Система аскорбиновой кислоты растений: Монография

КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Г.Н. Чупахина

СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ

Калининград 1997

КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Г.Н. Чупахина


Монография

Калининград

1997

Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений: Монография. - Кали-

нингр. ун-т. - Калининград, 1997. - 120 с. - ISBN 5-88874-063-2. В монографии дана характеристика системы аскорбиновой кислоты растений,

включающей аскорбиновую, дегидроаскорбиновую и дикетогулоновую кислоты, а также ферменты, окисляющие и восстанавливающие аскорбат. Приведены результаты исследования действия полихроматического и монохроматического света на компонен-ты системы, обсуждается вопрос о фоторецепторе светозависимого синтеза аскорбино-вой кислоты. Рассматриваются пути биосинтеза аскорбата, компартментация данного процесса и субклеточная локализация кислот системы аскорбиновой кислоты. Иссле-дована зависимость биосинтеза указанных кислот от фотосинтеза и дыхания. Впервые исследовалась дикетогулоновая кислота как компонент системы аскорбиновой кисло-ты. Приводится метод получения альбиносных проростков, их физиолого-биохимическая характеристика, рекомендация использования в качестве модели для изучения светозависимых процессов не связанных с фотосинтезом.

Для физиологов, биохимиков, преподавателей вузов, аспирантов и студентов. Иллюстр. 30. Библиогр.: 461 назв. Рецензент - зав. отделом химии фотосинтеза Института биоорганической химии и

нефтехимии АН Украины, чл.-кор. АН Украины А.А. Ясников. Печатается по решению редакционно-издательского Совета Калининградского го-

сударственного университета.

ISBN 5-88874-063-2 © Калининградский государственный университет, 1997

Галина Николаевна Чупахина


Монография

Лицензия № 020345 от 27.12.1991 г. Редактор Л.Г. Ванцева.

Оригинал-макет подготовлен Д.В. Голубиным. Подписано в печать 25.12.1996 г. Формат 60×90 1/16. Бумага для множительных аппаратов. Усл. печ. л. 7,5.

Уч.-изд. л. 8,0. Тираж 200 экз. Заказ 92.

Калининградский государственный университет, 236041, г. Калининград, ул. А. Невского, 14.

3

ВВЕДЕНИЕ Аскорбиновая кислота - уникальное полифункциональное соединение. Об-

ладая способностью обратимо окисляться и восстанавливаться, она принимает участие в важнейших энергетических процессах растительной клетки - фотосин-тезе [341, 378] и дыхании [451, 362]; является признанным антиоксидантом [8]. Несомненно ее участие в процессах роста, цветения, вегетативной и репро-дуктивной дифференциации [230], в водном обмене [151], регуляции фермента-тивной активности [46], стимуляции реакций метаболизма, связанных с обменом нуклеиновых кислот и синтезом белка [207, 365], в защитных реакциях растений [200, 2].

Особый интерес для биотехнологии представляет факт накопления аскорби-новой кислоты в культуре растительных тканей и активации их роста аскорба-том [288, 295]. В связи с этим знание условий, формирующих пул аскорбиновой кислоты зеленых растений, необходимо не только для программированного по-лучения высоковитаминных растительных продуктов, что само по себе является важным для решения проблемы качества пищи, но и для понимания механизмов, определяющих продуктивность растений.

Возросший интерес к аскорбиновой кислоте как к лекарственному препарату [257] обусловлен противовирусным [395] и противоопухолевым действием ас-корбиновой кислоты и ее дериватов [450], а также авторитетной рекламой дваж-ды лауреата Нобелевской премии Л.Полинга [116]. При определении витамин-ной ценности растительного сырья витамин С определяется как сумма взаимо-превращающихся восстановленной и окисленной форм аскорбиновой кислоты [152]. Однако дегидроаскорбиновая кислота не всегда переходит в аскорбино-вую, так как разрыв ее лактонового кольца ведет к необратимому образованию дикетогулоновой кислоты, не обладающей витаминной активностью и практиче-ски не исследованной у растений. Поэтому для всесторонней оценки роли ас-корбиновой кислоты в метаболизме растений необходимо одновременное иссле-дование всей системы аскорбата, включающей вышеназванные органические кислоты, а также ферментные системы, способствующие окислению и восста-новлению аскорбиновой кислоты. Именно такие подходы к исследованию вита-мина С [258, 430] являются наиболее перспективными.

4

Со времени открытия аскорбиновой кислоты интерес к этому соединению не проходит, хотя в последние годы он значительно снизился. Но это не говорит о том, что решены все проблемы, связанные с аскорбатом. Они есть. В частности, до сих пор не выяснены пути синтеза аскорбиновой кислоты, не до конца ясна ее роль в жизни автотрофных организмов, являющихся продуцентами и поставщи-ками витамина С для человека. Решение этих вопросов требует нового уровня исследований, чему, несомненно, может служить изучение аскорбиновой кисло-ты как компонента системы органических кислот: аскорбиновая ↔ дегидроа-скорбиновая → дикетогулоновая кислота.

В предлагаемой работе обобщены литературные данные и результаты собст-венных исследований автора, касающиеся путей биосинтеза аскорбиновой ки-слоты и субклеточной локализации аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дике-тогулоновой кислот. Рассматривается действие полихроматического и монохро-матического света на компоненты системы, зависимость биосинтеза анализи-руемых кислот от фотосинтеза и дыхания. Для решения этих вопросов исполь-зовались данные по биосинтезу кислот в проростках ячменя с измененным пиг-ментным составом, в экспериментально полученных альбиносных проростках, а также при ингибировании и стимуляции дыхания интермедиатами цикла Кребса.

5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АК - аскорбиновая кислота АО - аскорбатоксидаза ГН - глютатион восстановленный ГS-SГ - глютатион окисленный ДАК - дегидроаскорбиновая кислота ДКГК - дикетогулоновая кислота ДКС - дальний красный свет 2,4 - ДНФ - 2,4 - динитрофенол ИУК - индолилуксусная кислота КС - красный свет МДАК - монодегидроаскорбиновая кислота НАД - никотинамидадениндинуклеотид НАДФН+Н+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный ОПФЦ - окислительный пентозофосфатный цикл ПААГ - полиакриламидный гель СМ - стрептомицин УФ - ультрафиолет ФАР - физиологически активная радиация Фдк - фитохром с максимумом поглощения в области дальнего красного све-

та около 730 нм ФС I - фотосистема I ФС II - фотосистема II Хл - хлорофилл ЦТК - цикл трикарбоновых кислот ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

6

Глава 1. КИСЛОТЫ И ФЕРМЕНТЫ СИСТЕМЫ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

В 1927 году A.Сцент-Гиорги впервые выделил из некоторых растений и ко-

ры надпочечников неустойчивое вещество с сильно выраженными восстанови-тельными свойствами, которое сначала назвал гексуроновой кислотой, затем - аскорбиновой, учитывая ее антискорбутное (скорбут - цинга) действие. Химиче-ская формула АК была предложена в 1933 году Хирстом и независимо от него Эйлером, а в конце 1933 г. ее правильность окончательно доказана Михеелем. Химический синтез АК осуществлен Рейхштейном в 1932 г., когда структура ее еще не была известна. В 1933 г. Рейхштейн и Хаворс с Хирстом опубликовали методы синтетического получения АК. История открытия и изучения АК под-робно описана Б.А. Кудряшовым [69].

В химическом отношении АК является лактоном 2,3-диэнол-l-гулоновой ки-слоты с эмпирической формулой С6Н8О6. Она обладает сильно выраженными восстанавливающими свойствами благодаря наличию в молекуле диэнольной группы:

С ОН С ОН

Окисляясь, АК легко переходит в дегидроформу:

O O C C

НО-С О = С НО-С О - 2H О = С О

H-C + 2H H-C HO-C-H HO-C-H СH2-OH СH2-OH

L-аскорбиновая Дегидроаскорбиновая кислота кислота

(восстановленная форма) (окисленная форма)

Этот процесс обратимый, и ДАК может вновь восстановиться до l-AK. Окисление АК до ДАК происходит в результате отдачи двух протонов и

двух электронов. При окислении АК в особых условиях (УФ свет, температура жидкого воздуха) за счет отдачи только одного протона возникает свободный радикал - монодегидроаскорбиновая кислота. Это нестабильная, реакционноспо-собная форма АК.

7

O O O O C C C C НО-С HO-С O-С O=С НО-С О -H+ О-С О -H+ О-С О -2e О=С О H-C H-C H-C H-C HO-C-H HO-C-H HO-C-H HO-C-H СH2-OH СH2-OH СH2-OH СH2-OH

L-аскорбиновая Монодегидро- Анион дегидро- Дегидроаскор- новая кислота аскорбиновая аскорбиновой биновая кис-

кислота кислоты лота Переход l-АК в ДАК двухэтапный. На первом этапе две молекулы l-AK дают

начало двум молекулам монодегидроаскорбиновой кислоты. Далее они дисму-тируют: одна молекула превращается в ДАК, другая - в l-АК [60].

Лактоновое кольцо в молекуле l-AK стабильно, а в ДАК легко гидролизует с образованием кислоты с открытой цепью - 2,3-дикетогулоновой кислоты [84]. Последняя может подвергаться окислительному распаду под действием гипоио-дида натрия с образованием щавелевой и треоновой кислот:

O O C C - OH COOH

О = С С = O COOH О = С О +H2O С = О Щавелевая

кислота H - C H - C - OH HO - C - H HO - C - H COOH СH2 - OH СH2 - OH H - C - OH HO - C - H CH2OH Дегидроас- 2,3-дикето- корбиновая l-гулоновая L-треоновая кислота кислота кислота

8

Введенная экзогенно дикетогулоновая кислота при освещении хлоропластов фотоокисляется [453]. Под влиянием окисляющих АК ферментов происходит декарбоксилирование ДАК и ДКГК с образованием l-ксилоновой и l-ликсоновой кислот.

У растений, аккумулирующих щавелевую кислоту (шпинат, бегония, кисли-ца), окисление введенной 1-14С-АК или 1-14С-ДАК происходит с образованием щавелевой и винной кислот. В проростках ячменя, которые не накапливают ща-велевую кислоту, включение метки в последнюю происходит слабо. Отмечено, что метка из 1-14C-ДАК легко включалась в щавелевую кислоту шпината и кис-лицы, а 1-14С-ДКГК очень медленно метаболизировалась в щавелевую кислоту. Вероятно, для образования щавелевой кислоты существенно наличие лактоново-го кольца в предшественнике [453].

У герани также два первые атома углерода АК включаются в молекулу ща-велевой кислоты, а С4-фрагмент - в винную кислоту [445, 448]. Однако судьба двух первых атомов углерода АК может быть иной. Например, у винограда от-резок цепи с первого по четвертый атом углерода включается в l-винную кисло-ту, а оставшийся С2-фрагмент повторно вовлекается в цикл гексоз и продуктов их метаболизма. [445, 383]. При этом углерод первого атома АК может выс-вобождаться в форме CO2 [272].

Изолированные листья Parthenocissus quinquefolia L метаболизируют АК с образованием l-треоновой и винной кислот. Показано, что треоновая кислота не является промежуточным метаболитом обмена аскорбата, превращающегося в винную кислоту [271]. Такими метаболитами могут быть l-идониновая, 2-кето-l-идониновая и 5-кето-l-идониновая кислоты. В молодых тканях винограда вве-денная АК превращается в 5-кето-l-идониновую кислоту через 2-кето-l-идониновую и l-идониновую кислоты. Из С4-фрагмента 5-кето-l-идониновой ки-слоты далее синтезируется l-(+)винная кислота. Считается [318], что именно l-АК. является физиологическим интермедиатом на пути биосинтеза винной ки-слоты в листьях винограда. Радиоактивность от 5-кето-l(6-14С)идониновой ки-слоты обнаруживалась в сахарах и нерастворимом осадке [381, 382]. Следова-тельно, обмен АК в растениях связан с органическими кислотами и углеводами, которые в одних условиях являются субстратом в биосинтезе АК, а в других для их образования используются фрагменты молекулы АК, полученные после ее деградации.

Таким образом, АК в растительных тканях может присутствовать в восста-новленной форме, окисленной и в виде нестабильной монодегидроаскорбиновой кислоты. Восстановленная и окисленная АК находятся в свободном состоянии. Известны три связанные формы АК: аскорбиген - соединение АК с полипепти-дом; комплекс АК с витамином Р и, вероятно, еще с каким-то неизвестным ве-ществом; третья связанная форма АК - это соединение АК с нуклеиновой кисло-той через посредство минерального железа [158].

Обычно в растениях преобладает восстановленная форма АК. Накоплению ДАК препятствует ее нестабильность (особенно при рН выше 5), поэтому при измельчении тканей наблюдается быстрая потеря ДАК. Тем не менее измеримые количества ДАК присутствуют во многих тканях. Содержание окисленной фор-мы АК в разных условиях неодинаково и иногда достигает высоких значений.

9

Так, в яблоках в начале созревания ДАК составляла 55% от общего количества АК и ДАК, а в конце - только 5-6% [35]. Соотношение двух форм АК может служить показателем физиологического состояния растений: высокая интенсив-ность процессов жизнедеятельности - больше восстановленной АК, низкая ин-тенсивность - растет содержание дегидроформы [68,34].

Для красных водорослей показано сезонное изменение соотношения АК/ДАК. В апикальной части таллома птерокладии оно достигало максимума в декабре, а к лету значительно снижалось. В базальной части соотношение АК/ДАК в течение года было низким и мало менялось [303].

АК в чистых растворах с сильно кислой реакцией среды и в растительных соках с нормальной кислотностью при рН ниже 7 не способна к самоокислению. Однако в других растворах на воздухе АК быстро окисляется. Катализирующее действие на процесс неферментативного окисления АК оказывают гидроксиль-ные ионы, двух- и трехвалентные металлы, особенно медь.

Известны четыре ферментные системы, принимающие участие в окислении АК. Это специфическая оксидаза АК - аскорбатоксидаза (1.10.3.3), цитохромная система, полифенолоксидаза (1.14.18.1) в присутствии полифенолов и перокси-даза (1.11.1.7) в присутствии перекиси водорода [35].

Аскорбатоксидаза - медьсодержащий фермент, окисляет АК кислородом воздуха, но имеет ограниченное сродство к кислороду [26]. Механизм окисления АК пероксидазой и полифенолоксидазой - с помощью хинонов. Коферментами пероксидаз являются различные фенольные соединения, они окисляются до хи-нонов, последние окисляют АК до ДАК:

кислород + фенол → хинон; хинон + АК → ДАК + фенол.

Окислительно-восстановительные превращения АК ↔ ДАК тесно связаны с системой глютатиона: 2ГSН ↔ ГS - SГ + 2Н+, в которой восстановление окис-ленного глютатиона катализируется ферментом глютатионредуктазой (1.6.4.2), а окисление идет при участии глютатиондегидрогеназы (аскорбата) (1.8.5.1) [409]. Есть мнение, что превращение ДАК в АК - неферментативный процесс [59].

Окислительно-восстановительная система АК у эвглены, по данным Шигео-ки и др. [402, 403], включает следующие компоненты:

H2O2 (1) H2O (3) l-АК (3) Монодегидро-l-АК Дегидро-l-АК

(2) НАДФ+ НАДФН+Н+ (4) ГS - SГ Г - SH где: (1) - l-аскорбатпероксидаза,

10

(2) - монодегидро-l-аскорбатредуктаза, (3) - неферментативная реакция, (4) - дегидро-l-аскорбатредуктаза. Таким образом, система АК растений включает АК, монодегидро-АК, ДАК

[239], которые обладают витаминной активностью. ДКГК, образующаяся из ДАК, уже лишена биологической активности. Количественный анализ ДКГК может служить показателем направленности процессов в системе АК ↔ ДАК, которая зависит от активности ферментов, окисляющих AК: аскорбатоксидазы, полифенолоксидазы, цитохромоксидазы и пероксидазы, а также ферментов, вос-станавливающих кислоты системы АК: монодегидро-l-аскорбатредуктазы и де-гидро-l-аскорбатредуктазы. В качестве восстановителя выступает система глю-татиона ГS - SГ ↔ Г - SН и НАДФН+Н+. Высокий уровень АК стимулирует биосинтез аскорбатоксидазы [240,3] и подавляет аскорбатредуктазу [3].

ДКГК растений, рассматриваемая нами в системе АК, практически не иссле-дована, исключая единичные работы [85,405,279,334,205] и работы автора [181, 174, 178], хотя следует подчеркнуть, что ее уровень дает информацию для пони-мания функционирования системы АК ↔ ДАК.

Глава II. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ЖИЗНИ АВТОТРОФНЫХ ОРГАНИЗМОВ

2.1. Участие аскорбиновой кислоты в энергетических процессах растений

В хлоропластах содержится значительное количество АК, по весу не усту-

пающее содержанию хлорофилла, а выраженное в молях даже превосходящее его [123]. Этот факт, а также способность АК обратимо окисляться и восстанав-ливаться могут определять ее участие в важнейшем энергетическом процессе зеленых растений - в фотосинтезе. Действительно, многие экспериментальные исследования подтверждают такую возможность. В частности, показано, что ас-корбат способствует биосинтезу хлорофилла [237, 218] и восстановлению его в темноте при участии активной МДАК [38]. В семенах японской редьки при 48-часовом освещении возрастало содержание АК и пропорционально - содержание хлорофилла. Между количеством хлорофилла и АК отмечалась линейная зави-симость при коэффициенте корреляции 0,96 [437].

Основываясь на опытах по обратимому фотохимическому восстановлению хлорофилла АК в растворах пиридина, А.А.Красновский [62, 66] полагал, что этот процесс может представлять одну из стадий фотосинтеза. Подтверждая на-личие реакции А.А. Красновского, в результате которой образовывалась красная восстановленная форма хлорофилла при освещении его растворов в пиридине в присутствии АК, Т.Баннистер [213] уточнил, что донором электрона при фото-

11

восстановлении хлорофилла может быть анион АК, возникающий при ее диссо-циации в среде воды и пиридина.

На роль АК как донора электронов в фотосинтетических реакциях или в ре-акциях, тесно связанных с ними, указывал и Л.Мапсон [325]. Он считал, что АК может участвовать в переносе электрона от пластохиона к цитохрому f. Другие авторы также рассматривали АК как переносчика электронов при фотосинтезе [250, 335, 343]. По мнению Л.Мапсона, действительным переносчиком электро-нов является нестабильная МДАК, способная участвовать в цепи реакций не-циклического фосфорилирования в растениях [324].

При изучении фотоокисления аскорбата изолированными хлоропластами шпината было показано [221], что АК может замещать воду как донор электро-нов для ФС II и что обе световые реакции и электрон-транспортная система ме-жду ними принимают участие в фотоокислении АК.

В ныне признанных схемах циклического и нециклического переноса элек-тронов в процессе фотосинтеза среди переносчиков электронов нет АК, но в мо-дельных системах АК часто используется как экзогенный донор электрона для ЭТЦ фотосинтеза [298, 376, 384]. При блокировании переноса электронов между ФС I и ФС II дихлорфенилдиметилмочевиной электроны от АК могут поступать в ФС I [85].

АК необходима для фотофосфорилирования [51]. В ее присутствии лучше сохраняется без инактивации фотосинтетический аппарат клетки, увеличивается фосфорилирование изолированных хлоропластов [227, 203, 204, 249, 333], ста-билизируется фотофосфорилирование фрагментов фотосинтетических мембран [341].

Таким образом, участие АК в процессе фотосинтеза может проявляться или в биосинтезе фотосинтетического аппарата растительной клетки, или в его ста-билизации, что будет способствовать повышению его фотохимической активно-сти, а в конечном итоге - фотофосфорилированию.

Предположение о том, что, обладая окислительно-восстановительными свой-ствами, АК может участвовать в процессе дыхания, впервые было выдвинуто А.Сцент-Дьерди в 1927 г. Позднее ряд исследователей рассматривал АК как су-щественный фактор дыхания [77, 328, 323]. К.Е.Овчаров [95] отмечал, что не случайно при прорастании семян имеет место энергичное образование АК, ведь энергия дыхания прорастающих семян очень высока.

Усиление дыхания под действием АК наблюдали многие авторы [313, 43, 46]. Так, в присутствии аскорбата увеличивалось поглощение кислорода изоли-рованными проростками ячменя [278], суспензией хлоропластов шпината [199] и хлореллы, находящейся в темноте [59], срезанными стеблями томатов [377].

В процессе воздействия на дыхание важная роль принадлежит соотношению АК/ДАК, так как последняя, функционируя как переносчик водорода в дыха-тельной цепи растений [323], отвлекает часть водорода окисляемого субстрата, что, вероятно, и приводит к торможению дыхания. Показано, что ДАК тормозит активность дегидрогеназ, интенсивность восстановительных синтезов, образова-ние макроаргических связей. Поэтому повышение отношения АК/ДАК за счет

12

уменьшения ДАК сопровождается усилением дыхания и роста растительных клеток [434].

При окислении субстрата за счет отнятия водорода последний при участии переносчиков передается в зависимости от вида растения, сорта или стадии ин-дивидуального развития на цитохромную систему, флавиновую или аскорбаток-сидазу. Этот фермент может отдать водород непосредственно на кислород и вы-полнить функцию терминальной оксидазы [134]:

Глютатион Редуктаза Аскорбат- редуктаза ДАК оксидаза SH2 НАДФ 2 глютатион-SH ДАК Н2О S НАДФ⋅Н2 глютатион-S-S- АК 1/2 О2 глютатион Так как аскорбатоксидаза имеет ограниченное сродство к кислороду, можно

полагать, что окисление через систему АК/ДАК имеет подчиненное значение. Однако Мапсон и Мустафа [328] нашли, что у проростков гороха дыхание на 25% осуществляется за счет системы аскорбатоксидазы. При прорастании семян гороха примерно через пять дней в них появлялась аскорбиноксидазная система, для функционирования которой требовалась АК, восстановленный глютатион, НАД+Н+ и в качестве окисляемого субстрата - яблочная кислота. Аскорбинокси-дазная система проростков была связана с растворимой частью цитоплазмы и не обнаруживалась в митохондриях.

По мнению Б.А.Рубина и М.Е.Ладыгиной [134], аскорбатоксидаза участвует и в дыхании хлоропластов, дыхательная цепь которых схематически изобража-ется следующим образом:

Система пероксидазы ДАК ↔ АК — Аскорбинатоксидаза НАДФ+Н2

+ О2 Хинон ↔ фенол — о-Дифенолоксидаза Цитохром в6

В молодых плодах лимона система переноса электронов от дыхательного

субстрата - яблочной кислоты на кислород также включает АК, оксидоредуктазу АК и глютатион [410]. Интересно отметить, что, как показано в данной работе, глютатион и АК стимулировали дыхание только в августе - декабре, а в январе-июне угнетали.

Наряду с фактами активации дыхания в присутствии АК известны примеры прямо противоположного ее действия. Так, наблюдалось ингибирование аскор-батом дыхания корней проростков пшеницы в условиях торможения окисли-

13

тельной активности эндоплазматического ретикулума, что, вероятно, связано с усилением аскорбатзависимого перикисного окисления липидов [25]. Возмож-ность стимуляции окисления жирных кислот (особенно стеариновой) в присут-ствии увеличивающихся доз АК (до 106,56 мМ) была показана ранее [255].

Исследуя взаимосвязь между биосинтезом АК и развитием нечувствительно-го к цианиду дыхания в срезах клубней картофеля, авторы [206] предположили, что АК необходима для синтеза белков, участвующих в дыхании по нечувстви-тельному к цианиду пути. В связи с чем АК рассматривается как фактор, кон-тролирующий данный тип дыхания.

Таким образом, АК может участвовать в дыхательном процессе как непо-средственный переносчик водорода и как ко-фактор, стимулирующий процесс, о чем говорят данные только что рассмотренного исследования. Причем доля ды-хания через систему АК/ДАК может колебаться и в некоторых случаях стано-виться доминирующей. Так, у растений табака, пораженных картофельным ви-русом У основной вклад в интенсивность дыхания вносила система глютатион - аскорбат [315].

2.2. Влияние аскорбата на экспрессию генома, ферментативную активность,

водный режим, ростовые и другие процессы Рассматривая вопрос о физиологической роли АК в растениях, Чикай и

Сингх [230] указывают, что АК активирует реакции метаболизма, связанные с обменом нуклеиновых кислот. Это возможно за счет того, что АК играет роль дерепрессора, снимающего репрессорное действие гистонов на ДНК. Таким пу-тем АК освобождает большее число матриц для синтеза мРНК [230, 398].

Наиболее существенное физиологическое воздействие АК на растения обу-словлено тем, что она оказывает влияние на ферментативную активность. В ее присутствии активируется тиоглюкозидаза [276], мирозиназа [361], фермента-тивный гидролиз бензилглюкозинолата [269], протеазы, амилазы, усиливается синтез РНК [231] и активность РНК-азы [338], хотя другие исследования [231] последнее не подтверждают.

Характер действия окисленных форм АК на ферментативную активность может быть иным, чем у восстановленной АК. Так, если восстановленная АК активировала фосфоглюкомутазу семян гороха, то ДАК снижала, а ДКГК - не оказывала влияния [205]. Другой пример: АК и ДКГК в анаэробных условиях не меняли активность ферментных систем, окисляющих сукцинат и глюкоза-6-фос-фат, а ДАК при этом оказывала тормозящее действие [334].

Известны случаи ингибирующего влияния на активность ферментов и вос-становленной формы АК. Это показано для полифенолоксидазы [4] и протеоли-тических ферментов, для которых АК является антагонистом [390]. АК вызыва-ла лаг-фазу в активности пероксидазы, которая снималась аскорбатоксидазой [224].

Механизм действия АК на ферментативную активность различных энзимов, вероятно, не одинаков. Активацию претеолитических ферментов аскорбатом

14

объясняют [45, 46] тем, что в присутствии АК восстанавливаются дисульфидные группировки. Стимуляция тиоглюкозидазы может происходить за счет того, что АК вызывает конформационное изменение молекулы фермента, сопровождаю-щееся увеличением сродства к субстрату [276]. Есть мнение [231], что действие АК затрагивает геном растений: она контролирует кодирующий механизм, диф-ференцированно влияя на синтез РНК и скорость реакций различных ферментов. Полагают, что АК может играть роль гормона, мобилизующего ферменты.

Таким образом, действие АК на ферментативную активность может прояв-ляться или в изменении активности уже имеющихся ферментов, или в измене-нии скорости их синтеза.

АК оказывает существенное влияние на водный режим растений. Оно про-является в торможении поступления воды [44, 431, 433], уменьшении оводнён-ности [44], в изменении подвижности внутриклеточной воды [153], ускорении транспирации [431, 433, 151]. Хотя в отношении последнего имеются и прямо противоположные данные [44].

Под действием АК изменяется соотношение свободной и связанной воды за счет увеличения свободной. Механизм действия АК на поступление и потерю воды объясняют [44] изменением коллоидно-химических свойств протоплазмы, а также деполяризацией протоплазменных мембран.

Важную роль АК играет в процессах роста и развития растений. Она обеспе-чивает дружное и более быстрое прорастание семян у пшеницы, овса, кукурузы, кунжута и других растений [241, 230, 408]; активирует рост гипокотиля и корней [432, 400, 236], проростков люпина, растений ячменя [176] и помидоров, семя-доли которых были удалены после прорастания [300], пазушных побегов [58]. Имеются данные о стимуляции роста стеблей тростника окисленной формой АК [443]. Определяя содержание АК в 5-7-дневных проростках гороха и кукурузы, Г.Ф.Проценко [122] показала, что растения, отличающиеся быстрым ростом, со-держали меньше АК, чем медленно растущие. На основании чего автор полага-ет, что АК принимает участие в биохимических превращениях, лежащих в осно-ве роста. Действительно, АК меньше используется карликовыми сортами сорго [291], хотя ее содержание, как показано в данной работе, почти одинаково у вы-соко-, средне- и низкорослого сортов.

