TEMA 15: Fecundación: Importancia de la sincronización. Maduración del ovocito Regulación de la traducción. Regulación del transporte del ovocito hacia la ampolla y sus alteraciones. Transporte del espermatozoide. Capacitación espermática. Termotaxis. Quimiotaxis. Reacción acrosoma. Interacción espermatozoide- zona pelúcida. Bloqueo de la poliespermia. Reprogramación del material genético, Huella genética (imprinting). Marcadores genéticos de viabilidad embrionaria.

INTRODUCCIÓN

La fecundación supone la unión de dos células haploides para la formación de una célula diploide. Este proceso puede ser interno (en mamíferos, en ampolla del oviducto) o externo (ej en animales acuáticos).

El ovocito, para que sea fecundado, se somete debe madrurar en su viaje a la ampolla del oviducto. El espermatozoide madura en el epidídimo y se capacita en el extremo distal del cuerno uterino (cerca del oviducto).

A la región de la ampolla del oviducto llegan pocos espermatozoides, es decir, que sufren un proceso de selección por el camino.

MADURACIÓN DEL OVOCITO

El ovocito está rodeado, desde el interior al exterior, por:

- Membrana vitelina .- Zona pelúcida : con glicoproteínas y receptores ZP con funciones protectoras. Receptores de

espermatozoides y funciones protectoras. Regula la comunicación entre el ovocito y las células del cumulus oophorus.

- Células de cumulus oophorus : tienen acido hialurónico, están unidas al ovocito por uniones GAP y vellosidades para transportar vesículas. Además tiene proteínas (factor sérico interα-1) que estabiliza el ácido hialurónico. A medida que el ovocito madura, se produce la expansión de las células del cumulus (factor de expansión de las células del cumulus oophorus).

Señales del ovocito: el cúmulus oophorus libera señales:

- Estrógenos.- Prostaglandinas (regulan desplazamiento)- Oxitocina: algunas especies.- Regulación de la maduración del ovocito: Factor de crecimiento (algunas especies), ligando

KIT, estrógenos/prostaglandinas.

Las células del cumulus liberan estrógenos, progesterona, prostaglandinas… actuando en las células del oviducto, regulando el movimiento de sus cilios. También generan factores de crecimiento que regulan la maduración (como el ligando kit) del ovocito. El ovocito libera una serie de señales orientadas a atraer los espermatozoides por quimiotaxis, como el factor natriurético atrial, la progesterona, el compuesto RANTES (en humana)…

Para favorecer el movimiento:

- Inhibidores de proteasas: regulan la reacción acrosómica en el espermatozoide (impiden que se produzca de forma anticipada).

- Señales que atraen a los espermatozoides: como las prostaglandinas, factor nartiurético atrial

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Los espermatozoides tienen unos receptores similares a los olfativos que activan este proceso de atracción.

Las células del cumulus oophorus están unidas entre sí por madejas de ácido hialurónico que, a su vez, se unen covalentemente a un factor que le da estabilidad (el factor sérico inhibidor de la tripsina inter α1), que también inhibe proteasas e impide que la reacción acrosómica del espermatozoide se desarrolle antes de tiempo.

Denominamos ovocito a la célula sin fecundar , en cambio el óvulo es el ovocito fecundado durante 48 horas postfecundación. Tras estas 48 horas se denomina embrión hasta los 30-40 días de fecundación y, tras este periodo, feto (varía según la especie).

La maduración del ovocito comprende un proceso de división (mitosis) y uno de diferenciación (meiosis).

PROCESO DE MADURACIÓN DEL OVOCITO

Durante la maduración del ovocito se produce: maduración citoplasmática de la célula + maduración nuclear celular + maduración epigenética + expansión de las células del cumulus oophorus.

Las células de cumulus oophorus se expanden, porque disminuye la proteína estabilizante y aumentan las proteínas de expansión. También aumenta la LH y disminuye la formación de conexinas (uniones GAP).

1. Maduración Citoplasmática : en el momento de la ovulación se liberan señales del cumulus oophorus para incrementar el numero de receptores ZP y el ácido hialurónico.

Se caracteriza porque aumenta el tamaño del ovocito, el núcleo pasa a una posición central, se establecen microtúbulos que facilitan el desplazamiento de los gránulos corticales hacia la periferia y las mitocondrias pasan a una posición central, cerca del núcleo (generan mucho ATP para la meiosis). El ovocito “ordena” sus orgánulos:

- Núcleo central- Gránulos en periferia- Mitocondrias centrales- Otros: REL cerca del núcleo (acumula Ca2+), acúmulo de glutatión en citoplasma,..

2. Maduración nuclear

Se produce la meiosis o mecanismo de alteración del número de cromosomas de la célula. Alteraciones en la meiosis dan lugar a distintas patologías, como el Síndrome de Turner (alteración en el número de cromosomas sexuales).

3. Maduración Epigenética (=reprogramación del material genético)

Las células germinales no se encuentran en el feto, sino en la placenta, de donde viajan al feto liberando proteasas (capacidad migratoria) y dividiéndose hasta llegar a los conductos mesonéfricos (esbozos gonadales), donde se dividen de nuevo un número determinado de veces (alrededor de 20, acortándose los telómeros). Una vez aquí se denominan ovogonias, en caso de hembra. En esta división, se corrigen alteraciones en el ADN por las proteínas P53, P63 y P73.

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Durante el viaje se dividen y programan estas células y una vez que llegan a los conductos mesonéfricos, estos liberan inhibidores de las proteasas que detienen la migración. Si la migración no se realiza de forma correcta y las células germinales viajan a otras localidades, no se produce este efecto de inhibición y existe riesgo de tumor.

Durante la migración se van dividiendo y programando y finalmente se convierten en espermiogonia o gametogonia. Lo hacen por la programación genética, es decir que hay genes que se expresan o no según su grado de metilación.

