440-456.

136. Pol O, Puig MM (2004). Expression of opioid receptors during peripheral inflammation.

Curr. Top. Med. Chem. 4: 51-61.

137. Poyner DR, Sexton PM, Marshall I, Smith DM, Quirion R, Born W, Muff R, Fischer JA,

Foord SM (2002). International Union of Pharmacology. XXXII. The mammalian

calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin, and calcitonin receptors.

Pharmacol. Rev. 54: 233-246.

138. Przewlocki R, Przewlocka B (2001). Opioids in chronic pain. Eur. J. Pharmacol. 429: 79-

91.

139. Puehler W, Zöllner C, Brack A, Shaqura MA, Krause H, Schafer M, Stein C (2004). rapid

upregulation of opioid receptor mRNA in dorsal root ganglia in response to peripheral

inflammation depends on neuronalé conduction. Neuroscience 129: 473-479.

140. Rácz B, Gallyas Jr F, Kiss P, Tóth G, Hegyi O, Gasz B, Borsiczky B, Ferencz A, Rőth E,

Tamás A, Lengvári I, Lubics A, Reglődi D (2006). The neuroprotective effects of PACAP

in monosodium glutamate-induced retinal lesion involves inhibition of proapoptotic

signaling pathways. Regul. Pept. 137: 20–26.

141. Raynor K, Reisine T (1992). Somatostatin receptors. Crit. Rev. Neurobiol. 6: 273-289.

142. Regoli D, Boudon A, Fauchere JL (1994). Receptors and antagonists for substance P and

related peptides. Pharmacol. Rev. 46: 551-599.

143. Reichlin S (1983). Somatostatin. N. Engl. J. Med. 309: 1495-1501.

144. Reubi JC, Laissue JA, Waser B, Steffen DL, Hipkin W, Schonbrunn A (1999).

Immunohistochemical detection of somatostatin sst2a receptors in the lymphatic, smooth

Page 86: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

86

muscular, and peripheral nervous systems of the human gastrointestinal tract: facts and

artifacts. J. Clin. Endocrin. Metabol. 84: 2942-2950.

145. Samuel BU, Mohandas N, Harrison T, McManus H, Rosse W, Reid M, Haldar K (2001).

The role of cholesterol and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins of erythrocyte

rafts in regulating raft protein content and malarial infection. J Biol Chem. 276:29319-29.

146. Segre GV, Goldring SR (1993). Receptors for secretin, calcitonin, parathyroid hormone

(PTH)/PTH-related peptide, glucagon-like peptide 1, growth hormone releasing hormone,

and glucagon belong to a newly discovered G-protein-linked receptor family. Trends

Endocrinol. Metab. 4: 309–314.

147. Shaqura MA, Zöllner C, Mousa SA, Stein C, Schafer M (2004). Characterization of

opioid receptor binding and G protein coupling in rat hypothalamus, spinal cord, and

primary afferent neurons during inflammatory pain. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308: 712-

718.

148. Sherwood NM, Krueckl SL, McRory JE (2000). The origin and function of the Pituitary

Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP)/glukagon superfamily. Endocr. Rev.

21: 619-670.

149. Shigyo M, Aizawa H, Inoue H, Matsumoto K, Takata S, Hara N (1998). Pituitary

adenylate cyclase activating peptide regulates neurally mediated airway responses. Eur.

Respir. J. 12: 64-70.

150. Shigyo M, Aizawa H, Inoue H, Matsumoto K, Takata S, Hara N (1998). Pituitary

adenylate cyclase activating peptide regulates neurally mediated airway responses. Eur

Respir J. 12:64-70.

151. Shioda S, Legradi G, Leung WC, Nakajo S, Nakaya K, Arimura A (1994). Localization of

pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its messenger ribonucleic acid in

the rat testis by light and electron microscopic immunocytochemistry and in situ

hybridization. Endocrinology. 135:818-25.

152. Shioda S, Nakai Y, Nakajo S, Nakaya K, Arimura A (1996). Localization of pituitary

adenylate cyclase-activating polypeptide and its type I receptors in the rat ovary:

Immunohistochemistry and in situ hybridization. Ann. N.Y. Acad. Sci. 805: 677–683.

153. Simons K, Ikonen E (1997). Functional Raft in cell membranes. Nature 387: 569-72.

154. Singer SJ, Nicolson GL. (1972). The fluid mosaic model of the structure of cell

membranes. Science. 175:720-31.

155. Somogyvári-Vigh A, Reglődi D (2004). Pituitary adenylate cyclase activating

polypeptide: a potential neuroprotective peptide. Rev. Curr. Pharm. Des. 10: 2861-89.

