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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Departamento de Ciências dos Alimentos Bacharelado em Química de Alimentos Disciplina de Seminários Métodos rápidos de análise microbiológica Júlia Coswig Goldbeck Pelotas, 2008.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASDepartamento de Ciências dos AlimentosBacharelado em Química de Alimentos

Disciplina de Seminários

Métodos rápidos de análise microbiológica

Júlia Coswig Goldbeck

Pelotas, 2008.

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2

Júlia Coswig Goldbeck

Métodos rápidos de análise microbiológica

Trabalho acadêmico apresentado ao

Curso de Bacharelado em Química

de Alimentos da Universidade

Federal de Pelotas, como requisito

parcial da disciplina de seminários.

Orientadora: Josiane Chim

Co-Orientadora: Carla Mendonça

Pelotas, 2008.

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3

Agradecimentos

À colaboração de todos integrantes da Microbial, em especial a Msc. Andréia

Saldanha de Lima e ao Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva, pela orientação,

confiança e oportunidade de crescimento pessoal e profissional.

À Profa. Dra. Miriam Galvão e Dra. Caroline Borges, pela orientação e

conhecimentos transmitidos.

Às orientadoras da referente disciplina, Profa. Dra. Carla Mendonça e Profa.

Josiane Chim.

Aos amigos, e ao apoio e compreensão do meu companheiro de todas as

horas, Wilson Colvara.

Ao órgão apoiador de minha graduação, CNPQ, pela concessão de bolsa

Iniciação Científica.

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4

“ A descoberta consiste em ver o que todo mundo viu e pensar no que

ninguém pensou. "( Jonathan Swift )

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5

GOLDBECK, Júlia C. Métodos rápidos de análise microbiológica. 2008. 32f.

Trabalho acadêmico. Bacharelado em Química de Alimentos. Universidade Federal

de Pelotas.

Resumo

A necessidade de rapidez dos resultados de análise, fez surgir os métodos rápidos

de análise microbiológica. Os métodos rápidos possuem várias vantagens, como

diminuição de custos para a empresa, facilidade de leitura e interpretação dos

resultados, bem como, simplificação de tarefas. Alguns desses métodos já são

aprovados pela AOAC, porém, resultados positivos devem ser apenas presuntivos,

enquanto que resultados negativos são considerados confirmatórios. Sob visão

geral, os métodos são projetados especificamente para identificar um grupo ou

espécie bacteriana. Quase todos os métodos rápidos são projetados para identificar

um único alvo, o que os torna muito eficientes em programas de qualidade. Os

testes são similares no formato e desempenho e possuem de 90 – 99% de exatidão

quando comparados a métodos convencionais, sendo que os resultados são obtidos

em alguns minutos, segundos ou em algumas horas. Os métodos rápidos são

divididos em métodos para avaliar a qualidade e métodos para avaliar a inocuidade.

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6

Lista de tabelas

Tabela 1 – Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimáticos

encontrados no mercado.................................................................................. 23

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Lista de figuras

Figura 1 – Microscópio fluorogênico, usado para contagem de microrganismos e

conseqüente formação de colônias........................................................................... 18Figura 2 – Placas PetrifilmTM prontas para uso.........................................................

Figura 3 – Reação antígeno anticorpo que ocorre no “Kit” ELISA.............................

Figura 4 – Eletroforese em gel de agarose................................................................

18

26

28Figura 5 – Bax® System, sistema automatizado de PCR real

time...........................

28

Figura 6 – Riboprinter® System da DuPont Qualicon, usado para identificar e

caracterizar bactérias de forma automatizada........................................................... 29

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Sumário

1 Introdução................................................................................................... 102 Métodos rápidos........................................................................................ 122.1 Métodos convencionais x métodos rápidos........................................ 133 Técnicas rápidas para a identificação de microrganismos................... 153.1 Métodos para avaliar a qualidade......................................................... 153.1.1 Métodos de contagem direta.............................................................. 153.1.1.1 Técnica de membrana filtrante........................................................ 153.1.1.2 Técnica de epifluorescência direta................................................. 163.1.1.3 Técnica fluorogênica........................................................................ 173.1.1.4 Sistemas prontos para uso.............................................................. 183.1.2 Métodos de contagem indireta........................................................... 193.1.2.1 Bioluminescência............................................................................. 203.1.2.2 Impedância/condutância.................................................................. 213.1.2.3 Placas SIMPLATETM......................................................................... 213.2 Métodos para avaliar a inocuidade....................................................... 223.2.1 Métodos bioquímicos.......................................................................... 223.2.2 Métodos imunológicos........................................................................ 223.2.2.1 Ensaios imunoenzimáticos.............................................................. 223.2.2.2 Imunocaptura.................................................................................... 233.2.2.3 Imunoimobilização............................................................................ 243.2.2.4 Coaglutinação................................................................................... 243.2.2.5 ELISA................................................................................................ 243.2.3 Métodos moleculares.......................................................................... 263.2.3.1 Sondas genéticas............................................................................ 263.2.3.2 Reação de Polimerase em cadeia (PCR)........................................ 263.2.3.3 Bacteriófagos com DNA modificado............................................... 283.2.3.4 Ribotipagem...................................................................................... 28

4 Conclusões ................................................................................................ 30Referências.................................................................................................... 32

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1. Introdução

É impossível determinar exatamente quando, na história da humanidade, o

homem tomou conhecimento da existência de microrganismos e da sua importância

para os alimentos.