En la reprogramación:

- Se retiran todos los grupos metilo (desmetilan): por la desacetilasa, slienciación de genes.- En función de las señales y del sexo (XX o XY): se expresan unos genes y se silencian otros.

La reprogramación ocurre dos veces.

Este proceso ocurre justo después de la fecundación (cuando las células germinales viajan al embrión). Las células germinales están en la placenta, luego viajan al feto y muchas mueren, pero antes se comunican entre sí.

Esta reprogramación del material genético se conoce como maduración epigenética.

Estas células se dividen un determinado número de veces, sobre todo en la hembra. Sufren un proceso de meiosis, único en las células germinales. Es un mecanismo para transformar una célula diploide en haploide:

- Machos: 4 células haploides.- Hembras: 1 célula haploide.

Meiosis en macho (izq) y en hembra (dcha). En la hembra, se liberan dos corpúsculos polares correspondientes a la primera y segunda división respectivamente.

La meiosis en el macho ocurre de forma continua, mientras que en la hembra es estacionada, es decir, hay paradas y reinicios. Estas paradas favorecen las alteraciones en el material genético.

Tanto en hembras como en machos hay meiosis I y II.

Fases:

- Duplicación del material genético (mitosis, en el desarrollo embrionario)- Meiosis I.- Meiosis II.

En la hembra son dos fases asimétricas, se forman los corpúsculos polares (formados por material genético y escaso citoplasma) orientados a formar una célula con un gran citoplasma, por lo que tiene más nutrientes para vivir mucho tiempo y generar el embrión. Un fallo en la liberación de uno o de los dos corpúsculos polares puede dar lugar a células triploides o tetraploides (con tres o cuatro dotaciones cromosómicas) el ovocito entra en apoptosis. Tetrapoide seria si no se liberan los dos corpúsculos polares y es fecundado.

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Si el corpúsculo polar demasiado grande: Corpusculo polar que acapara demasiado citoplasma puede dejar al ovocito desprovisto del citoplasma necesario para sobrevivir.

Meiosis I a la izquierda y meiosis II a la derecha.

La meiosis en la hembra es muy distinta a la meiosis en el macho.

Diferencias en la meiosis en las hembras y los machos:

1. Inicio de la meiosis : en el desarrollo fetal en la hembra y en la pubertad en el macho (en la pubertad se inicia la síntesis de espermatozoides)

Acido retinoico (Vit A activa): señal de inicio de la meiosis, generada por las células del mesonefros en la hembra fetal. Esta señal también es importante en el machoCélulas de Sertoli en el macho: producen proteasas que rompen el ácido retinoico hasta llegar la pubertad. En la pubertad la FSH inhibe entonces estas proteasas inhibidoras (regulado por el reloj interno).

2. Características . En la hembra la meiosis es escalonada, es decir, que se frena y dura años. Es LENTA. En los machos la meiosis es rápida y no se frena.

3. Las divisiones de la meiosis no son simétricas en la hembra mientras que sí lo son en el macho. En el macho da lugar a 4 células haploides iguales, mientras que en la hembra solo se da una célula haploide y 2 corpúsculos polares con los restos nucleares de la división.

Hembra Macho

Inicio meiosis

(ambos: importancia del ácido retinoico)

Desarrollo fetal Pubertad

Características meiosis Lenta, escalonada Rápida, no escalonada

Divisiones Asimétricas (1 + 2 corpúsculos polares)

Simétricas (4)

En la hembra las células germinales se dividen hasta 20 veces, acortando sus telómeros, antes de iniciar la meiosis:

- Se frena en profase I (meiosis I). Aquí se encuentra en el momento del nacimiento.

- Hasta la pubertad: se encuentra en periodo quiescente hasta el pico de LH (aumenta el AMPc y el Ca). Esta es la señal para la reanudación de la

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meiosis hasta la fase de metafase II (meiosis II), donde se frena de nuevo. En la metafase II el ovocito es maduro, es decir, fecundable. La liberación del primer corpúsculo polar se produce en la ovulación.

- En la fecundación, la entrada del espermatozoide en la célula provoca un aumento intracelular de Ca2+, reiniciando de nuevo la meiosis y liberándose el segundo corpúsculo polar.

Si no se libera el primer y segundo corpúsculo polar, la célula resultaría ser tetraploide y el ovocito entraría en apoptosis.

En carnívoros y yegua: durante la ovulación el ovocito es muy inmaduro, estadio poco avanzado de la meiosis y necesita más maduración.

INTERRUPTOR DE LA MEIOSIS

La regulación del inicio de la meiosis se debe a la actividad de fosfatasas y a los niveles de ciclina B.

Al complejo CDK1 ( también conocida como cdc2) y ciclina B se le llama MPF (Este interruptor también existe en la mitosis). Este interruptor aparece apagado largos periodos de tiempo en el caso de las hembras.

Básicamente la activación del sistema depende del grado de fosforilación y de la disponibilidad de ciclina B.

El AMPc inhibe el sistema mediante la activación de proteínas quinasas (PKA, Wee1 , Myt1); mientras que el calcio activa el sistema porque activa fosfatasas (Cdc 25). El interruptor se activa por defosforilación.

La disponibilidad de ciclina B se encuentra regulada por:

- Grado de expresión gen que codifica ciclina B - Traducción mRNA ciclina B- Destrucción de ciclina B (separasa y otras proteasas...)

Localización: la ciclina B tiene que ser transportada al núcleo.

Las proteínas kinasas fosforilan, las fosfatasas defosforilan de forma que las kinasas permiten inactivar el sistema y las fosfatasas lo activan.

El AMPc activa la PK-A, por lo que inhibe la meiosis. Este AMPc puede generarse dentro del ovocito o puede generarse en las células del cumulus oophorus, entrando en el ovocito por las uniones GAP.

Algunas hormonas, como la LH, inducen la meiosis. La LH aumenta en la ovulación, al actuar sobre las células disminuye las uniones GAP, disminuye el AMPc (porque activa fosfodiesterasas que eliminan el AMPc), formando un metabolito inocuo y esteroles (que secuestran el AMPc). La LH, por tanto, provoca un aumento del calcio intracelular, activa fosfatasas que defosforilan y reactivan la meiosis.