Page 87: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

87

156. Spencer F, Chi L, Zhu M (2001). Temporal relationships among uterine pituitary

adenylate cyclase activating polypeptide, decidual prolactin-related protein and

progesterone receptor mRNAs expressions during decidualization and gestation in rats.

Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 129: 25-34.

157. Steenstrup BR, Jorgensen JC, Alm P, Hannibal J, Junge J, Fahrenkrug J, Ottesen B

(1996). Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP): occurrence and

vasodilatory effect in the human uteroplacental unit. Regul. Pept. 61: 197-204.

158. Stein C, Hassan AHS, Przewlocki R., Gramsch C., Peter K., Herz A (1990). Opioids from

immunocytes interact with receptors on sensory nerves to inhibit nociception in

inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 5935-5939.

159. Stein C, Machelska H, Binder W, Schafer M (2001). Peripheral opioid analgesia. Curr.

Opin. Pharmacol. 1: 62-65.

160. Stein C, Yassouridis A (1997). Peripheral morphine analgesia. Pain 71: 119–121.

161. Steinhoff M, McGregor GP, Radleff-Schlimme A, Steinhoff A, Jarry H, Schmidt WE

(1999). Identification of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and

PACAP type 1 receptor in human skin: expression of PACAP-38 is increased in patients

with psoriasis. Regul. Pept. 80: 49-55.

162. Suda K, Smith DM, Ghatei MA, Bloom SR (1992). Investigation of the interaction of VIP

binding sites with VIP and PACAP in human brain. Neurosci. Lett. 137: 19–23.

163. Szállási Á, Blumberg PM (1999). Vanilloid (Capsaicin) receptors and mechanisms.

Pharmacol. Rev. 51: 159-212.

164. Szolcsányi J (1977). A pharmacological approach to elucidation of the role of different

nerve fibres and receptor endings in mediation of pain. J. Physiol. (Paris) 73: 251-259.

165. Szolcsányi J (1984a). Capsaicin and neurogenic inflammation: history and early findings.

In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds: Chahl LA, Szolcsányi

J, Lembeck F), pp. 7-26, Akadémiai Kiadó, Budapest.

166. Szolcsányi J (1984b). Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensory-

efferent function. In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds:

Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F), pp. 27-53, Akadémiai Kiadó, Budapest.

167. Szolcsányi J (1988). Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation. Agents

Actions 23: 4-11.

168. Szolcsányi J (1993). Actions of capsaicin on sensory receptors. In: Capsaicin in the study

of pain (ed: Wood JN), pp. 1-26, Academic Press, London.

Page 88: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

88

169. Szolcsányi J (1996). Neurogenic inflammation: reevaluation of axon reflex theory. In:

Neurogenic Inflammation (eds: Geppetti P, Holzer P), pp. 33-42.

170. Szolcsányi J (2004). Forty years in capsaicin research for sensory pharmacology and

physiology. Neuropeptides 38: 377-384.

171. Szolcsányi J, Barthó L (1982). Capsaicin-sensitive non-cholinergic excitatory innervation

of the guinea-pig tracheobronchial smooth muscle. Neurosci. Lett. 34: 247-251.

172. Szolcsányi J, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J, Pintér E (1998). Release of somatostatin

and its role in the mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic

stimulation of sensory fibres of rat sciatic nerve. Br. J. Pharmacol. 123: 936-942.

173. Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A (1975). Sensory effects of capsaicin congeners I.

Relationship between chemical structure and pain-producing potency of pungent agents.

Arzneimittelforschung 25: 1877-1881.

174. Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A (1976). Sensory effects of capsaicin congeners II:

Importance of chemical structure and pungency in desensitizing activity of capsaicin-type

compounds. Arzneimittelforschung 26: 33-37.

175. Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs (2004). Sensocrine function of capsaicin-sensitive

nociceptors mediated by somatostatin regulates against inflammation and hyperalgesia.

In: Hyperalgesia: molecular mechanisms and clinical implications (eds: Handwerker HO,

Brune K), pp.113-128, IASP Press, Seattle.

176. Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J (1998b). Systemic anti-

inflammatory effect induced by counter-irritation through a local release of somatostatin

from nociceptors. Br. J.Pharmacol. 125: 916-922.

177. Tatsuno I, Gottschall PE, Köves K, Arimura A (1990). Demonstration of specific binding

sites for pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in rat astrocytes.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 168: 1027–1033.

178. ten Bokum AM, Hofland LJ, van Hagen PM (2000). Somatostatin and somatostatin

receptors in the immune system: a review. Eur. Cytokine Netw. 11: 161-176.

179. Thán M, Németh J, Szilvássy Z, Pintér E, Helyes Zs, Szolcsányi J (2000). Systemic anti-

inflammatory effect of somatostatin released from capsaicin-sensitive vagal and sciatic

sensory fibres of the rat and guinea-pig. Eur. J. Pharmacol. 399: 251-258.