Определенную роль АК играет в процессах цветения, вегетативной и репро-дуктивной дифференциации. Она стимулирует растяжение и морфогенез клетки [385], цветение некоторых растений [166]. Уровень АК резко повышается в на-чале дифференциации цветков [424]. Обработка растений АК увеличивает коли-чество мужских и женских цветков, но уменьшает их соотношение по сравне-нию с контролем [396]. Отмечено стимулирующее действие АК на клубнеобра-зование картофеля и его прорастание [270, 393]. Введение АК в питательную среду значительно усиливало прорастание пыльцы хлопчатника, а обработка ра-стений АК ускоряла образование и уменьшала опадение завязей [96]. Плоды аб-рикоса и сливы быстрее созревали в присутствии АК [417]. Общее воздействие АК на растение проявляется в задержке старения листьев, то есть распада хло-рофилла, РНК, ДНК [252].

15

Стимулирующее действие АК на ростовые процессы для каждого вида и сорта растений проявляется в определенных пределах концентраций. Обработка семян яровой пшеницы АК в концентрации 0,01% стимулировала ростовые про-цессы, а в концентрации 0,1% - подавляла их [43]. Для корней кукурузы стиму-лирующим рост оказался раствор АК в концентрации 0,05-0,005%, а в концен-трации 0,05-2,5% - ингибирующим [88]. В ряде опытов [372] стимуляция роста отрезков колеоптилей овса под действием АК наблюдалась в узких пределах концентраций (0,3·10-3 - 4,5·10-3 М).

Наряду со стимуляцией роста при обработке растений АК происходит уве-личение содержания последней [245, 184, 168, 264, 248, 253, 407], тем самым увеличивается суммарное воздействие АК на ростовые процессы.

Отмеченное в ряде работ отсутствие стимуляции или даже угнетение роста под действием АК [334, 352, 369, 428, 435] можно объяснить тем, что АК при окислении быстро превращается в ДАК, которая замедляет рост [47, 436]. Так, ингибирование роста, наблюдаемое у карликовых мутантов кукурузы, имело место при более высоком отношении ДАК/АК по сравнению с нормально рас-тущими растениями и, как заключает автор, рост связан с более восстановлен-ным состоянием клетки [340]. Хотя поддерживать его за счет восстановленной АК непросто, так как у карликовых и нормально растущих растений кукурузы наибольшая активность свободного и связанного с клеточными стенками фер-мента, окисляющего АК, - АО - обнаружена в тканях мезокотиля с активным растяжением клеток. Таким образом, для активного роста растений необходимо высокое содержание восстановленной формы АК при активной АО.

Ингибирующее действие АК на ростовые процессы находит и другое объяс-нение с учетом результатов следующего опыта: 30-дневные растения пшеницы опрыскивали в течение 11 дней 0,001 и 0,005 М растворами АК [412]. Это при-вело к снижению высоты растений, количества побегов, массы надземной части, содержания общего количества свободных аминокислот. В связи с чем угне-тающее действие АК на рост автор связывает с влиянием ее на синтез аминокис-лот. Конкретнее, это может проявляться в ингибировании переаминирования глутаминовой кислоты и аланина [398].

Таким образом, в литературе имеются данные о стимуляции и ингибирова-нии ростовых процессов у растений под действием АК. Естественно, это можно объяснить и видовой специфичностью объектов исследования, и конкретными условиями опытов. Но в любом случае для окончательного решения вопроса не-обходим одновременный анализ всех кислот системы АК: АК ↔ ДАК → ДКГК, так как свойства АК и ДАК как доноров электронов, источников водорода - пря-мо противоположные, что, несомненно, сказывается на их воздействии на росто-вые процессы. При этом легкость перехода АК в ДАК и наоборот усложняет си-туацию определения действующего начала. Тем не менее большинство авторов разделяет точку зрения о том, что в присутствии АК отмечается стимуляция ростовых процессов.

Механизм действия АК на рост может быть двояким. С одной стороны, АК может выполнять функцию дерепрессора, снимающего репрессию синтеза ДНК

16

гистонами, что определяет ее участие в работе кодирующего механизма клетки [230, 398]. С другой стороны, действие АК на рост может быть опосредовано через ауксины. Показано, что АК может тормозить окисление индолилуксусной кислоты, катализируемое пероксидазой, возможно, прямо связываясь с ИУК. В этом случае АК выступает как конкурентный ингибитор пероксидазы, защищая ИУК от разрушения [357]. Стоит отметить, что существовало мнение, согласно которому специфическая активность ауксинов сама является результатом их первичного воздействия на обмен АК [332].

Особый интерес для биотехнологии, и в частности для отработки методов культивирования растительных тканей, представляют данные о накоплении АК этими тканями и о стимуляции их роста АК [288, 295].

АК оказывает влияние на азотистый обмен растений. Обработка пшеницы раствором АК приводила к уменьшению в листьях количества свободных ами-нокислот и некоторому повышению содержания нерастворимого азота [412]. Присутствие АК в функционирующих клубеньках вигны говорит о возможном ее участии в процессе азотфиксации [253].

Под действием АК активируются некоторые биосинтетические процессы. Показана необходимость АК для биосинтеза оксипролинсодержащих белков в растениях [207, 365] и синтеза алкалоидов в недифференцированной каллюсной ткани мака снотворного [295]. АК вызывала снижение окислительно-восстано-вительного потенциала березы, что ускоряло переход к вегетации, связанной с синтезом биополимеров [144].

Экзогенный аскорбат оказывает действие на разность поверхностных биопо-тенциалов, сдвигая ее в область положительных значений у набухающих семян кукурузы и пшеницы [139]. АК снимала индуцируемое феррицианидом увели-чение рО2 у элодеи и валлиснерии [93].

Таким образом, даже конспективное перечисление тех процессов, в которых принимает участие АК: фотосинтез, дыхание, рост, развитие, устойчивость, экс-прессия генома, ферментативная активность, биосинтетические и биофизические процессы, азотфиксация, восстановление нитритов [214] - говорит о том, что АК затрагивает практически все стороны жизнедеятельности растений и относится к числу важнейших полифункциональных соединений автотрофных организмов.

2.3. Защитная функция аскорбиновой кислоты

АК выполняет важную защитную функцию, что прежде всего проявляется в

отношении растений к пониженным температурам. В ряде работ показана роль АК в формировании зимостойкости [1, 117, 147, 170, 202]. Это касается интро-дуцируемых растений [72], плодово-ягодных культур [118, 188] и злаков [122, 126], зимостойкие сорта которых накапливали больше АК, чем менее зимостой-кие.

Большое количество работ посвящено исследованию действия АК на им-мунные свойства растений, так как считается, что одним из проявлений активно-го иммунитета растений является нормальное или повышенное образование в них АК [27, 112, 119]. Например, содержание АК в плодах манго, превышающее

17

40 мг %, увеличивает их устойчивость к поражению бактериями, вызывающими черную пятнистость плодов [439].

Ответной реакцией на многие поражения растений является усиленный био-синтез АК. Так, в листьях виноградной лозы, восприимчивых к антракнозу, об-наружено повышенное содержание АК при высокой активности АО [44]. Высо-ким был уровень АК в листьях баклажана, подверженных вертициллезному увя-данию [389]. Обработка восприимчивых к нематоде сортов томатов раствором АК (45 мМ) на 96-99% снижала их поражаемость. Полагают, что АК использу-ется для синтеза митохондриальных оксипролин-содержащих белков, которые определяют устойчивость томатов к нематоде [208].

Известно мнение, что защитную функцию выполняет не восстановленная АК, а ее окисленная форма [112], так как у устойчивого к пероноспорозу сорта гороха в клетках, расположенных у очага поражения, часть АК была представ-лена окисленной формой. Она-то, как считают авторы, и служит барьером на пути возбудителя. У восприимчивых сортов гороха в местах проникновения па-тогена обнаружена только восстановленная форма АК.

Защитное действие АК проявляется и при радиационном поражении расте-ний. Предпосевное облучение сухих семян кукурузы различными дозами рент-геновских лучей (до 22 тыс. рентген) и гамма-лучей (до 33 тыс. рентген) вызы-вало при больших дозах радиации увеличение у растений содержания АК [145]. В связи с этим предпринимаются попытки выяснить защитное действие пре- и постобработки экзогенной АК на семена, подвергнутые воздействию гамма-из-лучения [426]. Уже имеются данные о том, что замачивание семян ячменя в 0,5 М растворе АК за час до облучения снижало количество поврежденных об-лучением проростков и стимулировало их рост [449]. При облучении в леталь-ных дозах количество АК может уменьшаться, возможно, за счет того, что воз-растает ее расход на окисление липидов [94, 406].

Столь же актуальным, как исследование защитной роли АК при радиацион-ном облучении, является изучение защитных свойств соединений системы АК в отношении растений, обрабатываемых гербицидами [397]. Для практики сель-ского хозяйства определенный интерес может представлять тот факт, что коэф-фициент восстановления - окисления ДАК и АК соответственно был значитель-но выше у сортов, устойчивых к полеганию [82].

Повышенным уровнем АК отличаются пораженные раком органы картофеля [76]. По данным Р.Маковер [316], АК ослабляет его побурение. Некоторые про-изводные АК - аскорбат калия, аскорбат кальция - способны защищать листья фасоли от повреждений, вызываемых озоном [248]. Каким образом растения мо-гут защищать себя от губительного действия озона, используя АК ? Предполага-ется, что диффундирующий в листья озон прежде всего реагирует с АК, скон-центрированной в клеточных стенках, и это ограничивает его проникновение в наиболее уязвимые ткани. Другие механизмы инактивации озона в клеточной стенке, такие, как разрушение его в результате образования перекисей и реакций с этиленом, вероятно, не столь эффективны [225].

Экзогенный аскорбат может снимать ингибирование нитратредуктазы в ли-стьях овса в темноте вызванное перекисью [293]. Возможная функция АК и

18

компонентов ее системы в растениях, находящихся в условиях стресса, рассмат-ривается в ряде работ [455, 457-461].

Таким образом, при участии АК формируется устойчивость растений по от-ношению ко многим неблагоприятным воздействиям: к пониженной температу-ре, радиации, вирусной и бактериальной инфекции и т.д. Учитывая результаты цитированных выше работ, можно рекомендовать использование обработки АК для борьбы с возбудителями некоторых заболеваний растений. Кроме этого, уровень эндогенной АК может служить тестом, характеризующим устойчивость растений. В перспективе растения, обладающие высоким показателем тести-рования по данному признаку, можно использовать при получении растений с заданными свойствами методами соматической гибридизации и генной инжене-рии.

Глава 3. БИОСИНТЕЗ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ДЕРИВАТОВ

3.1. Субстраты для новообразования аскорбата Способностью синтезировать АК обладают растения различных уровней ор-

ганизации: грибы, водоросли, мхи, лишайники, хвощи, плауны, голосеменные и покрытосеменные растения. Присутствует она и в бактериях [152]. Содержание АК в растениях колеблется в значительных пределах, достигая рекордной вели-чины в плодах австралийского растения терминалии фернандианы и мальпигии - около 4000 мг % [162]. Виды растений, листья которых отличаются повышен-ным содержанием АК, могут иметь самое различное таксономическое поло-жение [198]. Растения легко синтезируют АК, но каким образом они это делают, до сих пор полностью не ясно [28].

Изучение путей синтеза АК началось с установления природы веществ, яв-ляющихся исходными при ее новообразовании. Первые убедительные доказа-тельства того, что АК образуется из гексоз, были получены в экспериментах С.Рай [371], которая показала, что у отрезанных зародышей гороха, растущих на стерильной синтетической среде, гексозосахара увеличивали содержание вита-мина С. Со времени первых экспериментов прошло немало лет, однако до сих пор не ясно, какие именно сахара являются исходными для синтеза АК.

К.Л.Поволоцкая [115], испытав различные моно- и дисахара: глюкозу, фрук-тозу, галактозу, лактозу, маннозу и сахарозу - показала, что все они, за исключе-нием лактозы, используются в синтезе АК. Необходимость глюкозы для синтеза АК отмечала и К.З.Тульчинская [159].

Инфильтрируя в проростки овса различные соединения, В.Н.Девятнин [32] установил, что синтез АК усиливается при введении веществ, содержащих 6 уг-леродных атомов и сходных по расположению отдельных атомов в положении С5-С6 с l-АК. Соединения, не отвечающие этим требованиям, как полагает автор,

19

в биосинтезе АК непосредственного участия не принимают. Основным материа-лом для синтеза АК, по его мнению, являются углеводы, и в первую очередь та-кие углеводы и их производные, как инозит, сорбит, 2-кето-l-гулоновая кислота, левулоза и сорбоза.

Большое влияние на биосинтез аскорбиновой кислоты из экзогенных суб-стратов оказывают условия освещенности. Так, в опытах Аберга [193] выдержи-вание в темноте в течение 1-5 суток листьев овса и петрушки на 2,5-5%-ных рас-творах сахарозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, ксилозы снижало в них содержание аскорбиновой кислоты и только при длительном выдерживании листьев (2-4 суток) на 10-20%-ных растворах сахарозы и 5%-ных растворах глю-козы и ксилозы в темноте наблюдалось некоторое увеличение содержания ас-корбиновой кислоты по сравнению с исходным. В наших исследованиях [98, 103] также подчеркивается необходимость света в образовании аскорбиновой кислоты из глюкозы.

Иного характера данные приводит Е.Ассольбергс [209]. Из большого набора исследованных им соединений (d-глюкоза, d-фруктоза, l-сорбоза, d-глюкуроно-вая кислота, 2-кета-l-гулоновая кислота, глюкозоциклоацетоуксусная кислота и др.) только γ-лактон глюкуроновой кислоты вызывал значительное увеличение содержания аскорбиновой кислоты в листьях молодых побегов яблони, находя-щихся на свету (18 тыс.люкс, 24,48 часов). Автор не нашел положительного дей-ствия глюкозоциклоацетоацетата на биосинтез АК, в то время как ряд исследо-вателей [350, 427] рассматривал это соединение как промежуточное при биосин-тезе АК. Семена фасоли при проращивании в присутствии радиоактивной глю-козы или радиоактивного глюкозоциклоацетоацетата использовали последний в пять раз лучше, чем глюкозу [427]. М.Натх и М.Белкходе [350] также отмечали преимущественное использование глюкозоциклоацетоацетата в биосинтезе АК по сравнению с глюкозой и ацетоацетатом.

В опытах М.Накатани [З48] ферментный препарат, выделенный из зароды-шей 6-дневных зеленых проростков гороха, способных интенсивно синтезиро-вать АК, катализировал образование АК из d-глюкуроновой, d-галактуроновой и особенно из диацетон-2-кето-l-гулоновой кислот. В присутствии d-глюкозы и d-галактозы синтез АК не шел.

Использование углеводов в биосинтезе АК в настоящее время не вызывает сомнения [368, 402]. Что касается исследования органических кислот как суб-страта для образования АК, то здесь следует снова обратиться к работе В.А.Девятнина [32], в которой помимо уже названных соединений изучалось действие щавелевой, винной, фумаровой, янтарной, лимонной, альгиновой, АК и 2-кета-l-гулоновой кислот. При инфильтрации в проростки овса из них лишь по-следняя увеличила содержание АК на 20% по сравнению с исходным. Введение АК поднимало собственный уровень лишь на 6%, фумаровой и лимонной - на 2,6. Винная и альгиновая кислоты не меняли содержание АК, щавелевая - сни-жала его на 15%. В опыте использовались растения, выращенные на свету.

20

В своей работе по изучению действия органических кислот на биосинтез АК мы строго контролировали условия освещения во время опыта. В качестве суб-страта использовали α-кетоглутаровую, янтарную, винную, щавелевую, яблоч-ную и лимонную кислоты в концентрации 0,005 М. Опытные 7-9-дневные про-ростки ячменя, предварительно выдержанные в темноте в течение 48 часов, по-мещали на растворы кислот в темноте и на свету люминесцентных ламп ЛЦД-40 (17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на 6 часов. В связи с тем, что использование глюкозы в про-цессе биосинтеза АК является доказанным, в параллельных вариантах листья помещались на 0,005 М раствор глюкозы и на воду. Контролем служили расте-ния, растущие во время опыта в темноте.

В таблице 1 представлены данные о действии винной кислоты на биосинтез АК в проростках ячменя. На растворе винной кислоты на свету содержание АК в листьях увеличилось в 2,5 раза по сравнению с контролем, тогда как на растворе глюкозы - общепризнанном субстрате для биосинтеза АК - в 2 раза, на воде - лишь на 38%. Положительное действие на биосинтез АК винная кислота, так же как и глюкоза, оказывала только на свету.

Таблица 1

Влияние винной кислоты на биосинтез АК в 8-9-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)

Вариант опыта АК t мкг/г %

Контроль (а) 49,3 100 На воде:

свет (б) темн. (в)

67,8 50,9

138 103

ав= 0 41,

На 0,005 М растворе винной кислоты: свет (г) темн. (д)

126,5 44,4

256 90

бг= 9 27,

ге= 12 39,

ад= 0 85,

На 0,005 М растворе глюкозы: свет (е) темн. (ж)

99,0 49,1

201 100

бе= 6 09,

аж= 0 07,

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05 Достаточно хорошо используется в биосинтезе АК и α-кетоглутаровая ки-

слота (табл.2): содержание АК в листьях, плавающих на 0,005 М растворе α-ке-тоглутаровой кислоты, на свету увеличилось на 47%, на растворе глюкозы - на

21

44. В этой серии опытов использовались проростки с более высоким исходным содержанием АК, поэтому прибавка АК в абсолютных величинах не столь высо-ка, как в предыдущих опытах, однако и здесь достоверно показано, что α-кетоглутаровая кислота используется в биосинтезе АК так же хорошо, как и глюкоза. Использование α-кетоглутаровой кислоты в этом процессе идет только на свету.

Положительное действие на биосинтез АК оказала и янтарная кислота (табл.3). Содержание АК в листьях, находившихся на растворах янтарной кисло-ты и глюкозы, увеличилось соответственно на 51 и 58%, на воде - на 39. В дан-ных опытах выявлено достоверное накопление АК в листьях, находившихся в темноте на растворе янтарной кислоты и на воде. Вероятно, в определенных ус-ловиях проростки содержат достаточное количество предшественника АК, что позволяет им осуществлять синтез АК и в темноте, независимо от наличия экзо-генных субстратов.

В проростках ячменя, помещенных на 0,005 М раствор щавелевой кислоты на свету (табл.4), за 6 часов освещения содержание АК увеличилось на 55% по сравнения с контролем. В листьях на растворе глюкозы прибавка в содержании АК составила 56%, на воде - 32. Следовательно, щавелевая кислота наряду с винной, янтарной и α-кетоглутаровой может использоваться как субстрат в био-синтезе АК.

Таблица 2

Влияние α-кетоглутаровой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)




142,7 115,0

137 110

ав= 5 54,

На 0,005 М растворе α-кетоглутаровой кислоты: свет (г) темн. (д)

152,8 98,3

147 94

бг= 3 62,

ге= 0 48,

ад= 1 41,


150,1 111,0

144 106

бе= 8 70,

аж= 1 33,

22

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05

Таблица 3

Влияние янтарной кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)




175,7 140,9

139 111

ав= 4 96,

На 0,005 М растворе янтарной кислоты: свет (г) темн. (д)

191,7 137,8

151 109

бг= 3 76,

ге= 1 38,

ад= 9 58,


199,6 135,8

158 107

бе= 4,60

аж= 1 23,

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05

Таблица 4

Влияние щавелевой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)




150,0 125,6

132 110

ав= 2,79

На 0,005 М растворе щавелевой кислоты: свет (г) темн. (д)

176,4 144,4

155 127

бг= 7 45,

ге= 0 54,

ад= 3 55,


178,2 130,5

156 115

бе= 3 61,

аж= 1 93,

23

n = 8, tтабл. = 2,36 для Р ≤ 0,05 Наиболее активно биосинтез АК идет в проростках, помещенных на раствор

щавелевой кислоты на свету, однако щавелевая кислота может использоваться и в темноте.

Содержание АК в проростках, используемых в опытах по изучению дейст-вия яблочной кислоты на биосинтез АК, было низким (табл. 5), поэтому отмеча-лось резкое возрастание содержания АК в освещенных листьях, находящихся на воде и на глюкозе (на 113 и 140%). В варианте же с яблочной кислотой увеличе-ние АК составило всего лишь 48%, т.е. меньше, чем на воде.

Таблица 5

Влияние яблочной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 7-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)




107,5 47,6

213 94

ав= 1 39,

На 0,005 М растворе яблочной кислоты: свет (г) темн. (д)

74,4 58,2

148 115

бг= 6 32,

ге= 7 35,

ад= 0 91,


121,2 43,5

240 86

бе= 3 46,

аж= 3 85,

n = 8, tтабл. = 2,36 для Р ≤ 0,05

В следующей серии опытов исследовалось действие лимонной кислоты на

накопление АК (табл. 6). Здесь также отмечено резкое возрастание содержания АК в освещенных проростках, причем прибавка АК была почти одинаковой во всех вариантах: на воде - 89%, на растворе лимонной кислоты - 94%, несколько большее увеличение на растворе глюкозы - 104%. Во всех темновых вариантах прибавка АК составила 19-26%. Следовательно, в присутствии экзогенной ли-монной кислоты скорость новообразования АК на свету не увеличивается по сравнению с контролем на воде, а в случае с яблочной кислотой даже уменьша-ется.

24

Таким образом, наряду с углеводами в процессе биосинтеза АК могут ис-пользоваться соединения, содержащие более короткую углеродную цепочку, в частности некоторые органические кислоты, такие, как щавелевая, янтарная, винная и α-кетоглутарозая. Причем использование их идет преимущественно на свету, а в случае с винной и α-кетоглутаровой кислотами - только на свету [110]. Стимуляцию накопления АК в присутствии экзогенной щавелевой и винной ки-слот можно объяснить исходя на того факта, что деградация АК в растениях идет с образованием данных кислот. Следовательно, при их избытке, когда воз-можно ингибирование процесса деструкции молекулы АК конечными про-дуктами реакции, снижаются ее потери.

Таблица 6

Влияние лимонной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)




139,6 92,3

189 125

ав= 19 91,

На 0,005 М растворе лимонной кислоты: свет (г) темн. (д)

143,6 87,6

194 119

бг= 0 71,

ге= 1 08,

ад= 5 05,


150,6 92,9

204 126

бе= 1 56,

аж= 2 47,

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05 Стимуляцию синтеза АК экзогенными субстратам вообще, и органическими

кислотами в частности, нельзя интерпретировать однозначно, как непосредст-венное использование этих соединений при новообразовании АК. Возможно опосредованное ускорение биосинтеза АК через стимуляцию других процессов, например, ЦТК в случае с органическими кислотами - интермедиатами цикла [15]. Это предположение проверялось в опытах по исследованию действия экзо-генного пирувата, декарбоксилирование которого дает уксусную кислоту, ис-пользуемую в ЦТК. Исследования показали стимуляцию синтеза АК в листьях ячменя, плавающих на 0,005 М растворе пирувата, по сравнению с вариантом, где в качестве субстрата использовался 0,005 М раствор глюкозы (рис.1). Поло-

25

жительное действие пирувата наблюдалось только у освещенных растений (рис. 2). Следовательно, существует связь биосинтеза АК с функционированием ЦТК на свету.

Рис. 1. Накопление АК в освещенных (31,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) листьях ячменя, плавающих на 0,005 М растворе глюкозы (1) и 0,005 М растворе пирувата (2)

различное время

26

Рис. 2. Действие экзогенного пирувата (0,005 М) на накопление АК в листьях ячменя в

темноте (1) и на свету (31,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) (2) Более достоверные и информативные данные при исследовании возможно-

сти использования в биосинтезе АК тех или иных соединений, несомненно, дает метод меченых атомов. Показано, что изолированные листья девичьего виногра-да пятилисточкового (Parthenocissus quinquefolia α.) трансформируют меченую d-глюкозу (5-3H-1-14С-глюкозу и 3H-, 14С-глюкозу) в АК с сохранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной группы [271, 272]. Таким образом, метод позволяет не только однозначно решить вопрос о возможности использования конкретного субстрата в биосинтезе АК, но и дает материал для решения вопроса о путях ее биосинтеза. Подробнее эти два взаимосвязанных вопроса будут рассматриваться в следующем разделе.

3.2. Химизм биосинтеза

Установление веществ, необходимых для образования АК, является лишь

первым этапом в изучении путей ее синтеза, которые до сих пор полностью не исследованы [28, 306]. Наиболее значительные работы в этой области выполне-ны двумя группами исследователей: Ф.Ишервуд, Л.Мапсон, Г.Чжень и Ф.Ловус, Р.Джанг, а в последние годы - Ф.Ловус в сотрудничестве с Я.Хелспером, К.Саито и др. уже больше внимания обращали не на биосинтез, а на метаболизм АК.

Большинство авторов наиболее вероятными предшественниками АК счита-ют d-глюкозу и d-галактозу [150]. Это значит, что при превращении их в l-АК гидроксильные группы у пятого углеродного атома должны быть перемещены из d, положения в l. Это может осуществиться прямой инверсией групп у С5 или инверсией всей цепи так, что С-1 d-глюкозы станет С-6 углеродной цепи АК. Имеется несколько возможных механизмов для реализации этих изменений.

Ф.Ишервуд, Г.Чжень, Л.Мапсон [282, 283] считают, что превращение d-глю-козы и d-галактозы в l-АК включает инверсию всей молекулы и идет без предва-рительного расщепления углеродной цепи:

CHO CHO СH2OH CO Н-С-OH H-С-OH H-С-OH HO-С НО-С-H HО-С-H HО-С-H * HО-С О H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C H-C-OH H-C-OH H-C-OH HO-C-H СH2OH СOOH СOOH СH2-OH

D-глюкоза D-глюкуро- L-гулоно- L-АК

27

новая кислота вая кислота * инверсия Биосинтез АК, по их мнению, более вероятно протекает из d-галактозы пу-

тем окисления ее в d-галактуроновую кислоту, восстановления d-галактуроновой кислоты в l-галактоновую и окисления γ-лактона последней в l-АК:

CHO CHO СH2OH CO Н-С-OH H-С-OH H-С-OH HO-С НО-С-H HО-С-H HО-С-H * HО-С О HO-C-H HO-C-H HO-C-H H-C H-C-OH H-C-OH H-C-OH HO-C-H СH2OH СOOH СOOH СH2-OH

D-галактоза D-галактуро- L-галактоно- L-АК

новая кислота вая кислота Приведенная схема не включает всех промежуточных соединений на пути

синтеза АК. Л.Мапсон и Ф.Ишервуд [327] более подробно анализируют превра-щение d-галактуроновой кислоты в l-АК растительными экстрактами. Под влия-нием экстракта из проростков гороха происходит превращение производных d-галактуроновой кислоты в производные l-галактоновой кислоты и дальше в l-АК. Этот процесс in vitro осуществляется в две стадии:

1) восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно-γ-лактон под влияни-ем фермента, локализованного в растворимой части цитоплазмы; процесс идет за счет восстановленного НАД⋅Н;

2) окисление лактона в АК, требующее присутствия ферментного ком-понента, заключенного в митохондриях.

Эффективность использования l-галактоно-γ-лактона в биосинтезе АК пока-зана и другими авторами [287], наблюдавшими при его введении в листовые пластинки Petroselinum crispum резкое возрастание АК, содержание которой че-рез 190 часов достигало 12% от сухого веса.

Правильность предлагаемой схемы синтеза проверяется следующим обра-зом: в качестве субстрата растениям дается предполагаемое промежуточное ве-щество и регистрируется, насколько быстро из него синтезируется АК. В том случае, когда образование АК идет из d-глюкозы, непосредственным предшест-венником l-АК будет l-гулоно-γ-лактон [74, 283, 388]. Возможность использова-ния в синтезе АК d-галактуроновой кислоты и гулонолактона отрицалась Е.Ассольбергсом [209], который показал, что в отрезанных листьях яблони они вызывали меньший синтез АК, чем водный контроль. Автор предполагал, что

28

промежуточное вещество между глюкуроновой и АК может быть иным, чем γ-лактон.

Схема биосинтеза АК, предложенная Ф.Ишервудом с сотрудниками, нахо-дит подтверждение в экспериментах с использованием экзогенных субстратов (in vivo) и ферментных препаратов (in vitro). Подкормка проростков салата, бо-бов и гороха l-галактоно-γ-лактоном легко дает l-АК. Д-глюкуроно-γ-лактон и l-гулоно-γ-лактон также дают l-АК, но в намного меньшем количестве, чем соот-ветствующие производные галактозы.