El AMPc inhibe la meiosis, puede pasar al ovocito por el cumulo oophorus, pero también por un receptor (GPR3).

La LH actúa sobre las células del cumulus oophorus que liberan factores de crecimiento.

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Si los niveles de calcio son muy elevados, se activa una ubiquitina que destruye la securina, se forma el complejo anafase-profase o Ciclosoma. Si sigue aumentando el calcio, se generan ubiquitinas y destruye la ciclina B y, por tanto, frena la meiosis.

Una vez que la célula inicia la meiosis, esta se completa o la célula muere por apoptosis, es un proceso irreversible. Al contrario que la mitosis (que tiene muchos puntos de control), la meiosis no los tiene, por lo que se producen muchas alteraciones (sobretodo en el proceso de entrecruzamiento.

Una vez completa la meiosis, se recombina el pronucleo femenino (con la información genética) con el pronucleo masculino.

RECOMBINACION GENÉTICA

En la meiosis se produce una replicación del material genético (se duplica) y luego se da el entrecruzamiento, intercambiando la información genética del extremo distal de los cromosomas (región pseudoautosómica).

Proceso de recombinación:

- Emparejamiento de homólogos: se comprueba la unión al huso acromático, la tensión adecuada del mismo y la correcta orientación de los cromosomas. Este paso falla en 1% de los individuos (en pediátricos, en mujeres > 33 años,..)

- Cohesinas: unen ambos cromosomas por la región pseudoautosómica. Están muy desprotegidas en determinadas zonas y protegidas en otras. La separasa rompe las cohesinas y favorece el proceso de la meiosis. Existe en gran concentración en la región de los centrómeros (región central). Las separasas están inhibidas por la securina, pero si la separasa está muy activa, podría afectar a las cohesinas cercanas al centrómero y propiciar el

NOTA:

- los niveles bajos de LH provocan un aumento en AMPc y los niveles preovulatorios de LH producen un aumento de calcio.

- El calcio activa fosfatasas, disminuye y cierra las uniones GAP- El calcio activa el complejo anafase profase ciclosoma APC/C

Se reinicia la meiosis pero pronto se vuelve a parar por que el APC/C, destruye la securina, se activa la separasa que destruye la ciclina B (entonces la meiosis se frena) y tambien destruyen las cohesinas de la region pseudoautosimica con lo que se separan los cromosomas homologos (en la meiosis I) o las cromatidas hermanas en la (meioisis II).

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entrecruzamiento de genes que no deben entrecruzarse, dando lugar a alteraciones (ej trisomías).

- Se produce un aumento en los niveles de calcio. Se activa el complejo anafase profase ciclosoma (APC/C ó APC) que actúa como una ubiquitina ligasa y provoca la destrucción de la securina (que a su vez inhibe la separasa y la p53) y de la ciclina B facilitando la unión de la ubiquitina (ub). Como consecuencia de la destrucción de la ciclina B se frena momentáneamente la meiosis, como consecuencia de la ubiquitinización de la securina (ó segurina) se activa la separasa que rompe las cohesinas y se produce las disyunción de los cromosomas homólogos (MI) o cromátidas hermanas (MII) finalmente se activa p 53 que detecta alteraciones.

Alteraciones debidas a disfunción de la separasa:

- debido a la no actuación de la separasa. No se separan las cromátidas homólogas- actuación antes de tiempo. No se lleva a cabo separaciones adecuadas de los cromosomas.

En ambos casos, se trata de alteraciones significativas de la meiosis.

Alteraciones frecuentes de la meiosis:

1. Reversión del sexo . Ej XX que se desarrolla como macho. - Uno de los X tiene el gen SRY que determina el sexo masculino. Normalmente se

encuentra en el gen Y, cerca del centrómero (no se realiza el entrecruzamiento habitualmente).

- Si pasa al cromosoma X, es porque se ha producido el entrecruzamiento en regiones no pseudoautosómicas

- Es relativamente frecuente en humanos. Sin embargo, es poco frecuente en animales. 2. Aneuploidía : variación en el número de cromosomas de un

individuo.- Si es el cromosoma sexual: el individuo sobrevive, con

alteraciones. Se puede producir monosomía del cromosoma sexual. Ej Síndrome de Turner en humanos (X-), imagen derecha arriba.

- Trisomías. Ej XXY o Síndrome de Klinefelter. Se trata de hombres con ginecomastia, testículos pequeños, sin barba, vello pubiano disminuido o siguiendo un claro patrón femenino, problemas reproductivos, reducida líbido sexual,… Otro ejemplo es el síndrome de down (trisomía en cromosoma 21)

- Nulisomía: falta de un par de cromosomas. Incompatible con la vida.

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3. Traslocación Robertsoniana : variaciones en el número de cromosomas que surgen por unión de dos cromosomas. Ej Vaca tiene 60 cromosomas. A veces se ven vacas con aparentemente 59 cromosomas. Esto es debido a la unión de los centrómeros de los cromosomas 1 y 29 (alteraciones en securina o separasa). 10% de abortos.

CARACTERÍSTICAS DEL OVOCITO MADURO

- La célula aumenta de tamaño y se produce un proceso de expansión de las células del cumulus oophorus porque en la ovulación aumenta la LH y disminuyen las uniones GAP entre las células del cumulus.

- Disminuyen los niveles del factor sérico inhibidor de la tripsina α1, que favorece la expansión del cumulus oophorus y disminuye la secreción del ácido hialurónico, lo que también favorece la expansión.

- El núcleo pasa de una posición periférica en la célula a una central.- Las mitocondrias que están en la periferia se desplazan hacia el centro, donde está el núcleo,

a través de los microtúbulos. Esto se debe a que las mitocondrias generan mucho ATP y Ca necesarios para desensamblar el núcleo de la célula, importante para la fecundación.