Após o período no qual o ser humano tinha a sua alimentação baseada

apenas nos abundantes recursos da natureza, o homem passou a plantar, criar

animais e produzir o seu próprio alimento. Com o surgimento de alimentos

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preparados, começaram a ocorrer os problemas relacionados com doenças

transmitidas pelos alimentos e com a rápida deterioração dos mesmos,

principalmente pela conservação inadequada (FRANCO, 1999).

Entre os vários parâmetros que determinam a qualidade de um produto, os

mais importantes são, sem dúvida, aqueles que diferem as suas características

microbiológicas. A avaliação microbiológica do alimento fornece informações que

permitem avaliá-lo quanto às condições em relação à saúde da população.

Para que a análise microbiológica seja conduzida de forma que os resultados

obtidos permitam um julgamento correto do produto analisado, é necessário que os

critérios de avaliação sejam claramente estabelecidos. Esses critérios são definidos

de modo a permitir uma avaliação segura e válida.

Os critérios de avaliação são estabelecidos pela legislação de cada país, e

em nível internacional, por um programa conjunto FAO/WHO, da Organização das

Nações Unidas (Joint FAO/WHO Food Standards Program) e através da comissão

do Codex Alimentarius.

No Brasil, padrões microbiológicos para alimentos são definidos em nível

federal, pelo Ministério da Saúde sob RDC n° 12 de 02 de janeiro de 2001, devem

ser aprovados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Em nível

estadual, alguns estados de federação, como São Paulo, têm legislação própria.

Logo, a análise de alimentos para se verificar quais e quantos microrganismos

estão presentes é fundamental, não somente para conhecer as condições de higiene

de determinado produto, como também é para observar se os padrões e

especificações microbiológicos, nacionais ou internacionais, estão sendo atendidos

adequadamente (FRANCO & LANDGRAF, 1996).

Atualmente, a análise microbiológica de um alimento pode ser realizada

através dos métodos “convencionais”, aqueles desenvolvidos há muitos anos e que

ainda vêm sendo empregados como métodos oficiais, ou métodos rápidos, ao quais

vêm se desenvolvendo de forma espantosa devido a sua praticidade.

Portanto, o objetivo do presente trabalho, foi conhecer as características, bem

como as vantagens e desvantagens, em relação aos métodos convencionais, de

alguns métodos rápidos empregados na análise microbiológica de alimentos.

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11

2. Métodos rápidos

Os métodos rápidos surgiram a partir da década de 70, como conseqüência da

necessidade de se abreviar o tempo necessário para a obtenção de resultados

analíticos e de se melhorar a produtividade laboratorial (HAJDENWURCEL, 1998).

São utilizados, geralmente, como técnicas de seleção e a fim de garantir a

segurança dos consumidores. Sob visão geral, a maioria desses métodos consiste

em um dispositivo descartável que contém 15 a 30 meios ou carcaças, projetados

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especificamente para identificar um grupo ou uma espécie bacteriana. Os testes são

similares no formato e no desempenho e possuem exatidão de 90 – 99% quando

comparados a métodos convencionais (FUNG et al., 2000)

A maioria dos testes são projetados para identificar/quantificar as bactérias

entéricas, como também Campylobacter, Listeria, bactérias anaeróbias, gran

negativas e gran positivas. Os métodos rápidos mais encontrados no mercado são

os para contagem de coliformes totais e Escherichia coli, contagem de bolores e

leveduras, detecção de Salmonella spp. e Listeria, monocytogenes

(HAJDENWURCEL, 1998).

Quase todos os métodos rápidos são projetados para detectar um único alvo,

o que os torna eficientes em programas de controle de qualidade por selecionar

rapidamente um grande número de amostras contaminadas por um determinado

patógeno (YUSTE, 2007).

Os resultados com a utilização dos métodos rápidos podem se dar em alguns

minutos, segundos ou algumas horas e, as avaliações dos mesmos, mostram que o

bom desempenho desses métodos está relacionado com o tipo de alimento. Isto

pode ser atribuído, na maioria das vezes devido à composição química do alimento,

por isso, é aconselhável executar estudos comparativos para assegurar a eficiência

da análise (FRAQUEZA, 2002).

Ainda são poucos os métodos validados oficialmente para alimentos, porém, vários

métodos alternativos de contagem têm sido proposto nos últimos anos, tem se

observado que a área de métodos rápidos desenvolve-se de forma espantosa.

Porém, muitos dos chamados “novos métodos em microbiologia de alimentos” nada

tem de “novos”, são na verdade resultados da transposição de métodos há muito

tempo utilizados em outras áreas da microbiologia.

2.1 Métodos convencionais X métodos rápidos

Os métodos convencionais recebem essa denominação porque foram

desenvolvidos há muitos anos e desde então vem sendo empregados como

métodos oficiais na maioria dos laboratórios de microbiologia de alimentos. Esses

métodos estão descritos em publicações consideradas de referência,

internacionalmente aceitos e recomendados pela American Public Health

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Association (APHA), pelo International Commission on Microbiological Specification

for Foods (ICMSF) e pela Food and Drug Administration (FDA).