Ф.Ишервуд с сотрудниками первыми демонстрировали образование l-АК in vitro в экстрактах из проростков гороха, используя l-галактоно-γ-лактон как суб-страт. Ответственные ферменты были всецело локализованы внутри митохонд-рий. L-галактоно-γ-лактон быстро превращался в l-АК. Скорость превращения l-гулоно-γ-лактона в l-АК составляла лишь 1/20 от скорости предыдущей реакции [282].

Таким образом, группой Ф.Ишервуда получены экспериментальные данные в подтверждение того, что в биосинтезе АК могут быть использованы производ-ные d-глюкозы и d-галактозы, причем последние: d-галактуроновая кислота, l-галактоно-γ-лактон - являются лучшими субстратами, чем соответствующие производные d-глюкозы. Этот путь образования АК, по мнению авторов, вклю-чает инверсию углеродного скелета исходной молекулы и образование проме-жуточных фосфорилированных продуктов.

Схема путей биосинтеза l-АК у Euglena gracilis, предложенная С.Шигеока [402], предусматривает возможность обмена метаболитами, образующимися из d-глюкозы и d-галактозы при перестройке их в молекулу АК:

Д-глюкоза Д-галактоза UДР-глюкоза UДР-галактоза (А) UДР-глюкуроновая кислота UДР-галактуроновая кислота Д-глюкуроновая кислота Д-галактуроновая кислота (В) Д-глюкуроно-γ-лактон L-галактоновая кислота (В) L-гулоно-γ-лактон L-галактоно-γ-лактон

(С) (С) L-аскорбиновая кислота

Жирные линии на схеме показывают главный путь синтеза АК, в ней приве-

дены некоторые ключевые ферменты, катализирующие данный процесс: (А) - UДР-глюкозо дегидрогеназа; (В) - NАДР: l-гексонат дегидрогеназа; (С) - l-гулоно-γ-лактон дегидрогеназа.

29

Эффективным приемом в выяснении путей синтеза АК является ис-пользование радиоактивных метчиков, что дает возможность проследить путь от исходного вещества до конечного продукта. Такие исследования с использова-нием радиоактивных веществ проведены Ф.Ловусом с сотрудниками. В отде-ленные созревающие плоды земляники вводились растворы гексоз, меченых по определенному атому углерода. Через 24-120 часов из плодов выделялась АК, в ней определялось место меченого углерода и величина его активности. Кроме земляники анализировались листья винограда, петрушки, проростки кресс-сала-та, молодые побеги фасоли,

Изолированные листья винограда трансформировали d-глюкозу в l-АК с со-хранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной группы [272]. В ягодах земляники и побегах фасоли [217] исследовался биосинтез l-АК из l-гулоно-1,4-лактона и l-галактоно-1,4-лактона. Радиоактивность в l-АК была локализована в том же атоме углерода, что и в предшественнике. Результаты некоторых исследований, выполненных Ф.Ловусом с сотрудниками [308, 309, 310, 311, 312], суммированы в таблице 7.

Из представленных данных видно, что в плодах земляники и проростках кресс-салата молекула глюкозы, меченая по 1,2 или 6-му углеродному атому, превращается в l-АК, меченую соответственно по 1, 2 или 6-му атому углерода. Это дало возможность авторам предполагать, что образование l-АК из d-глюкозы и d-галактозы идет без разрыва углеродной цепи и без специфического использования одной или другой триозы. Данный случай рассматривается как один из путей образования АК в растениях, включающий образование фосфори-лированных гексоз.

Иная картина была получена, когда в зеленые плоды земляники ввели d-глю-куронолактон, меченый по первому углеродному атому. После 66-часовой экс-позиции 97% метки было сосредоточено в 6-м углеродном атоме l-АК, что воз-можно только при перестройке углеродного скелета [311].

Подобная инверсия цепи углерода имела место при введении в плоды земля-ники d-галактуроновой кислоты [304]. Данные эксперименты подтверждают мнение Ф.Ишервуда и его коллег о том, что образование l-АК предусматривает инверсию молекул исходных гексоз. Однако необходимо иметь в виду, что в данном случае образование АК зависело от введения специфического углерод-ного источника, такого, как d-глюкуронолактон. В нормальном процессе био-синтеза АК этот путь, очевидно, не будет главным.

Таблица 7

Включение субстратов - 14С в l-АК

Объект

Субстрат

Распределение меченого С в молеку-ле АК, в % от общей активности

С1 С2 С3 С4 С5 С6 Проростки кресс-салата

d-глюкоза-1-14С 64 73

-

-

-

-

-

d-глюкоза-1-14С 65-70 7-8 2-8 14-19

30

Созревающие плоды d-глюкоза-2-14С 69-73 0-6 22-23 2-5 земляники d-глюкоза-6-14С 24 <1 1 2 73 d-глюкуронолактон-1-

14С - - - 97

d-галактоза-1-14С 45 - 8 6 - 41 Следовательно, в растениях существует и другой путь синтеза l-АК из d-

глюкуронолактона и d-галактуроновой кислоты, который не включает образова-ние промежуточных фосфорилированных продуктов и предусматривает образо-вание l-АК с инвертным порядком углерода С-цепочки по сравнению с исходной уроновой кислотой или лактоном.

Предположение о существовании в растениях двух путей синтеза l-АК, вы-двинутое Ф.Ловусом и др., встретило возражение со стороны Ф.Ишервуда и Л.Мапсона [282]. Так как экспериментальные доказательства в пользу отсутст-вия инверсии углеродной цепи глюкозы при образовании АК зависят от чистоты ее изолирования, то можно предположить, что существует радиоактивное за-грязнение АК, которое трудно удалить. Таким загрязняющим веществом авторы считают d-арабоаскорбиновую кислоту, которая может быть образована сле-дующим образом: d-глюкоза → 6-фосфо-d-глюконовая кислота → 3-окси-6-фос-фо-d-глюконовая кислота → 3-окси-d-глюконовая кислота → d-арабоаскорбино-вая кислота. Важно отметить, что глюкоза, меченая по первому углеродному атому, даст d-арабоаскорбиновую кислоту, меченую также по первому углерод-ному атому, так что действительная картина превращения d-глюкозы в l-АК бу-дет завуалирована.

В связи с тем, что в синтезе АК галактоза используется лучше, чем глюкоза, а радиохимические доказательства отсутствия инверсии в отношении галактозы менее определенны, чем в отношении глюкозы, то необходимы дальнейшие ра-боты, чтобы решить вопрос, существуют ли два пути синтеза l-АК в растениях, как предполагает Ф.Ловус [305], или один путь, включающий инверсию угле-родной цепочки d-глюкозы или d-галактозы при образовании l-АК, как считает Ф.Ишервуд и др.

3.3. Компартментация процесса биосинтеза аскорбиновой,

дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот Внутри растительной клетки АК распределена неравномерно. Содержание ее

в субклеточных структурах во многом зависит от их функционального состоя-ния [195, 289] и от внешних условий [181, 273]. Обнаружение АК в тех или иных органоидах еще не дает основания связывать ее биосинтез с данными компар-тментами, так как между клеточными структурами постоянно идет обмен мета-болитами. Поэтому при решении вопроса о внутриклеточной локализации био-синтеза АК в листьях ячменя нами не только учитывались данные по количест-венному распределению аскорбата [178], но и исследовалось накопление АК и ее дериватов - ДАК и ДКГК - при ингибировании хлоропластных, митохондриаль-

31

ных и цитоплазматических рибосом в зеленых, этиолированных и альбиносных листьях ячменя.

Содержание АК, ДАК и ДКГК определяли по методу В.В.Соколовского, Л.В.Лебедевой, Т.Б.Лиелуп, приспособленному нами для анализа растительного материала [172]. В качестве ингибитора хлоропластных рибосом использовали стрептомицин, связывающийся с 30S-субъединицами 70S-рибосом. Цитоплазма-тические рибосомы блокировали циклогексимидом в концентрации 15 мкг/мл [155], митохондриальные - хлорамфениколом (100 мкг/мл) [185], учитывая, что к нему чувствительны и рибосомы хлоропластов [7].

Растения, полученные из обработанных СМ семян (альбиносы), имели аль-биносное основание, зеленую верхушку и желто-зеленую переходную зону. Анализ содержания АК, ДАК и ДКГК в участках листа с различной пигментаци-ей (рис.3) показал присутствие анализируемых кислот и в альбиносной ткани, где уровень АК и ДАК был несколько ниже, чем в верхней и средней зоне листа, но в большем количестве обнаруживалась окисленная форма АК. Таким обра-зом, альбиносная ткань обладает способностью синтезировать АК и ее произ-водные, несмотря на значительные нарушения структуры некоторых клеточных органоидов.

Рис. 3. Содержание АК, ДАК и ДКГК в верхней (1), средней (2) и нижней альбиносной (3) частях мутантных листьев ячменя

Правомерно возникает вопрос о возможности транспорта АК из зеленой тка-

ни листа в альбиносную, так как в растениях АК может из листьев передвигаться по проводящим пучкам флоэмы, по центральной полости стебля и по межклет-никам паренхимы даже в корни [169]. Исследования, выполненные на листьях хлорофитума с различным содержанием белой ткани, показали, что в срезанных

32

листьях не происходит переброса меченых ассимилятов из зеленой ткани в бе-лую ни на свету, ни в темноте [14], хотя стоит учесть, что характер расположе-ния белых зон у хлорофитума и у частично альбиносных листьев ячменя раз-личный.

С целью изучения компартментации процесса биосинтеза АК исследовалось накопление ее в одновозрастных зеленых, этиолированных и альбиносных про-ростках ячменя. В опытах использовались не целые листья, а лишь нижние их участки, по размеру соответствующие альбиносной зоне мутантных листьев. Длительное выдерживание зеленых проростков ячменя в темноте снижало в них уровень АК, а последующее освещение стимулировало ее накопление [181]. Этюд определялась постановка наших опытов, в которых масштаб светозависи-мого накопления АК определялся в проростках, отличающихся по степени сформированности фотосинтетического аппарата после длительного выдержи-вання их в темноте (рис.4). После 48-часовой темновой экспозиции проростки значительно отличались по содержанию восстановленной формы АК: макси-мальное количество аскорбата обнаружено в этиолированных проростках, ми-нимальное - у альбиносных, зеленые проростки содержали лишь 62% АК от уровня ее в этиолянтах.

Рис. 4. Действие света (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в 7-дневных зеленых (а), этиолированных (б) и альбиносных (в)

проростках ячменя, выдержанных 48 часов в темноте

Последующее освещение в течение 24 часов увеличило количество АК во всех типах проростков, но масштаб светозависимого накопления аскорбата был неодинаков; если у зеленых проростков произошло удвоение содержания АК, то

33

у альбиносов и этиолированных проростков прирост АК составил лишь 36 и 19% соответственно.

Следовательно, проростки, отличающиеся по пигментному составу и по сте-пени сформированности фотосинтетического аппатара, обладают разной спо-собностью накапливать АК. Пул АК на свету определяется новообразованием и одновременно идущими процессами ее использования, в которых восстановлен-ная форма АК обратимо окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты, а разрыв лактонового кольца в последней приводит к необратимому образованию дикетогулоновой кислоты.

Одновременный анализ указанных кислот показывает направленность про-цессов в системе АК ↔ ДАК → ДКГК. Так, в зеленых проростках на свету уменьшается уровень ДАК при одновременном возрастании количества ДКГК, тогда как у этиолированных проростков сумма дериватов не меняется и остается на более низком уровне, чем в пигментированных листьях. В связи с этим можно полагать, что у зеленых проростков на свету восстановленная форма АК исполь-зуется активнее, чем у этиолированных и, следовательно, действительный уро-вень светозависимого биосинтеза АК в зеленых проростках выше определяемо-го. Следует отметить, что если у этиолированных проростков на свету количест-во ДАК увеличивается, то у зеленых уменьшается, что, вероятно, происходит за счет фотовосстановления ДАК до АК, которое имеет место в хлоропластах [286].

Таким образом, учитывая структурные и физиологические различия зеле-ных, этиолированных и альбиносных проростков и их способность синтезиро-вать АК на свету, можно было бы связывать биосинтез аскорбата с хлоропла-стами и, вероятно, с процессом фотосинтеза. Но, как показали проведенные опыты, АК накапливается в больших количествах в этиолированных проростках в темноте, а светозависимый биосинтез ее идет и у альбиносных проростков при увеличивающемся использовании АК на свету, так как в этих условиях нараста-ло количество продуктов окисления АК - ДАК и ДКГК. Альбиносные проростки были получены из семян, обработанных стрептомицином, который взаимодейст-вует с 30S-субъединицами 70S-рибосом. Следовательно, светозависимое на-копление АК может идти при ингибировании хлоропластных рибосом, и можно предположить, что ферменты, участвующие в метаболизации углеводов до АК, синтезируются без участия данных структур.

В последующих опытах выяснялось влияние ингибирования митохондри-альных рибосом на биосинтез АК, так как ранее при исследовании количествен-ной локализации АК в листьях ячменя было показано светозависимое накопле-ние АК во фракции, включающей митохондрии [178]. Ингибирование митохон-дриальных рибосом осуществлялось хлорамфениколом (100 мкг/мл), к которому чувствительны и рибосомы хлоропластов. В опытах использовались зеленые и альбиносные проростки, выдержанные 48 часов в темноте. Нижние участки ли-стьев данных проростков, а также этиолированных вырезались и помещались основанием в воду (контроль) или раствор хлорамфеникола на свет (рис. 5).

34

У контрольных зеленых проростков на свету количество АК увеличилось на 134%, ДКГК - почти вдвое. В присутствии хлорамфеникола уровень светозави-симого накопления АК и ДКГК понизился с одновременным возрастанием со-держания окисленной формы. В этиолированных проростках, также как и у зе-леных, в присутствии хлорамфеникола на свету синтез АК тормозился, и только у альбиносов светозависимое наколение АК не ингибировалось хлорамфенико-лом. Таким образом, в присутствии хлорамфеникола светозависимое накопление восстановленной формы АК снижалось у этиолированных и зеленых проростков и не менялось у альбиносных.

35

Рис. 5. Действие хлорамфеникола на содержание АК, ДАК и ДКГК в зеленых (а), этиолированных (б) и альбиносных (в) листьях ячменя, находящихся на свету

(33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1). Проростки предварительно 48 часов выдерживались в темноте Хлорамфеникол оказывает ингибирующее действие на 80S-рибосомы мито-

хондрий, но известно его влияние и на синтез белков хлоропластов, преимуще-ственно высокомолекулярных [81]. Поэтому снижение уровня АК у зеленых и этиолированных проростков в присутстсвии хлорамфеникола может быть ре-зультатом действия его на оба типа рибосом. У альбиносных проростков на све-ту масштаб накопления АК в присутствии хлорамфеникола не менялся, и это дает основание считать, что синтез ферментов, участвующих в метаболизации углеводов до АК, может идти без участия не только хлоропластных рибосом, но и митохондриальных.

Светозависимое накопление АК, блокируемое хлорамфениколом,в зеленых проростках составило 35% от всей синтезированной на свету АК, в этиолиро-ванных - 54. Следовательно, как минимум половина АК листьев ячменя синте-зировалась в присутствии ингибитора хлоропластных и митохондриальных ри-босом. Разницу в масштабе ингибирования светового синтеза АК в зеленых и этиолированных проростках хлорамфениколом можно объяснить, допустив, что фотовосстановление ДАК в хлоропластах - чисто фотохимический процесс, идущий без участия ферментов, хотя восстановление ДАК до АК возможно с помощью дегидроаскорбатредуктазы. Скорее всего, эти проростки отличаются разной скоростью использования АК на свету и неодинаковой обеспеченностью субстратом процесса биосинтеза АК.

Рибосомы митохондрий высших растений по седиментационным свойствам и плотностной характеристике не отличаются от 80S-рибосом [29], но отноше-ние к ингибиторам белкового синтеза у них иное, чем у цитоплазматических, имеющих константу седиментации тоже 80S: если митохондриальные рибосомы ингибируются хлорамфениколом, то цитоплазматические - цикдогексимидом [7], угнетающим синтез белка. Действие циклогексимида на светозависимое на-копление АК проверялось в следующих опытах (рис. 6).

36

Рис. 6. Содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в зеленых проростках ячменя после 48 часов темноты (а) и 24 часов освещения (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на воде (б)

и растворе циклогексимида (15 мкг/мл) (в) Уровень АК в проростках ячменя подвержен сезонным колебаниям: зимой

он выше, летом ниже. В данных опытах использовались зеленые проростки с низким содержанием АК, чему способствовало и предварительное выдержива-ние их в темноте в течение 24 часов. Такие проростки обычно активно накапли-вают на свету аскорбат. В условиях опыта часть проростков после темноты ос-вещалась на воде (контроль), другая - на растворе циклогексимида. В контроль-ном варианте уровень АК повысился более чем в 3 раза, в присутствии же цик-логексимида светозависимое накопление АК было полностью блокировано. Сле-довательно, в процессе биосинтеза АК в растениях на свету принимают участие ферменты, биосинтез которых идет на 80S-рибосомах цитоплазмы.

Как говорилось выше, АК в растениях может синтезироваться из глюкозы и (с большей скоростью) из галактозы, но путь этого синтеза окончательно не изу-чен. В общем виде он представляется следующим образом: d-галактоза → d-галактуроновая кислота → l-галактоновая кислота → l-галактоно-γ-лактон → l-аскорбиновая кислота. По данным [327], восстановление метил-d-галактурона-та в l-галактоно-γ-лактон в системе in vitro идет при участии фермента, локали-зованного в растворимой части цитоплазмы, а окисление лактона в l-АК требует ферментного комплекса или одного фермента, заключенного в митохондриях. В случае использования в качестве субстрата при биосинтезе АК глюкозы этими ферментами будут глюкуронатредуктаза и гулонолактоноксидаза [74] соответ-ственно (рис. 7). Для второго фермента показано [402], что в митохондриях эвг-лены его содержание составляет только 11,6% от общего количества, а больная часть (86,7%) обнаруживается в цитозоле.

Учитывая полученные данные по полному ингибированию биосинтеза ас-корбиновой кислоты циклогексимидом, можно полагать, что биосинтез глюку-ронатредуктазы идет на 80S-рибосомах. Возможно, и биосинтез гулонолакто-ноксидазы связан с цитоплазматическими рибосомами, если же она синтезиру-ется на митохондриальных рибосомах, то блокирование синтеза АК в этом слу-чае обусловлено отсутствием субстрата для фермента-l-гулонолактона.

В работе [178] показано, что при длительном освещении проростков ячменя значительно увеличивается количество АК во фракции, содержащей митохонд-рии, тогда как во фракции хлоропластов содержание аскорбата уменьшается (или не меняется) при 10-минутной экспозиции [243], а в темноте - наоборот. Эти факты могут говорить об активном использовании АК в митохондриях в процессе дыхания и в хлоропластах в процессе фотосинтеза, поэтому при отсут-

37

ствии в темноте фотосинтеза АК накапливается в хлоропластах, а на свету, когда в зрелых тканях ячменя с хорошо сформированным фотосинтетическим аппара-том понижается темновое дыхание [161], количество АК увеличивается в мито-хондриях.

Накопление АК в митохондриях на свету может быть и результатом суб-стратной стимуляции новообразования аскорбата. Однако показано, что экзо-генный субстрат - глюкоза - в темноте не стимулирует синтез АК [103]. Если же предположить, что в биосинтезе АК лучше используются "молодые" продукты фотосинтеза [125] или восстановитель - НАДРН+Н+ фотосинтетического проис-

38

Рис. 7. Схема биосинтеза аскорбиновой кислоты (по А.Ленинжеру, 1985 г.)

39

хождения, тогда становится понятным факт более активного накопления АК в зеленых проростках на свету по сравнению с этиолированными и альбиносными.

Таким образом, масштаб светозависимого накопления восстановленной формы АК в проростках ячменя определяется степенью сформированности хло-ропластов и является максимальным у зеленых проростков по сравнению с этиолированными и альбиносными. Пополнение пула АК на свету тормозится в присутствии хлорамфеникола у всех типов проростков, кроме альбиносных. У зеленых растений светозависимое накопление АК полностью ингибировалось циклогексимидом, что говорит об участии цитоплазматических 80S-рибосом в биосинтезе ферментов, принимающих участие в метаболизации углеводов в l-АК.

Глава 4. ДЕЙСТВИЕ ПОЛИХРОМАТИЧЕСКОГО И МОНОХРОМАТИЧЕСКОГО СВЕТА НА БИОСИНТЕЗ КИСЛОТ СИСТЕМЫ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

4.1. Светозависимый синтез аскорбиновой кислоты

в зеленых и этиолированных проростках Биосинтез АК в растениях в основном рассматривается как темновой спе-

цифически направленный окислительный процесс, в котором происходит аэроб-ное окисление молекулы сахара. К.Л.Поволоцкая [115], наблюдая образование АК в этиолированных проростках, сделала вывод о том, что свет не является безусловно необходимым для биосинтеза АК, но в случае зерновых обеспечива-ет большее (в 1,5-2 раза) накопление АК.

При изучении природы предшественников АК в этиолированных растениях коровьего горошка М. Рейд [374] отмечала увеличение АК в темноте в пророст-ках, находящихся 4 дня на 0,5%-ном растворе глюкозы. Эти данные подтвер-ждают возможность темнового биосинтеза АК и стимуляцию его экзогенной глюкозой в то время, когда собственные запасы семядолей уже израсходованы.

Наблюдаемое рядом авторов [77] увеличение содержания АК в ломтиках лука на воздухе В.А.Девятнин [33] рассматривал как свидетельство наличия в луке ферментативной системы, осуществляющей биосинтез АК. Им была сде-лана попытка экспериментально показать ферментативный характер образова-ния АК. С этой целью свежеотжатый луковый сок помещался в колбу с раство-ром глюкозы. Через колбу пропускалась сильная струя воздуха, содержимое колбы охлаждалось до 0°С и освещалось. При соотношении сока к раствору глюкозы 1:20 в присутствии сернокислого марганца синтезировалась АК. Пре-кращение аэрации останавливало процесс. Если в опыте использовался сок, предварительно нагретый до 100°С, биосинтез АК не шел. Этот факт автор рас-сматривал как подтверждение того, что биосинтез АК идет при участии фер-

40

мента, который ингибируется высокой температурой. Освещение и температу-ра, как указывает автор, играют второстепенную роль в данном процессе.

Таким образом, биосинтез АК В.А.Девятнин [33] рассматривал как фермен-тативный процесс, который протекает при достаточном снабжении раститель-ных тканей кислородом и катализируется солями марганца. Природа фермента-тивной системы осталась не выясненной им, но было показано, что в ней прини-мают участие органические соединения марганца. Однако сама посылка, из ко-торой исходил В.А.Девятнин,-наличие раневого синтеза АК в кусочках лука - вскоре стала подвергаться сомнению. Так, И.П.Митев, Р.Белева-Стайкова [86] показали, что при поранении луковицы возрастает содержание сульфгидриль-ных групп и невитаминных редуктонов, которые при титрационном способе оп-ределения АК с 2,6-дихлорфенолиндофенолом дают завышенные результаты.

В.Франке [244] на основании анализа литературных данных сделал вывод о косвенном влиянии света на процесс образования АК. Это мнение разделял К.Е.Овчаров [95], отрицающий прямое участие света в биосинтезе АК. Он гово-рил, что то обстоятельство, что содержание витаминов в растениях, произра-стающих в темноте, как правило, снижается, позволило некоторым авторам прийти к выводу о прямом участии света в биосинтезе витаминов. Однако дос-товерные факты, говорящие о непосредственном действии света, имеются лишь в отношении витамина Д, а что касается других витаминов, в том числе и вита-мина С, то такое утверждение ошибочно. В подтверждение этого положения он приводит факт темнового образования витаминов в изолированных корнях горо-ха, хлопчатника и других культур. К.Е.Овчаров считал, что нельзя говорить о прямом, непосредственном действии света в процессе образования витаминов, а наблюдаемое снижение биосинтеза некоторых витаминов в темноте правильнее объяснить глубокими нарушениями обмена веществ, вызванными длительным пребыванием зеленых растений без освещения. Это может задержать биосинтез не только витаминов, но и многих других жизненно необходимых веществ, иг-рающих важную роль в образовании витаминов.

Таким образом, сторонники темнового образования АК указывали на факт накопления АК в этиолированных проростках и в неосвещенных частях расте-ний: в корнях, клубнях. Говоря о накоплении АК в этиолированных проростках, Т.Н.Кузнецова-Зарудная [70] полагала, что в этих условиях происходит не ново-образование АК, а переход ее из неактивной формы в активную. Это предполо-жение автор сделал на основании того, что накопление витамина С в семенах достигает максимума в момент налива семени, а затем снижается в процессе со-зревания. При прорастании в темноте накопление витамина С в проростке огра-ничено тем максимумом, которого оно достигало в стадии налива семени. К то-му же наблюдаемое в темноте образование АК, возможно, происходит за счет предшественников, которые синтезируются на свету. Такого мнения придержи-валась М.Рэйд [374]. Б.Оберг [192] отмечал бóльшее накопление АК в листьях гороха в темноте, чем на свету, но количество синтезированной АК зависело от интенсивности света предыдущих дней.

Несмотря на отрицание рядом исследователей прямого участия света в обра-зовании АК, в литературе накапливались данные, указывающие на увеличение

41

ее содержания под действием света. Еще М.Рэйд [374] отмечала большое влия-ние света на накопление АК при прорастании и на ранних стадиях роста коровь-его горошка. Семидневные растения, растущие на свету, содержали в четыре раза, а одиннадцатидневные - в 8 раз больше АК, чем проростки соответствую-щего возраста, растущие в темноте. В листьях тюльпана, находящихся на свету, по данным Ф.Ажена [266], количество АК было в 4-5 раз больше, чем в темноте.

Со временем появляются наблюдения, указывающие на то, что преимущест-венное накопление АК происходит у растений, растущих на открытых участках, по сравнению с затененными; в солнечные дни - по сравнению с пасмурными. Такие данные для томатов были получены Н.Восом [444], а также Мао Ляном [322], исследовавшим содержание АК у 48 видов дикорастущих овощных куль-тур, 8 видов древесных и у некоторых других растений. У деревьев и кустарни-ков было найдено повышенное содержание АК в наиболее освещенных частях кроны [446], а у хлопчатника в наиболее освещенных ярусах листьев [140].

Высокое содержание АК в солнечную погоду наблюдалось в листьях люцер-ны [36], кукурузы [37]. Д.И.Шматок [186] на основе определения АК в 242 видах растений из 31 семейства, растущих в полярно-альпийском ботаническом саду (Мурманская область), также отмечает большее накопление АК в солнечную погоду, чем в пасмурную. Аналогичный вывод сделан для плодово-ягодных культур Алтая [188].

Биосинтез АК из меченой 1-14С-,6-14C-,1-4Н- и 6-3Н-Д-глюкозы идет значи-тельно быстрее на свету, чем в темноте [274].

Стимулирующее действие света на биосинтез АК зависит от его интенсивно-сти. Это показано в опытах с этиолированными проростками ряда растений, вы-полненных Т.Сугаварой [413]. Пятидневные проростки кукурузы, редиса, китай-ской капусты освещались 6-42 часов светом различной интенсивности (10-1000 люкс). Установлено, что увеличение содержания АК при освещении шло про-порционально увеличению интенсивности света, по крайней мере в пределах эксперимента автора. В этиолированных проростках, находящихся в ходе экспе-римента в темноте, количество АК оставалось почти без изменения.

Зависимость биосинтеза АК от интенсивности действующего света показана для целого ряда растений: огурцов, кукурузы, проса, конопли, мака, которые выращивались в парниках при интенсивности света, составляющей 1-1/20 от полного летнего освещения. Оказалось, что уменьшение интенсивности освеще-ния в 10 раз у всех растений привело к уменьшению количества АК в 3-5 раз [67]. С увеличением интенсивности света (0, 3000, 10000, 20000 люкс, 43 часа) возрастало содержание АК в проростках капусты [346] и семядолях японской редьки (О, 500, 2500, 10000 люкс, 24 часа) [284]. При выращивании растений в фитотроне уровень АК также повышался с увеличением мощности ФАР [183]. Работы такого плана продолжаются в связи с решением вопросов выращивания овощей в закрытом грунте и получения витаминной пищи [260, 421].