180. Tohei A, Ikeda M, Hokao R, Shinoda M (2009). The different effects of i.c.v. injection of

pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on prolactin secretion in adult

male and lactating rats. Exp. Anim. 58: 489-495.

Page 89: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

89

181. Tominaga M, Caterina MJ, Malmberg AB, Rosen TA, Gilbert H, Skinner K, Raumann

BE, Basbaum AI, Julius D (1998). The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-

producing stimuli. Neuron 21: 531-543.

182. Tornoe K, Hannibal J, Georg B, Schmidt PT, Hilsted L, Fahrenkrug J, Holst JJ (2001).

PACAP 1-38 as neurotransmitter in the porcine antrum. Regul. Pept. 101: 109-121.

183. Tsui-Pierchalla, Enchinas M, Milbrandt J, Johnson E M (2002). Lipid raft in neuronal

signaling and function. Trends Neurosci. 25: 412-7.

184. Uddman R, Grunditz T, Kato J, Sundler F (1998). Distribution and origin of nerve fibers

in the rat temporomandibular joint capsule. Anat. Embryol. 197: 273-282.

185. van Rossum D, Hanisch U, Quirion R (1997). Neuroanatomical localization,

pharmacological characterization and functions of CGRP, related peptides and their

receptors. Neurosci. Biobehav. Rev. 21: 649-678.

186. Vaudry D, Falluel-Morel A, Bourgault S, Basille M, Burel D, Wurtz O, Fournier A, Chow

BKC, Hashimoto H, Galas L, Vaudry H (2009). Pituitary adenylate cyclase activating

polypeptide and its receptors: 20 years after the discovery. Pharmacol. Rev. 61: 283-357.

187. Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Yon L, Fournier A, Vaudry H. (2000). Pituitary

adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors: from structure to functions.

Pharmacol. Rev. 52: 269-324.

188. Vaudry D, Pamantung TF, Basille M, Rouselle C, Fournier A, Vaudry H, Beauvillain JC,

Gonzalez BJ (2002). PACAP protects cerebellar granule neurons against oxidative stress-

induced apoptosis. Eur. J. Neurosci. 15: 1451-1460.

189. Vécsei L, Widerlöv E (1988). Brain and CSF somatostatin concentrations in patients with

psychiatric or neurological illness. An overview. Acta Psychiatr. Scand. 78: 657-667.

190. Vígh S, Arimura A, Gottschall PE, Kitada C, Somogyvári-Vígh A, Childs GV (1993).

Cytochemical characterization of anterior pituitary target cells for the neuropeptide,

pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP), using biotinylated ligands.

Peptides 14: 59–65.

191. Wang ZY, Waldeck K, Grundemar L, Hakanson R. (1997). Ocular inflammation induced

by electroconvulsive treatment: contribution of nitric oxide and neuropeptides mobilized

from C-fibres. Br. J. Pharmacol. 120: 1491-1496.

192. Warren JB, Wilson AJ, Loi RK, Coughlan ML (1993). Opposing roles of cyclic AMP in

the vascular control of edema formation. FASEB J. 7: 1394-1400.

Page 90: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

90

193. Wray V, Kokoschke C, Nokihara K, Naruse S (1993). Solution structure of pituitary

adenylate cyclase-activating polypeptide by nuclear magnetic resonance spectroscopy.

Biochemistry 32: 5832–5841.

194. Wu FY, Tsao PH, Wang DC, Lin S, Wu JS, Cheng YK (2005). Factors affecting growth

factor activity in goat milk. J. Dairy. Sci. 89: 1951-1955.

195. Zadina JE (2002). Isolation and distribution of endomorphins in the central nervous

system. Jpn J Pharmacol. 89:203-8.

196. Zadina JE, Hackler L, Lin-Jun G, Kastin AJ (1997). A potent and selective endogenous

agonist for the -opiate receptor. Nature 386: 499-502.

197. Zhang Y, Danielsen N, Sundler F, Mulder H (1998). Pituitary adenylate cyclase-activating

peptide is upregulated in sensory neurons by inflammation. Neuroreport 9: 2833-2836.

198. Zhang Y, Malmberg AB, Sjolund B, Yaksh TL (1996). The effect of pituitary adenylate

cyclase activating peptide (PACAP) on the nociceptive formalin test. Neurosci. Lett. 207:

187-190.

199. Zhang Y, Malmberg AB, Yaksh TL, Sjölund B, Sundler F, Hakanson R (1997).

Capsaicin-evoked release of pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP) and

calcitonin gene-related peptide (CGRP) from rat spinal cord in vivo. Regul. Pept. 69: 83-

87.