O método convencional de contagem de microrganismos consiste

basicamente no plaqueamento de alíquotas do produto homogeneizado e de suas

diluições em meios de cultura sólidos, adequadamente selecionados em função do

microrganismo a ser enumerado. O plaqueamento pode ser feito por semeadura na

superfície do meio de cultura previamente distribuído em placas de Petri estéreis

(semeadura em superfície), ou então o meio de cultura pode ser adicionado após a

transferência das alíquotas para as placas de Petri vazias (semeadura em

profundidade). As placas são então incubadas a uma combinação de tempo e

temperatura adequada para a determinação a ser feita, durante a qual os

microrganismos se multiplicam formando as colônias visíveis, que podem ser

enumeradas manualmente ou com o auxílio de contadores automáticos (FRANCO,

1999).

Apesar da aparente simplicidade dessa técnica, ela é bastante trabalhosa e

sujeita a erros, levando em consideração que: os microrganismos estão arranjados

em pares, tétrades, cadeias e cachos, conseqüentemente, o número de colônias que

aparece na placa não corresponde ao número de células individuais presentes, além

disso, quando muitas diluições precisam ser plaqueadas também pode haver erros,

bem como algumas partículas de alimentos podem ser confundidas com colônias,

levando a um falso resultado positivo, sendo a leitura dos resultados bastante difícil,

pois pode variar de acordo com o analista, além de ser cansativa e imprecisa,

mesmo quando contadores automáticos são empregados (SILVEIRA et al.,1997).

Visando minimizar estes problemas, surgiram os métodos alternativos

(métodos rápidos), que apresentam a conveniência de produzirem resultados mais

rápidos, sensíveis e específicos, se comparados às técnicas convencionais. Tais

métodos também podem oferecer economia de espaço e materiais, aumentando a

produtividade laboratorial. Alternando a necessidade de rapidez dos resultados de

análises microbiológicas, em face do alto volume de alimentos à disposição do

consumidor em curto espaço de tempo (SILVA, 1996).

Como vantagens dos métodos rápidos, pode-se enumerar:

• Redução do tempo de análise;

• Menor tempo de retenção do produto na indústria;

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• Diminuição de custos;

• Simplificação das tarefas envolvidos na análise;

• Facilidade de leitura dos resultados;

• Especificidade;

• Maior sensibilidade de alguns métodos quando comparados com os

métodos convencionais.

Contudo, ao se escolher e implantar os métodos rápidos deve se levar em

conta parâmetros como precisão, custo, tempo de análise, aceitabilidade pelos

órgãos oficiais, simplicidade de operação, assistência técnica dos fabricantes e

disponibilidade de espaço no laboratório. Porém, segundo Feng (1995), os métodos

rápidos aprovados pelos órgãos oficiais podem ser utilizados somente para controle,

sendo que os resultados negativos são considerados como definitivos, mas

resultados positivos são considerados presuntivos e devem ser confirmados por

métodos padrões.

3. Técnicas rápidas para a identificação de microrganismos

Os métodos rápidos podem ser divididos em dois grupos: métodos para

avaliar a qualidade e métodos para avaliar a inocuidade (SILVEIRA, 2006). Os

métodos que avaliam a qualidade do alimento estão mais relacionados aos

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microrganismos deteriorantes, aqueles não patogênicos, já os métodos que avaliam

a inocuidade, quantificam/identificam microrganismos patogênicos.

3.1 Métodos para avaliar a qualidade

3.1.1 Métodos de contagem direta

3.1.1.1 Técnica de membrana filtrante

Utilizada há bastante tempo para enumeração de coliformes totais, fecais e

Escherichia coli em água, porém, seu uso em alimentos é mais recente. A mistura

alimento-diluente é filtrada através de membranas filtrantes de acetato de celulose

ou de nitrocelulose que tem porosidade suficiente (0,45µm) para retenção dos

microrganismos presentes nessa mistura. Em seguida as membranas são

transferidas para a superfície de placas contendo ágar ou cartões absorventes

saturados com meio de cultura. Após o tempo de incubação adequado para cada

microrganismo, faz-se a enumeração das colônias que surgiram na superfície das

membranas. A contagem pode ser facilitada pelo emprego de membranas

quadriculadas e pelo uso de contadores automáticos.

A técnica das membranas filtrantes apresenta as seguintes vantagens:

• Remove os componentes do alimento que podem interferir no

crescimento microbiano (sólidos em suspensão ou agentes

antimicrobianos);

• Microrganismos presentes em pequeno número, por vezes não

detectáveis em outras técnicas, podem ser “concentrados” pela filtração

de volume maior da amostra;

• Permite a contagem de 1 até 1,6x10-3 UFC por membrana, o que elimina

a necessidade de diluição;

• As colônias são coradas para facilitar a visualização.

O uso de membranas Isogrid é aprovado pela AOAC para enumeração de

bactérias totais, coliformes totais, Escherichi coli e Salmonella, sendo também

aprovados diversos tratamentos enzimáticos que podem ser utilizados em função do

tipo de alimento, para melhorar a filtrabilidade.