В литературе имеется лишь несколько указаний на то, что содержание АК в растениях снижается в солнечные дни, но при этом или отмечалась очень жаркая погода, или опытные растения находились на прямом солнечном свету [317]. Для гороха показано увеличение содержания АК в ночное время [70].

42

Первые данные о накоплении АК на свету в нефотосинтезирующих органах приведены М.Рэйд [375]. При искусственном культивировании на питательной смеси отрезанных верхушечных долей корешков Calonyction aculeatum на свету и в темноте спустя 4-8 недель было обнаружено, что содержание АК в темноте не изменилось, а на свету возросло в 4-10 раз. Аналогичные данные приведены А.М.Смирновым и К.Е.Овчаровым [148]. Однако авторы указывали на замедле-ние роста корней на свету, что могло привести к концентрированию АК на еди-ницу веса корня.

Позднее стали появляться работы, указывающие на возможное прямое уча-стие света в образовании АК. Так, А.А.Ничипорович [92] отмечал, что наряду с углеводами прямыми продуктами фотосинтетической деятельности растений могут быть аминокислоты, а также вещества высокой физиологической актив-ности типа витаминов и фитогормонов; что состав и количественное соотноше-ние первичных продуктов фотосинтеза сильно меняются в зависимости от типа и физиологического состояния растений, от минерального питания, от условий водного режима, от интенсивности и спектрального состава света.

А.Мицуи, Я.Ои [344], изучая природу восстанавливающего вещества, обра-зующегося при освещении реакционной смеси, состоящей из суспензии хлоро-пластов и цитоплазматической фракции листьев шпината, нашли, что весь неиз-вестный фотопродукт или большая его часть является АК. Гомогенаты из зеле-ных и этиолированных проростков ячменя в анаэробных условиях на свету так-же накапливали восстанавливающие вещества [343]. Данный факт авторы объ-яснили тем, что на свету происходит фотовосстановление предшественника АК. Если вытяжки содержали не целые хлоропласты, а их фрагменты, то фотовос-становительного образования АК не происходило.

Е.Ассолбергс [209] уточняет, что только некоторые ступени синтеза АК яв-ляются светозависимыми. Данное заключение он делает на основании того, что отрезанные листья яблони, выдержанные в атмосфере 14СО2, продолжали вклю-чать радиоактивный углерод в молекулу АК, находясь в нормальной атмосфере и в темноте, и на свету. Однако с увеличением интенсивности света включение 14С в АК возрастало.

Увеличение содержания АК при освещении связывается многими исследо-вателями с процессом фотосинтеза. Так, Т.Н.Кузнецова-Зарудная [70] показала, что при световом голодании взрослого растения происходит прогрессивная по-теря АК. При перенесении растения в нормальные условия содержание АК вновь возрастает, но во время активной ассимиляции сильно снижается. Отсюда автор делает вывод об участии АК в процессе фотосинтеза и новообразовании ее в том же самом процессе. Предположение о существовании прямой связи между содержанием АК и фотосинтезом высказал Т.Сугавара [413]. Соответст-вие между количеством АК и площадью поверхности изолированных листьев яблони, по мнению Е.Ассолбергса [209], указывает на прямую зависимость со-держания АК от интенсивности фотосинтеза.

Большинство авторов [77,138, 152] стимулирующее действие света объяс-няют тем, что в процессе фотосинтеза создаются особые активные сахара, из

43

которых легко может синтезироваться АК. С.Д.Львов, Г.К.Гуцевич, А.Пантелеев [77] писали, что связь процесса образования АК с фотосинтезом не прямая, а косвенная, что в условиях оживленного фотосинтеза действительно наблюдается накопление витамина С, поскольку в процессе фотосинтеза созда-ются особые активные сахара, из которых легче может синтезироваться молеку-ла АК. При отсутствии фотосинтеза для образования АК из наличных сахаров требуются более сложные условия для переработки их в соответствующую форму, поэтому накопление АК идет здесь, если оно вообще имеет место в та-ких условиях, гораздо более замедленным темпом и не достигает того высокого уровня, как на свету. Подтверждением положения, высказанного С.Д.Львовым с соавторами, может служить наблюдение того, что суточные кривые накопления АК не совпадают с кривыми фотосинтеза, но всегда максимальное накопление АК в растениях отмечается после наибольшего подъема фотосинтеза. В корнях, где отсутствует фотосинтез и сахара вновь не образуются, влияние света, по мнению К.Е.Овчарова [96], осуществляется через активирование ферментов.

Связь АК с фотосинтезом В.Франке [244, 246] также считает косвенной, так как синтез АК может идти в бесхлорофильных органах при наличии ассимиля-тов. У 4-недельных альбиносных проростков конских бобов он наблюдал значи-тельное содержание АК - не меньшее, чем у одновозрастных зеленых. По мне-нию Г.Менера и В.Франке [339], АК не относится к числу прямых продуктов фотосинтеза, так как при усиленном фотосинтезе в атмосфере, богатой углекис-лым газом, образование ее ослабевает.

Таким образом, имеющиеся в литературе данные не дают возможности од-нозначно оценить роль света в биосинтезе АК. С одной стороны, известны фак-ты темнового образования АК в этиолированных проростках, корнях и клубнях, с другой стороны, множество наблюдений говорит об увеличении ее содержа-ния на свету. В связи с этим возникает вопрос: ограничивается ли действие све-та в процессе образования АК только тем, что на свету увеличивается количест-во продуктов фотосинтеза - углеводов, необходимых для биосинтеза АК в каче-стве субстрата, или свет непосредственно участвует в процессе новообразования аскорбата?

Важную роль в процессе образования АК играет качественный состав света. К 1939 году накопилось немало данных о действии света различного спектраль-ного состава на фотосинтез. Согласно этим данным, продуктивность фотосинте-за в зеленых растениях в большинстве случаев уменьшалась с уменьшением длины волны действующего света.

Т.Сугавара [414], признавая наличие прямой связи между фотосинтезом и содержанием АК, попытался установить влияние качества света на биосинтез АК. Им исследовалось действие красного (670 нм), оранжево-красного (645 нм), зеленого (560-455 нм), синего (505-380 нм) и белого света на образование АК в этиолированных проростках кукурузы, гороха, сои, китайской капусты, редиса, ячменя и др. растений. Фильтры, необходимые для получения света различной длины волны, изготавливали, покрывая стеклянные пластинки окрашенной пленкой желатина. Используемый свет выравнивался не по общей энергии, а по

44

величине максимума пропускания. Учитывая эффективность действия на обра-зование АК, свет различных участков спектра можно было расположить в сле-дующем порядке: белый свет > красный ≥ оранжево-красный > зеленый > синий. В опыте с редисом результаты не совпадали с основными наблюдениями: про-цент АК был относительно высок в зеленой и синей частях спектра. Данный факт автор объяснил тем, что на синем и зеленом свету проростки редиса росли энергичнее.

Б.И.Щербаков [187], исследуя проростки пшеницы, нашел, что среди от-дельных лучей солнечного спектра наиболее активная роль в стимуляции обра-зования АК принадлежит красному свету (680-620 нм и на линии 344,061 нм). Действие сине-фиолетовых лучей в комплексе с голубыми и зелеными было слабее. Наиболее активным для синтеза АК автор считает свет тех участков спектра, которые активны в отношении фотосинтеза. Однако в опытах с листья-ми традесканции И.Руге [379] отметил, что содержание АК в листьях при осве-щении светом с длиной волны 650 нм и выше было больше, чем в неосвещенных листьях, а свет с длиной волны меньше 480 нм тормозил синтез АК, так что наи-более активные для фотосинтеза области спектра - 440 и 630 нм - не совпадали с точками наибольшей стимуляции синтеза АК.

Имеются примеры положительного влияния зеленого света на биосинтез АК в растениях [95, 98, 187], что также нельзя связать с процессом фотосинтеза.

Результаты исследования действия синего света на биосинтез АК крайне противоречивы. К.Е.Овчаров [95], выращивая проростки хлопчатника под лю-минесцентными лампами различного спектрального состава, нашел, это синий свет задерживал образование в них АК. По данным И.А.Чернавиной [167], синий свет, напротив, повышал в листьях яровой и озимой пшеницы содержание вос-становленной и окисленной форм АК. Только на синем свету (380-440 нм) отме-чено увеличение общего количества АК у эвглены, тогда как зеленый и красный свет не проявили активности [404]. К.Богдански, Н.Богданска [220] исследовали накопление АК в плодах яблонь, завязи которых прикрывали цветными пленка-ми из полиэтилена. Определение содержания АК через 6 недель показало, что количество ее в плодах, затененных синей пленкой, было выше, чем в плодах под желтой и особенно под красной пленкой. Эффективность сине-зеленого све-та для образования АК в проростках фасоли отмечали Нива и Катаяма [351].

В большинстве работ, анализирующих влияние качества света на биосинтез АК, отмечается бóльшая эффективность белого (полихроматического) света по сравнению с монохроматическим [98,108, 187, 194, 220, 414]. Обзор литератур-ных данных о действии света различного спектрального состава на биосинтез АК показывает, что имеется незначительное число работ, освещающих эту тему. К тому же представленные данные, особенно по действию синего света, неодно-значны. Это может быть следствием того, что в работах использовались различ-ные источники света, различные виды растений. Исследованиями же Т.А.Пари-бок [111] показано, что реакция растений на освещение светом различного спек-

45

трального состава имеет видовую специфичность. Так, для томатов и сельдерея наиболее активным в образовании АК был свет розовых люминесцентных ламп, а для гороха - синих ламп.

Кроме этого специфичность действия лучей различных областей ФАР на биосинтез АК зависит от мощности лучистого потока. У пшеницы и редиса при низкой интенсивности света (50 Вт/м2) максимальное количество АК накаплива-лось на красном свету, а с повышением интенсивности света до 100 Вт/м2 и вы-ше - на синем свету [48]. В большинстве работ для освещения растений исполь-зовался свет широких участков спектра, данные по действию на биосинтез АК света спектральных линий практически отсутствуют.

При изучении действия света на биосинтез АК в растениях нами было пока-зано, что свет является одним из важнейших факторов в этом процессе [173]. Стимуляция светом накопления АК в зеленых проростках ячменя проявлялась уже при интенсивности света, равной около 100 эрг⋅см-2⋅с-1 [98], и во многом за-висела от первоначального содержания АК в проростках. Поэтому предвари-тельное выдерживание растений в темноте, снижающее общее количество АК, способствовало большему накоплению ее на свету (табл. 8). На основании этого в наших исследованиях проростки перед опытами около 40 часов выдержива-лись в темноте для снижения в них уровня АК, что в дальнейшем способствова-ло повышению отзывчивости проростков на освещение.

По имеющимся представлениям, биосинтез АК в растениях усиливается при дополнительном снабжении их гексозами, однако роль света в этом процессе не выяснена. Как показали наши исследования, положительное действие углеводов на биосинтез АК в зеленых листьях ячменя проявлялось только на свету (рис.8). В освещенных проростках, находившихся в течение 10 часов на растворе глюко-зы, значительно увеличилось содержание АК. За это же время в листьях ячменя, плавающих на растворе глюкозы в темноте, количество АК не повысилось, хотя следовало бы ожидать увеличения содержания АК от дополнительно поступив-шей в лист глюкозы, если бы биосинтез АК был только темновым процессом. За 6-7 часов пребывания листьев на растворе глюкозы-1,6-14С в темноте в них вхо-дит глюкоза: по нашим данным, активность 0,1 мл сока, выделенного из осве-щенных листьев, составила 2504 имп/мин, а из темновых листьев - 778 имп/мин. К тому же за это время в листьях, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы, происходит увеличение редуцирующих углеводов на 20% [100]. Следовательно, хотя в лист в темноте входит значительное количество глюкозы, увеличения со-держания АК не наблюдается. Только при очень длительном выдерживании рас-тений, дополнительно снабженных углеводами, в темноте (от 64 часов до 4 су-ток) на сильно концентрированных растворах (10-20%-ная сахароза) отмечается некоторое увеличение содержания АК [193, 374], что подтверждается и нашими данными [98]. Однако необходимо иметь в виду, что при столь длительном пре-бывании зеленых растений в темноте в них могли произойти глубокие измене-ния в обмене веществ.

46

- темнота;

- свет

Рис. 8. Влияние света на биосинтез АК в растущих проростках ячменя (а) и проростках, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы (б). Интенсивность света 25 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, экспозиция 10 часов

Таблица 8

Влияние предварительного затемнения на содержание АК в 8-дневных проростках овса, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы в темноте

и на белом свету (интенсивность света 25 эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 8 часов)

Условия выращивания Условия Содержание АК проростков до опыта опыта мкг/г %

Нормальная смена дня и ночи Исходное содержание 537,6±4,8 100 В темноте 541,6±8,9 101 На свету 621,2±13,1 116 40 часов в темноте Исходное содержание 468,4±3,5 100 В темноте 474,4±1,5 101 На свету 600,8±3,0 128 69 часов в темноте Исходное содержание 386,8±0,3 100 В темноте 431,6±2,0 112 На свету 516,2±9,6 133

Приведенные данные позволяют заключить, что свет имеет значение не

только для фотосинтетического процесса, дающего исходный материал для био-

47

синтеза АК, но и играет определенную роль в преобразовании углеводов в мо-лекулу АК. Можно предположить, что в зеленых листьях ячменя в процессе биосинтеза АК наряду с темновыми реакциями имеют место фотохимические.

Одним из доказательств наличия фотохимической реакции является посто-янство продукта реакции в том случае, если не изменяется произведение интен-сивности действующего света на время его действия [156]. Из приведенных данных (табл.9) видно, что количество синтезированной АК всегда оставалось постоянным, если произведение интенсивности света на время действия не ме-нялось и равнялось 90 (10 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 × 9 часов; 15 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 × 6 ча-сов; 30 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 × 3 часа). Следовательно, результаты этого опыта под-тверждают выдвинутое нами предположение о возможности существования в биосинтезе АК фотохимических реакций. При биосинтезе АК в растениях фото-химическая реакция или реакции, вероятно, чередуются с биохимическими, так как при понижении температуры до минус 1°С наблюдалось замедление образо-вания АК в проростках, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы на свету.

Увеличение содержания АК в растениях на свету многие исследователи свя-зывают с процессом фотосинтеза [42, 70, 209], в результате которого образуют-ся углеводы, необходимые для темнового синтеза АК. В этом случае спектры действия биосинтеза АК и фотосинтеза должны совпадать. Нами исследовалось действие света различного спектрального состава на биосинтез АК в зеленых и этиолированных проростках ячменя. Монохроматический свет получали с по-мощью цветных стеклянных светофильтров с известными характеристиками. В качестве источника света использовались лампы накаливания и люминесцент-ные лампы БС-30. В табл. 10 приведены результаты действия света той макси-мальной интенсивности, которую удалось получить от указанных источников света.

Экспериментальные данные показывают, что содержание АК значительно увеличилось только на свету красного участка спектра 620-740 нм, активного для фотосинтеза. Некоторое накопление АК отмечено на зеленом свету 480-560 нм, тогда как активные для фотосинтеза синий 430-520 нм и фиолетовый 370-460 нм участки спектра [11, 128] не оказали положительного действия на био-синтез АК.

Таблица 9

Влияние света различной интенсивности и времени освещения (при постоянстве их произведения) на биосинтез АК в 6-дневных зелёных проростках ячменя

Условия Интенсивность Время Произведение времени Содержание АК опыта света в тыс.

эрг⋅см-2⋅с-1 освещения в часах

освещения на интен-сивность света

мкг/г %

В темноте - - - 65,9±1,3 100 На свету 10 9 90 126,8±8,6 192 На свету 15 6 90 134,0±1,3 203 На свету 30 3 90 138,0±8,9 209

48

Таблица 10

Влияние света различного спектрального состава на биосинтез АК в зеленых и этиолированных проростках ячменя (экспозицая 10 ч)

№ Условия Интенсивность Содержание АК в проростках опы- опыта света, тыс. зеленых этиолированныхта эрг⋅см-2⋅с-1 мкг/г % мкг/г % 1 В темноте - 71,8±1,1 100 89,8±2,7 100 На УФ свету 320-400 нм 1,6 72,6±1,6 101 114,2±2,6 127 На белом свету 16,0 156,2±3,8 218 178,0±1,5 198 2 В темноте - 155,7±12,7 100 151,6±1,8 100 На фиолетовом свету

370-460 нм

1,3 164,4±0,9

106

183,2±9,2

121 3 В темноте - 188,8±10,2 100 236,6±3,9 100 На синем свету

430-520 нм

6,5 193,4±2,4

102

280,3±4,9

118 4 В темноте - 86,0±0,1 100 184,8±2,8 100 На зеленом свету

480-560 нм

4,4 98,8±0,8

115

230,2±4,2

125 5 В темноте - 143,6±3,2 100 - - На красном свету

620-740 нм

5,0 187,2±7,8

130 -

-

- // - 50,0 208,4±1,2 145 - - 6 В темноте - 210,4±17,9 100 334,2±1,4 100 На красном свету

600-1100 нм

26,0 217,2±9,0

103

362,8±5,5

109 7 В темноте - 81,0±1,0 100 - - На красном свету

690-1100 нм

32,0 100,3±0,1

124 -

-

На красном свету 720-1100 нм

32,0 114,4±5,6

141

-

-

8 В темноте - 210,4±17,9 100 128,4±0,6 100 На инфракрасном свету

880-3000 нм

75,0 195,2±12,0

93

160,0±0,4

125

Красный свет с ближним инфракрасным 600-1100 нм, включающий актив-

ную для фотосинтеза область спектра, также оказался неэффективным для био-синтеза АК, что, возможно, объясняется добавлением к красному свету инфра-красной радиации. В то же время положительно действовал на биосинтез АК длинноволновый красный свет с ближним инфракрасным 690-1100 и 720-1100 нм, который малоактивен для фотосинтеза. Таким образом, спектры дейст-вия фотосинтеза и биосинтеза АК в отдельных областях не совпадают. Это дает основание предположить, что биосинтез АК в зеленых проростках ячменя прямо не связан с фотосинтезом.

49

Этиолированные проростки ячменя, несмотря на не полностью синтезиро-ванный за 10 часов опыта пигментный аппарат, отличались большей чувстви-тельностью к освещению, чем зеленые. Так, содержание АК в них увеличилось на синем 430-520 нм, фиолетовом 370-460 нм, ультрафиолетовом 320-400 нм и инфракрасном 880-3000 нм свету, т.е. в тех участках спектра, которые не стиму-лировали биосинтез АК в зеленых проростках.

На зеленом свету 480-560 нм АК накапливалась как в зеленых, так и в этио-лированных проростках, однако в последних более интенсивно, что тоже гово-рит о большой чувствительности к освещению этиолянтов.

Для этиолированных проростков ячменя, так же, как и для зеленых, неактив-ным оказался красный свет с ближним инфракрасным 600-1100 нм интенсивно-стью 26 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. Увеличение содержания АК в этиолированных проро-стках на УФ и инфракрасном свету - неактивных для фотосинтеза участках спек-тра - подтверждает высказанное ранее предположение о том, что биосинтез АК в растениях прямо не связан о фотосинтезом, а протекает при участии специфиче-ских фотобиохимических реакций. Об этом же говорят и данные опытов с использованием экзогенной глюкозы-14С [171].

Вывод об отсутствии прямой связи между фотосинтезом и биосинтезом АК находит подтверждение в исследовании роли зеленых пигментов в накоплении АК. При решении этого вопроса мы исходили из следующего положения: если существует прямая зависимость между биосинтезом аскорбиновой кислоты и наличием хлорофилла, то освещение проростков светом с длиной волны, соот-ветствующей пикам поглощения хлорофилла А и В в листе [123] как в красной, так и в сине-фиолетовой области, способствовало бы накоплению аскорбиновой кислоты. Этим самым была сделана попытка выяснить спектр действия биосин-теза аскорбиновой кислоты.

В результате исследований [104,109] было выяснено, что свет с длиной вол-ны 370-460 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла А в фиолетовой области, и 440-520 нм, включающей пик поглощения хлорофилла В в синей об-ласти, не оказал влияния на биосинтез аскорбиновой кислоты в проростках яч-меня при интенсивности 6 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. Красный свет 670-740 нм, соответст-вующий пику поглощения хлорофилла А, оказывал положительное действие на биосинтез АК лишь при высокой интенсивности, равной 12 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. При добавлении к свету данного участка спектра более коротковолнового крас-ного света, включающего пик поглощения хлорофилла В в красной области, на-капливалось значительное количество АК уже при интенсивности света 500 эрг⋅см-2⋅с-1.

Одновременное освещение проростков светом, соответствующим пикам по-глощения хлорофилла А в фиолетовой и красной областях, практически не из-менило содержания АК (табл. 11), хотя, как известно, хлорофилл А является ос-новным пигментом фотосинтеза. Следовательно, спектры действия фотосинтеза и биосинтеза АК в области поглощения хлорофилла А не совпадают.

50

Таблица 11

Влияние света с длиной волны, включающей пики поглощения хлорофилла А и В в красной и сине-фиолетовой областях, на биосинтез

аскорбиновой кислоты в проростках ячмени (экспозиция 10 ч)

Условия опыта

Интенсивность света в тыс.

Содержание восстановленной

АК эрг⋅см-2⋅с-1- в мкг/г в % В темноте - 147,8 100 На свету с длиной волны:

370-460 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла А в фиолетовой области;

670-740 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла А в красной области

0,7

5,0

159,6

108 На свету с длиной волны:

440-520 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла В в синей области;

635-780 нм, соответствующем пикам поглоще-ния хлорофилла А и В в красной области

0,7

5,0

184,4

125 На свету лампы накаливания 5,7 180,6 122

К сожалению, с помощью стеклянных светофильтров точно выделить свет,

включающий пик поглощения хлорофилла В в красной области, нам не удалось, поэтому исследовали свет, включающий пики поглощения хлорофилла В в си-ней в хлорофиллов А и В в красной областях. Этот свет оказался активным для биосинтеза АК и по своему действию был идентичен действию света лампы на-каливания равной интенсивности. Физиологическая роль хлорофилла В в расте-ниях еще не достаточно ясна. Возможно, что он, поглощая свет соответствую-щей части красной области спектра, участвует и в фотобиохимическом синтезе АК. В то же время не исключено, что активность света 635-780 нм объясняется добавлением к неактивному участку спектра 670-740 нм, соответствующему пику поглощения хлорофилла А в красной области, более коротко- и длинно-волновой радиации, т.е. расширением спектра действующего света.

Во всех наших опытах белый свет (полихроматический) был эффективнее в биосинтезе АК, чем монохроматический. При сочетании света нескольких уча-стков видимой области спектра также синтезировалось больше АК, чем при дей-ствии света одного участка спектра; в иных случаях активным оказался свет, полученный при смешении неактивных для биосинтеза АК областей спектра. Так, под действием синего света 430-520 нм интенсивностью 25 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1

содержание АК в зеленых проростках не изменилось (рис. 9). Неэффективным оказался и фиолетовый свет 370-460 нм интенсивностью 6 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, тогда как сине-фиолетовый свет 370-500 нм уже при интенсивности, равной 3 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, положительно влиял на накопление АК. Данный эффект, вероятно, не является точной копией эффекта Эмерсона, наблюдаемого в фотосинтезе и

51

заключающегося в усилении активности действующего света при дополнитель-ном освещении светом другой длины волны. В наших опытах активным для биосинтеза АК оказался свет, полученный при сочетании двух неактивных уча-стков спектра. В связи с этим и активность белого света в биосинтезе АК, по-видимому, нельзя рассматривать только как простое складывание активных для биосинтеза АК участков спектра.

Рис. 9. Процент увеличения биосинтеза АК на синем свету 430-520 нм интенсивностью 25 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 (1), фиолетовом 370-460 нм интенсивностью 6 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 (2)

и сине-феолетовом 370-500 нм интенсивностью 3 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 (3) по отношению к контролю (темнота). Экспозиция 10 часов

Обзор литературных данных по действию света различного качественного

состава на биосинтез АК показывает, что изучается в основном действие света широких участков спектра и остается невыясненной роль света чистых спек-тральных линий. Нами [107] исследовался свет синей спектральной линии 436 нм, выделенной из излучения ртутно-кварцевой лампы ПРК-7, при исполь-зовании светофильтров СС5, С3С18, ЖС11, а также свет зеленой линии 546 нм (светофильтры ЖС17, С3С10, ПС7) и желтой - 577 нм (светофильтры С3С10; ОС13; 3С7). Инфракрасная радиация устранялась водным экраном. Действие света спектральных линий сравнивалось с действием света соответствующих участков спектра равной интенсивности (6,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, рис. 10). Неэффек-тивным для биосинтеза АК оказался свет синей спектральной линии и синего участка спектра (430-520 нм). Свет зеленой спектральной линии не изменил со-держания аскорбиновой кислоты ни при интенсивности света, равной 6,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, ни при 13 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, тогда как свет зеленого участка спектра (480-600 нм), как всегда, проявил большую активность. Из трех исследованных спектральных линий только свет желтой линии оказал положительное действие на образование аскорбиновой кислоты. Однако свет желто-оранжевого участка спектра оказался более благоприятным для биосинтеза АК, чем свет желтой

52

спектральной линии. Следовательно, в биосинтезе АК свет широких участков спектра используется лучше, чем свет соответствующих спектральных линий при равных интенсивностях.

Рис. 10. Биосинтез АК проростками ячменя: А - в темноте; Б - на синем свету 430-520 нм; В - на свету синей спектральной линии 436 нм; Г - на белом свету; Д - на зеленом свету 480-600 нм, с резким уменьшением интенсивности в желтой части спектра; Е - на свету зеленой спектральной линии

436 нм; Ж - на желто-оранжевом свету 550-780 нм со значительным уменьшением интенсивности в красной части спектра; З - на свету желтой линии 577 нм.

Экспозиция 6 часов. Интенсивность света 6,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1

Известно, что энергия кванта света коротковолновой области спектра пре-восходит таковую в более длинноволновой области. Поэтому при сравнении действия света различных участков спектра друг с другом необходимо вырав-нивать их по квантам. Это было учтено в следующей серии опытов, где иссле-довалось действие красного 652 и 645 нм, желтого 587 нм и зеленого света 553 нм интенсивностью 1,44⋅1015 квантов⋅см-2⋅с-1 на биосинтез АК в 9-10-дневных проростках озимого ячменя сорта Паллидум 330/2. Монохроматический свет был выделен с помощью интерференционных светофильтров от кинопроекци-онной лампы, мощностью 400 Вт, являющейся точечным источником света. С помощью специальной установки на интерференционный светофильтр проекти-ровали параллельный пучок света, что давало возможность выделить монохро-матический свет с шириной в максимуме пропускания 9-12 нм.

Приведенные данные (табл. 12) подтвердили сделанный ранее вывод о вы-сокой активности в биосинтезе АК красного света, соответствующего пику по-глощения хлорофилла В в красной области спектра (645 нм), а также зеленого света с длиной волны в максимуме пропускания светофильтра 553 нм. Однако

53

наибольшую активность в биосинтезе АК проявил желтый свет - 587 нм, на ко-тором уровень АК увеличился на 160% по сравнению с темновым контролем. Сказанное дает основание заключить, что акцепторами света в процессе свето-зависимого накопления АК могут быть соединения, поглощающие свет в корот-коволновой красной области спектра и в желто-зеленой области.