200. Zhou CJ, Shioda S, Yada T, Inagaki N, Pleasure SJ, Kikuyama S (2002). PACAP and its

receptors exert pleiotropic effects in the nervous system by activating multiple signaling

pathways. Curr. Protein Pept. Sci. 3: 423-439.

201. Zhu Dan, Xiong Wen C, Mei L (2006). Lipid rafts serve as a signaling platform for

nicotinic acetylcholine receptor clustering. J. Neurosci. 26: 4841-51.

202. Zöllner C, Shaqura MA, Bopaiah CP, Stein C, Schafer M (2003). Painful inflammation-

induced increase of -opioid receptor binding and G-protein coupling in primary afferent

neurons. Mol. Pharmacol. 64: 202-210.

203. Nilius B (2007). TRP channels in disease. BBA-Mol. Bas. Dis. 8:805-812.

Page 91: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

91

VIII. PUBLIKÁCIÓS LISTA:

VIII.1. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ EREDETI KÖZLEMÉNYEK:

1. Börzsei R, Pozsgai G, Bagoly T, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs: Inhibitory action of

endomorphin-1 on sensory neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice.

Neuroscience 152(1):82-88, 2008. IF: 3,556; FC: 11

2. Reglődi D, Börzsei R, Bagoly T, Boronkai A, Rácz B, Tamás A, Kiss P, Horváth G, Brubel R,

Németh J, Tóth G, Helyes Zs: Agonistic behavior of PACAP6-38 on sensory nerve terminals and

cytotrophoblast cells. J. Mol. Neurosci. 36(1-3):270-278, 2008. IF: 2,061; FC: 4

3. Börzsei R, Márk L, Tamás A, Bagoly T, Bay C, Csanaky K, Bánki E, Kiss P, Váczy A, Horváth

G, Németh J, Szauer E, Helyes Z, Reglődi D: Presence of pituitary adenylate cyclase activating

polypeptide-38 in human plasma and milk. Eur J Endocrinol. 160(4):561-565. 2009.

IF: 3,539; FC: 3

4. Reglődi D, Gyarmati J, Ertl T, Börzsei R, Bodis J, Tamás A, Kiss P, Csanaky K, Bánki E, Bay C,

Németh J, Helyes Zs: Alterations of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-like

immunoreactivity in the human plasma during pregnancy and after birth. J Endocrinol Invest.

33(7):443-445 2010. IF: 1,476; FC: 2

5. Czeglédi L, Tamás A, Börzsei R, Bagoly T, Kiss P, Horváth G, Brubel R, Németh J, Szalontai B,

Szabadfi K, Jávor A, Reglődi D, Helyes Zs: Presence of pituitary adenylate cyclase-activating

polypeptide (PACAP) in the plasma and milk of ruminant animals. Gen. Comp Endocrinol.

172(1):115-119, 2011. IF: 3,108

Az értekezés alapját képező közlemények összesített impakt faktora: 13,740

Ezekre kapott idegen citációk száma: 20

Page 92: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

92

VIII.2. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBA KÖZVETLENÜL NEM ILLESZKEDŐ EGYÉB KÖZLEMÉNYEK:

1. Szolcsányi J, Bölcskei K, Szabó A, Pintér E, Pethő G, Elekes K, Börzsei R, Almási R, Szűts T,

Kéri G, Helyes Zs: Analgesic effect of TT-232, a heptapeptide somatostatin analogue, in acute

pain models of the rat and the mouse and in streptozotocin-induced diabetic mechanical

allodynia. Eur J Pharmacol. 498(1-3):103-109, 2004. IF: 2,432; FC: 20

2. Jakab B, Helyes Zs, Varga A, Bölcskei K, Szabó A, Sándor K, Elekes K, Börzsei R, Keszthelyi

D, Pintér E, Pethő G, Németh J, Szolcsányi J: Pharmacological characterization of the TRPV1

receptor antagonist JYL1421 (SC0030) in vitro and in vivo in the rat. Eur. J. Pharmacol. 517(1-

2):35-44, 2005. IF: 2,477; FC: 22

3. Helyes Zs, Pozsgai G, Börzsei R, Németh J, Bagoly T, Márk L, Pintér E, Tóth G, Elekes K,

Szolcsányi J, Reglődi D: Inhibitory effect of PACAP-38 on acute neurogenic and non-neurogenic

inflammatory processes in the rat. Peptides 28(9):1847-1855, 2007. IF: 2,368; FC: 7

4. Elekes K, Helyes Zs, Németh J, Sándor K, Pozsgai G, Kereskai L, Börzsei R, Pintér E, Szabó A,

Szolcsányi J: Role of capsaicin-sensitive afferents and sensory neuropeptides in endotoxin-

induced airway inflammation and consequent bronchial hyperreactivity in the mouse. Regul.

