荧光定量 PCRreal time-PCR

定量 PCR 反应体系

①actin ③achi ⑤aly ⑦vlg ⑨stat

②actin ④achi ⑥aly ⑧vlg ⑩stat

模板 cDNA 4ul

Tag mixture 10ul

引物 1 0.5ul

引物 2 0.5ul

H20 5ul

1♀模板

2♂模板

① ③ ⑤ ⑦ ⑨ 443.45

ng/ul

686.75 ng/ul

② ④ ⑥ ⑧ ⑩ 17.738 ng/ul

26.47 ng/ul

定量与常规定量与常规 PCRPCR 的差别的差别• 常规 PCR 技术：• 对 PCR 扩增反

应的终产物进行定量及定性分析

定量 PCR 技术：通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析三个关键词：

实时，定量，荧光

PCR 分四个阶段

如何定量？如何定量？

• CtCt 值的概念值的概念• Ct 值的定义是 PCR 扩增过程中，荧光信号

开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。

定量原理定量原理确定初始模板的浓度

初始 DNA 量越多 , 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少

Log 浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量

起点定量与终点定量

荧光化学荧光化学

SYBR Green 1SYBR Green 1

TaqManTaqMan

TaqManTaqMan

SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理• 。 SYBR Green 1 结合到双链 DNA 的小沟部位• SYBR Green 1 染料只有和双链 DNA 结合后才发荧光

GT T TG G

C

C CCC C CA AA

GGG

ACT

T

G

ATAG

CAT

CG

TA

A

G

TT

T TT T

GG G G

C

C CC CCC

CA A AAA

TA

C CG GGG

T T

ACGA

AC

G GT

A AT

未结合 SYBR Green 1 dye

变性变性 : : 无荧光信号无荧光信号

SYBR Green I SYBR Green I 应用范围应用范围• 起始模板浓度定量

• 融解曲线分析– ---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体

• 基因型分析

SYBR Green I SYBR Green I 优点优点

SYBR Green I SYBR Green I 缺点缺点

PCR 程序指南

UNG 酶使用原理

金牌 Tag 酶活性

参比荧光：管家荧光 ROX

ROX 校正效果

96 孔板设置举例

PCR 曲线

标准曲线