Таблица 12

Влияние зеленого, желтого и красного света интенсивностью 1,44⋅1015 квантов⋅см-2⋅с-1 на биосинтез АК в 9-10-дневных

проростках озимого ячменя (экспозиция 8 ч)

№ Вариант Содержание АК опыта опыта мкг/г %

1 В темноте 58±1,5 100 На зеленом свету 553 нм 110±4,0 190 2 В темноте 30±2,0 100 На желтом свету 587 нм 78±2,0 260 3 В темноте 36±0,5 100 На красном свету 645 нм 76±3,5 211 4 В темноте 22±0,5 100 На красном свету 652 нм 33±1,0 150 Продукты фотосинтеза во многом определяются качеством действующего

света: работами Н.П.Воскресенской [18, 19] и других [280, 215] показано слабое образование углеводов на синем свету, поэтому можно предположить, что не-эффективность синего света (430-520 нм) в процессе образования АК объясня-ется недостаточной обеспеченностью данного процесса углеводами. Однако в серии опытов, проведенных с зелеными проростками ячменя, плавающими на 0,5%-ном растворе глюкозы, где не было недостатка в исходном материале, также наблюдалась слабая активность синего света по сравнению с красным (620-740 нм) и зеленым (480-600 нм) светом (рис. 11) [102].

На синем свету в проростках, получивших экзогенную глюкозу, накопление АК отмечалось лишь при высокой интенсивности синего света, равной 20 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, тогда как на белом свету в проростках даже без дополнительного снабжения углеводами биосинтез АК шел уже при интенсивности света, равной около 100 эрг⋅см-2⋅с-1, на зеленом свету - при интенсивности света, равной 4,4 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, а на коротковолновом красном - при 2,3 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. Следо-вательно, активный для фотосинтеза синий участок спектра (430-520 нм) прояв-ляет некоторую активность в биосинтезе аскорбиновой кислоты лишь при вы-соких интенсивностях света и при дополнительном снабжении углеводами. Ве-роятно, спектры действия фотосинтеза и биосинтеза аскорбиновой кислоты в отдельных областях не совпадают, а свет оказывает специфическое действие на биосинтез АК помимо фотосинтетического процесса. Аналогичный вывод дела-ет И.Руге [379]. Однако в литературе имеется ряд указаний о положительном действий синего света на биосинтез АК: Нива, Катаяма [351], И.А. Чернавина

54

[167], К. Богдански, Н. Богданска [220]. Но так как большинство авторов для выделения синего света использовало цветные пленки, то, скорее всего, они имели дело не с чисто выделенным синим участком спектра, а с комплексным светом, который используется в биосинтезе АК лучше, чем свет монохромати-ческий [186].

- ДАК

- АК

Рис. 11. Биосинтез АК и ДАК листьями ячменя, находящимися на 0,5%-ном растворе глюкозы в темноте (а), на синем 430-520 нм (б), зеленом 480-600 нм (в), крас-

ном 620-740 нм (г) и белом свету (д) интенсивностью 20 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 8 часов

Обобщая вышеизложенное, можно заключить, что свет играет важную роль в биосинтезе АК, причем большое значение в этом процессе имеет качественный состав света. Действие света на биосинтез АК не только осуществляется через фотосинтез, дающий субстрат для аскорбата, но и носит специфический харак-тер, что дает основание рассматривать в целом образование АК как фотохимиче-ский процесс; хотя, скорее всего, лишь некоторые реакции (или реакция) на пути от углеводов к АК являются фотохимическими. Таким может быть последний этап в образовании АК из предшественника [343].

55

4.2. Биосинтез аскорбиновой кислоты проростками с измененным соотношением зеленых и желтых пигментов

При прорастании семян даже в темноте в проростках образуется АК. Со-

держание ее в первые дни увеличивается до определенного предела, затем по-нижается, что связывается с исчезновением субстратных ресурсов семени [374,379]. Для новообразования же АК необходим свет. При перенесении на свет этиолированных проростков наряду с накоплением АК происходит их зе-ленение, поэтому естественным было связывать новообразование АК с накоп-лением пигментов.

Работами многих авторов показано, что хлорофиллоносные ткани растений наиболее богаты АК [39, 52, 142]. Подтверждением этого положения могут слу-жить исследования Т.Сугавары [414], в которых 5-дневные этиолированные проростки редиса, кукурузы и китайской капусты при прозеленениии на свету высокой интенсивности внешне были тёмно-зелёными и содержали больше АК, чем желто-зеленые проростки, находящиеся на свету низкой интенсивности. В других опытах освещение 5-дневных проростков кукурузы, содержащих хлоро-филл, приводило к накоплению в них АК, в то время как альбиносные пророст-ки при освещении не меняли уровня АК. Увеличивающийся синтез АК на свету, по мнению автора, был, несомненно, прямо или косвенно обусловлен влиянием света на деятельность хлоропластов.

Как считает Ф.Я.Механик [83], прямая зависимость между содержанием АК и хлорофилла имеет место лишь в определенных пределах уровней этих показа-телей. Количество АК растет параллельно с увеличением содержания хлоро-филла лишь до 85% от его содержания в нормальных листьях. У зеленых ово-щей, по данным А.Акао [197], отношение содержания хлорофилла к АК состав-ляет 0,81, а в семядолях японской редьки при 48-часовом освещении между со-держанием хлорофилла и АК отмечалась линейная зависимость при коэффици-енте корреляции 0,96 [284].

Детальные исследования динамики зеленения этиолированных проростков подсолнечника, кукурузы, репы, конских бобов и овса [415] показали, что через 30-60 минут после начала освещения в проростках появляется хлорофилл А и начинается фотосинтез. Только после этого отмечается новообразование АК. Хлорофилл В появляется через 2-3 часа после хлорофилла А, отсюда следует, что присутствие хлорофилла В не обязательно для начала образования АК. В то же время И.Руге [379] считал, что природа листовых пигментов, обусловли-вающих синтез АК, еще не ясна и что они не идентичны ни хлорофиллу, ни ка-ротину. М.Мириманов [342] предполагал наличие в клеточном соке связи АК с флавонолами.

Однако, хотя большее количество АК обычно находится в хлорофиллонос-ных тканях, ряд авторов [233 363, 374, 415] указывает на отсутствие паралле-лизма в образовании АК и хлорофилла. М.Рэйд [374] отмечала, что листья могут иметь очень мало хлорофилла, но содержать много АК или иметь очень много хлорофилла, но сравнительно мало АК. В работе К.Г.Врублевской [22] показано,

56

что в отдельные фазы онтогенеза конских бобов значительное количество АК находится в корнях, куда она может транспортироваться из листьев [169]. Неза-висимость образования АК от содержания хлорофилла А.М.Смирнов и К.Е.Овчаров [148] подтверждают опытами с изолированными корнями ряда рас-тений, в которых на свету отмечалось увеличение содержания АК. Корни более 25 месяцев росли без надземных органов, поэтому, как считают авторы, нет ос-нований считать, что в синтезе АК принимал участие хлорофилл.

Вопрос о взаимоотношении АК и желтых пигментов изучен крайне недоста-точно. В.А.Бунаков и др. [10, 363], исследуя плоды томата, моркови, шиповника, отмечают отсутствие определенного соотношения между содержанием АК и ка-ротина. Некоторые авторы считают, что существует антогонизм между процес-сами образования каротина и АК. В.С.Фёдорова [160], напротив, наблюдала од-новременное накопление АК и каротина у лиственницы, кедра и кипрея с подня-тием их в горы до верхних границ массового распространения видов.

Такие противоречивые сведения дают основание сказать, что функциональ-ные связи между хлорофиллоносностью клеток и синтезом в них АК остаются пока неясными [247]. То же самое с еще большим правом, можно сказать о взаимосвязи биосинтеза АК и желтых пигментов.

В работе М.М.Окунцова и др. [109] было показано, что, создавая различные условия освещения для этиолированных проростков, можно получить растения с определенным соотношением зеленых и желтых пигментов и что особенно большим различием в содержании зеленых пигментов отличаются проростки, выращенные на синем и зеленом свету. В своих исследованиях мы использовали это свойство проростков для получения растений, отличающихся по содержа-нию пигментов, с тем чтобы на этих объектах выяснить зависимость образова-ния АК от количественного содержания пигментов (хлорофилла А, хлорофилла В, каротина, лютеина, виолаксантина). В результате проведенных опытов не об-наружено количественной зависимости в содержании АК и пигментов, а в неко-торых случаях растения, содержащие больше зеленых и желтых пигментов, от-личались даже более низким уровнем АК (табл.13). Возможно, здесь имеет ме-сто такое же явление, как в случае фотосинтеза и хлорофилла, где также не на-блюдается количественной зависимости интенсивности фотосинтеза от содер-жания зеленых пигментов, хотя роль хлорофилла в фотосинтезе общеизвестна.

4.3. Исследование способности альбиносных проростков

накапливать аскорбиновую кислоту на свету Освещенные части растений обычно содержат больше АК, однако при ис-

следовании действия света на ее биосинтез рядом исследователей высказывалось предположение, что этот процесс прямо не связан с фотосинтезом [244, 246, 339]. Подтверждением такого мнения могут служить данные о несовпадении в некоторых областях спектров действия биосинтеза АК и фотосинтеза [101, 103].

57

Неясными пока остаются функциональные связи между хлорофиллоносностью клеток и синтезом в них АК [24, 109].

58

Таблица 13

Влияние белого света на образование аскорбиновой кислоты и пигментов в проростках ячменя, выращенных на синем (430-520 нм) и красном свету (620-1100 нм) интенсивностью 9 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1

Содержание пигментов в γ на 1 г Содержание АК Условия выращивания проростков хлорофилл каро- люте- виолак- в мг % в %

А В тин ин сантин 1, 2 день - в темноте 0,00 0,00 6,70 23,91 17,84 13,42 100

3, 4, 5 день: в темноте по 8 часов на синем свету ежедневно по 8 часов на красном свету ежедневно

192,83

47,85

14,97

31,44

23,11

107,2±1,3

154

6 день: в темноте 8 часов на белом свету интенсивностью 5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1

После освещения 15 часов в темноте

725,58

846,26

245,01

285,41

36,86

43,60

48,26

50,03

35,75

36,40

184,0±2,2179,2±4,4

137 134

59

При исследовании этих вопросов наиболее перспективными могут быть ра-боты с беспигментными мутантами или с растениями, имеющими измененный пигментный состав, которые можно получить при обработке растений некото-рыми антибиотиками: хлорамфениколом или СМ. Исследование механизма дей-ствия СМ на прокариотные организмы показало его ингибирующее влияние на функцию рибосом. СМ связывается с 70S-рибосомами [31, 261], в результате чего появляются ошибки при считывании информации с природной матрицы [420]. Наличие 70S-рибосом и у высших растений объясняет факт подавления в присутствии СМ синтеза хлорофилла, РНК, развития структуры хлоропластов [222], уменьшение скорости включения аминокислот в белки пластид [228].

Угнетение биосинтеза хлорофилла и развития хлоропластов под действием СМ отмечено у этиолированных проростков томатов, турнепса, капусты, горчи-цы [319, 320, 321]. Другим исследователям, используя обработку растений СМ, удалось получить альбиносные особи эвглены [366] и альбиносные растения пшеницы [6]. По данным Р.С.Бабаяна и др. [6], СМ в концентрации 150-200 мкг/мл вызывает появление альбиносных проростков у пшеницы, однако эффективные для пшеницы дозы СМ не оказывали существенного действия на семена ячменя, поэтому в начале своей работы мы определили концентрации СМ, вызывающие альбинизм у ячменя. Эти концентрации примерно в десять раз превосходили активные для пшеницы дозы и равнялись 1-2,5 мг/мл. Такое большое колебание величины концентрации действия, вероятно, объясняется тем, что 30S-субъединицы рибосом в зависимости от температуры могут при-соединять одну или две молекулы СМ [31].

Проростки ячменя, выросшие из семян, обработанных стрептомицином (справа - контроль). Фото Я.Д. Кесельман

60

Для получения альбиносных проростков семена ячменя, помещенные в чаш-ки Петри или плоские кюветы, смачивались раствором СМ [181]. Чаще всего использовалась концентрация 2,5 мг/мл. Через сутки обработка семян раствором повторялась; через двое-трое суток проклюнувшиеся семена высаживались в почву. Первый лист проростков, полученных из обработанных СМ семян, на две трети был альбиносным, верхушка оставалась пигментированной (см. фото на с. 57). Зона раздела имела желто-зеленую окраску. В опытах использовались вы-резки из альбиносных участков мутантных листьев. В них определено содержа-ние пигментов по Нибому [75]. Действие света (люминесцентные лампы ЛЦЦ-40) на содержание хлорофилла и каротиноидов представлено в таблице 14. Кро-ме альбиносного материала исследовались зеленые и этиолированные пророст-ки.

В зеленых листьях ячменя, плавающих на растворе СМ, при освещении про-исходит уменьшение количества хлорофиллов и суммы каротиноидов по срав-нению с контрольным вариантом - листьями, плавающими на воде.

Таблица 14

Биосинтез пигментов (мкг/г) листьями ячменя в присутствии СМ на свету (интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 24 ч)

Вариант опыта Хлорофилл А Хлорофилл В Каротиноиды 3еленые листья

Исходное содержание 360,2±3,0 295,4±13,0 156,3±9,2 На воде 442,7±20,8 305,9±7,9 212,4±7,4 На воде + СМ 314,2±10,9 233,8±7,1 158,5±5,1

Этиолированные Исходное содержание 0 0 16,0±0,1 На воде 147,8±2,9 113,2±7,6 94,3±6,5 На воде + СМ 42,0±1,8 41,2±10,4 37,4±1,0

Световые альбиносы Исходное содержание 0 0 4,1±0,1 На воде 0 0 4,8±0,4 На воде + СМ 0 0 3,2±0,1

Темновые альбиносы Исходное содержание 0,2±0,3 0,3±0,66 5,0±0,2 На воде 0,9±0,03 1,7±0,1 8,4±0,6 На воде + СМ 0 0 5,5±0,5

В этиолированных проростках в присутствии СМ за 24 часа освещения син-

тезируется некоторое количество хлорофилла А, В и каротиноидов, однако в контроле синтез указанных пигментов был в три раза выше. Можно предполо-жить, что ингибирование биосинтеза зеленых пигментов СМ не затрагивает процесс перехода протохлорофиллида в хлорофилл и синтезированные в этио-лированных проростках предшественники хлорофилла на свету переходят в хлорофилл даже в присутствии СМ; новообразование предшественников хлоро-

61

филла, вероятно, ингибируется антибиотиком, что и ведет к меньшему накопле-нию зеленых пигментов в варианте с СМ.

Вырезки из альбиносных частей листьев ячменя, выращенных на свету (в таблице - световые альбиносы) и в темноте (темновые альбиносы), или не имели зеленых пигментов, или содержали их в небольшом количестве, которое убира-лось дальнейшим освещением в присутствии СМ.

Таким образом, используя обработку семян СМ, удалось получить расти-тельный материал, практически лишенный зеленых пигментов и содержащий незначительное количество каротиноидов. Распределение АК, ДАК и ДКГК по зонам в зеленых и мутантных листьях демонстрирует рис. 12, из которого видно, что по содержанию восстановленной формы АК опытные и контрольные зеле-ные растения отличались незначительно, в то время как окисленная форма АК и ДКГК преобладали в верхней зеленой и нижней альбиносной части мутантных растений.

- листья с альбиносным основанием

- зеленые листья

Рис. 12. Содержание АК, ДАК и ДКГК в верхней части (1) и основаниях (2) зеленых и частично альбиносных листьев ячменя

62

В дальнейшем исследовалась способность альбиносных листьев синтезиро-вать АК, ДАК и ДКГК. Поскольку используемый материал не содержал зеленых пигментов и фотосинтез в нем был блокирован, субстрат для биосинтеза АК вводился экзогенно: вырезки из листьев помещались на 1%-ный раствор глюко-зы. В связи с этим была проверена способность синтезировать хлорофилл А, В и каротиноиды вырезками из листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы (табл. 15). Ингибирующий эффект СМ сохранялся и в этих условиях, а вырезки из листьев темновых и световых альбиносов содержали следовые коли-чества зеленых пигментов и через 24 часа освещения, если они находились на растворе глюкозы с СМ.

Таблица 15

Биосинтез пигментов (мкг/г) вырезками из листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы в присутствии СМ на свету

(интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 24 ч)

Вариант опыта Хлорофилл А Хлорофилл В Каротиноиды

Зеленые листья Исходное содержание 429,1 ± 7,6 336,1 ± 24,1 184,2 ± 17,3 На глюкозе 496,0 ± 20,0 364,0 ± 9,5 211,7 ± 8,8 На глюкозе + СМ 432,7 ± 10,8 356,5 ± 4,5 191,7 ± 6,1

Этиолированные Исходное содержание 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,1 1,5 ± 0,1 На глюкозе 135,7 ± 13,0 141,6 ± 3,0 70,3 ± 3,0 На глюкозе + СМ 25,6 ± 3,6 12,7 ± 2,3 24,7 ± 1,4

Световые альбиносы Исходное содержание 0 0 5,8 ± 0,2 На глюкозе 1,2 ± 0,5 1,0 ± 0,02 6,2 ± 0,1 На глюкозе + СМ 0,6 ± 0,02 0,4 ± 0,01 3,8 ± 0,5

Темновые альбиносы Исходное содержание 2,0 ± 0,1 1,7 ± 0,1 4,5 ± 0,3 На глюкозе 3,4 ± 0,2 2,3 ± 0,4 8,6 ± 1,0 На глюкозе + СМ 2,1 ± 0,1 1,7 ± 0,1 5,6 ± 1,0

При исследовании зависимости биосинтеза антоцианов от зеленых пигмен-

тов Манцинелли, Янг и др. [320] использовали этиолированные проростки, об-рабатывая их СМ. Как видно из представленных данных, такие проростки и в присутствии СМ продолжают синтезировать некоторое количество хлорофил-лов, вырезки же из альбиносов в этом плане представляют собой лучший мате-риал. Поэтому нами для исследования биосинтеза АК, ДАК и ДКГК в зависимо-сти от содержания зеленых пигментов были взяты альбиносные участки первых листьев проростков ячменя, выращенных на свету, а в качестве контроля - соот-ветствующие участки зеленых листьев.

В вырезках из зеленых и альбиносных листьев ячменя было определено ис-ходное содержание всех исследуемых кислот и, как видно из таблицы 16, альби-

63

носы по количественному содержанию в них АК, ДАК и ДКГК мало отличались от зеленых проростков.

Таблица 16

Биосинтез АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) зелеными и альбиносными участками листьев ячменя, плавающими на 1% растворе глюкозы в присутствии СМ на свету (интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 24 ч)

Вариант опыта АК ДАК ДКГК

Зеленые участки Исходное содержание 178,3 ± 10,6 57,3 ± 13,4 39,1 ± 10,9 В темноте 85,7 ± 13,1 40,8 ± 7,7 21,0 ± 4,8 На свету 220,2 ± 15,3 22,7 ± 9,1 69,7 ± 15,8

Альбиносные участки Исходное содержание 166,4 ± 8,5 44,5 ± 2,2 37,2 ± 6,1 В темноте 91,4 ± 2,0 35,6 ± 7,8 19,1 ± 5,5 На свету 217,5 ± 19,7 13,9 ± 3,3 71,1 ± 17,6

Выдерживание в темноте зеленых проростков в течение 24 часов привело к

уменьшению содержания всех кислот: в большей степени АК и ДКГК, в мень-шей - ДАК. 24-часовое освещение способствовало накоплению АК и особенно ДКГК, но в три раза уменьшило количество ДАК.

Изменение содержания АК, ДАК и ДКГК в зависимости от освещения у аль-биносов имело такой же характер, как и у зеленых проростков, т.е. не зависело от наличия зеленых пигментов.

Накопление АК и ДКГК в зеленых и альбиносных проростках, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы, наблюдалось только на свету. Необходимо отме-тить, что поступление в лист экзогенной глюкозы зависит от условий освеще-ния: так, в опытах М.М.Окунцова, Р.А.Карначук, Н.М.Фроловой [106] на свету в листья овса входило почти в два раза больше 14С-глюкозы, чем в темноте. Сле-довательно, в нашем опыте проростки, находящиеся на свету, лучше снабжены субстратом, чем темновые, но это, вероятно, не является единственной причи-ной, обусловливающей световой биосинтез АК и ДКГК, так как если бы он был темновым, мы наблюдали бы накопление кислот и в темноте, но в меньших масштабах, чем на свету. На самом же деле в темноте количество указанных ки-слот резко снижается. По-видимому, помимо субстрата решающее значение в процессе накопления АК и ДКГК имеет свет.

Исследована реакция на свет зеленых и альбиносных проростков, предвари-тельно выдержанных в темноте в течение 45 часов (табл. 17). Такое длительное пребывание в темноте способствовало снижению в зеленых проростках содер-жания окисленной формы АК и в два раза уменьшило количество восстановлен-ной АК и ДКГК. Последующее 20-минутное освещение почти полностью вос-становило исходное содержание АК и ДКГК и резко снизило (в 2,5 раза) количе-ство окисленной формы АК, тогда как в темноте за это время существенных из-менений не произошло.

64

Таблица 17

Биосинтез АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) зелеными и альбиносными участками листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы в присутствии СМ

(экспозиция 20 мин; предварительное выдерживание проростков в темноте 45 ч; интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)

Вариант опыта АК ДАК ДКГК

Зеленые участки Исходное содержание 299,6 ± 2,3 57,8 ± 2,2 86,5 ± 4,8 45 ч темноты 99,0 ± 5,3 50,8 ± 2,8 42,2 ± 4,3 45 ч темноты + 20 мин темноты 95,2 ± 1,3 47,5 ± 1,8 40,5 ± 1,7 45 ч темноты + 20 мин света 200,8 ± 9,1 19,3 ± 1,2 79,3 ± 5,7

Альбиносные участки Исходное содержание 177,2 ± 10,1 42,2 ± 2,7 67,9 ± 4,5 45 ч темноты 87,6 ± 6,6 31,1 ± 2,5 13,0 ± 0,1 45 ч темноты + 20 мин темноты 90,0 ± 13,8 31,7 ± 2,0 12,8 ± 3,6 45 ч темноты + 20 мин света 169,7 ± 6,4 8,0 ± 0,0 25,0 ± 1,0

45-часовое пребывание в темноте альбиносов особенно сильно сказалось на

содержании ДКГК, количество которой уменьшилось с 67,9 до 13,0 мкг/г. По-следующее 20-минутное освещение увеличило ее содержание почти в 2 раза, но оказалось недостаточным для восстановления исходного уровня. Характер из-менений восстановленной и окисленной форм АК у альбиносов был таким же, как и у зеленых проростков.

Таким образом, альбиносные участки листьев ячменя на свету при наличии экзогенного субстрата интенсивно синтезируют АК и ДКГК, следовательно, их образование не связано с наличием зеленых пигментов и представляет собой не зависимый от фотосинтеза светозависимый процесс.

Следует отметить, что под действием СМ количество желтых пигментов в листьях ячменя уменьшается в десятки раз, но это тоже не оказывает существен-ного влияния на накопление АК и ДКГК, хотя нужно учитывать, что регулятор-ные функции пигменты могут выполнять и в небольших концентрациях, когда поглощенная ими световая энергия используется лишь для переключения мета-болических путей [20, 64].

Механизм светоактивации образования АК и ДКГК пока неясен. Однако, учитывая то, что некоторые органические кислоты (щавелевая, янтарная, винная, α-кетоглутаровая) способствуют накоплению АК на свету [110], можно предпо-ложить, что зависящее от света накопление АК (возможно, и ДКГК) в зеленых, и особенно в альбиносных, проростках связано с функционированием цикла Креб-са, деятельность которого, как теперь известно, продолжается и на свету [12, 16, 97]. В связи с чем на свету усиливается поступление радиоактивного углерода из 1,6-14С-глюкозы в ди- и трикарбоновые кислоты [97]. О возможности биосинтеза С4-кислот непигментированными клетками уже сообщалось [18].

65

Светозависимое накопление АК альбиносными проростками говорит об от-сутствии прямой связи данного процесса с фотосинтезом. Реальнее выглядит зависимость биосинтеза АК от дыхательного процесса, для которого работами последних лет показана возможность функционирования на свету не только ЦТК, но и гликолиза, а также ОПФЦ [5, 13, 16, 80]; тем более, что на свету в анализируемых альбиносных проростках стимулируется дыхание в целом и от-дельные его этапы: гликолиз, ОПФЦ, ЦТК [49].

Исследование действия света различного спектрального состава на биосин-тез АК в альбиносных проростках ячменя показало (рис. 13), что наибольшую активность в этом процессе проявил зеленый свет (480-600 нм) и далее по мере уменьшения активности - синий (430-520 нм) и красный (620-740 нм).

Рис. 13. Содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в альбиносных проростках ячменя на свету различного спектрального состава в % к количеству кислот в темновом варианте - 100% (интенсивность света - 2,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция - 1 ч)

Таким образом, и в опытах с альбиносными проростками ячменя подтвер-

дился факт стимулирующего действия зеленого света на накопление АК. Зеле-ный свет длительное время рассматривался как малоактивный для растений, и его обычно использовали для выполнения препаративной работы перед свето-вым экспериментом и во время фотоморфогенетических исследований. Работа-ми, выполненными в 60-70-е годы, нам удалось показать, что на зеленом свету, а также на желто-зеленом активно синтезируется АК в этиолированных и зеленых проростках [98, 103, 104]. Далее было установлено, что зеленый свет оказывает влияние на ростовые процессы [53, 297, 302, 394], на фотосинтетический аппа-рат [24, 40, 55, 91, 314] и содержание органического углерода у растений [79].

66

Активация некоторых реакций метаболизма зеленым светом рассматривается рядом авторов как опосредованная фитохромом, возбуждаемым зеленым светом [54, 120, 146]. Следовательно, зеленый свет нельзя рассматривать как физиоло-гически инертный, а уточнение механизма его действия на растения - дело бу-дущих исследований.

4.4. Субклеточная локализация аскорбиновой кислоты

и ее окисленных форм в связи с освещением Гистохимическое исследование распределения АК в листьях чистяка весен-

него (Ficaria verna Huds.) показало, что она сосредоточена в хлоропластах, около ядер и во внешнем слое цитоплазмы. В стебле этого растения центральный ци-линдр и кора богаты АК, которая содержится главным образом в хлоропластах [195]. Более 30 - 40% АК листьев шпината также находится в хлоропластах [243]. В клетках корня конских бобов (Vicia faba L.) и лука репчатого (Allium сера L.) повышенное содержание АК обнаружено в области, близкой к клеточ-ной стенке, а в клетках меристемы она распределена по всей цитоплазме равно-мерно [289]. Много АК и в самой клеточной стенке [225]. В клетках корня хрена весь аскорбат сосредоточен в больших центральных вакуолях [262].

Субклеточная локализация АК в большой степени определяется физиологи-ческим состоянием клетки и ее структур. В зависимости от функционального состояния хлоропластов содержание АК в протоплазме может быть выше, чем в хлоропластах [195]. Делящиеся клетки культивируемых верхушек корней куку-рузы накапливали АК в цитоплазме, но картина распределения АК менялась по-сле начала элонгации клеток. В полностью вытянувшихся клетках основная часть АК была связана с клеточной стенкой [236].

Имеющиеся в литературе фрагментарные данные не дают цельной картины количественной локализации АК в клетке. Исследование же этого вопроса, не-сомненно, имеет большое значение для всесторонней оценки физиологической роли АК в обмене веществ растений.

Для клеточных структур свойственен постоянный обмен метаболитами, по-этому, решая вопрос о субклеточной локализации АК, мы провели одновремен-ный анализ ее содержания в хлоропластах и митохондриях, клеточном соке и структурных элементах - фракции целых листьев, оставшейся после извлечения сока [177, 178]. При этом учитывались условия освещенности, которые оказы-вают существенное влияние на содержание АК [181, 275]. Наряду с анализом восстановленной АК исследовалась ее окисленная форма - дегидроаскорбиновая кислота и продукт необратимого окисления АК - дикетогулоновая кислота, практически не исследованная в растениях [172]. В опытах использовались 7-9-дневные проростки ячменя сорта Надя. Источник света - люминесцентные лам-пы ЛДЦ-40 интенсивностью 33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1.

Хлоропласты выделяли по методике, описанной в работе Г.А. Могилевой и др. [87]. Супернатант, полученный при осаждении фракции хлоропластов, под-вергали центрифугированию при 9 тыс. об/мин (ЦЛР-1) в течение 15 минут для отделения митохондрий. Целостность структур в выделенных фракциях контро-

67

лировали микроскопированием соответствующих образцов. Клеточный сок из-влекали центрифугированием (1 мин при 2 тыс. об/мин, ЦЛС-3) обработанных хлороформом листьев в специальных стеклянных контейнерах [105].

