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VARIAZIONI NELLA SEQUENZA DEL DNA POSSONO DETERMINARE VARIAZIONI NELLA SEQUENZA DI
AMINOACIDI DI UNA PROTEINA
ALCUNE VARIAZIONI POSSONO COMUNQUE PORTARE AD UNA PROTEINA FUNZIONALE (POLIMORFISMO
GENETICO), ALTRE POSSONO INVECE DETERMINARE PROTEINE ANOMALI
Le mutazioni Variazioni nel patrimonio ereditario di un individuo: cambiamenti nella sequenza di nucleotidi del DNA Negli organismi pluricellulari che si riproducono per via sessuale, la mutazione avrà conseguenze differenti a seconda del tipo di cellula interessata. Quindi si distingueranno: Mutazioni ereditabili: riguardano il DNA delle cellule deputate alla riproduzione (cellule germinali). Queste mutazioni saranno ereditate dalla prole. Mutazioni somatiche (a carico del “soma”, corpo): riguardano il DNA delle cellule somatiche, quindi la mutazione si presenterà solo nell’individuo che ne è portatore e non sono quindi ereditabili (es. mutazioni neoplastiche).
Cause delle mutazioni
Alcune mutazioni sono spontanee, altre possono essere causate da agenti mutageni quali: – raggi X – radiazioni ionizzanti – raggi ultravioletti – agenti chimici
Sequenza di DNA normale
Sequenza di RNA normale
Sequenza aminoacidica normale
AUG ACU AGA AAU UGG GAU CCU ACG UGA
3
5
H2N
COO-
Stop
In assenza di mutazioni
MUTAZIONI PER SOSTITUZIONI DI UNA BASE
Mutazione missenso
Mutazione nonsenso
5
5
H2N
H2N COO- Stop
COO- Stop
MUTAZIONI FRAMESHIFT
Causa una mutazione nonsenso
Mutante per delezione(-1)
Mutante per delezione(-2)
H2N
H2N
H2N
(Stop)
...
...
Mutazioni genetiche
Per mutazione si intende un cambiamento della sequenza o del numero di nucleotidi in una parte del DNA. Se queste mutazioni riguardano l'aggiunta-eliminazione di un nucleotide o la sostituzione sono chiamate puntiformi. si dividono in 3 tipi: Mutazioni di senso, quando cambia un amminoacido e per cui il nostro corpo produce una proteina diversa; una malattia portata da questo è l'anemia falciforme. Mutazioni di nonsenso, il risultato della sostituzione di un nucleotide è un codone d'arresto e per cui quando la ''costruzione'' di un amminoacido conclude prima/dopo la vera terminazione; questa mutazione provoca di solito le malattie più gravi. Mutazioni silenti, quando il risultato del cambiamento del nucleotide è sempre lo stesso amminoacido.
Le mutazioni sono una delle fonti principali della variabilità degli organismi e
dunque dell’evoluzione.
Le funzioni del DNA
Replicazione
Trascrizione
mRNA rRNA tRNA snRNA
Traduzione
Proteine strutturali
Proteine con funzioni
speciali
Enzimi
Controllo delle attività metaboliche
Auto – sintentica Replicazione
del DNA
Allosintetica Sintesi di RNA
Sintesi Proteica Proteina
Il processo biologico fondamentale della riproduzione richiede la fedele trasmissione dell’informazione genetica
dai genitori alla progenie.
La replicazione accurata del DNA genomico è essenziale per la vita di tutte le cellule e organismi.
Nonostante l’importanza di un’accurata replicazione e del mantenimento del DNA, i genomi cellulari sono
lontani dall’essere statici.
Mutazioni e riarrangiamenti dei geni sono necessari per mantenere la variabilità
genetica tra gli individui.
La ricombinazione tra cromosomi omologhi durante la meiosi gioca un ruolo chiave in tale processo.
Struttura del DNA Il DNA è composto da una doppia elica (due filamenti contrapposti). Una scala a pioli in cui i montanti sono costituiti dal deossiribosio e dai gruppi fosfato e i pioli dalle basi azotate (A,T,C,G) appaiate e unite da legami a H. L appaiamento delle basi non avviene in modo casuale, ma tra basi complementari
La distanza tra le basi è di 0,34 nm
Ciascun filamento compie un giro completo ogni 10 basi = 3,4 nm
1nm=10-9 cm
Il DNA è una doppia elica con le basi all’interno e lo scheletro di zuccheri e fosfati all’esterno della molecola
Le basi di filamenti complementari sono unite da legami H (A--T e G---C).
I due filamenti di DNA corrono in direzioni opposte (5’-3’’ e 3’-5’).
2 nm
0,34 nm
3,4 nm
5’ 3’
5’ 3’
Estremità 3’
Estremità 5’
Estremità 5’
Estremità 3’
Struttura del DNA
Basi Azotate
Puriniche Adenina
Guanina
Timina (solo nel DNA)
Uracile (solo nel RNA)
Citosina
Pirimidiniche
Basi Puriniche (dalla Purina)
Zuccheri
Basi Pirimidiniche (dalla Pirimidina)
Basi Azotate e Zuccheri Pentosi
Adenina (A) Guanina (G)
Citosina (C) Timina (T) Uracile (U)
Ribosio 2 - deossiribosio
La replicazione del DNA è un processo semiconservativo poiché una catena del DNA parentale è conservata in ciascuna molecola figlia, e funziona da
stampo per la sintesi di nuovi filamenti figli complementari
Cooper & Hausman 2012
Dimostrazione sperimentale della replicazione semiconservativa
Cooper & Hausman 2012
Dimostrazione sperimentale della replicazione semiconservativa
LA REAZIONE CATALIZZATA DALLA DNA POLIMERASI
La replicazione avviene in direzione 5’-3’ aggiungendo un dNTP al gruppo idrossilico 3’ della catena in crescita.