- Los gránulos corticales distribuidos por toda la célula, se desplazan a la periferia.- El ovocito está maduro al entrar en metafase II.- La maduración citoplasmática hace referencia a los cambios de las mitocondrias y los

gránulos corticales.- El ovocito durante su maduración, necesita unas proteínas determinadas en un momento

determinado de manera rápida. Se necesitan de un modo tan rápido que el propio ovocito es incapaz de sintetizarlas y, para ello, sintetiza mucho RNAm que almacena mucho tiempo, de forma que al necesitar una proteína determinada, traduce el RNAm (no necesita transcribirlo) y obtiene esas proteínas de forma rápida.

El ovocito envejecido:

- Experimenta un proceso de apoptosis y endurecimiento de la zona pelúcida.

- Se deterioran receptores ZP. (no conviene que el ovocito envejecido sea fecundado)

- Disminuyen señales de supervivencia como la Bcl-2.- Se reduce el contenido de ATP ya que se daña la membrana

mitocondrial.- No funcionan bombas que dependen del ATP, los niveles de

calcio aumentan en el citoplasma (mientras se reducen en el retículo endoplásmico que actúa como un reservorio de calcio).

- Disminuyen los niveles de MPF (Maturation-promoting factor)- El huso de meiosis presenta alteraciones.

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Pero como el calcio es tan elevado se activa el APC/C (Anaphase-promoting complex) y se puede producir la disyunción anómala del material genético (cromosomas o cromátidas que no se han separado adecuadamente migran hacia uno de los polos y acaban en una de las células hijas, mientras que la otra célula se queda sin ese material genético).

REGULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN EN EL OVOCITO

Durante dos antes y dos días después de la fecundación, el ovocito va a depender de la traducción del mRNA que tiene almacenado.

El factor de inicio de la traducción eIF4E interactúa con el residuo metilguanosina en la región cap (m7GpppN). Posteriormente actúan otros factores de inicio de la traducción eIF4G etc en un orden determinado y se unen a la proteína de unión a la cola poli A (Poli A Binding Protein, PABP).

El mRNA se circulariza lo que facilita la unión de varios ribosomas y adquiere una conformación muy estable (muy importante para la traducción).

La longitud de la cola poli A se encuentra directamente relacionada con la vida media del mRNA y con las posibilidades de ser traducido. De tal forma que el mRNA con la cola poli A corta es destruido y/o se deteriora (pero ocasionalmente se traduce gracias a la proteína DAZL).

Regulación de la traducción

La proteína de unión (4E-BP) cuando Esta poco fosforilada se une al factor de inicio de la traducción eIF4E e impide la unión de otros factores de inicio de la traducción y esta no se produce.

Sin embargo cuando esta muy fosforilada no se une al factor de inicio de la traducción y esta se desarrolla sin problemas.

La proteína FRAP/mTOR es mantenida inactiva por la Rapamicina. La Rapamicina se emplea de forma experimental en procesos oncológicos ya que inhibe la traducción, bloquea el ciclo en la fase G1 y lo que podría provocar la muerte de las células tumorales, inhibe la angiogénesis....

El mRNA que no se traduce ( permanece almacenado) lleva una secuencia rica en uracilos (UUUUUAU), y que se llama elemento de poliadenilacion citoplasmática (CPE). A esta secuencia se une la proteína de unión al elemento de poliadenilacion citoplasmática (CPEB) y una o varias proteínas que enmascaran físicamente al mRNA ( de tal forma que no es reconocido por los factores de inicio de la traducción). La primera en estudiarse fue Maskin ( en ovocitos de xenopus); c-Mos, tPA más frecuentes en mamíferos.

Cuando CPEB se activa (fosforilado por una proteína, quinasa Aurora A). Recluta y activa una poli A polimerasa que Alarga la cola poliA, luego se une la proteína de unión a la cola poli A y esta retira a maskin y facilita la unión de factores de inicio de la traducción. Se produce la traducción.

La presencia o ausencia de CPE determina su mRNA se almacena o se traduce.

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TRANSPORTE DE LOS GAMETOS A LA AMPOLLA DUCTAL

En esta ampolla se da la fecundación y es importante que esté sincronizada la llegada de ovocitos y espermatozoides.

EL OVOCITO

El ovocito sólo es fecundable 12 horas, después se da el proceso de endurecimiento de la zona pelúcida, en el que los receptores para los espermatozoides se dañan (receptores ZP), se altera la función de las mitocondrias y disminuyen los niveles de ATP, disminuyen los niveles de proteínas de supervivencia (bcl-2) aumentan los niveles de radicales libres, aumenta el Ca intracelular, disminuye el factor promotor de la meiosis (MPF y ciclina B), se sintetizan las proteínas de muerte celular y comienza la apoptosis.

El ovocito llega a la ampolla por las contracciones del oviducto, que tiene receptores α adrenérgicos, receptores para la oxitocina (que se libera en el coito), y receptores para la LH, ya que el ovocito no tiene flagelo. El pico de la LH dilata el infundíbulo (aumenta la irrigación) de manera que se disminuye el riesgo de caída a cavidad peritoneal. Los roedores tienen un abolsa periovarica.

El transporte del ovocito depende de varios factores:

- Vasodilatación : en el momento de la ovulación se produce vasodilatación, de forma que los vasos del infundíbulo abrazan el ovario para que el ovocito entre directamente en el oviducto.

- Capacidad contráctil del oviducto . El oviducto tiene receptores para:o LH.o Oxitocina: aumentan en el coito.o PGF2α.o Receptores adrenérgicos

Los más importantes en las contracciones del oviducto son la PGF2α y la oxitocina. - Movimiento de células ciliadas del oviducto : el ovocito dirige el movimiento de los cilios

mediante la liberación de:o Estrógenos: movimiento hacia el útero.o Progesterona: movimiento hacia el ovario

En función del grado de maduración del ovocito se liberan diferentes hormonas (estrógenos/progesterona) para llegar a la ampolla en el momento adecuado. Ej si está inmaduro, se libera más progesterona y si está maduro, más estrógenos.