Pept. 141(1-3):44-54, 2007. IF: 2,422; FC: 10

5. Helyes Zs, Elekes K, Németh J, Pozsgai G, Sándor K, Kereskai L, Börzsei R, Pintér E, Szabó A,

Szolcsányi J: Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in endotoxin-induced

airway inflammation in the mouse. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 292(5):L1173-1181,

2007. IF: 4,214; FC: 17

6. Sütő B, Bagoly T, Börzsei R, Lengl O, Szolcsányi J, Németh T, Loibl C, Bardonicsek Z, Pinter

E, Helyes Zs: Surgery and sepsis increase somatostatin-like immunoreactivity in the human

plasma. Peptides 31(6):1208-12, 2010. IF: 2,654

7. Szőke E, Börzsei R, Tóth DM, Lengl O, Helyes Z, Sándor Z, Szolcsányi J: Effect of lipid raft

disruption on TRPV1 receptor activation of trigeminal sensory neurons and transfected cell line.

Eur J Pharmacol. 628(1-3):67-74, 2010. IF: 2,737; FC: 7

8. Markovics A, Szőke E, Sándor K, Börzsei R, Bagoly T, Kemény A, Elekes K, Pintér E,

Szolcsányi J, Helyes Zs: Comparison of the anti-inflammatory and anti-nociceptive effects of

cortistatin-14 and somatostatin-14 in distinct in vitro and in vivo model systems. J Mol Neurosci.

46(1): 40-50. 2012. F: 2,922

9. Csanaky K, Bánki E, Helyes Zs, Börzsei R, Bagoly T, Márk L, Bay Cs, Gyarmati J, Ertl T, Kiss

P, Brubel R, Váczy A, Németh J, Szauer E, Tarcai I, Szalontai B, Heronyányi D, Bilonka Zs,

Page 93: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

93

Reglődi D, Tamás A: Hypophysis adenilát cikláz aktiváló polipeptid (PACAP) kimutatása vér- és

tejmintákból várandósság, szülés és szoptatás alatt. Védőnő folyóirat (közlés alatt) 2012.

Az értekezés témájába közvetlen nem illeszkedő egyéb közlemények impakt faktora: 22,226

Ezekre kapott független citációk száma: 83

Az összes eredeti közlemény kummulatív impakt faktora: 35,966

Kummulatív független citációk szám: 103

VIII.3. KÜLFÖLDI KONFERENCIASZEREPLÉSEK, FOLYÓIRATBAN MEGJELENT ABSZTRAKTOK:

1. Helyes Zs, Bölcskei K, Szabó Á, Pintér E, Pethő G, Elekes K, Almási R, Börzsei R, Szűts T,

Kéri Gy, Szolcsányi J: Analgesic effect of TT-232, a heptapeptide somatostatin analogue, in

acute pain models of the rat and the mouse and in streptozotocin-induced diabetic hyperalgesia.

European Neuropeptide Club, 14th

Annual Meeting, Alicante, Spanyolország, 2004.

2. Elekes K, Németh J, Sándor K, Börzsei R, Beck A, Kereskai L, Pozsgai G, Péter Sz, Pintér E,

Szabó Á, Szolcsányi J, Helyes Zs: Role of the TRPV1 receptor in subacute airway inflammatory

model of the mouse. European Neuropeptide Club, 15th

Annual Meeting, Riga, Latvia, 2005.

Absztrakt: Neuropeptides 39(6), p.625., 2005. IF: 2,155

3. Helyes Zs, Elekes K, Németh J, Sándor K, Börzsei R, Beck A, Kereskai L, Pozsgai G, Péter Sz,

Pintér E, Szabó Á, Szolcsányi J: TRPV1 receptor-mediated release of the inhibitory neuropeptide

somatostatin in murine airway inflammatory model. Summer Neuropeptide Conference, Miami

Beach, Florida, USA, 2005. Absztrakt: Neuropeptides 40(2), p.155., 2005. IF: 2,155

4. Börzsei R, Pozsgai G, Bagoly T, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs: Inhibitory action of

Endomorphin-1, an endogenous opioid peptide, on sensory neuropeptide release and neurogenic

inflammation in rats and mice. European Neuropeptide Club Joint Meeting, Santorini,

Görögország, 2007.

5. Elekes K, Sándor K, Kereskai L, Börzsei R, Pintér E, Szolcsányi J, Quinn JP, Helyes Zs:

Involvement of the neurokinin 1 receptor and preprotachykinin A gene-encoded peptides in

endotoxin-induced murine airway inflammation. European Opioid Conference – European

Neuropeptide Club Joint Meeting, Ferrara, Olaszország, 2008.