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Além da aprovação oficial, as membranas podem ser também utilizadas para a

pesquisa de Staphylococcus aureus, V. parahaemolyticus, Y. enterocolítica, C.

perfringens, P. aeruginosa, bactérias gran negativas e estreptococus fecais. Sua

aplicação em alimentos como leite, carne, condimentos, farinhas vegetais, frutos do

mar e outros têm apresentado ótimos resultados (MACHADO, 2007).

3.1.1.2 Técnica de epifluorescência direta

Técnica rápida de contagem de microrganismos que não depende de seu

cultivo e conseqüente formação de colônias. Os microrganismos viáveis e não

viáveis são enumerados por microscopia, sendo uma das técnicas que oferece

resultados mais rapidamente. A amostra devidamente homogeneizada tratada com

enzimas e tensoativos, se necessário, é filtrada através de uma membrana de

policarbonato, que retém os microrganismos. Essa membrana é então corada com

fluorocromo nucleofílico (alaranjado de acridina) e observada em um microscópio de

fluorescência. O corante permite a diferenciação das células viáveis, pois o DNA e

RNA corados apresentam fluorescência de coloração diferente, em função da fase

de crescimento microbiano. As células viáveis apresentam fluorescência laranja-

avermelhado, enquanto células mortas têm fluorescência verde. A epifluorescência

direta tem boa sensibilidade, resultante da concentração das células na superfície da

membrana filtrante. Tem sido bastante usada em leite.

Essa técnica, porém,apresenta algumas desvantagens:

• Técnica muito cansativa;

• Injúria de bactérias devido ao calor pode alterar a fluorescência;

• O custo elevado dos equipamentos torna seu uso limitado a grandes

laboratórios (MACHADO, 2007).

3.1.1.3 Técnica fluorogênica

Os testes baseados na adição de MUG (4-metil-umbeliferil-β-D-glicuronideo) a

um caldo de cultura para detecção de Escherichia coli., são exemplos desta técnica.

A enzima β-glicuronidase produzida pela grande maioria das cepas desse

microrganismo transforma o MUG em umbeliferona, fluorescente quando observado

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sob luz ultravioleta de onda longa. A observação do número de tubos turvos, com

gás e fluorescentes após 24 ou 48h, permite o cálculo do número mais provável de

E. coli por grama (ou mL) do produto (MACHADO, 2007).

Este método oferece como vantagens:

- Rapidez e facilidade de usar;

- Identificação direta e enumeração de Escherichia coli ou enterococos em 36

horas (em comparação com 3 ou 4 dias usando métodos tradicionais);

- Dispensa a preparação de meio de cultura;

- Emprega microplacas estéreis e prontas para uso;

- Padronização do preparo, incubação e técnica de leitura para E. coli e

Enterococcus;

- Detecção da atividade de uma enzima específica de cada bactéria por

microplaca;

- Resultados confiáveis;

- Economia de tempo e material.

A Fig. 1 representa ilustrativamente um microscópio fluorogênico, usado

nesta técnica para enumerar as células viáveis não viáveis.

Figura 1 – Microscópio fluorogênico, usado para contagem de microrganismos.Fonte: Google imagens (Epifluorescência direta), 2008.

3.1.1.4 Sistemas prontos para uso

Existem diferentes sistemas disponíveis comercialmente, com princípios

distintos, nos quais os meios de cultura já vêm prontos para uso, muitas vezes já na

própria placa de petri. Entre esses, destacam-se as Placas de Petrifilm-3M, Placas

de Simplate e diversos ágares adicionados de substratos cromogênicos ou

fluorogênicos.

As placas PetrifilmTM são produzidas e comercializadas pela 3M, são filmes de

papel quadriculado revestido com polietileno, recobertos de nutrientes desidratados

e géis hidrossolúveis a frio. Cada placa tem ainda um filme superior de polipropileno,

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que na face voltada para o filme inferior é revestido por géis hidrossolúveis a frio e

um corante indicador (cloreto de trifeniltetrazolio – TTC), com exceção daquelas

usadas para contagem de fungos.

As placas devem ser armazenadas em temperaturas inferiores a 8°C, antes do

uso necessitam estar em temperaturas ambientes. A exposição das mesmas a

temperaturas superiores a 25°C e/ou umidade superior a 50% podem afetar seu

desempenho.

As placas Petrifilm são prontas para uso, isto é, basta erguer o filme superior e

inocular 1mL do produto a ser analisado, voltar o filme para a posição inicial e aplicar

um difusor plástico a fim de distribuir uniformemente o inoculo pela placa, através de

leve pressão manual. Os agentes gelificantes são solúveis em água e a frio. A água

de diluição contida na amostra, em contato com os componentes da placa provoca a

hidratação dos nutrientes e a geleificação da mistura.

Após a geleificação (1 min) as placas são incubadas na temperatura e tempo

adequados, fazendo-se em seguida a enumeração de colônias. As colônias

apresentam-se vermelhas devido ao indicador que quando reduzido pelo

microrganismo passa de incolor para vermelho.

A tecnologia Petrifilm pode ser usada para a enumeração de: bactérias

aeróbias totais, coliformes totais e fecais, E. coli, enterobactérias, leveduras e

bolores e ainda bactérias láticas.