Cooper & Hausman 2012
NELLE CELLULE PROCARIOTICHE IL PRINCIPALE ENZIMA DELLA REPLICAZIONE DEL DNA è LA DNA POLIMERASI III
LE CELLULE EUCARIOTICHE POSSEGGONO TRE DNA POLIMERASI: α, δ e ε,
COINVOLTE NELLA REPLICAZIONE DEL DNA NUCLEARE.
UNA DIVERSA DNA POLIMERASI (γ), CHE SI TROVA NEI MITOCONDRI, è RESPONSABILE DELLA
REPLICAZIONE DEL DNA MITOCONDRIALE.
La replicazione del DNA è bidirezionale a partire dall’origine di replicazione
Le forcelle replicative sono zone di attiva sintesi
Se la replicazione avviene in direzione 5’-3’, come può essere sintetizzato l’altro filamento di DNA?
Il filamento leading viene sintetizzato in continuo nella direzione del movimento della forcella di replicazione; il filamento lagging viene sintetizzato in brevi segmenti (frammenti di Okazaki) in direzione opposta rispetto a quella generale di replicazione.
Cooper & Hausman 2012
RNA innesco (primer) e frammenti di Okazaki
L’attività della DNA polimerasi richiede un “innesco” di RNA,
catalizzato dall’enzima RNA primasi, e, sull’elica stampo 5’ → 3’, la sintesi di tratti di DNA (frammenti di Okazaki) aventi ognuno
direzione di crescita opposta rispetto al
filamento di DNA finale
Brevi frammenti di RNA costituiscono gli inneschi per la replicazione del DNA
Cooper & Hausman 2012
Gli inneschi a RNA vengono rimossi e la DNA polimerasi riempie con DNA le interruzioni
I frammenti di DNA che ne derivano possono essere uniti dalla DNA ligasi Cooper & Hausman 2012
I ruoli delle DNA polimerasi in E. coli e nelle cellule di mammifero
Cooper & Hausman 2012
Le elicasi svolgono i due filamenti di DNA parentale davanti alla forcella di replicazione
I filamenti svolti di DNA sono poi stabilizzati da proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB proteins) in modo che possano servire da stampo per la sintesi di nuovo DNA.
Cooper & Hausman 2012
Azione delle topoisomerasi durante la replicazione del DNA
Le topoisomerasi catalizzano la rottura e legatura reversibili dei filamenti di DNA. I tagli transienti introdotti da questi enzimi servono da perni che permettono ai due filamenti di DNA di ruotare liberamente l’uno intorno all’altro. Cooper & Hausman 2012
Correzione delle bozze (proofreading) da parte della DNA polimerasi
Cooper & Hausman 2012
Origine della replicazione in E.coli e nei cromosomi eucariotici
Batteri
Eucarioti
Cooper & Hausman 2012
La sintesi di DNA inizia in corrispondenza di una specifica sequenza di basi, chiamata origine di replicazione
I filamenti vengono separati nel punto di origine e svolti dalla DNA elicasi che “cammina” lungo la molecola di DNA precedendo gli enzimi deputati alla sintesi. Proteine destabilizzatrici dell’elica si legano al DNA a singolo filamento, impedendo che possa riappaiarsi. La zona di attiva sintesi del DNA corrisponde alla “forca di replicazione” che si è formata nel punto di congiunzione tra i tratti di DNA a singolo filamento e la regione ancora a doppia elica. La sintesi procede su ciascun filamento singolo della forca in direzione 5’-3’.
Mentre i nuovi filamenti continuano a crescere in questa direzione, lo svolgimento e la replicazione iniziano all’altra estremità dell’origine così che la replicazione procede in entrambe le direzioni.
Al termine della replicazione si ottengono due molecole, identiche tra loro e alla molecola originaria, ognuna delle quali possiede un filamento “stampo” e uno di nuova sintesi.
Complesso enzimatico di duplicazione del DNA Origine di replicazione
Torsione introdotta nell’elica a causa dello svolgimento della molecola RNA primer
RNA primer
DNA elicasi
Proteine destabilizzatrici dell’elica
Complesso enzimatico di duplicazione del DNA
Direzione di replicazione
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
3’
3’
5’
5’ 3
’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
Visto che le DNA polimerasi estendono gli inneschi di replicazione solamente in direzione
5’-3’, come possono essere replicate le sequenze terminali dei cromosomi lineari eucariotici?
Elizabeth Blackburn e Carol Greider scoprirono che i telomeri sono protetti dal progressivo accorciamento da
un enzima chiamato telomerasi (Nobel Prize 2009)
Azione della telomerasi
La telomerasi possiede il proprio RNA, complementare
al DNA telomerico, come parte del complesso
enzimatico
Cooper & Hausman 2012
I telomeri formano dei cappucci alle estremità dei cromosomi. Essi contengono una sequenza unica di DNA
ripetuta molte volte.