Page 94: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

94

6. Börzsei R, Szőke É, Tóth DM, Bagoly T, Helyes Zs, Sándor Z, Szolcsányi J: Effect of lipid raft

disruption by methyl b-cyclodextrin on TRPV1 receptor activation in distinct experimental

system. European Opioid Conference – European Neuropeptide Club Joint Meeting, Ferrara,

Olaszország, 2008.

7. Reglődi D, Németh J, Pozsgai G, Sándor K, Börzsei R, Bagoly T, Elekes K, Pintér E, Kiss P,

Szolcsányi J, Helyes Zs: Effect of PACAP-38 on sensory neuropeptide release and neurogenic

inflammation in rats and mice. 7th International Conference of Neuroimmunology, Rio de

Janeiro, Brazilia, 2008.

8. Varga A, Horváth A, Seprodi J, Vantus T, Tanai H, Börzsei R, Elekes K, Helyes Zs, Pintér E,

Szolcsányi J, Miyazaki A, Okada Y, Kéri Gy: Effect of somatostatin derived peptides and

peptidomimetics on neurogenic inflammation. European Peptide Symposium, Helsinki,

Finnország, 2008. Absztrakt: J Pept Sci. 14(8): 127-127, 2008. IF:1,654

9. Tamas A, Borzsei R, Mark L, Bagoly T, Bay Cs, Csanaky K, Banki E, Kiss P, Vaczy A, Horvath

G, Nemeth J, Czegledi L, Szauer E, Helyes Zs, Reglodi D: Presence of PACAP-38 in mammalian

plasma and milk: from guinea pig to humans Satellite Symposium of the 9th International

Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides, Yakushima, Japan, 2009.

10. Markovics A, Sándor K, Kemény Á, Börzsei R, Bagoly T, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs:

Cortistatin and somatostatin: comparing their effects on inflammation in vitro and in vivo. The 7th

Joint Meeting of the European Neuropeptide Club & Summer Neuropeptide Conference, Pécs,

Magyarország, 2010. Absztrakt: Neuropeptides 44, p. 542., 2010. IF: 1,917

11. Reglodi D, Tamas A, Czegledi L, Szalontai B, Börzsei R, Bagoly T, Csanaky K, Banki E, Kiss

P, Horvath G, Szauer E, Nemeth J, Mark L, Brubel R, Helyes Zs: Presence of pituitary adenylate

cyclase activating polypeptide in the milk of domestic animals and humans. 25th

Conference of

European Comparative Endocrinologists, Pécs, Magyarország, 2010.

12. Tamás A, Helyes Zs, Börzsei R, Márk L, Bagoly T, Bay Cs, Gyarmati J, Ertl T, Bodis J, Csanaky

K, Bánki E, Kiss P, Váczy A, Horváth G, Németh J, Szauer E, Reglődi D: PACAP-38 in human

plasma and milk under physiological and pathological conditions: introductory measurements for

possible future clinical diagnostic application. 9th International Symposium on VIP, PACAP and

Related Peptides, Kagoshima, Japan 2009. Absztrakt: J Mol Neurosci. 42(3):293-294, 2010.

IF: 2,922

Page 95: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

95

VIII.4. HAZAI KONFERENCIASZEREPLÉSEK, FOLYÓIRATBAN MEGJELENT ABSZTRAKTOK:

1. Szabó Á, Czirják L, Helyes Zs, Pintér E, László T, Sándor K, Bite A, Börzsei R, Bánvölgyi Á,

Szolcsányi J: A kapszaicin receptor (VR1/TRPV1) szerepe krónikus gyulladásos és szkleroderma

egérmodellekben. Magyar Klinikai Farmakológusok V. Kongresszusa és MFT

Immunfarmakológiai Szekció Ülése, Debrecen, 2003.

2. Helyes Zs, Bölcskei K, Szabó Á, Pintér E, Pethő G, Elekes K, Almási R, Börzsei R, Szűts T, Kéri

Gy, Szolcsányi J: A heptapeptid szomatosztatin analóg, TT-232, analgetikus hatása akut és

krónikus nociceptív modellekben patkányban. Magyar Élettani Társaság LXVIIII.

Vándorgyűlése, Debrecen, 2004.

3. Szabó Á, Czirják L, Helyes Zs, Pintér E, László T, Sándor K, Bite A, Börzsei R, Bánvölgyi Á,

Szolcsányi J: A TRPV1 receptor szerepének vizsgálata génhiányos egerek segítségével krónikus

ízületi gyulladásos modellben. Magyar Fájdalom Társaság Kongresszusa, Siófok, 2004.

4. Helyes Zs, Bölcskei K, Szabó Á, Pintér E, Pethő G, Elekes K, Almási R, Börzsei R, Szűts T,

Kéri Gy, Szolcsányi J: A heptapeptid szomatosztatin analóg, TT-232, anti-nociceptív hatásának

vizsgálata patkány fájdalommodellekben. Magyar Fájdalom Társaság Kongresszusa, Siófok,

2004.