Os resultados podem ser obtidos em 24 horas sendo, em alguns casos,

necessário incubar por 48 horas. Leveduras e bolores podem ser enumerados,

sendo a incubação pelo período de 3-5 dias a 25°C (SANT’ANA; CONCEIÇÃO;

AZEREDO, 2002).

Entre as vantagens desse sistema, tem-se:

• Ser um sistema pronto para uso;

• Execução fácil e rápida, que dispensa a necessidade de preparo de meios de

cultura, do uso de placas de Petri e de equipamentos laboratoriais especiais;

• Custo baixo;

• Obtenção rápida dos resultados.

A Fig. 2 mostra as placas Petrifilm ilustrando que cada placa tem ainda um

filme superior de polipropileno e, como é observado o resultado final,

respectivamente,

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Figura 2. Placas PetrifilmTM prontas para uso.Fonte: Google Imagens (Placas Petrifilm), 2008.

3.1.2 Métodos de contagem indireta

Além das técnicas diretas os analistas têm a seu dispor diversas técnicas

alternativas indiretas, baseadas na medição da atividade metabólica dos

microrganismos nos alimentos. Nestas técnicas os microrganismos presentes são

quantificados através da dosagem de determinados produtos metabólicos, que

produzem quando se multiplicam nos alimentos ou, ainda, através de medidas de

alterações físicas ocorridas durante este processo. Estas técnicas exigem a

construção de curvas-padrão, nas quais se faz a correlação entre os parâmetros

medidos e o número de células viáveis presentes. O princípio básico é quanto maior

o número de microrganismos presentes mais intenso é o fenômeno medido, desta

maneira quanto maior for o nível de contaminação de um produto, menor é o tempo

de retenção.

Através destas técnicas, teoricamente, é possível detectar a presença de até

uma célula viável na amostra em teste (FRANCO et al., 1992).

3.1.2.1 Bioluminescência

Esta técnica está baseada no princípio de que a quantidade de Adenosina

Trifosfato (ATP) presente em um sistema está relacionada ao numero de células

metabolicamente ativas, inclusive microrganismos. Uma das formas mais simples de

se medir a quantidade de ATP é através do sistema luciferina-luciferase, inicialmente

obtido da cauda de vagalumes ou extraído de peixes e, mais recentemente, obtido

Page 20: 90695281 Metodos Rapidos de Analise Micro Biologic A

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por manipulação genética de microrganismos. ATP reage com a enzima luciferase,

na presença de luciferina e íons Mg++, formando um complexo que, em contato com

o oxigênio, sofre uma descarboxilação, com emissão simultânea de luz.

A luz emitida pode ser medida em luminômetro, um fluorímetro ou em um

espectrofotômetro de cintilação líquida, podendo ser expressa através da seguinte

reação:

Mg+2

E + LH2 + ATP E - LH2 - AMP + PP

E - LH2 - AMP + O2 oxiluciferina + CO2 + AMP + luz

E = enzima luciferase, LH2 = luciferina , E - LH2 - AMP = complexo luciferase-

luciferina-AMP

Equação 1. Reações que ocorrem durante o ensaio de bioluminescência.

Uma das grandes aplicações dessa técnica é o monitoramento da eficiência

de procedimentos de limpeza e higienização em plantas processadoras de alimentos

(FRANCO; LANDGRAF, 1996).

Esta técnica é bastante conveniente no monitoramento de programas de

APPCC (análise de perigos e pontos críticos de controle).

Apresenta como vantagens:

- Fácil leitura, com valores máximos e mínimos;

- Resultados em minutos;

- Sistema portátil, fácil transporte;

- Fácil utilização, qualquer pessoa pode usar;

- Capacidade de armazenamento de dados (memória);

- Não necessita adição de soluções;

- Medição exata da quantidade de ATP.

3.1.2.2 Impedância/Condutância

São baseadas na propriedade que os microrganismos têm de alterar a

transmissão da corrente elétrica através de um meio de cultura. Essas alterações

ocorrem como conseqüência da mudança da composição química desse meio

Page 21: 90695281 Metodos Rapidos de Analise Micro Biologic A

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devido à atividade metabólica dos microrganismos presentes. Durante a

multiplicação microbiana, moléculas grandes (proteínas, lipídeos, carboidratos) são

transformadas em moléculas menores (aminoácidos, ácidos graxos, ácidos

orgânicos), quimicamente mais ativas; o acúmulo desses metabólitos finais resulta

em alterações mensuráveis na condutância e impedância elétrica do meio

(SILVEIRA, 2006).

São exemplos de equipamentos o Bactometer (bioMéurieux), RABIT (Don

Whitley Scientific) e o Malthus 2000 (Malthus Instrumments).

3.1.2.3 Placas SIMPLATETM

Técnica alternativa para a enumeração de bactérias totais, coliformes,

Escherichia coli, bolores e leveduras em alimentos. As placas são plásticas e

apresentam 84 ou 198 câmaras, às quais se adicionam alíquotas da amostra em

análise e o meio de cultura Simplate. As placas são incubadas a 35ºC por 24 horas.

A contagem de bolores e leveduras e bactérias mesófilas são realizadas

enumerando-se as câmaras que apresentam fluorescência sob luz UV. Coloração

púrpura indica presença de coliformes totais e fluorescência sob luz UV presença de

Escherichia coli. O número de microrganismos é determinado através de uma

tabela, expressando-se o NMP.g-1 ou mL-1 de alimento analisado (SILVA; GALLO,

2003).