Расчет количества исследуемых кислот проводился на сухой и сырой вес хлоропластов, митохондрий и целых листьев. Закономерности изменения со-держания кислот в условиях опытов сохранялись при обеих формах расчета, по-этому приводим только данные, полученные при пересчете на сырое вещество с тем, чтобы была возможность сопоставить содержание кислот в структурах и клеточном соке.

Одновременный анализ АК, ДАК и ДКГК в клеточном соке и структурных элементах листьев ячменя (рис. 14) показал, что все исследованные кислоты ко-личественно преобладают в клеточном соке, превосходя содержание АК в струк-турных элементах почти в 4 раза, а ДАК - более чем в 2 раза.

Длительное выдерживание проростков в темноте (40 ч) привело к выравни-ванию содержания кислот в анализируемых фракциях за счет повышения уровня АК в структурных элементах и одновременного снижения окисленной формы АК в обеих фракциях.

Последующее 24-часовое освещение, снизив уровень АК в структурных элементах и повысив его в клеточном соке, вновь вернуло к исходному соотно-шение в них АК (1 : 4). Свет повысил содержание ДАК и ДКГК в структурных элементах и в клеточном соке, в последнем особенно резко.

Таким образом, основным местом сосредоточения АК, ДАК и ДКГК в листь-ях ячменя является клеточный сок. Содержание АК и ДКГК в нем довольно ста-бильно, не меняется даже при длительном пребывании растений в темноте и увеличивается только при продолжительном освещении [180].

Наиболее существенные изменения содержания кислот в связи с освещением происходят во фракции "структурные элементы": в темноте резко возрастает количество АК, что сопровождается снижением ее окисленной формы - ДАК, на свету характер изменений становится противоположным. Вероятно, повышение содержания АК в структурных элементах в темноте является результатом неис-пользования ее в процессе фотосинтеза, где она может идти на поддержание в восстановленном состоянии хлорофилла [63], пластоцианина [425], возможно, и других соединений электрон-транспортной цепи [301].

Длительное освещение изменило содержание АК в клеточном соке, увеличив его на 49% по сравнению с исходным содержанием. Это увеличение коррелиро-вало с нарастанием продуктов окисления АК - ДАК и ДКГК. Можно предполо-жить, что в данных условиях увеличивается и светозависимое использование АК, идущее с накоплением ее окисленной формы и ДКГК, образующейся при разрыве лактонового кольца ДАК.

Стимулируемое светом накопление АК в клеточном соке может идти или за счет ее новообразования, или за счет усиливающихся на свету притоков АК из клеточных структур. Скорее всего, решающим является второе событие, так как в обеих анализируемых фракциях на свету увеличивается содержание ДАК, ко-торое, обладая повышенной по сравнению с АК способностью растворяться в

68

липидах, довольно легко может проходить через клеточные мембраны и выпол-нять роль транспортной формы АК [154].

- свет

- темнота

Рис. 14. Действие света (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на содержание АК (1), ДАК (2)

69

и ДКГК (3) в клеточном соке (а) и структурных элементах (б) листьев ячменя

- АК - ДАК - ДКГК

Рис. 15. Содержание АК, ДАК и ДКГК в целых листьях ячменя (1), хлоропластах (2) и митохондриях (3) после 40 часов пребывания в темноте (а) и последующего

70

24-часового освещения (б) (интенсивность света - 33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) В следующей серии опытов проводился одновременный анализ АК, ДАК и

ДКГК в целых листьях, хлоропластах и митохондриях, выделенных из растений, находящихся в различных условиях освещения (рис. 15), с тем, чтобы исследо-вать способность к биосинтезу АК данных клеточных структур, входящих в со-став анализируемой нами фракции "структурные элементы".

Из представленных данных видно, что в одном грамме хлоропластов, выде-ленных из листьев проростков ячменя, находящихся 40 часов в темноте, содер-жится больше восстановленной АК, чем в грамме целых листьев, а в митохонд-риях - меньше.

Последующее освещение растений, длительное время находившихся в тем-ноте, увеличило содержание аскорбата в целых листьях и существенным обра-зом повлияло на распределение АК в структурах: в хлоропластах уровень кисло-ты понизился, а в митохондриях увеличился в 3 раза. Таким образом, показано светозависимое накопление АК в беспигментных структурах - митохондриях.

Что касается окисленной формы АК, то в структурах, выделенных из темно-вых листьев, она практически отсутствовала; ДКГК, напротив, накапливалась в больших количествах. Эти данные дают возможность представить направлен-ность обмена исследуемых кислот: в темноте в хлоропластах и митохондриях идет необратимое окисление ДАК до ДКГК.

При освещении в хлоропластах появляется ДАК, а в митохондриях ее коли-чество увеличивается с 5,3 мкг/г до 33,3 мкг/г. Следовательно, на свету начина-ется использование АК с образованием окисленной формы. Последняя в мито-хондриях в больших размерах необратимо окисляется до ДКГК, а в хлоропла-стах этот процесс идет не так активно, вероятно, за счет того, что часть ДАК подвергается фотовосстановлению до АК [286].

Способность хлоропластов синтезировать АК в зависимости от освещения исследовалась и в опытах с изолированными хлоропластами. Последние выделя-лись из листьев 7-9-дневного ячменя, находившегося 40 часов без освещения. В хлоропластах определялся уровень АК, ДАК и ДКГК, затем часть их освещалась 2 часа в склянках Тищенко при постоянном продувании через среду выделения (0,4 М сахароза, 1/15 М фосфатный буфер, 0,01 N NaCl) воздуха со скоростью 1 л/мин; другая часть находилась в аналогичных условиях в темноте (табл. 18). За два часа освещения в изолированных хлоропластах уровень АК увеличился в 4 раза, и только в этом варианте была обнаружена ДАК. Количество ДКГК, на-против, в освещенных хлоропластах было ниже, чем у неосвещенных. Из анали-зируемых кислот в среде выделения накапливалась только ДКГК, причем в зна-чительном количестве, не уступающем ее содержанию в изолированных хлоро-пластах и хлоропластах целого листа.

По всей видимости, при инкубации изолированных хлоропластов АК, актив-но синтезируемая в них, выделяется в среду. В темноте она разрушается до

71

ДКГК, на свету этот процесс тормозится, поэтому в среде выделения обнаружи-вается ДАК - промежуточный продукт окисления АК до ДКГК.

Таблица 18

Влияние света на накопление АК, ДАК и ДКГК изолированными хлоропластами листьев ячменя (интенсивность света 15,7 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 2 ч)

Вариант опыта АК ДАК ДКГК мкг/г t мкг/г мкг/г t

Хлоропласты листьев ячменя, нахо-дящегося 40 часов в темноте - (а)

210,2

0

233,9

+ 2 часа темноты: изолированные хлоропласты (б) среда выделения (в)

278,2

0

aб= 161,

0 0

266,9 225,4

aб= 0 82,

aв= 104,

+ 2 часа света: изолированные хлоропласты (г) среда выделения (д)

840,4

0

aгбг

=

=

19 2

10 3

,

,

55,6 0

228,7 221,4

aгбг

=

=

011

3 04

,

,

aд= 0 78,

n =8, tтабл. = 2,37 для Р ≤ 0,05 Таким образом, субклеточная локализация АК, ДАК и ДКГК в листьях яч-

меня в значительной степени определяется условиями освещения. Светозависи-мое накопление АК при длительной экспозиции связано с увеличением ее со-держания в клеточном соке и митохондриях. В хлоропластах на свету также идет новообразование АК за счет или фотовосстановления предшественника [344], или фотовосстановления окисленной формы [286], однако наряду с этим имеет место активное использование восстановленной формы АК в светозави-симых процессах, масштаб которого превышает биосинтез. Поэтому при дли-тельном освещении растений содержание АК в хлоропластах начинает снижать-ся. Можно допустить и другое: синтезированная на свету в хлоропластах АК быстро поступает в клеточный сок, тем самым определяя высокое содержание в нем аскорбата. Обмен восстановителем может идти не только с клеточным со-ком, но и с митохондриями, и такая возможность уже обсуждается [56].

Представляется интересным подробнее обсудить возможный механизм вы-явленного нами стимулируемого светом накопления АК в митохондриях. В ли-тературе известны факты светозависимых изменений некоторых процессов в альбиносных растениях [456], в беспигментных структурах: в клеточных ядрах [71], в митохондриях, где при включении света резко возрастает НАД ⋅ Н2 [267]. Что касается биосинтеза АК, то известно, что ферменты, ответственные за пре-вращение l-галактоно-γ-лактона в АК, содержатся в митохондриях [282]. Можно предположить, что эта заключительная реакция в биосинтезе АК является свето-зависимой. Возможными акцепторами света в митохондриях могут быть цито-

72

хромы, в частности, цитохром С, для которого показано небольшое ускорение окислительно-восстановительных превращений при действии “белого” света [63, 65]. К тому же цитохромы имеют поглощение в зеленой области спектра - до-вольно активной в биосинтезе АК [104].

Последняя ступень биосинтеза АК у эвглены катализируется l-гулоно-лактон дегидрогеназой, сосредоточенной преимущественно в цитозоле (86,7%); 11,6% ее находится в митохондриях [402]. На свету активность данного фермента уве-личивается [404], что может обусловливать светозависимое накопление АК не только в цитозоле, но и в митохондриях.

Если же стимуляция светом биосинтеза АК осуществляется на уровне обра-зования предшественника, то этот процесс должен идти в цитоплазме, содержа-щей ферменты, ответственные за восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно-γ-лактон [307, 327]. Следовательно, помимо субстрата лимитировать биосинтез АК может и восстановитель -НАДФН+Н+. Источником его в растени-ях являются фотосинтез и ОПФЦ, функционирующий в цитоплазме и в хлоро-пластах. Поскольку на свету в хлоропластах ОПФЦ полностью ингибирован, а в цитоплазме ограничен [80], то в светозависимом биосинтезе АК, скорее всего, используется восстановитель фотосинтетического происхождения. Тогда возни-кает вопрос: почему на свету в хлоропластах, где идет фотосинтез, дающий вос-становитель, количество АК уменьшается, а в митохондриях - увеличивается? Этот факт можно объяснить лишь рассматривая масштаб использования АК в данных компартментах.

В хлоропластах АК используется в фотосинтезе и в дыхании. На свету пер-вый источник затрат резко возрастает, а использование в дыхании, наоборот, уменьшается, следствием чего является снижение общего уровня АК в хлоро-пластах и повышение в митохондриях. Кроме того, увеличение содержания АК в митохондриях может быть и результатом того, что здесь идет заключительный этап биосинтеза АК - превращение l-галактоно-γ-лактона в АК.

Способность этиолированных и альбиносных проростков синтезировать АК говорит о возможном использовании в этом процессе и НАДФН+Н+ ОПФЦ. На-блюдаемая у них стимуляция биосинтеза АК светом также идет за счет исполь-зования восстановителя ОПФЦ, так как для альбиносов, например, показано, что на свету гликолиз и ОПФЦ не ингибируются, а напротив, отмечается стимуля-ция выделения 14СО2 из равномерно меченой глюкозы [80]. Таким образом, на примере альбиносов видно, что не только субстрат, необходимый для биосинте-за АК, но и восстановитель может лимитировать ее новообразование; так, у аль-биносов при отсутствии фотосинтеза, дающего субстрат, биосинтез АК стиму-лируется светом.

При исследовании участия АК в обмене веществ растений, как правило, ана-лизируется система кислот АК↔ДАК. Однако присутствующее количество ДАК не всегда говорит о масштабе использования АК, так как уровень ДАК оп-ределяется и одновременно идущим процессом восстановления окисленной формы, и необратимым ее окислением до ДКГК. Поэтому привлечение в подоб-ных исследованиях данных по содержанию ДКГК дает дополнительную инфор-

73

мацию к решению вопроса о направленности окислительно-восстановительных процессов в системе АК↔ДАК↔ДКГК.

4.5. Возможные фоторецепторы светозависимого синтеза аскорбиновой кислоты

Вопрос об акцепторе света, регулирующего накопление АК, пока решается

однозначно. Это может быть фитохром [219, 391, 392] или родственное соеди-нение [329]. Фоторецепторную функцию он может выполнять в растениях с раз-личной пигментацией. Так, фитохром обнаружен в проростках овса, биосинтез хлорофилла которых ингибировался гербицидом норфлуразоном, и уровень фи-тохрома в них мало отличался от такового этиолированных растений [285]. Г.Мор [89], относя увеличение скорости синтеза АК к фотореакциям проростков горчицы, также в качестве пигмента, поглощающего эффективный свет, рас-сматривает фитохром. По его данным, ФДК способен быстро индуцировать и терминальную оксидазу АК - аскорбатоксидазу.

В проростках горчицы лаг-фаза изменения скорости накопления АК при включении дальнего красного света равняется 1,5 часа у 36-часовых проростков и 3 часам у 72-часовых [219]. В связи с этим повышение содержания АК на све-ту, по-видимому, нельзя объяснить только системой фитохрома, так как лаг-фаза вызванного фитохромом увеличения содержания АК составляет один час и бо-лее [219, 391], а в наших и других [404] опытах светозависимое образование АК отмечено и через более короткое время.

Регуляторные возможности фитохрома, вероятно, не так безграничны, как сейчас принято считать. В частности, уже приводятся данные о том, что регуля-торное действие фитохрома на биогенез хлоропластов в большей степени прояв-ляется в этиолированных проростках и при их прозеленении до этапа образова-ния мембран тилакоидов, а дальше фитохром уже не влияет на состав и функ-ционирование тилакоидов [232]. В связи с этим, пытаясь объяснить механизм стимулирующего действия света на биосинтез АК, нам хотелось бы привлечь внимание исследователей и к другим фоторецепторам [370], в частности, погло-щающим свет в зеленой области спектра. Даже в случае с фитохромом высказы-вается предположение, что зеленый свет фитохром поглощает не самостоятель-но, а через посредство “зеленого фоторецептора”, который может взаимодейст-вовать с фитохромом и регулировать его содержание в мембранах [441].

Зеленый свет могут поглощать цитохромы. Основным местом их локализа-ции являются хлоропласты и митохондрии. Каждый цитохром имеет три полосы поглощения α, β и γ [73] (см. табл. 19). Следовательно, и полосы поглощения ци-тохромов ЭТЦ фотосинтеза приходятся на зеленую область спектра (490 - 570 нм) [50, 131, 438]. Проявивший большую активность в биосинтезе АК зеленый свет с длиной волны 553 нм (табл. 12) как раз соответствует поглощению вос-становленного цитохрома f [447].

Митохондриальные цитохромы b и с также имеют поглощение в зеленой об-ласти спектра. Оно может несколько отличаться от вышеприведенного. Так, в листьях шпината α-пик цитохрома с обнаружен при 552 нм, b цитохромов - при 560 нм, а цитохромов - при 604 нм. Несколько отличалось поглощение α-пика

74

цитохромов стеблей шпината: оно приходилось на 549 нм у цитохрома с, 599 нм у цитохрома а и 554, 557, 567 нм - у цитохромов b [251].

Таблица 19 Поглощение света цитохромами (нм)

Полоса поглощения Цитохромы α β γ

Митохондриальные b с1 с

563 554 550

532 524 521

429 418 412

Хлоропластные f b6 b3

555 563 559

526 -

529

422 -

422-425

B зеленой области спектра поглощают и микросомальные цитохромы в про-ростках маша: 559, 560,5, 562,5 нм [277].

Цитохромы обнаружены в нефотосинтезирующих клетках [259, 331], поэто-му они могут выступать в качестве акцепторов зеленого света и в этиолирован-ных проростках ячменя, пластиды которых содержат цитохромы f, b (низко по-тенциальный), цитохром b - 563 нм [349].

Помимо цитохромов в зеленой области спектра поглощают беталаиновые пигменты [149], пластоцианин хлоропластов [416] и этиохлоропластов [130], антоцианы и незаряженные флавиновые радикалы (максимум поглощения 580 нм) [85], возможно, и другие соединения [294]. При исследовании спектра дей-ствия фотоэлектрической реакции фасоли было показано, что он сходен с тако-вым фотосинтеза, но имеет еще дополнительный максимум в зеленой области спектра, наличие которого авторы связывают с фикобилиновыми пигментами [358].

Каким образом энергия зеленого света, поглощенного данными соединения-ми, может стимулировать биосинтез АК, пока не ясно. Заманчиво предположить, что энергия света, поглощаемого, например, цитохромом в-559, функция кото-рого не ясна [234], непосредственно используется в фотовосстановлении ДАК до АК. Система ДАК/АК имеет более высокий отрицательный окислительно-восстановительный потенциал (0,08 В, рН 7,0), чем цитохромы (0,12 - 0,29 В) [133], и энергия зеленого света может быть использована для осуществления пе-реноса электрона от цитохромов в сторону компонентов с более высоким отри-цательным окислительно-восстановительным потенциалом: ДАК/АК.

Механизм участия зеленого света в биосинтезе АК может быть связан и с ак-тивацией ЭТЦ дыхания или фотосинтеза, так как некоторые из указанных фото-рецепторов являются их компонентами. Возможно и другое - при облучении зе-леным светом, когда меняется скорость ростовых [53, 302, 394, 297] и ряда об-менных процессов [24, 40, 55, 91, 314], уменьшается использование АК, напри-мер, на фотовосстановление пигментов [378] или других соединений, что также будет способствовать накоплению аскорбата.

75

Такая возможность проверялась в опытах с альбиносными проростками яч-меня, в которых с помощью салицилальдоксима ингибировалась активность пластоцианина [175]. Медьсодержащий белок пластоцианин присутствует в ти-лакоидных мембранах хлоропластов [216, 132] и функционирует в качестве пе-реносчика электронов от цитохрома f на Р700 в ЭТЦ между фотосистемой II и I [265, 354, 355]. Образование пластоцианина зависит от интенсивности дейст-вующего света, и скорость его биосинтеза в темноте составляла лишь 1/10 от светового варианта [386]. В спектре поглощения окисленного пластоцианина имеется три максимума - 460, 597 и 775 нм, то есть один из них приходится на зеленую область спектра (рис. 16). Голубая окраска пластоцианина полностью исчезает при его восстановлении АК [416]. АК используется в процессе восста-новления пластоцианина, хотя эта реакция может играть лишь второстепенную роль, так как в хлоропластах пластоцианин в основном восстанавливается цито-хромом f [422]. Р700 также восстанавливается АК [41, 263], и этот процесс усили-вается в 20-25 раз при добавлении 2,6 моля пластоцианина на моль Р700 [301].

Рис. 16. Спектры поглощения цитохрома с в окисленной (1) и восстановленной (2) формах. Указаны характерные полосы поглощения восстановленной формы - α, β и γ

(по А.Ленинджеру, 1985)

Пластоцианин присутствует в пигментированных тканях. Наличие его у аль-биносов было показано нами с использованием метода афинной хроматографии [182]. Для ингибирования пластоцианина использовались различные концентра-ции салицилальдоксима (5⋅10-4 - 5⋅10-9 М), добавленные к 1%-ной глюкозе, и в их присутствии исследовалось светозависимое накопление АК альбиносными проростками ячменя (рис. 17). Характер действия салицилальдоксима зависел от его концентрации: при 5⋅10-4 - 5⋅10-5 М отмечено увеличение содержания АК при

76

снижении ДАК; в присутствии меньших концентраций (5⋅10-6 - 5⋅10-7 М) уровень АК и ДКГК снижался, что сопровождалось накоплением ДАК.

Рис. 17. Изменение содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в альбиносных листьях ячменя, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы на свету (1 час, 33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) в присутствии различных концентраций

салицилальдоксима (СА) в % к контролю (100%)

Стимулирующее действие салицилальдоксима на накопление АК можно объяснить тем, что ингибирование пластоцианина влечет за собой уменьшение использования АК на его восстановление и восстановление Р700. Салицилальдок-сим в концентрации 5⋅10-6 - 5⋅10-7 М, вероятно, уже не оказывает активного ин-гибирующего действия на пластоцианин, и уменьшение накопления АК на свету в этом случае может определяться использованием ее на восстановление пласто-цианина, и как результат использования восстановленной формы АК возрастает ДАК.

Обнаруженный нами эффект стимуляции накопления АК салицилальдокси-мом в альбиносных проростках ячменя на свету проявлялся, хотя и в меньшей степени, и в этиолированных проростках. Вероятно, прозеленение этиолянтов отвлекает часть восстановленной АК, что подтверждалось данными опытов с более длительной, двухчасовой экспозицией: процесс прозеленения проростков нарастал, и стимуляция накопления АК салицилальдоксимом уже отсутствовала. Следовательно, пул АК в проростках ячменя на свету может зависеть от функ-

77

ционального состояния пластоцианина, способного самовосстанавливаться и восстанавливаться АК.

Обсуждая приведенный материал по исследованию накопления АК в проро-стках ячменя в присутствии салицилальдоксима, вероятно, нужно иметь в виду и нижеследующее соображение. Механизм ингибирующего действия салицилаль-доксима основан на его влиянии на ионы меди. Если это не специфическая реак-ция, то салицилальдоксим может ингибировать не только медьсодержащий бе-лок - пластоцианин, но и медьсодержащие ферменты, окисляющие АК, и тогда наблюдаемое увеличение уровня АК в присутствии салицилальдоксима будет опосредовано не функциональным состоянием пластоцианина, а оксидазами АК.

Возможность влияния экзогенного цитохрома с (поглощение при 550 и 521 нм) на светозависимое накопление АК проверялось нами в опытах с 11-дневными альбиносными проростками ячменя, которые предварительно выдер-живались 40 часов в темноте (табл. 20). Освещение (интенсивность света 33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) листьев на растворе цитохрома с (0,403 мг/мл) стимулировало нако-пление восстановленной формы АК и снижало ее дериваты - ДАК и ДКГК. Можно предположить, что энергия зеленого света, поглощенного цитохромом с, идет на восстановление ДАК в АК.

Таблица 20

Действие экзогенного цитохрома с на содержание АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) в 11-дневных альбиносных проростках ячменя на свету (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)

(экспозиция 24 ч; предварительное выдерживание растений в темноте 40 ч)

Вариант опыта АК ДАК ДКГК На воде 134,4 ± 5,4 92,3 ± 4,7 104,4 ± 7,4

На растворе цитохрома с (0,403 мг/мл)

268,6 ± 12,9

66,8 ± 2,1

86,8 ± 11,0

Таким образом, физиологическая активность зеленого света, в частности, в

отношении светозависимого накопления АК, может быть связана не только с функционированием фитохрома, но и с другими фоторецепторами, поглощаю-щими свет в зеленой области спектра.

Глава 5. АЛЬБИНОСНЫЕ ПРОРОСТКИ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕТОЗАВИСИМЫХ ПРОЦЕССОВ,

НЕ СВЯЗАННЫХ С ФОТОСИНТЕЗОМ Разработанный нами метод получения альбиносных проростков ячменя из

обработанных СМ семян (глава 4.3) позволяет получать неограниченное количе-ство материала, который можно использовать для исследования светозависимых

78

процессов, не связанных с фотосинтезом, а также для изучения биогенеза хлоро-пласта, его функциональной активности. В настоящее время имеется целый ряд примеров успешного использования подобных объектов для исследования неко-торых физиологических проблем, и в частности для выяснения механизмов фо-тосинтеза, его структурной и функциональной организации [411].

Под действием СМ ингибируется синтез хлорофилла, развитие структуры хлоропластов [222, 228]. Детального исследования влияния СМ на биосинтез белков хлоропласта не проводилось. В связи с этим нами выполнена работа по изучению действия СМ на состав и активность некоторых белков электрон-транспортной цепи, ферментов цикла Кальвина, ассимиляцию СО2 и продукты пятиминутного фотосинтеза [182].

В опытах использовались вырезки из зеленых и альбиносных участков му-тантных листьев ячменя. Контролем служили зеленые проростки. Наличие или отсутствие белков электрон-транспортной цепи контролировали электрофорезом в ПААГ. Для выделения фракции белков навеску листьев 1,5 г измельчали в жидком азоте, затем экстрагировали 0,05 М трис-НСl+ 0,1% тритон Х-100. Белки осаждали холодным ацетоном (1:1 объем/объем), осадок экстрагировали выше-указанным буфером. Нерастворимые белки отделяли центрифугированием при 10 тыс. g в течение 15 минут. Супернатант хроматографировали на сефадексе Г-25, белковую фракцию, выходящую из колонки первой, использовали для элек-трофореза.

Изоферменты пероксидазы в ПААГ выявляли по Орнстейну [356], ферре-доксин-НАДФ-редуктазу, ферредоксин и пластоцианин по Христину и др. [164, 165]. Перед электрофорезом белковые метчики и экстракты листьев инкубиро-вали 40 минут при 90° С в присутствии додецилсульфата натрия (2%) и дитиот-реитола (0,01%).

Для получения фракции водорастворимых белков листья растирали в трис-НСl буфере 0,05 М, рН 7,8, содержащим дитиотреитол 0,001 М, MgCl2 0,01 М, ЭДТА 0,0005 M. После разрушения гомогенат центрифугировали (20 тыс. об/мин) при 0° С в течение 30 минут. Скорость ферментативной реакции изме-ряли в свежеприготовленных экстрактах. Активность РДФ-карбоксилазы опре-деляли радиометрическим методом, рибозо-5-фосфатизомеразы и фосфорибуло-киназы - колориметрическим [129].

Продукты пятиминутного фотосинтеза выявляли в листьях, предварительно экспонированных в газовой камере с 14СO2 (конц. 0,033%), фиксацию проводили кипящим 96%-ным этанолом. Далее листья растирали и экстрагировали нисхо-дящими концентрациями этанола, сумму спиртоводорастворимых соединений лиофильно высушивали, растворяли в 1 мл дистиллята, определенную аликвоту наносили на бумажную хроматограмму. Для разделения соединений применяли систему растворителей: 1 направление - этанол, насыщенный аммиаком, 2 на-правление - бутанол - метанол - этанол - муравьинная кислота - вода (30:30:36:5:4 соответственно). Хроматограммы совмещали с рентгеновской

79

пленкой РТ-1, 14С-соединения идентифицировали по метчикам, радиоактивные соединения просчитывали в сцинтилляционном счетчике. Расчет радиоактивных соединений вели на радиоактивность всей водорастворимой фракции.

Спектр поглощения ацетонового экстракта из альбиносных участков 11-дневных листьев ячменя показал отсутствие в объекте хлорофилла и каротинои-дов (рис. 18). На этом же рисунке представлены спектры поглощения белков, полученных из ацетоновых экстрактов альбиносных и зеленых листьев. Видно, что белки альбиносных и контрольных растений поглощают в одной области, однако следует отметить большее поглощение первых в области полосы Соре (от 350 до 425 нм).

Рис. 18. Спектры поглощения: А - ацетонового экстракта из альбиносных участков листьев ячменя;

Б - белков ацетонового экстракта из альбиносных участков листьев ячменя; В - белков ацетонового экстракта зеленых листьев ячменя

80

Более подробный анализ белков ацетоновых экстрактов показал, что элек-трофореграммы, окрашенные красителем, а также зимограммы пероксидаз и диафораз существенно не отличаются у зеленых и альбиносных листьев. Обна-ружена лишь незначительная разница в интенсивности окрашивания одной изо-формы пероксидаз, ферментативная активность которой оказалась выше у аль-биносных листьев (рис. 19).

Рис. 19. Электрофореграммы изоферментов пероксидазы (А) и диафоразы (Б) зеленых (1) и альбиносных (2) листьев ячменя

В обоих вариантах опыта обнаружены ферредоксин, содержащий негемино-

вое железо, и пластоцианин, содержащий ионы меди, что свидетельствует о био-синтезе в альбиносных листьях функционально активного ферредоксина и пла-стоцианина. Приведенные данные указывают на то, что биосинтез белков ЭТЦ не ингибируется теми концентрациями СМ, которые использованы в опыте.