El ovocito se debe adherir a los cilios durante un milisegundo. En aquellos ovocitos con alteraciones en el material genético disminuyen los elementos de adhesión, por lo que van a llegar más tarde a la ampolla. De forma que llegan cuando empiezan a degenerarse.

Para movilizar el ovocito las células del cumulus se adhieren a los cilios del ovocito unos segundos.

La nicotina (mujeres fumadoras) o el síndrome de los cilios inmóviles (animales o personas mayores) producen una disminución del movimiento de los cilios y se dificulta la sincronización. Como el ovocito no llega a la ampolla a tiempo, se dificulta la fecundación pero si es fecundado, hay un mayor riesgo de alteraciones en la separación de cromosomas (provocando una alteración en el número de cromosomas del feto).

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LOS ESPERMATOZOIDES

El desplazamiento del espermatozoide depende de muchos factores (volumen de eyaculado, lugar donde se deposita el eyaculado – que suele ser vagina en RU y roedores, o cerca del conducto cervical en cerdos y caballos). Los espermatozoides suelen avanzar unos 100 cm/h y, según la longitud del tracto genital, tardarán más o menos en llegar. Muchos espermatozoides se pierden por reflujo por la vagina.

En la vagina el pH es muy ácido (protección frente bacterias), el plasma seminal por el contrario tiene un pH básico, de esa forma los espermatozoides adquieren más movilidad.

En la mayoría de especies, la última fracción del eyaculado se coagula formando un tapón vaginal, que luego se licua. Esto es debido a la seminogelina. En casos especiales, forma un tapón que evita la pérdida de espermatozoides, por reflujo de la vagina, interfiere en la monta de un segundo macho... Este fenómeno se da mucho en roedores o en serpientes, primates, verracos...

Por lo tanto, dos formas de protección del semen frente al reflujo vaginal son:

- Formación del tapón seminal, típico de roedores. Interfiere con una posible monta de un segundo macho.

- Coagulación del eyaculado por altos niveles de seminogelina. Al cabo de 30 minutos, se licúa de nuevo.

Existe un fenómeno llamado guerra espermática, que se da en especies donde la hembra es cubierta por varios machos (especies promiscuas). Los espermatozoides de estos machos compiten entre sí. Así, en un mismo eyaculado hay varias poblaciones de espermatozoides:

- Espermatozoides kamicaze . Son espermatozoides rezagados del resto. Forman una red impenetrable para evitar la entrada de espermatozoides de un segundo macho. Esta acción la realizan creando una red física en el conducto cervical (ej roedores) y liberando enzimas que destruyen los espermatozoides del segundo macho. Además en su acrosoma tienen más de 20 enzimas que se liberan al paso de otros espermatozoides para dañarlos.Llevan el ligando Fas, actuando sobre los que tienen el receptor Fas (que también están alterados).

- Espermatozoides fértiles

Cooperativita espermática: entre los espermatozoides de un mismo macho, por ejemplo mediante unió de sus cabezas que permite la natación más rápida. Posteriormente, se liberan uno o dos que se dirigen a fecundar al ovocito. En los roedores se produce este fenómenos. Las cabezas de los espermatozoides se

Imagen de la derecha: tipos de espermatozoides. Espermatozoides con receptor fas, espermatozoides con ligando fas, espermatozoides con ambos y espermatozoides con ninguno.

En el macho alfa hay una gran concentración de espermatozoides kamikaze y gran cantidad de espermatozoides fértiles (sin ligando fas o receptor fas, el último de la imagen).

Estrategias, en especies polígamas (modificaciones en forma y número de espermatozoides,y modificaciones en plasma seminal)

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- Producir muchos espermatozoides: aumenta la probabilidad de fecundar.- Apendice uretralis: en rumiantes. Retira el tapón cervical del macho de la anterior monta.- Roedores: el macho detecta por el olfato si previamente la hembra ha sido montada. Si no es

asíU, libera pocos espermatozoides y, en la ultima fracción, libera una sustancia odorífera y evita la llegada de otros machos. Feromonas impregnadas sobre la hembra repelen a otros machos.

- Secuestro de la hembra en periodos cercanos a la ovulación.- Camélidos: sustancias para inducir la ovulación.- Carnívoros: no existen estos mecanismos. No hay guerra espermática. La perra tiene celos

muy largos y es montada por muchos machos. Tiene cachorros de distintos padres en una misma camada.

- Otras estrategias: alto contenido de detergente (disuelve el tapón cervical), modificaciones en el plasma seminal

o Aumento de elementos antioxidantes: aumenta la viabilidad del espermatozoide (ej superóxido dismutasa)

o Aumento del volumen del plasma seminal- Rumiantes: aumento del tamaño del testículo. Relacionado con número de espermatozoides.- Peleas entre machos: el macho dominante (macho alfa), provoca estrés en los subordinados. - Especies promiscuas: espermatozoides muy veloces (con cola de gran longitud y la cabeza

más pequeña)- Especies monógamas: cabeza de mayor tamaño y cola más pequeña. No se producen los

fenómenos de guerra espermática.

Que sea polígama o monógama depende del receptor de la vasopresina, en las polígamas tienen un alelo (alelo 334), de forma que el receptor de la vasopresina se expresa menos.

El conducto cervical tiene muchas funciones, como la de filtro y la de selección de espermatozoides. En este conducto hay muchas células del SI que destruyen los espermatozoides (especialmente los que tienen anticuerpos adheridos).

En el plasma seminal, hay sustancias inmunosupresoras que favorecen la supervivencia de los espermatozoides frente al SI de la hembra. En plasma seminal congelado se quitan parte de los elementos inmunosupresores y por eso hay más metritis, ya que el sistema inmune está más activo.