3.2 Métodos para avaliar a inocuidade

3.2.1 Métodos Bioquímicos

São baseados na avaliação da capacidade dos microrganismos de utilizarem

determinados substratos ou de produzirem determinados metabólitos. Existem no

mercado diversos “kits”, na maioria miniaturizados, onde os testes são executados

com pequenos volumes de meio de cultura, os quais se encontram na forma

desidratada ou liofilizada, e são reidratados pela adição de pequeno volume da

Page 22: 90695281 Metodos Rapidos de Analise Micro Biologic A

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amostra a ser testada. Após a incubação faz-se a leitura dos resultados,

normalmente através de uma combinação de números obtida de acordo com o

resultado de cada um dos testes que faz parte do sistema. Cada combinação de

números corresponde a um microrganismo diferente (MACHADO, 2007).

3.2.2 Métodos Imunológicos

Esses métodos apresentam grande sensibilidade e elevada especificidade e,

em função disso, vêm sendo empregados cada vez mais em microbiologia de

alimentos. São baseados em reações específicas entre antígenos e anticorpos, os

quais podem ser poli ou monoclonais. Os principais métodos imunológicos são

descritos abaixo (SILVEIRA, 2006).

3.2.2.1 Ensaios imunoenzimáticos

Nesses ensaios um dos reagentes, antígeno ou anticorpo, fica adsorvido a

superfície de uma matriz sólida (esferas de poliestireno, placas de microtitulação,

partículas metálicas revestidas de policarbonato e outras). A reação é baseada na

ligação não covalente e reversível do antígeno com o anticorpo específico, no qual

um desses reagentes é marcado com uma enzima, normalmente cromogênica, ou

seja, que age em reações que resultam no desenvolvimento de cor. A cor formada

pode ser observada a olho nu ou em espectrofotômetro. Dois tipos de ensaios

imunoenzimáticos são mais comumente utilizados: competitivo e não competitivo. O

tipo não competitivo, também conhecido como tipo Sanduíche, é o mais utilizado nos

sistemas de triagem de microrganismos patogênicos em alimentos (SILVEIRA,

2006).

Existe no mercado um grande número de sistemas comerciais baseados em

técnicas imunoenzimáticas, conforme a Tab. 1, a seguir.

Tabela 1 – Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimáticos

encontrados no mercado

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23

Fonte: MACHADO, 2007.

3.2.2.2 Imunocaptura

Também chamada de imunoseparação magnética, nessa técnica os

anticorpos ficam ligados a partículas metálicas recobertas com policarbonato. Após

a ligação com o antígeno específico, as partículas metálicas são atraídas por um

imã, permitindo que o restante do material seja removido. Após a retirada do imã,

obtém-se um produto concentrado que pode, então, ser submetido aos testes de

escolha para pesquisa do microrganismo de interesse. Essa técnica, quando

aplicada diretamente em alimentos pode reduzir, ou mesmo substituir a etapa de

pré-enriquecimento, sempre necessária quando se pretende investigar a presença

de microrganismos patogênicos em alimentos por métodos convencionais (SILVA,

1996).

3.2.2.3 Imunoimobilização

Nessa técnica, bactérias móveis cultivadas em meio semi-sólido têm sua

mobilidade bloqueada pela adição de anticorpos flagelares específicos. Há formação

de uma banda de precipitação visível na interface anticorpo-bactéria.

3.2.2.4 Coaglutinação

SISTEMA FABRICANTESalmonella-Tek, Listeria-Tek, EHEC-Teck Organon Teknika

Listeria-Via, Salmonella-Via, EHEC-Via, S. aureus-

Via

Tecra

Unique Salmonella, Unique Listeria TecraECOLI Difcro

Listeria Rapid Test Oxoid REVEAL Listeria, Salmonella e E. coli Neogen

Vip E. coli BiocontrolVIDAS Siatema Salmonella, Listeria, E. coli e E.

aureus

bioMéuriex

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24

Essa técnica é baseada na aglutinação de partículas de látex sensibilizadas

com anticorpos antitoxinas. Também são conhecidas como reações de aglutinação

de látex ou aglutinação passiva reversa.

3.2.2.5 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

É um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos

específicos no soro. Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças

infecciosas uma vez que vários agentes patológicos induzem a produção de

anticorpos (imunoglobulinas) por parte dos linfócitos B do sistema imunológico

humoral humano.

Este é o teste de primeira linha no diagnóstico da infecção pelo HIV vírus da

SIDA/AIDS, estes testes até a sua terceira geração só detectavam a presença de

anticorpos (IgG e IgM) três ou quatro semanas após o contato, no entanto, os testes

de quarta geração já detectam tanto anticorpos como um dos antígenos do HIV - a

proteína p24 - fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janela

imunológica, podendo chegar a apenas duas semanas.

Um resultado positivo num teste de ELISA é sempre confirmado por outros

testes específicos como é o caso do Western blot, que detecta proteínas do vírus, e

do PCR, que detecta os ácidos nucleicos virais.

O teste ELISA também pode ser utilizado de diversas outras formas.