В гомогенатах, полученных из альбиносных и зеленых участков листьев опытных растений, определены РДФ-карбоксилаза, фосфорибулокиназа и рибо-зо-5-фосфатизомераза (табл. 21). Из представленных данных видно, что ассими-ляция СО2 альбиносными тканями очень низкая, что коррелирует с низким уровнем активности РДФ-карбоксилазы. Активность двух других ферментов - фосфорибулокиназы и рибозо-5фосфатизомеразы - у альбиносов также снижена, но остается на достаточно высоком уровне.

Таблица 21

Ассимиляция СО2 и активность ферментов цикла Кальвина в зеленых и альбиносных участках листьев ячменя, полученных из обработанных СМ семян

Участки Процент ингибирования от контроля (зеленые листья - 100%) листьев Скорость ас- Количество Активность

симиляции СО2

водораство-римого белка

РДФ-кар-боксилазы

фосфори-булокиназы

рибозо-5-фос-фатизомеразы

Зеленые 49,1 ± 1,3 37,3 ± 2,7 41,7 ± 2,2 17,7 ± 2,1 35,5 ± 5,2

Альбиносные 99,6 ± 0,3 - 41,8 ± 2,8* 89,4 ± 5,2 26,5 ± 0,3 44,5 ± 6,6

81

* В данном варианте ингибирование отсутствовало. Количество водорастворимого

белка увеличилось на 41,8% по сравнению с контролем. Таким образом, в листьях ячменя под действием СМ происходит уменьше-

ние активности ферментов цикла Кальвина, и в основном это относится к РДФ-карбоксилазе, большая субъединица которой кодируется ДНК хлоропласта и там же синтезируется, что и объясняет ингибирующее действие СМ, связывающего-ся с 70S рибосомами, на активность РДФ-карбоксилазы [367].

Данные по распределению 14С в продуктах пятиминутного фотосинтеза по-казывают, что по основным продуктам контроль и зелёная часть опытных листь-ев не отличаются (табл. 22). Более 80% радиоактивного углерода в них включа-ется в сахара и фосфорные эфиры сахаров. При хроматографировании экстракта из альбиносной ткани почти вся радиоактивность (93%) была обнаружена в зоне стартового пятна. Можно предположить, что у альбиносов в отсутствии фото-синтеза идет ассимиляция CO2 по типу гетеротрофной фиксации высокомолеку-лярными соединениями, которые при хроматографировании не отрываются от старта использованными системами растворителей. Возможность ассимиляции СO2 белыми листьями подтверждается и другими исследователями [387].

На основании приведенных данных можно заключить, что СМ избирательно ингибирует биосинтез белков в хлоропласте: мало влияя на образование иссле-дованных белков ЭТЦ, он нарушает биосинтез хлорофилла, каротиноидов, асси-миляцию CО2 и активность РДФ-карбоксилазы. Предлагается использовать экс-периментально полученные альбиносные проростки как модель для изучения биогенеза хлоропласта, его функциональной активности и регуляции метабо-лизма.

Глава 6. ОБРАЗОВАНИЕ АСКОРБИНОВОЙ, ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ И ДИКЕТОГУЛОНОВОЙ КИСЛОТ ПРИ

ИНГИБИРОВАНИИ ДЫХАНИЯ И ОТДЕЛЬНЫХ ЕГО ЭТАПОВ Биосинтез аскорбиновой кислоты связан с окислительным превращением

гексоз [306], в зеленых растениях она накапливается преимущественно на свету [110]. Этот процесс идет независимо от фотосинтеза, так как увеличение содер-жания аскорбата отмечено и у альбиносных проростков при наличии экзогенно-го субстрата [246, 181]. Пул АК у освещенных растений определяется скоростью ее новообразования и использования, например, в качестве восстановителя в ре-акциях, связанных с функционированием электрон-транспортной цепи фотосин-теза и дыхания, и кроме того, скоростью фотовосстановления образующейся в данных процессах окисленной формы аскорбиновой кислоты - ДАК [286]. При разрыве лактонового кольца дегидроформы образуется ДКГК, накопление кото-рой может служить показателем направленности процессов в системе АК↔ДАК. В связи с этим нами одновременно определялось содержание АК,

82

ДАК и ДКГК в зависимости от процесса дыхания в целом и от отдельных его этапов - гликолиза и цикла трикарбоновых кислот с тем, чтобы оценить вклад указанных процессов в формирование пула АК на свету [174].

84

Объектом исследования служили зеленые и этиолированные 6-7-дневные проростки ярового ячменя сорта Майя. Перед опытами в зеленых проростках уровень аскорбиновой кислоты снижали сорокачасовым выдерживанием их в темноте. В работе использовали следующие ингибиторы: 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ) в концентрации 1 ⋅ 10-3 М, ингибитор гликолиза - фторид натрия (1,5 ⋅ 10-2 М), ингибитор цикла Кребса - малоновая кислота (5 ⋅ 10-2 М). Навески листьев, помещенные на растворы ингибиторов, освещались в течение 1 часа светом лю-минесцентных ламп дневного света интенсивностью 15 тыс. эрг.⋅см-2⋅с-1. Кон-трольные растения освещались на воде.

2,4-ДНФ в концентрации 1 ⋅ 10-3 М ингибировал накопление АК и ДКГК в зеленых и этиолированных проростках ячменя на свету (табл. 23). Содержание ДАК при этом в этиолянтах увеличилось более чем в три раза, тогда как в зеле-ных проростках данный процесс был выражен слабее.

Таблица 23

Влияние 2,4-динитрофенола на накопление АК, ДАК и ДКГК в проростках ячменя на свету

Соединение Содержание кислот, мкг/г t исходное

(а) на воде

(б) на 1 ⋅ 10-3 М 2,4-ДНФ (в)

aб

бв

aв

Зеленые проростки* АК 356 403 368 6,34 4,04 1,68 ДАК 67 30 44 6,07 2,73 4,92 ДКГК 88 117 85 5,69 6,34 0,60

Этиолированные проростки** АК 370 439 348 5,51 7,23 1,74 ДАК 50 21 74 7,06 16,88 9,44 ДКГК 52 91 47 8,48 11,56 1,54

* n = 4, tтабл. = 3,18 для Р ≤ 0,05; ** n = 6, tтабл. = 2,57. Используемая в опытах концентрация 2,4-ДНФ на 52% подавляла дыхание

(рис. 20). Таким образом, ингибирование дыхания оказывает существенное влияние на содержание исследуемых кислот. Выявлена различная способность накапливать ДАК в присутствии 2,4-ДНФ у зеленых и этиолированных пророст-ков, что связано с особенностями фотовосстановления ДАК [286] или необрати-мого окислительного превращения AK [272] у этих растений.

В следующей серии опытов мы исследовали биосинтез АК, ДАК и ДКГК при ингибировании гликолиза (табл. 24). В присутствии фторида натрия содер-жание восстановленной формы АК и ДКГК возрастало, что сопровождалось уменьшением количества дегидроформы.

85

Рис. 20. Влияние ингибиторов на дыхание листьев ячменя: 1 - контроль (на воде), 2 - в присутствии 2,4-ДНФ (1 × 10-3 М), 3 - в присутствии малоната (5 × 10-2 М), 4 - в присутствии фторида натрия (1,5 × 10-2 М)

(экспозиция 1 ч)

Таблица 24 Влияние фторида натрия на накопление АК, ДАК и ДКГК

в проростках ячменя на свету

Соединение Содержание кислот, мкг/г t исходное

(а) на воде

(б) на 1,5 ⋅ 10-2 М

фториде натрия (в) aб

бв

aв



* n = 4, tтабл. = 3,18 для Р ≤ 0,05; ** n = 6, tтабл. = 2,57. АК в составе окислительно-восстановительной системы глутатион-аскорбат

участвует в превращении дыхательного субстрата [315]. Аллен, Холл [199], Ма-зурова [78] отмечали стимуляцию дыхания под действием АК, а величины инги-бирования дыхания и синтеза АК под действием ликорина - специфического ин-

86

гибитора биосинтеза АК - коррелировали между собой [206]. В связи с этим можно предположить, что факт стимуляции накопления АК фторидом натрия является результатом снижения использования ее в дыхательном процессе в присутствии данного ингибитора. Но, принимая во внимание то, что фторид на-трия лишь на 11% ингибировал дыхание (рис. 20), можно заключить, что выска-занное предположение лишь частично объясняет наблюдаемые изменения в со-держании АК под действием ингибитора гликолиза.

Процесс биосинтеза АК и ДКГК не связан с гликолизом как с энергетиче-ским процессом, так как с энергетической точки зрения гликолиз малоэффекти-вен [134]. Скорее всего, биосинтез АК и ДКГК идет из гексоз без окончательно-го расщепления их в процессе гликолиза. Это хорошо подтверждается данными опыта, представленными в табл. 25, из которых видно, что дополнительное снабжение листьев ячменя экзогенной глюкозой - одним из основных субстратов в биосинтезе AK [402] - снимает эффект накопления АК и уменьшает накопле-ние ДКГК под действием фторида натрия. Следовательно, биосинтез АК, ДКГК и гликолиз конкурируют за один и тот же субстрат и ингибирование гликолиза, отвлекающего часть имеющихся углеводов, может способствовать накоплению АК и ДКГК.

Таблица 25

Влияние фторида натрия на накопление АК, ДАК и ДКГК в этиолированных проростках ячменя, плавающих на растворе глюкозы на свету

Соединение Содержание кислот, мкг/г исходное на 1%-ном растворе глюкозы без фторида натрия с 1,5 ⋅ 10-2 М фторида натрия

АК 420 ± 20 512 ± 3 521 ± 14 ДАК 32 ± 6 14 ± 3 0 ДКГК 72 ± 2 106 ± 1 123 ± 6

Данные этих опытов не отрицают наличия субстратной связи между биосин-

тезом АК, ДКГК и гликолизом, так как фторид натрия ингибирует дыхание на стадии превращения 2-фосфоглицериновой кислоты в фосфоенолпируват и не исключено, что в биосинтезе АК и ДКГК используется не целая молекула глю-козы, а метаболизированная в реакциях гликолиза, не ингибируемых фторидом натрия. Кроме этого гликолиз имеет альтернативу - гексозомонофосфатный шунт, который не блокируется данным ингибитором [163]. Эффект стимулиро-вания биосинтеза АК фторидом натрия в этиолированных проростках выше, чем в зеленых, что можно объяснить тем, что часть вновь синтезированной АК в зе-леных растениях отвлекается на процессы фотосинтеза и дыхания хлоропластов [206]. Таким образом, указанный эффект в конечном итоге определяется умень-шением использования АК в процессе дыхания в присутствии фторида натрия и увеличением количества субстрата, необходимого для образования АК и ДКГК. Субстратом может быть целая молекула глюкозы или глюкоза, преобразованная в гексозомонофосфатном цикле или начальных реакциях гликолиза.

87

При ингибировании ЦТК малонатом (дыхание снизилось на 31%) содержа-ние всех исследуемых кислот в зеленых и этиолированных проростках на свету уменьшилось по сравнению с контролем (табл. 26). Следовательно, биосинтез АК и ее производных зависит от функционирования ЦТК. Эта зависимость мо-жет быть энергетической, поскольку для образований АК необходимо фосфори-лирование ее предшественников, если признать схему биосинтеза аскорбата, предложенную Левусом [304]. С другой стороны, ЦТК может быть донором предшественников, необходимых для образования АК. Известно, что некоторые органические кислоты способны отвлекаться из цикла. Среди них α-кетоглута-ровая, янтарная, щавелевая - кислоты, стимулирующие биосинтез АК в пророст-ках ячменя [110].

Таблица 26

Влияние малоната на накопление АК, ДАК и ДКГК в проростках ячменя на свету

Соединение Содержание кислот, мкг/г t Исходное

(а) На воде

(б) На 5 ⋅ 10-2 М рас-твора малоната (в)

aб

бв

aв



* n = 4, tтабл. = 3,18 для Р ≤ 0,05; ** n = 6, tтабл. = 2,57. Учитывая полученные данные, можно заключить, что на свету в проростках

ячменя функционирует система трех кислот - АК↔ДАК→ДКГК. При окислении ДКГК образуется винная кислота и C2-фрагмент, который может вовлекаться в обмен углеводов [306, 405]. Биосинтез двух кислот из этой системы - АК и ДКГК - носит светозависимый характер, тогда как ДАК на свету уменьшается. Изменения в содержании АК, вызванные присутствием ингибиторов дыхания, всегда коррелировали с изменением уровня ДКГК. Это не относится к ДАК, ко-торая является нестабильной и на свету быстро или фотовосстанавливается, или необратимо окисляется до ДКГК, что объясняет светозависимый характер нако-пления последней.

Таким образом, биосинтез АК и ДКГК в зеленых и этиолированных проро-стках идет с использованием органических кислот или глюкозы - целой ее моле-кулы или метаболизованной в начальных реакциях гликолиза и гексозомоно-

88

фосфатного цикла. Светозависимое накопление АК и ДКГК связано с процессом дыхания, причем в большей степени с ЦТК, чем с гликолизом, которые вносят определенный вклад в формирование пула АК на свету.

Глава 7. ФОТОРЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ, ОКИСЛЯЮЩИХ АСКОРБИНОВУЮ КИСЛОТУ

Регуляция обмена веществ растений идет на двух уровнях: на уровне синтеза

ферментов и изменения их активности. Значительные колебания ферментатив-ной активности происходят в ответ на такие факторы, как свет, темнота, суб-страты, гормоны, оводненность тканей, аэрация и т.д.

Механизм световой регуляции активности ферментов особенно важен для фототрофных организмов. Световая и темновая модуляции активности фермен-тов [201] регулируют обмен веществ у фотосинтезирующих организмов таким образом, что на свету идет синтез сахаров и запасных веществ, а в темноте их использование. Отсюда тот интерес, который проявляют исследователи к вопро-су фоторегуляции ферментов восстановительного пентозофосфатного цикла [21, 191]. На свету в хлоропластах быстро активизируются четыре фермента этого цикла: НАДФН-зависимая глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, седогепту-лозо-1,7-бисфосфатаза, фруктозо-1,6-бисфосфатаза и фосфорибулокиназа, а фер-менты гликолитического пути - фосфофруктокиназа и НАДФ-зависимая глюко-за-6-фосфатдегидрогеназа окислительного пентозофосфатного пути - на свету инактивируются [61].

Изменение активности ферментов на свету, предполагается [201], происхо-дит за счет посттрансляционной модификации хлоропластных и цитоплазмати-ческих ферментов. Некоторые модификации, вероятно, включают восстановле-ние дисульфидных связей.

Активация светом ферментов восстановительного пентозофосфатного цикла путем тиол-дисульфидного превращения происходит за счет перевода неактив-ных -S-S- форм ферментов в активные SH-формы. Это реализуется за счет того, что на свету осуществляется перенос электронов от хлорофилла на атом железа активного центра ферредоксина.

Восстановленный белок ферредоксин, окисляясь, передает водород тиоре-доксину при участии фермента ферредоксин-тиоредоксин-редуктазы. Тиоредок-син в восстановленной форме выступает как редуктаза дисульфидных групп белков, он функционирует как донор водорода для ряда ферментов.

В темноте восстановленные на свету ферменты вновь окисляются, и этот процесс может катализировать окисленный глутатион, также содержащий ди-сульфидную группу.

Механизм активации ферментов на свету путем тиол-дисульфидного обмена не является единственным. Активность ферментов в этих условиях может уси-

89

ливаться аллостерическими эффекторами: АТФ и NАДРН - для рибулозо-1, 5-бисфосфат-карбоксилазы, ионами кальция - для NАД-киназы [61].

Свет может не только менять активность уже имеющихся ферментов, но и индуцировать их синтез, что показано для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [454] и фосфоенолпируват-карбоксилазы [189].

Действие света на ферменты катаболиза, и в частности ферменты гликолиза, пентозофосфатного окислительного пути превращения соединений углерода, ферменты ЦТК, исследовано в меньшей степени [189, 14, 17, 161].

Изменение ферментативной активности под действием света зависит от ка-чества последнего. Кроме того, механизмы контролирования активности раз-личных ферментов светом одной и той же длины волны могут быть различны. Так, синий свет способен оказывать прямое действие на активность фермента, за счет чего может повышаться активность гликолатоксидазы, глюкозооксидазы и др., или же изменять активность опосредованно, через изменение уровня суб-стратов или эффекторов [380].

Восстановленная форма аскорбиновой кислоты на свету увеличивается [103]. Объяснение этого факта предполагает анализ активности ферментов, ее окисляющих: специфической оксидазы АК - аскорбатоксидазы и ферментных систем, которые опосредованно переводят АК в дегидроформу - полифенолок-сидазы, пероксидазы и цитохромоксидазы. Однако действие света на эти фер-менты исследовано крайне слабо.

Аскорбатоксидаза (КФ. 1.10.3.3) - глобулярный конъюгированный медьсо-держащий белок. Медь в молекуле фермента находится в смешанном валентном состоянии: два атома - одновалентные, они не несут ферментативной функции; шесть - двухвалентные, ответственные за оксидазную активность и голубую ок-раску водного раствора очищенного фермента. В молекуле белка содержится 18 различных аминокислот и гексозамин. Апофермент содержит 10 сульфгидриль-ных групп. Предполагается, что каталитические функции осуществляются не только при обратимом изменении валентности меди, но и при обратимых струк-турных изменениях белковой части молекулы фермента.

Аскорбатоксидаза катализирует реакцию окисления:

C6H8O6 + 1/2 О2 → С6Н6О6 + Н2О. АК ДАК

Методом ЭПР-спектрометрии было показано возникновение свободных ра-дикалов АК в этой реакции [452].

Активность фермента угнетается цианидом и диэтилдитиокарбаматом на-трия, который, активно захватывая ионы меди, образует прочный фермент-ингибиторный комплекс [134].

Аскорбатоксидаза обнаружена практически во всех хлорофиллоносных клетках. Она отсутствует в клубнях картофеля [326], в покоящихся семенах го-роха, но при прорастании последних быстро появляется в осевой части побега и корня, где увеличивается и изоферментный состав оксидазы [418]. В гипокотиле маша активность аскорбатоксидазы снижается от апекса к нижним зонам [256].

90

Несколько изоформ аскорбатоксидазы обнаружено в тыкве, однако в семядолях и гипокотиле горчицы, освещенной дальним красным светом и находящейся в темноте, присутствует лишь одна изоформа фермента [345]. На клеточном уров-не аскорбатоксидаза ассоциирована с клеточной стенкой и цитоплазмой [229].

В процессе роста и старения растений аскорбатоксидазная активность меня-ется. При снижении интенсивности света за счет общей освещенности и удале-нии УФ-излучения в растениях ячменя и девясила корнеглавого в онтогенезе активность аскорбактоксидазы понижается [157], что происходит и при созрева-нии ягод черной смородины [141].

Неодинакова аскорбатоксидазная активность и в течение года: в хвое сосны с максимального уровня в весенние месяцы - в марте-апреле - она снижается до минимума в октябре, повторяя ритмический характер накопления АК [240]. Аналогичная закономерность выявлена у деревьев, теряющих на зиму листья (конский каштан) или хвою (лиственница), и вечнозеленых (ель) [258]. Наличие прямой корреляции между содержанием АК и активностью аскорбатоксидазы показано и для хлопчатника [3].

В работе М.М.Окунцова и А.Н. Плотниковой отмечено, что активность АО в растениях фасоли хорошо коррелирует с суточными ритмическими движениями листьев. В дневные часы, когда листья подняты, фермент находится в активном состоянии; ночью, в темноте, в опущенных листьях окислительные ферменты переходят в неактивное состояние. Авторы полагают, что активность АО не за-висит от непосредственного влияния света, а связана только с эндогенным су-точным ритмом растения [99].

Как считает Н.Т.Бакарджиева [211], световой режим выращивания растений гороха незначительно влияет и на изоферментный состав АО, который в боль-шей степени определяется наличием в средах выращивания определенного типа ионов. Так, показано, что ионы меди активировали синтез АО в темновых расте-ниях.

В литературе имеются данные, указывающие на индукцию светом активно-сти АО [17]. Особое значение в фотоактивации АО придается дальнему красно-му свету, который значительно повышает активность фермента [364, 238, 196, 360]. Фитохром-зависимая репрессия и индукция ферментативного синтеза изу-чена на горчице [364, 210]. Фитохром ускорял синтез АО в семядолях и гипоко-тилях и не менял в корнях проростков. Причем активность АО, появившейся при фитохромной индукции, в гипокотиле была выше, чем в семядолях [26]. Фито-хром, активируя скорость образования фермента, тем самым увеличивал сум-марную активность АО [196].

В исследованиях по фитохромной регуляции синтеза АО показано, что у проростков горчицы определенное время активность фермента возрастает и в темноте, хотя в меньшей степени, чем на дальнем красном свету. Темновой и индуцированный светом фермент - один и тот же молекулярный тип [345]. Ав-торы [360] считают, что появление АО в темноте и на свету - независимые явле-ния. И можно только предполагать, что наряду с фотоактивацией синтеза АО в темноте имеет место субстратная стимуляция ферментативного синтеза, так как в прорастающих семенах появляется субстрат АО - аскорбиновая кислота.

91

Что же касается механизма фотоактивации аскорбатоксидазной активности, то, признавая факт стимуляции синтеза фермента дальним красным светом и связывая его с фитохромной регуляцией, стоит отметить, что действие света других спектральных участков на ферментативную активность АО совершенно не исследовано. Поэтому в опытах по изучению действия дальнего красного све-та на активность фермента [364, 238, 196], где в качестве контроля использова-лись растения, находящиеся в темноте, вероятно, стоило бы вводить и другой контроль - растения, освещающиеся полихроматическим светом.

Таким образом, учитывая немногочисленные и крайне противоречивые дан-ные по действию света на активность АО, стоит отметить, что данный вопрос требует дальнейшего исследования, которое должно объяснить механизм свето-вой регуляции активности АО, что в конечном итоге поможет определить усло-вия, формирующие пул АК на свету.

Помимо прямого окисления АК специфической оксидазой - аскорбатоксида-зой - возможно непрямое окисление при участии гемпротеида - пероксидазы. Этот фермент способен окислять субстрат за счет кислорода перекиси водорода, а в отсутствии последней - за счет молекулярного кислорода. Предполагается, что обе функции фермента - пероксидазная и оксигеназная - локализованы в пределах одной субъединицы.

Биосинтез компонентов молекулы пероксидазы имеет различную локализа-цию. Апопротеиновая часть синтезируется преимущественно на гранулярной эндоплазматической сети, гем - в митохондриях, гликозидная простетическая группа присоединяется к полипептиду в аппарате Гольджи [281]. В клетках ли-стьев и кончиков корней целого ряда растений активность пероксидазы связана с клеточными оболочками, вакуолями, плазмодесмами, ламеллами [290], возмож-но, и с особыми секреторными органеллами - пероксидазосомами [127].

Пероксидазы широко распространены среди растений. Наряду с классиче-ской пероксидазой (КФ 1.11.1.7) известны НАД- и НАДФ-пероксидазы, перок-сидаза жирных кислот, глутатионпероксидаза, цитохром-пероксидаза. Аскорбат пероксидаза окисляет АК до ДАК следующим образом [292]:

1) 2 Н2О + 2 НАДФ+ hν⎯ →⎯ 2 НАДФН + 2 Н+ + О2;

2) 2 НАДФН + 2 Н+ + ГSSГ → 4 ГSН + 2 НАДФ+; 3) 4ГSН + 2 ДАК → 2 ГSSГ + 2 АК; 4) 2 АК + 2 H2O2 → ДАК + 4 Н2О.

Пероксидаза АК встречается в хлоропластах и в цитозоле, но в митохондри-альной и микросомальной фракциях отсутствует [429]. У хлореллы это основной фермент окисляющей АК, так как АК-аза у нее не обнаружена [403]. Молекула пероксидазы поглощает свет определенной длины волны; так, пероксидаза хрена в растворе имеет поглощение при 645, 583 и 498 нм, а также наиболее выражен-ное при 410-430 нм (линия Соре). После восстановления остаются линия Соре и поглощение при 594 и 586 нм. Взаимодействие с перекисью водорода ведет к образованию промежуточных компонентов (их четыре типа), которые обладают различными спектральными характеристиками [134].

92

Обладая собственным поглощением, молекула пероксидазы должна быть чувствительна к действию радиации. При светоимпульсном облучении семян растений меняются физиологические и биохимические параметры растений, они приобретают колебательный характер. Механизм обнаруженных колебательных процессов, как показал Б.Г. Явишев [190], связан с активностью пероксидазы, а кроме этого - с синхронными изменениями SН ↔ S = S перехода. Обнаружено обратимое смещение в спектре ЯМР трех линий S- и N-содержащих групп глу-татиона.

Реакция на освещение пероксидазы различных видов растений, как показы-вают литературные данные, неоднозначна. Активность фермента на свету резко уменьшалась в стеблевой части гибридных проростков пшеницы [226] и в моло-дых проростках гороха, растущих при избытке Zn и Mn [212]. Замедление роста стебля гороха при освещении красным светом также сопровождалось падением активности пероксидазы [124]. В листьях риса, напротив, освещение после тем-ноты вызывало подъем активности фермента, а в темноте она снижалась [373], так же, как и в листьях ячменя [399]. Имеются и другие данные о стимуляции активности пероксидазы белым светом [423].

Показана фитохромная регуляция активности пероксидазы кукурузы. Крас-ный свет увеличивал активность фермента на 50-70% (5мин, 500 мкВт ⋅ см-2 ⋅ с-1), эффект красного света был обратим дальним красным светом. При продолжи-тельном (24 часа) освещении дальним красным светом наблюдалась стимуляция активности пероксидазы за счет синтеза фермента [401].

Механизм действия красного света на пероксидазную активность представ-ляется следующим образом: под действием красного света в растениях синтези-руется флавоноид кемпферол, который в качестве монофенольного кофактора стимулирует ферментативную активность [254].

В работе [359] объясняется механизм фотоактивации пероксидазы инфра-красным светом. Установлено, что при прямом освещении верхних листьев шпината в них активировались щелочные пероксидазы. Активность повышалась и в затемненных верхних листьях, если начинали освещать нижние листья; ответ наблюдался через 1,5 минуты. Наблюдаемый эффект инфракрасного света, по мнению исследователей, связан с изменениями мембранного аппарата.

Коротковолновое УФ-облучение 254 нм вызывало повышение активности растворимой и связанной ионными силами пероксидазы в листьях фасоли [223].

Таким образом, наряду с изучением действия белого света на пероксидазную активность предпринимается исследование света более узких спектральных уча-стков с попыткой объяснения механизма их действия. Что же касается других ферментов, участвующих в непрямом окислении АК, в частности полифенолок-сидазы (КФ 1.10.3.1), то вопрос о действии света на ее активность практически не исследован, хотя изучение субклеточной локализации фермента показало его присутствие в хлоропластах [299, 337]. Полифенолоксидаза локализована в ти-лакоидных мембранах хлоропластов и других пластид растений, но белок ее ко-дируется ядерным геномом. Предполагается, что все пластиды содержат поли-фенолоксидазу, активность которой с возрастом растений имеет тенденцию к увеличению [113], и хотя фермент относится к числу широко распространенных,

93

функция его недостаточно ясна. Возможно, она связана с реакцией Мелера в хлоропластах и с созданием в них "кислородного буфера" [440].

Что касается цитихромоксидазы (КФ 1.9.3.1), которая наряду с полифено-локсидазой участвует в непрямом окислении АК, то показана ее определенная реакция на освещение. В листьях пшеницы на свету (10 минут) значительно по-вышался стационарный уровень восстановленной цитохромоксидазы, что связы-вается с уменьшением на свету энергизации митохондрий и значительным уменьшением в них НАД+. В хорошо сопряженных митохондриях в темноте при стационарном уровне дыхания цитохромоксидаза находилась в более окислен-ном состоянии [347].

Цитохромоксидаза присутствует в хлоропластах [134], в бесхлорофилльных тканях ее активность резко снижена. В связи с этим предполагается, что в аль-биносных тканях доля участия в дыхании цитихромоксидазы снижается, а окис-ление дыхательных субстратов осуществляется при участии иных ферментных систем [136]. По другим данным [419], активность цитохром-с-оксидазы зеле-ных и неокрашенных листьев была близкой.