CONDUCTO CERVICAL

Cuando la eyaculación se realiza en vagina, los espermatozoides deben ascender por el conducto cervical. El pH de la vagina es muy ácido para protegerlo frente a bacterias. No obstante, el plasma seminal es muy básico y protege a los espermatozoides en su ascenso.

Los espermatozoides también pueden ser eliminados por el ligando fas, presente en el conducto cervical (los espermatozoides tienen muchos receptores fas). El conducto cervical se dilata por estrógenos y se contrae por la progesterona (si está gestante, así se produce la protección del feto).

Funciones del conducto cervical:

1. Función de filtro. Deja pasar espermatozoides perno el plasma seminal.2. Función de reservorio de los espermatozoides. 3. El conducto cervical tiene un papel en la selección de espermatozoides.

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FUNCIÓN DE FILTRO

Bajo la influencia de los estrógenos, el moco cervical forma haces paralelos, como pasillos que ayudan al paso de los espermatozoides. El pH es más ácido, lo que provoca que los grupos carboxi-terminal se repelan.

Con la progesterona, el pH es más básico, y los grupos carboxi-terminal del muchos pierden su carga negativa. De esta forma no se repelen y los filamentos de mucus forman un entramado impenetrable, de forma que se produce el cierre del cérvix.

Cambios en la disposición de las fibras del mucus cervical:

Fase luteínica: madeja impenetrable para espermatozoides y moco más denso. El COOH no pierde al H, queda neutro y las fibras del mucus no se repelen

Fase de celo : fibras paralelas. El grupo COOH de las fibras del mucus pierde un H y queda como COO-, de forma que las fibras se repelen y quedan paralelas.

FUNCION DE RESERVORIO

La forma más segura de que el ovocito y los espermatozoides se encuentren en la ampolla en el momento adecuado, es a través de un flujo constante de espermatozoides. Los espermatozoides que nadan más rápido no son los que fecundan al ovocito ya que cuando llegan a la ampolla el ovocito puede no estar preparado (llegan muy pronto). Por lo tanto, el cérvix hace una función de reservorio, de manera que los espermatozoides pueden permanecer mucho tiempo en las criptas del cérvix.

Algunas especies han desarrollado este mecanismo, como los pequeños rumiantes. En estos animales hay muchas criptas en el conducto cervical, donde se acumulan los espermatozoides que después se liberan poco a poco hacia la cavidad uterina. En las criptas tienen mucho K+ y glicina.

La garantía de un flujo constante de espermatozoides durante varios días aumenta las probabilidades de fecundación.

Para que esto ocurra, el conducto cervical ha desarrollado la capacidad de secreción de dos tipos de mucus:

Uno más denso y viscoso en la zona central formado por sulfomicinas. Uno menos denso en la periferia formado por sialomicinas.

Esto posibilita que los espermatozoides naden por la periferia, menos densa, facilitando su entrada en las criptas del cérvix.

NOTA: en la mujer se produce el Síndrome del Cervix Impenetrable.

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Los espermatozoides se desplazan a lo largo del útero y, según su movimiento y las contracciones uterinas, llegan al extremo distal del cuerno uterino, donde se capacitan.

PAPEL EN LA SELECCIÓN DE ESPERMATOZOIDES

El conducto cervical libera mucho ligando fas. Si existen anomalías en el material genético de los espermatozoides, presentan receptores fas en su superficie y esto posibilita su eliminación. Por lo tanto, esto supone una selección de anomalías genéticas (activación de la apoptosis).

Además, muchos espermatozoides son también eliminados por el sistema inmunológico.

CAPACITACIÓN ESPERMÁTICA

En el epidídimo se produce la maduración espermática. La capacitación se produce sobre todo en el extremo distal de los cuernos uterinos, si bien se produce en todo el ascenso del tracto genital femenino, iniciándose en el conducto cervical con la retirada del plasma seminal. La capacitación es un proceso que dura alrededor de 6 horas.

Características de este proceso:

- Es un proceso de selección espermática.- No depende de la especie (los espermatozoides de todas las especies deben capacitarse de

igual manera)- Es reversible- No todos los espermatozoides se pueden capacitar: necesidad de interacción entre

espermatozoides (con lecitinas) y cuerpo uterino. Si los espermatozoides no tienen lecitina, no se pueden capacitar (los que están entrando en apoptosis, los que tienen malformaciones,..).

- El resultado: aumento del AMPc en el espermatozoide, lo que les lleva a la hiperactividad.

El espermatozoide no capacitado está rodeado de muchas proteínas que, generalmente, proceden del plasma seminal (próstata, glándulas anejas...) que, al capacitarse, desaparecen. Estas proteínas protegen el acrosoma y se unen al flagelo para que no se mueva y el espermatozoide pierda energía.

Estas proteínas se sitúan sobre los receptores frente al ovocito protegiéndolos sin activarlos. Muchos receptores están en la cola o en la región posterior de la cabeza. Al capacitarse, los receptores se desplazan a la región apical de la cabeza del espermatozoide para interactuar con el ovocito, ya que, al capacitarse, aumenta la fluidez de la membrana y los receptores se desplazan.

NOTA: las tecnicas de reproduccion asistida no tienen este filtro. Se piensa en hacer columnas con ligando fas y hacer pasar a los espermatozoides por estas columnas de manera que se realiza una seleccion similar a la que se produce de forma natural en el cervix.

NOTA. En tecnicas de reproduccion asistida (fecundacion in vitro) los espermatozoides no se capacitan correctamente y, por eso, hay muchas muertes embrionarias.

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Los espermatozoides llevan calmodulina adherida que secuestra parte del Ca.

Las proteínas adheridas se desprenden porque en la ovulación el pH del oviducto se acidifica ligeramente y esto facilita su desprendimiento.

En la capacitación, se liberan del oviducto compuestos similares al colesterol (lipoproteínas de alta densidad), de forma que el colesterol de la membrana espermática se libera y se une a ellos, permitiendo el desplazamiento de los receptores (mayor fluidez de membrana).