Utilizando-se de um método semelhante ao método de Imunoradioensaio, pode-se

transformar muitas outras substâncias em antígeno e obter um anticorpo do mesmo.

Assim, é possível utilizar o teste para se detectar outras substâncias de interesse

como, por exemplo, hormônios. Pelo fato do radioimunoensaio ser muito caro, o

teste ELISA pode ser uma alternativa muito mais simples e barata.

O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-

antígeno. Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde

serão adsorvidas as proteínas de interesse. Depois é realizada uma lavagem com

uma proteína inespecífica para que esta ocupe os poços livres. A superfície é então

tratada com solução de anticorpo primário, sabendo-se que exista uma quantidade

maior de anticorpo do que a proteína, específico para a proteína de interesse e este

vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos

primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. Em seguida o produto

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25

é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá

produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo

primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário

que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a

enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da

superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de

interesse (SIMERSKY,2000).

A Fig. 3 mostra ilustrativamente como ocorre a reação específica entre o

antígeno e o anticorpo.

Figura 3. Reação antígeno e anticorpo que ocorre no “Kit” ELISA.

Fonte: Google Imagens (ELISA), 2008.A figura acima, mostra como é possível estabelecer a concentração do analito

em questão, ou seja quanto maior a intensidade da cor emitida pela enzima

cromogênica, menor é a concentração do analito, uma vez que, a enzima

cromogênica liga-se á enzima conjugada. A concentração é obtida através de uma

curva de calibração (Absorbancia x concentração), sendo porém inversamente

proporcional a quantidade do analito.

3.2.3 Métodos Moleculares

3.2.3.1 Sondas genéticas

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26

Nessa técnica é necessário submeter os microrganismos a um tratamento em

que seu material genético é liberado e separado em duas fitas simples. Em seguida,

adicionam-se sondas, que são fragmentos de DNA ou RNA específicos para o

patógeno alvo, marcadas com enzimas, normalmente cromogênicas e, quando há

hibridização com a sonda, há desenvolvimento de cor e, portanto, a presença do

microrganismo investigado é detectada (MACHADO, 2007).

3.2.3.2 Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)

É uma técnica muito utilizada em microbiologia para amplificação do material

genético de microrganismos.

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de

análise e por isso é realizada com muito cuidado para evitar contaminações que

possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair

o material genético da célula ou outro material a ser estudado sem danificá-lo.

Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA

(ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras

aplicações (FUNG, 2002).

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também

conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos

trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com três fosfato, os primers

também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA

polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador,

o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos

para cada reação (fragmento a ser amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96ºC, por pouco

tempo, para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na

segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC, dependendo da

quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem

(pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a

temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima possa funcionar sintetizando a

nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são

realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é

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27

exponencial 2ciclo. O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de

agarose ou de poliacrilamida (figura 4).

Figura 4. Eletroforese em gel de agarose. Fonte: Google Imagens (PCR), 2008.

Atualmente existem outras técnicas mais rápidas que a PCR, como por

exemplo o Bax Sisten o qual é um sistema automatizado de PCR real-time,

baseado em DNA para análises microbiológicas de Salmonella, E.Coli 0157:H7,

Listeria Monocytogenes, Listeria.sp, Enterobacter.sakazakii, Campylobacter

jejuni/coli, Bolores e Leveduras. Roda de uma a noventa e seis análises por vez,

com resultados disponíveis em cerca de 3 horas e meia. Essa técnica avalia a

característica genética da bactéria, o que aumenta a capacidade e a estabilidade do

método de uma forma única, pois as variações do meio, flora acompanhante e

outras variáveis têm as suas influências reduzidas a praticamente zero (YUSTE;

FUNG, 2007).

A Fig. 5 mostra, ilustrativamente, a técnica acima citada, onde a leitura é feita

diretamente na tela do aparelho, ou seja não há a necessidade de realizar uma

eletroforese, como na técnica de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR).

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28

Figura 5. Bax® System, sistema automatizado de PCR real timeFonte: Google Imagens (Sistema Bax Sistem), 2008.

3.2.3.3 Bacteriófagos com DNA modificado

Esses bacteriófagos carregam informação genética para a síntese de

proteínas especiais, responsáveis pela formação de cristais de gelo, quando a

amostra é resfriada adequadamente. Esse princípio é utilizado em um teste para

Salmonella e, quando esse microrganismo está presente na amostra, os

bacteriófagos se ligam a Salmonella e o material genético é introduzido na bactéria,

que passa a sintetizar proteínas especiais. A formação dos cristais de gelo provoca

alteração na coloração do meio, facilmente observada a olho nu (MACHADO, 2007).

3.2.3.4 Ribotipagem

É feita em um equipamento sofisticado, totalmente automatizado, no qual

bactérias podem ser identificadas rapidamente (menos de 8 horas) em nível de

espécie. Virtualmente qualquer bactéria pode ser identificada por esse método.

Como exemplo pode-se citar o Riboprinter® System da DuPont Qualicon é a

única tecnologia no mercado capaz de identificar e caracterizar bactérias de forma

automatizada, além de criar um banco de dados digital. O processo se baseia na

ribotipagem, ou seja, na análise e comparação de DNA-RNA oferecendo assim, um

alto poder discriminatório pela diferenciação em nível genético.