5. Helyes Zs, Elekes K, Németh J, Börzsei R, Sándor K, Beck A, Kereskai L, Pintér E, Szabó Á,

Szolcsányi J: A TRPV1 receptor szerepének vizsgálata szubakut légúti gyulladásos

egérmodellben. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság IV. Konferenciája,

Debrecen, 2004.

6. Elekes K, Helyes Zs, Németh J, Börzsei R, Sándor K, Beck A, Kereskai L, Pozsgai G, Péter Sz,

Pintér E, Szabó Á, Szolcsányi J: A TRPV1 receptor szerepének vizsgálata egér szubakut légúti

gyulladás modellben. Magyar Idegtudományi Társaság Konferenciája, Pécs, 2005.

7. Elekes K, Németh J, Sándor K, Börzsei R, Beck A, Kereskai L, Pozsgai G, Péter Sz, Pintér E,

Szabó Á, Szolcsányi J, Helyes Zs: TRPV1 receptor-mediated release of the inhibitory

neuropeptide somatostatin in murine airway inflammatory model. Magyar Kísérletes és Klinikai

Farmakológiai Társaság, a Magyar Experimentális Farmakológia Tavaszi Szimpóziuma,

Budapest, 2005.

8. Szabó Á, Helyes Zs, Jakab B, Varga A, Bölcskei K, Sándor K, Elekes K, Börzsei R, Keszthelyi

D, Pintér E, Pethő G, Németh J, Szolcsányi J: A JYL1421 (SC0030) kódjelű TRPV1 receptor

antagonista vegyület farmakológiai vizsgálata in vitro és in vivo patkányban. Magyar Fájdalom

Társaság Kongresszusa, Siófok, 2005.

Page 96: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

96

9. Elekes K, Sándor K, Kereskai L, Börzsei R, Pintér E, Szolcsányi J, Quinn JP, Helyes Zs: A

neurokinin 1 receptor és preprotachykinin A gén által kódolt peptidek szerepe endotoxinnal

kiváltott légúti gyulladásban. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság és a Magyar

Élettani Társaság LXXII. Vándorgyűlése Debrecen, 2008. Absztrakt: Acta Physiologica

Hungarica 96(1), p.71-72., 2009. IF:0,750

10. Szőke E, Börzsei R, Tóth DM, Bagoly T, Helyes Zs, Sándor Z, Szolcsányi J: Effect of lipid raft

disruption on TRPV1 receptor activation on sensory neurones, transfected cell line and sensory

nerve endings. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság és a Magyar Élettani

Társaság LXXII. Vándorgyűlése Debrecen, 2008. Absztrakt: Act Physiol Hun. 96(1): 137-137,

2009. IF: 0,750

11. Helyes Zs, Elekes K, Börzsei R, Sándor K, Kereskai L, Pintér E, Szolcsányi J: A kapszaicin-

érzékeny afferensekből felszabaduló szomatosztatin szerepe légúti gyulladásmodellben. Erdélyi

Múzeum-Egyesület Orvos- és Gyógyszerésztudományi Szakosztály, XIX. Tudományos ülésszak,

Marosvásárhely, 2009.

12. Börzsei R, Mark L, Tamas A, Bagoly T, Bay Cs, Csanaky K, Banki E, Kiss P, Vaczy A, Horvath

G, Nemeth J, Szauer E, Helyes Zs, Reglodi D: Presence of pituitary adenylate cyclase activating

polypeptide in human serum and milk. Magyar Idegtudományi Társaság XII. Konferenciája,

Budapest, 2009.

13. Horváth G, Börzsei R, Márk L, Tamás A, Bagoly T, Bay Cs, Csanaky K, Bánki E, Kiss P, Váczy

A, Németh J, Szauer E, Helyes Zs, Reglődi D: Hypophysis adenilát cikláz aktiváló polipeptid

(PACAP) kimutatása vérplazma és anyatej mintákból. Magyar Anatómus Társaság XV.

Kongresszusa Budapest, 2009.

14. Váczy A, Börzsei R, Mark L, Tamas A, Bagoly T, Bay C, Csanaky K, Banki E, Kiss P, Horvath

G, Németh J, Szauer E, Helyes Zs, Reglődi D: Presnce of pituitary adenylate cyclase activating

polypeptdite in human serum and milk. 38. Membrán-transzport konferencia Sümeg, 2009.

15. Kiss P, Csanaky K, Bánki E, Tamás A, Börzsei R, Márk L, Bagoly, T, Bay Cs, Váczy A,

Horváth G, Németh J, Czeglédi L, Szauer E, Helyes Zs, Reglődi D: Presence of PACAP-38 in

mammalian plasma and milk: From guinea pig to humans. Magyar Élettani Társaság LXXIII.