También aumentan los fosfolípidos insaturados de la membrana, que aumentan la fluidez de la membrana, ya que se pierde Zn. El Zn inhibía la fosfolipasa A2 de membrana, que rompe los fosfolípidos y aumenta la fluidez de la membrana, por lo que al disminuir el Zn se activa la fosfolipasa y aumenta la fluidez, permitiendo el movimiento de los receptores.

- Cuando la membrana es rígida: fosfolípidos saturados y mucho colesterol. A 20ºC el colesterol es muy rígido, es decir, que hay una pérdida de fluidez. (NOTA: en congelación el colesterol fluidifica la membrana).

- Con la membrana fluida: fosfolípidos insaturados y pérdida de colesterol. Se produce la pérdida de Zn que activa la fosfolipasa y la pérdida de colesterol.

Procesos de la capacitación:

1. Pérdida de Zn activación de FLA2 aumento de fosfolípidos insaturados de membrana mayor fluidez de membrana

2. Desprendimiento de proteínas. Antes de estar capacitado está recubierto por muchas proteínas que interfieren con el flagelo e impiden que se mueva (ahorro de energía), protege el acrosoma y los receptores, además dificulta que el espermatozoide incorpore material genético exógeno. El desprendimiento se produce por cambios de pH en cuerno uterino.

3. Aceptores de colesterol en el cuerno uterino. Se retira el colesterol de la membrana de los espermatozoides, aumentando su fluidez

4. Receptores espermáticos se movilizan hacia la zona apical gracias a la fluidez de membrana. Van a permitir la interacción con el ovocito.

5. Aumento de la motilidad espermática. El espermatozoide adquiere así un movimiento rectilíneo. Debido a:

a. Aumento de AMPc intracelularb. Aumento del Ca2+ intracelular.

Tras la capacitación, los espermatozoides tienen más movilidad al no tener estas proteínas adheridas. En la capacitación aumentan los niveles intracelulares de Ca porque se activan bombas de Ca, que introducen Ca, y se inhiben las bombas de salida de Ca.

También se sintetizan muchos inositoles.

La capacitación supone una interacción con las células del útero. Cuando se capacita, es sensible a las señales del ovocito, por lo que los que no se capacitan no las reciben.

Señales responsables de la capacitación:

- HCO3-

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- Progesterona- Factores de crecimiento. Ej EGF

En este momento, el espermatozoide está preparado para la reacción acrosómica.

PROCESOS QUE ATRAEN LOS ESPERMATOZOIDES AL OVOCITO

Una vez capacitados los espermatozoides son atraídos por:

1. Proceso de “termotaxis”: se producen diferencias de temperatura entre el extremo distal del cuerno uterino (tiene más agua) y el proximal. Cerca de la ovulación aumenta 1ºC en el ovario. Los espermatozoides tienen tendencia a dirigirse a las zonas con mayor temperatura.

2. Señales del ovocito. Proceso de quimiotaxis. - El espermatozoide tiene receptores para progesterona. Esta hormona es importante

tanto en la capacitación como en la atracción espermática. Es producida por células del cumulus oophorus y actúa a largas distancias.

- Factor natriurético atrial (ANF)- Proteína RANTES.

Estas señales van actuando a distintas distancias del óvulo. Se trata de un “código” de activación secuencial de señales, que actúa sobre los espermatozoides capacitados, y que dura unas 4 horas tras la ovulación. Después, el ovocito deja de liberar estas señales.

- Estos factores actúan a diferentes distancias (la progesterona atrae al espermatozoide de lejos, posteriormente actúa el ANF y cuando está más cerca actúa el RANTES).

- El espermatozoide debería ir sintetizando los receptores por orden, pero como no tiene espacio, lleva todos los receptores incorporados al mismo tiempo. Los espermatozoides también tiene receptores similares a los olfativos, que podrían estar implicados en la quimiotaxis

FECUNDACIÓN

El espermatozoide tiene que atravesar el ácido hialurónico que une las células del cúmulos oophorus. Para ello, tiene receptores y más de 20 enzimas en la región apical:

- Receptores con actividad hialuronidasa. El espermatozoide libera pequeñas cantidades de hialuronidasa (contenida en el acrosoma, junto con otras como la acrosina, hay hasta 20). El espermatozoide capacitado es sensible a las señales del ovocito y su membrana es fluida, lo que permite liberación de pequeñas cantidades de hialuronidasa.

- El espermatozoide presenta enzimas secuestradas en su pared, que también tienen actividad hialuronidasa. Estos son receptores con actividad hialuronidasa. Para tener esta actividad, tienen que estar capacitados, porque si no, los receptores están recubiertos por proteínas.

- El espermatozoide también tiene receptores para el ácido hialurónico, que producen un aumento en la motilidad del espermatozoide. Se crea un feed back+ (> hialuronidasa, > acido hialurónico, > motilidad) y puede atravesar la barrera de ácido hialurónico.

NOTA: en la fecundacion asistida nos “saltamos” todos estos pasos por lo que es posible las alteraciones en el desarrollo embrionario.

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Una vez el espermatozoide llega al ovocito, interactúa con sus receptores. Los receptores de la zona pelúcida son el ZP2, el ZP3 (unidos por el ZP1:

1. UNION PRIMARIA (unión con ZP3). Primero interactúa el ZP3 , que es específico de especie (un ovocito sólo puede ser fecundado por espermatozoides de la misma especie, por lo que esta unión es muy específica). El ZP3 evoluciona rápidamente en la escala evolutiva (por lo que llega un momento que una familia no puede “cruzarse con otra” porque ya son diferentes). El espermatozoides tienen muchos receptores para interaccionar con el ZP3 ((este hecho sugiere que esta unión es muy importante).La interacción con este receptor aumenta el Ca2+ intracelular (ruta IP y DAG), lo que provoca la reacción acrosómica:

a. Rotura de Mb externa del acrosomab. Cambio en el pH en el interior de la célula, provocando la activación de ciertas

enzimasc. Activación y síntesis de enzimas fusogénicasd. Liberación de enzimas. La más importante es la acrosina, encargada de digerir la

zona pelúcida.Es un proceso muy bien regulado.