A Fig. 6 ilustra o equipamento da Riboprinter® System da DuPont Qualicon.

Figura 6. Riboprinter® System da DuPont Qualicon, usado para identificar e caracterizar bactérias de forma automatizada.Fonte: Google imagens (Ribotipagem), 2008.

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29

Com este equipamento é possível realizar a rastreabilidade completa do

microrganismo em questão, identificando a fonte e causa da contaminação de uma

maneira direta e indubitável, pois fornece um perfil genético de cada uma das

bactérias implicadas, permitindo que as bactérias com o ribogrupo coincidente sejam

identificadas e a causa do problema prevenida e/ou eliminada (FRANCO et al,

1996).

4. Conclusões

A partir do estudo realizado, observou-se que o controle e segurança da

qualidade dos alimentos tem sido um dos grandes desafios colocados á indústria

alimentar. Logo, devido à necessidade de rapidez de resultados, hoje, já são

encontrados no mercado varias técnicas que possibilitam resultados muito rápidos,

essas técnicas são conhecidas por “métodos rápidos de análise microbiológica”, os

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30

mais usados na área da pesquisa são PCR, o ELISA, placas petrifilm e placas

simplate.

Os métodos rápidos possuem muitas vantagens, como boa exatidão, além de

minimizar os custos de uma empresa, sendo de rápida e fácil leitura, porém,

possuem algumas desvantagens, como o elevados custo de algumas técnicas e

mesmo aqueles já aprovados pela AOAC, os resultados positivos ainda não são

considerados confirmatórios.

No entanto, torna-se imprescindível, não só aos microbiologistas, mas a todos

da área de alimentos, estarem interados com essas novas técnicas, pois estas vêm

crescendo, substituindo, em parte, os métodos convencionais aplicados na maioria

dos laboratórios de microbiologia de alimentos.

Referências

BRASIL. Resulução RDC n° 12, de 02 de janeiro de 2001. Regulamento técnico

sobre padões microbiológicos para alimentos. Diário oficial da República do

Brasil, Brasil, n° 7, p. 46-53, 2001.

Page 31: 90695281 Metodos Rapidos de Analise Micro Biologic A

31

FENG, P. Rapid methods for detecting food borne pothogenes. In: FOOD AND

DRUG ADMINISTRATION. Bacteriological analytical manual. 8.ed.

Gaithersburg: AOAC International, v.1, 1995.

FUNG, D. Y. C. et al. Hands-free “Pop-up” adhesive type method for microbial

sampling of meat surfaces. Journal of Rapid Methods and Automation in

Microbiology. v. 8, n. 3, p. 209-217, 2000.

FUNG, D.Y.C. Rapid Methods and Automation in Microbiology.Comprehensive

Reviews in Food Science and Food Safety, v.1, p. 2-32, 2002.

FRANCO, B. D. M. Métodos convencionais de análise microbiológica de

alimentos. 1999. p 1-18.

FRANCO, B. D. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia de alimentos. São Paulo:

Atheneu, 1996. 182p.

FRANCO, B. D. M. et al. Visão geral sobre novos métodos em microbiologia de

alimentos. Boletim da Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de

Alimentos. v. 26, n.1, p.45-66, jan-jun. 1992.

FRAQUEZA, M. J. Rapid methods applied to microbial food control. Proceedings

of the Veterinary Sciences Congress, p. 279-278, 2002.

HAJDENWURCEL, J. R. Atlas de microbiologia de alimentos. São Paulo:

Fonte Comunicação e Editora, 66 p,1998.

MACHADO, M. G. Métodos de análise microbiológica de alimentos. Apostila da

disciplina de microbiologia de alimentos, Universidade Federal de Pelotas, p.

1-8, 2007,

PELCZAR JR, M. J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e

aplicações. São Paulo: Mc Graw-Hill, 2.ed. v. 2, p. 372-397, 1997.

Page 32: 90695281 Metodos Rapidos de Analise Micro Biologic A

32

SANT’ANA, A. S.; CONCEIÇÃO, C.; AZEREDO, D. R. P. Comparação entre os

métodos rápidos Simplate e Petrifilm e os métodos convencionais de contagem

em placas para a enumeração de aeróbio mesófilos em sorvetes. 2002. Revista

Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 1 n. 22, p.60-64, 2002.

SILVA, M. C.; GALLO, C. R. Avaliação da qualidade microbiológica de alimentos

com a utilização de métodos convencionais e do sistema simplate. Revista

Higiene Alimentar. v. 17, n. 107, p. 75-85, 2003.

SILVA, N. Novos métodos de análise microbiológica de alimentos. Coletânea do

ITAL. v. 25, n.1, p.1-13, jan-jun. 1996.

SILVEIRA, N. F. A. Aplicação de métodos rápidos para o controle microbiológico.

Seminário Food design: tendências em HACCP. ITAL. p. 1-43, 2006.

SILVERA, N.F.A; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVA, N. Manual de métodos de

análise microbiológica de alimentos. São Paulo: Varela, 259 p. 1997.

SIMERSKY ,R. et al. Development of and ELISA-based kit for on-farm

determination of progesterone in milk, 2000.

YUSTE, J.; FUNG, Y. M. Métodos rápidos y automatización en microbiología

alimentaria. Alimentaria, p. 78-80, 2007.