Vándorgyűlése Budapest, 2009. Absztrakt: Act Physiol Hun. 97(1): 115-115, 2010. IF: 1,226

16. Tamás A, Börzsei R, Márk L, Bagoly T, Bay Cs, Csanaky K, Bánki E, Kiss P, Váczy A, Horváth

G, Németh J, Czeglédi L, Szauer E, Helyes Zs, Redglődi D: Presence of PACAP-38 in

mammalian plasma and milk: from guinea pig to humans Kisfaludy Lajos Alapítvány előadóülést,

Richter Gedeon Centenáriumi Alapítvány Budapest, 2010.

Page 97: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

97

17. Tamás A, Brubel R, Helyes Zs, Börzsei R, Márk L, Bay Cs, Gyarmati J, Ertl T, Csanaky K,

Bánki E, Kiss P, Váczy A, Horváth G, Németh J, Szauer E, Reglődi D: A PACAP

koncentrációjának mérése kismamák és újszülöttek véréből. Magyar Élettani Társaság LXXIV.

Vándorgyűlése és a Magyar Kísérleti és Klinikai Farmakológiai Társaság II. Közös tudományos

konferenciája, Szeged, 2010.

18. Tamás A, Helyes Zs, Börzsei R, Márk L, Bay Cs, Gyarmati J, Ertl T, Csanaky K, Bánki E, Kiss

P, Váczy A, Horváth G, Németh J, Szauer E, Reglődi D: A PACAP koncentrációjának mérése

kismamák és újszülöttek véréből. Szoptatás Világhete (Országos nyitó rendezvény) Dombóvár,

2010.

19. Tamás A, Helyes Zs, Börzsei R, Márk L, Bay Cs, Gyarmati J, Ertl T, Csanaky K, Bánki E, Kiss

P, Váczy A, Horváth G, Németh J, Szauer E, Reglődi D: A PACAP koncentrációjának mérése

kismamák és újszülöttek véréből. „AZ ANYATEJ VILÁGNAPJA” Pécs, 2010.

A folyóiratban megjelent absztraktok összesített impakt faktora: 13,529

Page 98: A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG …aok.pte.hu/hu/egyseg/phd_dolgozatok/1670/docs/phd/file/...A kapszaicin, és Capsicum fa paprika (Capsicum annuum rutescens) csípős anyaga, kémiai

98

IX. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek dr.Helyes Zsuzsannának, amiért oly

nagy kitartással és türelemmel irányította munkám, valamint szeretetével és támogatásával mindig

mellettem állt magánemberként is. Köszönöm dr. Pintér Erikának és dr. Szolcsányi János Professzor

Úrnak hasznos szakmai segítségüket és tanácsaikat. Köszönöm dr. Barthó Loránd Professzornak, az

intézet vezetőjének, hogy támogatta kutató munkámat. Hálás vagyok dr. Németh Józsefnek, hogy

végtelen türelmével és komoly szaktudásával segített a radioimmunassay módszerek elsajátításában.

Köszönöm Bagoly Teréznek és Zöldhegyi Józsefné, Marának, hogy örök vidámságukkal, precíz

munkájukkal és szakmai tapasztalatukkal segítettek a perfúziós kísérletekben és a radioimmunassay

mérések elvégzésében. Köszönöm dr. Sándor Katalinnak, PhD hallgató társamnak a barátságát, és

mindig vidám, optimista szavait, tanácsait, amikre nemcsak szakmai kérdésekben, de magánéleti

problémákban is számíthattam. Köszönöm dr. Szőke Évának, dr. Lengl Orsolyának, dr. Kemény

Ágnesnek, dr. Pozsgai Gábornak, dr. Csanaky Katának, dr. Bánki Eszternek a munkám során nyújtott

segítségüket. Köszönöm dr. Reglődi Dórának, dr. Tamás Andreának a fantasztikus ötleteket és

jókedvet, amit közös munkánk során élvezhettünk. Köszönet dr. Czeglédi Leventének, aki a biológiai

minták gyűjtését oly szorgalmasan végezte. Köszönöm dr. Szabadfi Krisztának az

immunhisztokémiai vizsgálatokban nyújtott segítségét, Hírné Perkecz Anikónak a biológiai metszetek

készítését és dr. Márk Lászlónak, aki a tömegspektrometria világába engedett betekintést. Köszönöm

a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet minden dolgozójának a támogatást és a jó

munkahelyi légkör megteremtését. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm Családomnak,

Szüleimnek, Bátyámnak és Sógornőmnek, Férjemnek a rengeteg türelmet, támogatást és

biztatást, amit az elmúlt években kaptam tőlük.