2. Unión con el receptor ZP2 . Después de la reacción acrosómica quedan expuestos unos receptores ocultos por el acrosoma, entonces estos receptores interaccionan con el receptor ZP2. Se produce una unión más estable entre el espermatozoide y el ovocito, y además se digiere la zona pelúcida. El espermatozoide atraviesa la zona pelúcida e interacciona con la membrana vitelina.

El espermatozoide penetra a través de la zona pelúcida, se liberan muchas proteínas y material genético que tiene adherido el espermatozoide a su superficie. Posteriormente, empieza a interaccionar con la membrana vitelina, para que ocurra tiene que producirse la reacción de la cola, porque el espermatozoide pierde la movilidad.

- ADHESION: Adhesión del espermatozoides a la membrana vitelina. Intervienen muchos receptores, el más conocido es la fertilina que actúa sobre la integrina del ovocito.

- FUSION: Al fusionarse las membranas del oocito y del esperma se libera, del espermatozoide, una molécula de superficie llamada “oscilina” o factor espermático, que activa el oocito produciendo la liberación pulsátil de Ca 2+ en el interior del ovocito. Estos pulsos tienen una duración variable (2-30 minutos), en función de la especie. Produce la liberación de los gránulos corticales de la periferia del ovocito, que contienen

ZP3 proteasas, bloqueando la posible entrada de un nuevo espermatozoide (bloqueo de la poliespermia). Estas ondas de Ca++ inducen tmb la activación del ovocito (vía activación de PLC) que termina con la formación de los pronúcleos y expulsión del segundo corpúsculo polar.

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CaMK: calmodulina kinasa; CaM: calmodulina; MPF: factor promotor de la maduración; Src-k: kinasa de la familia Src

En caso de producirse la poliespermia, el excesivo acúmulo de material genético hace entrar en apoptosis al ovocito.

Se inicia la descondensación del material genético del espermatozoide (en este proceso es importante el glutatión del ovocito que rompe los puentes disulfuro de la condensación), se libera de las protaminas y se condensa de nuevo en histonas (formación de puentes disulfuro, importancia tmb del glutatión del ovocito).

El proceso de la descondensación del DNA se produce en 30 minutos aproximadamente. Si no es así, se produce la muerte embrionaria precoz (descompensación del proceso).

Se produce la ubiquitinización (=destrucción) de las mitocondrias del espermatozoide. Tienen muchas alteraciones ya que han trabajado mucho.

Los centriolos del cuello del espermatozoide: da uno para contribuir a la formación del centrosoma para formar el huso de la meisis. Al igual que los microtúbulos.

El espermatozoide puede penetrar entero o sólo la cabeza, pero las mitocondrias siempre son destruidas por la ubiquitina.

REPROGRAMACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO

De un gen se heredan dos alelos y generalmente se expresan los dos, pero en el 1% de los genes tan sólo se expresa un alelo y el otro queda silenciado (metilado).

La reprogramación consiste en retirar los grupos metilo del material genético por la desmetilasa y se vuelven a establecer nuevos patrones de metilación.

La reprogramación se produce porque permite metilar el material genético exógeno que haya podido entrar adherido al espermatozoide. Hay estudios que señalan que los patrones de metilación pueden estar mediados por el medio ambiente (temperatura...) y lograr así una mejor adaptación de la especie.

Es un mecanismo de interacción entre el material genético de la madre y del padre.

- El material genético del macho tiene como objetivo una cría grande y fuerte. - La hembra quiere muchas crías y más pequeñas.

El ovocito intenta metilar el gen que codifica para el IGF2 para que no se exprese y el feto no sea demasiado grande. El espermatozoide intenta anular la expresión de otros genes en el ovocito. El material genético del espermatozoide, al descondensarse tanto, es más susceptible a la metilación.

Sin embargo, el espermatozoide lleva adherido pequeños trocitos de ARNm (ARNinterferente), procede de virus, bacterias y tracto genital de la hembra. La zona pelúcida puede actuar como filtro pero parte sigue quedando adherido al espermatozoide. Este material genético interfiere con el RNA de la hembra, de forma que se produce hélices de RNAm o unión del mismo al DNA. Esto interfiere con la producción de metilasas (se une al ADN del ovocito, formando tres cadenas y ya no se transcribe). También puede unirse al ARNm del ovocito, formando dos cadenas y entonces no se traduce.

El ovocito tiene varios mecanismos:

Zona pelúcida: elimina mucho material genético adherido.

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Proteína DICER: rompe al ARN interferente, que aun puede seguir actuando. Es una ribonucleasa que se encuentra en el citoplasma celular.

Repaso:

- Células germinales se reprograman en su viaje en espermatogonias (XY) u ovogonias (XX)

- Perturbadores endocrinos: interfieren en la reprogramación y desmetilación- Fetos de gran tamaño: debido a la hipometilación. Muchos genes de crecimiento se

expresan gracias a que no se encuentran metilados. (“Síndrome del Ternero Gigante”). En pacientes oligoespermicos el material genético suele estar hipometilado.

Causas del aborto:

1. Alteraciones en la migración de células germinales. Si no llegan al riñon, se producen muchas divisiones (“exceso” de mitosis) y posibles abortos.

2. Exceso de información genética. Ej no liberación del corpúsculo polar, alteración en el bloqueo de la poliespermia

3. Liberación del corpúsculo polar con mucho citoplasma. No se produce la supervivencia del ovocito.

4. Alteraciones en el entrecruzamiento o en el número de cromosomas.5. Alteraciones en la descondensación del material genético6. Se debe producir la traducción en el momento determinado (cadena de poli A).7. Sincronización no válida de la fecundación (tanto del ovocito como del espermatozoide).8. Procesos de selección cervical no adecuados.9. Alteración de la reprogramación genética (metilación/desmetilación)

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