Таким образом, вопросы, касающиеся действия света на ферменты, окис-ляющие АК, начинают привлекать внимание исследователей, но они еще далеки от окончательного решения. Изучение их является необходимым не только для выяснения условий и механизмов, формирующих пул АК на свету, но также и для решения более общих проблем взаимосвязи фотосинтеза и дыхания. В связи с этим в своей работе мы изучали действие полихроматического света на актив-ность АО, пероксидазы, полифенолоксидазы и цитохромоксидазы, а для перок-сидазы - и монохроматического синего, зеленого, красного света в проростках ячменя с различной пигментацией с тем, чтобы обсудить вопрос о возможных фоторецепторах светозависимых процессов, а в конечном итоге попытаться объ-яснить механизм действия света на указанные ферменты [179].

Действие света на активность АО изучалось в опытах с 7-9-дневными зеле-ными, этиолированными и альбиносными проростками ячменя, в которых опре-делялась исходная активность фермента, уровень ее после суточного пребыва-ния растений в темноте и последующего двухчасового освещения. Оказалось, что начальный уровень активности АО значительно отличается у проростков с различной пигментацией: минимальным он был у зеленых проростков, макси-мальным - у альбиносных (табл. 27).

Таблица 27

Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы в 8-дневных проростках ячменя (интенсивность света 30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1)

Вариант опыта Активность аскорбатоксидазы в проростках в единицах падения оптической плотности, ΔД

Зеленые Этиолированные Альбиносные Исходная активность 2,58 ± 0,18 3,65 ± 0,18 4,89 ± 0,14 24 часа темноты 5,54 ± 0,10 3,55 ± 0,10 7,85 ± 0,02 + 2 часа света 4,84 ± 0,12 4,65 ± 0,17 9,58 ± 0,36

94

Выдерживание в темноте в течение 24 часов повысило активность фермента у зеленых растений более чем в два раза и в несколько меньшей степени (в 1,6 раза) у альбиносов. У этиолянтов, для которых условия освещения в данном ва-рианте опыта не изменились, активность фермента осталась на прежнем уровне. Последующее двухчасовое освещение проростков, предварительно выдержан-ных в темноте, снизило активность АО у зеленых растений и стимулировало у проростков, лишенных зеленых пигментов.

- темнота

- свет (30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1)

Рис. 21. Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы в зеленых проростках ячменя

Характер светозависимых изменений активности АО при более длительной

(24 часа) световой экспозиции представлен на рис. 21-23. Опытные зеленые и альбиносные проростки перед освещением помещались в темноту на 24 часа; этиолянты, напротив, затемнялись после освещения. Активность фермента оп-

95

ределялась через каждые 2 часа в течение первых 12 часов пребывания растений на свету или в темноте, а затем в конце 24-часовой экспозиции.

У зеленых растений (рис. 21), помещенных в темноту, резко возросла актив-ность АО. Этот подъем продолжался в течение 4 часов, в последующие 4 часа активность фермента снижалась, значительно не доходя до исходного уровня. Дальнейшее присутствие проростков в темноте (от 10 до 12 часов) стабилизиро-вало активность фермента, и этот уровень сохранялся в следующие 12 часов.

После темновой экспозиции опытные растения сутки находились на свету. В течение первых 6 часов освещения активность фермента снизилась почти до ис-ходного уровня и после небольшого подъема через 8 часов поддерживалась на одном уровне до конца опыта.

- темнота

- свет (30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1)

Рис. 22. Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы в этиолированных проростках ячменя

96

В этиолированных проростках (рис. 22) в первые 2 часа освещения актив-ность повысилась, но в оставшееся до конца световой экспозиции время была значительно ниже исходной. Последующее затемнение растений стимулировало фермент, и через 7 часов его активность достигала исходного значения. Подъем продолжался в течение 10 часов, однако в дальнейшем ферментативная актив-ность стала снижаться и почти приблизилась к исходному уровню через 24 часа. Следует отметить, что через два часа прозеленения этиолированных проростков их реакция на освещение стала такой же, как у зеленых растений: свет ингиби-ровал активность АО, темнота - стимулировала.

Иной была реакция на освещение АО альбиносных проростков (рис. 23), у которых активность фермента повышалась не только в темноте, но еще в боль-шей степени при освещении. Причем при смене условий освещения в первые 6-8 часов опыта отмечался резкий подъем активности фермента, в дальнейшем она стабилизировалась и поддерживалась на одном уровне до конца световой или темновой экспозиции.

- темнота

- свет (30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1)

Рис. 23. Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы в альбиносных проростках ячменя

97

Таким образом, реакция на освещение АО проростков ячменя в значитель-ном степени зависит от состояния пигментного аппарата анализируемых расте-ний, а в конечном итоге, вероятно, от функционирования того или иного энерге-тического процесса - фотосинтеза или дыхания.

Действие света на активность цитохромоксидазы исследовалось в опытах с 6-дневными проростками ячменя с различной пигментацией (рис. 24), у которых ферментативная активность определялась до и после 24-часовой темновой экс-позиции. В темноте значительно повысилась активность цитохромоксидазы в зеленых проростках и в меньшей степени, но статистически достоверно, снизи-лась в этиолированных и альбиносных. Реакция на 4-часовое освещение расте-ний, предварительно находившихся сутки в темноте, была неоднозначной: в зе-леных проростках на свету активность цитохромоксидазы резко снизилась, тогда как в этиолированных и альбиносных - возросла. Следует отметить, что во всех вариантах опыта уровень активности цитохромоксидазы оставался самым высо-ким у альбиносов, самым низким - у зеленых растений.

- темнота

- свет

Рис. 24. Влияние условий освещения на активность цитохромоксидазы в зеленых (1), этиолированных (2) и альбиносных (3) проростках ячменя (в усл. единицах)

Действие света на активность полифенолоксидазы представлено на рис. 25.

В зеленых, этиолированных и альбиносных проростках, находившихся сутки в

98

темноте, активность фермента медленно нарастала. Включение света резко из-менило скорость процесса, причем если у этиолированных и альбиносных про-ростков активность полифенолоксидазы продолжала увеличиваться еще с боль-шей скоростью, то у зеленых проростков она быстро снизилась.

- темнота

- свет (30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1)

Рис. 25. Влияние условий освещения на активность полифенолоксидазы (ΔД, с/г) в зеленых (1), этиолированных (2) и альбиносных (3) проростках ячменя

Более длительное 6-часовое освещение по-прежнему стимулировало поли-фенолоксидазу у альбиносных и этиолированных проростков и только 24-часовая экспозиция несколько снизила скорость нарастания активности фермен-та. Полифенолоксидаза зеленых проростков, снизившись почти до исходного уровня в первые два часа освещения, в дальнейшем медленно возрастала, но в конце освещения (24 часа) тем не менее была в два раза ниже, чем у альбинос-ных проростков и почти в три раза меньше, чем у этиолянтов.

Таким образом, у зеленых проростков включение света после темноты инги-бировало активность полифенолоксидазы, а у проростков, лишенных зеленых пигментов, - стимулировало.

99

Анализ изоферментов пероксидазы в полиакриламидном геле показал, что в альбиносных участках мутантных листьев ячменя активность одной из изоформ фермента была выше, чем в соответствующих участках зеленых листьев [182], в этиопластах выше, чем в хлоропластах [135]. В работе М.В. Гусева и др.[30] ука-зывается, что при нарушении биосинтетических функций листа, в том числе свя-занных с накоплением хлорофилла, число молекулярных форм пероксидазы и активность некоторых из них увеличиваются. В связи с этим нами проведено подробное исследование активности пероксидазы в различных зонах листьев зеленых, этиолированных и мутантных проростков (табл. 28). Оказалось, что активность фермента практически одинакова по всей длине этиолированных ли-стьев, а у зеленых она максимальна в нижней части листа.

Таблица 28

Пероксидазная активность различных зон зеленых, этиолированных и мутантных листьев ячменя (ΔД, с/г)

Зона листа Зеленые листья Этиолированные Мутантные Верхняя 14,00 ± 0,84 15,61 ± 0,61 21,60 ± 0,39 Средняя 14,45 ± 0,85 16,04 ± 0,60 24,53 ± 0,85 Нижняя 17,07 ± 0,41 16,91 ± 0,36 31,98 ± 1,10

Наибольшая гетерогенность в распределении ферментативной активности

обнаружена у мутантных листьев, для которых характерен и самый высокий уровень ее по всем зонам листа по сравнению с зелеными и этиолированными проростками. Прослеживается обратная зависимость в содержании зеленых пиг-ментов и активности пероксидазы: наибольшая активность фермента выявлена в нижней альбиносной зоне мутантного листа, наименьшая - в верхнем пигменти-рованном участке.

Влияние света на пероксидазную активность представлено на рис. 26. Зеле-ные проростки сутки выдерживались в темноте, что приводило к снижению ак-тивности фермента. Последующее освещение в течение 6 часов резко активиро-вало пероксидазу. В дальнейшем стимуляция активности фермента прекраща-лась, и в конце световой экспозиции через 24 часа она имела тенденцию к сни-жению, хотя все еще оставалась выше, чем в темновом варианте.

Исследовано действие света различной интенсивности (4,4 и 30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1) на активность пероксидазы (рис. 27). Оказалось, что светозависи-мая стимуляция активности фермента в зеленых проростках нарастает с увели-чением интенсивности света.

Таким образом, показана положительная реакция пероксидазы зеленых про-ростков на освещение, которая зависит от продолжительности и интенсивности действующего света.

Наряду с зелеными проростками изучалось действие света на активность пе-роксидазы в этиолированных и альбиносных проростках (рис. 28), для которых также оказалась характерна светостимуляция активности фермента.

100

- темнота

- свет (30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1)

Рис. 26. Влияние условий освещения на активность пероксидазы в зеленых проростках ячменя

Рис. 27. Влияние различной интенсивности света (1 - 4,4 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1; 2 - 30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1) на активность пероксидазы

в зеленых проростках ячменя (в % к исходной активности - 100 %)

101

- темнота

- свет (4,4 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1)

Рис. 28. Действие двухчасового освещения на активность пероксидазы в зеленых (А), этиолированных (Б) и альбиносных (В) проростках ячменя

Для определения спектра поглощения возможного фоторецептора, ответст-

венного за светозависимую стимуляцию пероксидазной активности в проростках ячменя, исследовалось действие света различного спектрального состава на дан-ный процесс (табл. 29). Реакция на освещение монохроматическим зеленым и синим светом была одинакова у всех типов листьев: зеленый свет повышал, а синий снижал активность фермента. Красный свет активировал пероксидазу только у этиолянтов, у других - снижал. Таким образом, световая стимуляция активности пероксидазы в зеленых, этиолированных и альбиносных листьях яч-меня зависит от качественного состава действующего света.

Исследование действия света на активность ферментов, окисляющих АК, показало, что характер фотоответа зависел от состояния пигментного аппарата проростков ячменя: если у зеленых растений активность АО, полифенолоксида-зы и цитохромоксидазы ингибировалась светом и активировалась в темноте, то у альбиносных проростков свет стимулировал активность ферментов. У этиолиро-ванных растений реакция на освещение менялась в ходе прозеленения; так, ас-корбатоксидазная активность повышалась при переходе темнота - свет, но при продолжающемся освещении с появлением пигментов понижалась.

Вышеназванные ферменты являются медьсодержащими белками, которые в окисленной форме имеют интенсивное поглощение света в видимой области спектра 600 и 800 нм [90]. В связи с этим изменение активности АО, полифено-

102

локсидазы и цитохромоксидазы при освещении можно было бы рассматривать как результат посттрансляционной модификации молекулы фермента. Однако неоднозначная реакция на освещение активности ферментов у зеленых и бес-хлорофилльных растений не подтверждает это предположение.

Таблица 29

Действие света различного спектрального состава на активность пероксидазы (ΔД, с/г) в листьях ячменя

(экспозиция 2 ч; интенсивность света 4,4 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1)

№ опыта

Условия опыта Зеленые Этиолированные Альбиносные

1 В темноте 15,04 ± 0,40 9,42 ± 0,12 27,26 ± 1,13 На красном свету

(620-740 нм)

11,82 ± 0,46

11,93 ± 0,13

19,41 ± 1,46 На белом свету 16,45 ± 0,15 14,40 ± 0,36 33,50 ± 1,21

2 В темноте 9,92 ± 0,21 16,31 ± 0,22 28,99 ± 0,45

На синем свету (440-520 нм)

9,01 - 0,16

13,07 ± 0,32

23,97 ± 0,25

3 В темноте 15,51 ± 0,23 19,50 ± 0,36 23,26 ± 0,74 На зеленом свету

(480-600 нм)

17,72 ± 0,19

20,24 ± 0,32

26,94 ± 1,27

На свету в зеленых и альбиносных проростках ячменя увеличивается содер-жание восстановленной формы АК [181], у альбиносов возрастает скорость об-разования свободных фенольных соединений [121]. Таким образом, на свету при возрастании количества соответствующих субстратов активность АО и полифе-нолоксидазы снижается. Следовательно, и механизм субстратной активации ферментов не объясняет изменения их активности в связи с освещением.

АО, полифенолоксидаза и цитохромоксидаза - дыхательные ферменты, в ча-стности, они являются компонентами дыхательной цепи хлоропластов. Учиты-вая гипотезу о взаимозаменяемости энергетических процессов - фотосинтеза и дыхания [143], можно полагать, что на свету, когда в ассимилирующих клетках включается фотосинтез, конкуренция за энергетические кофакторы приводит к снижению дыхания. Следствием этого является понижение активности дыха-тельных ферментов. В нефотосинтезирующих и слабо пигментированных клет-ках в отсутствии конкуренции за аденилаты усиливается дыхание [330]. Это по-казано и для альбиносных листьев ячменя (рис. 29). Поэтому в этиолированных и альбиносных растениях в противоположность зеленым на свету активность АО, полифенолоксидазы и цитохромоксидазы не снижается, а даже возрастает. Последнее может быть следствием возрастающих на свету энергетических трат, связанных со светозависимыми синтезами.

Как показано для анализируемых мутантных проростков ячменя, на свету в альбиносной ткани стимулируется гликолиз, окислительный пентозофосфатный

103

цикл и цикл Кребса [80]. Следовательно, учитывая полученные нами данные по активации светом АО, полифенолоксидазы и цитохромоксидазы альбиносных и этиолированных проростков ячменя, можно говорить о стимуляции светом не только дыхательной цепи переноса водорода, включающей цитохромы, но и аль-тернативных путей, включающих полифенолоксидазу и АО. Последняя у неко-торых растений может обеспечить транспорт всего сжигаемого при дыхании во-дорода [49].

Рис. 29. Дыхание зеленых (А) и альбиносных (Б) участков листа ячменя в % к контролю (контроль - 100 %)

Таким образом, светозависимое изменение активности АО, полифенолокси-

дазы и цитохромоксидазы в зеленых, этиолированных и альбиносных пророст-ках ячменя происходит не путем непосредственного воздействия света на моле-кулу фермента, а, скорее всего, опосредованно, через изменение интенсивности дыхательного процесса, в котором задействованы указанные оксидазы.

Из исследованных нами ферментов, окисляющих АК, в зеленых проростках только пероксидаза активировалась светом. Этот фермент является гемпротеи-дом, поглощающим свет в нескольких областях спектра. Так, пероксидаза хрена поглощает свет с длиной волны 410-430, 498, 583, 645 нм. Проведенное нами исследование действия света различного спектрального состава на пероксидаз-ную активность показало, что зеленый свет (480-600 нм) повышал, а синий (440-520 нм) снижал активность фермента; красный свет (620-740 нм) активировал пероксидазу только у этиолированных проростков. Учитывая спектр поглоще-ния молекулы пероксидазы, можно предположить, что непосредственным ак-цептором света в светозависимом изменении ее активности может выступать сама молекула фермента, тонкая регуляция активности которой осуществляется светом определенного спектрального состава.

Действие света на активность пероксидазы, вероятно, не связано с изменени-ем скорости синтеза фермента, так как нами показано ингибирование активности пероксидазы синим светом, способствующим преимущественному накоплению

104

белков [215]. Синий свет может оказывать прямое действие на ферменты и не-прямое - через изменение уровня субстратов и эффекторов [380]. При длитель-ном освещении растений увеличивается чувствительность некоторых клеточных процессов к Фдк и синий свет может оказывать специфическое действие на опо-средованный фитохромом синтез ферментов - через модуляцию фитохромом экспрессии генома [353].

Одновременный анализ ферментов, окисляющих АК, в зеленых, этиолиро-ванных и альбиносных проростках ячменя показал, что максимальный их уро-вень был у депигментированных проростков. Этот факт находит подтверждение в работах по исследованию полифенолоксидазы бесцветной ткани листьев хло-рофитума [137], мутантных растений ячменя [235], и только у альбиносных про-ростков кукурузы цитохромоксидазная активность резко снижалась [136]. Хотя у других С4-растений активность цитохром-с-оксидазы была близкой в зеленых и неокрашенных участках пестрых листьев [419]. Наличие пероксидазной, по-лифенолоксидазной, цитохромоксидазной и АО активности у альбиносных про-ростков, полученных нами при ингибировании 30S-субъединиц 70S-рибосом, дает основание связывать синтез исследованных ферментов с 80S-рибосомами цитоплазмы.

Таким образом, реакция на освещение ферментов, окисляющих АК, неодно-значна и зависит от функциональной активности фотосинтетического аппарата: у зеленых проростков ячменя активность АО, полифенолоксидазы и цитохро-моксидазы снижается на свету, активность пероксидазы возрастает. В альбинос-ных и этиолированных тканях листа свет активирует все исследованные фер-менты. Следовательно, можно считать, что одной из причин возрастания пула АК у зеленых проростков на свету является ингибирование светом большинства ферментов, ее окисляющих.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Аскорбиновая кислота выполняет важные функции в жизни растений и че-

ловека, при этом участие витамина С в метаболизме гетеротрофных организмов более конкретизировано. Что же касается автотрофов, продуцирующих АК, то у них еще нуждается в уточнении и функция данного соединения, и пути его но-вообразования.

В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что одним из важнейших условий, определяющих биосинтез АК у растений, является свет. В сухих семе-нах АК отсутствует, при их прорастании даже в темноте в проростках синтези-руется АК, но, вероятно, за счет предшественников, запасаемых в семени. В зе-леных же растениях АК накапливается преимущественно на свету, поэтому оп-равдано было связывать ее биосинтез с фотосинтезом. Однако исследование действия света различного спектрального состава на биосинтез АК показало, что спектры действия фотосинтеза и биосинтеза АК в отдельных областях не совпа-дают. В частности, показана высокая активность желто-зеленого света в процес-

105

се образования АК. Отсутствует положительная корреляция в содержании фото-синтетических пигментов и способности растений накапливать АК. Кроме этого, светозависимый синтез АК был обнаружен у экспериментально полученных альбиносных проростков ячменя. Все сказанное дает основание говорить об от-сутствии прямой связи между фотосинтезом и биосинтезом АК, хотя полностью отрицать наличие контактов между этими процессами нельзя, так как углевод-ный субстрат для новообразования АК дает фотосинтез.

Экспериментально показано наличие связи между светозависимым биосин-тезом АК и дыхательным процессом в целом, а также с отдельными его этапами: гликолизом и ЦТК, особенно с последним. При активации ЦТК интермедиатами цикла (янтарной, α-кетоглутаровой кислотой) и при его ингибировании соответ-ственно менялось и накопление АК. Исследование субклеточной локализации АК в связи с освещением выявило активное накопление АК во фракции, вклю-чающей митохондрии, что также указывает на связь биосинтеза АК с органои-дами дыхания, хотя ингибирование хлоропластных, митохондриальных и цито-плазматических рибосом показало, что биосинтез АК в большей степени зависит от функционирования цитоплазматических 80S-рибосом, чем от митохондри-альных и хлоропластных.

Наблюдаемое светозависимое накопление АК в растениях, вероятно, нельзя связать с каким-либо одним процессом: фотосинтезом или дыханием, как это делалось раньше. Уже сейчас видно, что существует несколько процессов, кото-рые будут определять накопление АК на свету, и эти процессы могут быть свя-заны с фотосинтезом или с дыханием, для которого в последние годы показано наличие реакций, активируемых светом.

Пул АК в растениях определяется одновременно идущими процессами био-синтеза и использованием АК во многих процессах, в том числе и связанных с обоими энергодающими процессами - фотосинтезом и дыханием. Так, показано, что уровень АК на свету, с одной стороны, зависит от функционального состоя-ния пластоцианина и Р700. С другой стороны, он зависит от активности дыха-тельных ферментов - ферментов, окисляющих АК: аскорбатоксидазы, полифе-нолоксидазы, цитохромоксидазы и пероксидазы. Три первых фермента у зеле-ных проростков ингибируются светом, пероксидаза - активируется. У дефицит-ных по зеленым пигментам и альбиносных проростков свет активирует все вы-шеуказанные ферменты, поэтому одним из факторов, определяющих светозави-симое накопление АК у нормально пигментированных растений, является инги-бирование светом большинства ферментов, ее окисляющих.

Говоря о действии света на биосинтез АК, нужно иметь в виду не только опосредованное его влияние через фотосинтез, дающий субстрат для образова-ния АК, но и непосредственное его действие в процессе образования молекулы АК из глюкозы или галактозы. Одной из таких реакций может быть фотовосста-новление предшественника АК [343] или активирование светом l-гулоно-γ-лактон дегидрогеназы, катализирующей последнюю ступень биосинтеза АК и являющейся флавинсодержащим ферментом.

Фонд АК в растениях на свету может пополняться не только за счет новооб-разования АК, но и путем фотовосстановления ДАК в АК в хлоропластах. Оста-ется неясным, возможно ли восстановление ДАК за счет восстановителя, обра-

106

зующегося в процессе окислительного фосфорилирования. Следовательно, уро-вень АК в растениях будет зависеть от направленности процессов в системе АК↔ДАК. В связи с этим, характеризуя содержание АК в растениях, и особенно метаболизм данного соединения, необходимо одновременно анализировать со-держание не только АК и ДАК, но и ДКГК, образующейся при необратимой трансформации ДАК в результате разрыва ее лактонового кольца. ДКГК расте-ний практически не исследована, хотя это соединение начинает привлекать к себе внимание благодаря выявленному противоопухолевому его действию [450].

Таким образом, содержание АК в растениях определяется многими одновре-менно идущими процессами (рис. 30), и регуляция ее накопления требует согла-сованной их работы. Это имеет место не только при нормальном функциониро-вании растений, но и в стрессовых условиях, которые обычно сопровождаются усилением биосинтеза и использования АК. Познание регуляторных механизмов обменных процессов вообще, и в частности регуляции биосинтеза физиологиче-ски активных соединений, таких, как АК, является актуальным для физиологии растений в связи с перспективой биотехнологического использования расти-тельных объектов с целью получения важных для народного хозяйства метабо-литов.

Фотосинтез Пероксидаза

Глюкоза НАДФН · Н+ Цитохром-

Биосинтез АК оксидаза Полифенол- α-кето- оксидаза глуторат Аскорбат- оксидаза НАДФН · Н+ Пул АК ДАК ДКГК Изоцит- Орг. рат к-ты Пируват Фотовосстанов- ление в хлоро- ЦТК Гликолиз пластах Г-SH ОПФП НАДФ · Н+ ГS-SГ

Рис. 30. Процессы, формтирующие пул АК в зеленых проростках ячменя, активируемые ( ) и ингибируемые ( ) светом

Условные обозначения: Г-SH - глютатион восстановленный; ГS-SГ - глютатион окисленный; Орг. к-ты - органические кислоты: янтарная и α-кетоглутаровая

107

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Аксенова О.Ф. // Уч. зап. Томского ун-та. 1960. № 36. С. 219-228. 2. Алиева З.Н. // Уч. зап. Азербайджанского ун-та. 1973. № 4. С. 71-75. 3. Алиева З.Н. // Уч. зап. Азербайджанского ун-та. Сер. биол. наук. 1975. № 2. С.62-

65. 4. Андрейчева М., Байлов Д. // Изв. Ин-та растениевъдства Бълг. АН. 1959. Кн. 8. С.

79-87. 5. Астафурова Т.П., Верхотурова Г.С., Волкова О.В. и др. Вопросы взаимосвязи

фотосинтеза и дыхания / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1988. С. 30-36. 6. Бабаян Р.С., Геворкян А.М., Айрапетян Р.Б. и др. // Физиология растений. 1975.

Т. 22. № 3. С. 484-489. 7. Бил. Д., Ноулз Д. Внеядерная наследственность. М.: Мир, 1981. 168 с. 8. Бохински Р. Современные воззрения в биохимии. М., 1987. 543 с. 9. Букин В.Н. // Биохимия витаминов. М., 1982. С. 107. 10. Бунаков В.А. // Биол. науки. 1960. № 2. С. 144-147. 11. Бухов Н.Г., Воскресенская Н.П. // Физиология растений. 1986. № 4. Т. 33. С.692-

698. 12. Верхотурова Г.С. // Труды НИИ биологии и биофизики при Томском ун-те.

1977. № 8. С. 134-139. 13. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.Н. // Вопросы биологии. Томск, 1978. С. 77-82. 14. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. // Физиология растений. 1983. Т. 30. № 3.

С.580. 15. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Дудина Е.В. // Фотосинтез и продуктив-

ность растений / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1987. С. 39-44. 16. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Кудинова Л.И. // Вопросы взаимосвязи

фотосинтеза и дыхания / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1988. С. 19-29. 17. Верхотурова Г.С., Кудинова Л.И., Астафурова Т.П. // Физиология растений.

1987. Т. 33. № 2. С. 261-265. 18. Воскресенская Н.П. // Тр. Ин-та физиологии растений АН СССР. 1953. Т. 8.

№ 1. С. 42-55. 19. Воскресенская Н.П. Фотосинтез и спектральный состав света. М.: Наука, 1965.

311 с. 20. Воскресенская Н.П. // Фоторегуляция метаболизма и морфогенеза растений /

Отв. ред. А.Л. Курсанов, Н.П. Воскресенская. М., 1975. С. 16-36. 21. Воскресенская Н.П., Мажуль М.М. // Физиология растений. 1976. Т. 23. № 3.

С.483-489. 22. Врублевская К.Г. // Уч. зап. Томского ун-та. 1962. № 44. С. 199-207. 23. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по фи-

зиологии растений. М.: Высшая школа, 1975. 392 с. 24. Гапоненко В.И., Николаева Г.Н., Куперман Н.И. // Ботаника. Исследования.

1982. №24. С. 176-183. 25. Гордон Л.Х., Голубев А.И. // Физиология растений. 1976. Т. 23. № 1. С. 107-110. 26. Гофман Э. Динамическая биохимия. М.: Медицина, 1971. 311 с. 27. Гродзинский А.М. // Укр. ботанiчний журн. 1973. Т. 30. № 1. С. 28-35. 28. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: В 2 т. М.: Мир, 1986.

Т. 1. 392 с.

108

29. Гуликова О.М., Зайцева Г.Н. // Успехи современной биологии. 1984. Т. 97. № 2. С. 208-224.

30. Гусев М.В., Карташова Е.Р., Руденская Г.Н. и др. // Тезисы Междунар. симпоз. "Регуляция метаболизма первичных и вторичных продуктов фотосинтеза". Пущино, 1983. С. 65-66.

31. Гэйл Э., Кандлифф Э., Рейнолдс П. и др. Молекулярные основы действия анти-биотиков. М.: Мир, 1975. 500 с.

32. Девятнин В.А. // Биохимия. 1950. Т. 15. № 4. С. 323-329. 33. Девятнин В.А. // Тр. Всесоюз. науч.-исслед. витаминного ин-та. 1953. № 4.

С.128-131. 34. Девятлин В.А. // Тр. Ботан. ин-та АН СССР. 1959. Сер. 6. Вып. 7. С. 345-360. 35. Джеймс В. Дыхание растений. М. Изд-во ИЛ, 1956. 439 с. 36. Дымарский А.А. // Сб. тр. Харьковского вет. ин-та. 1958. № 23. С. 147-150. 37. Дымарский А.А., Артюх Е.И. // Ветеринария. 1958. № 8. С. 77-78. 38. Евстигнеев В.Б., Гаврилова В.А. // Докл. АН СССР. 1971. Т. 200. № 3. С. 725-

728. 39. Егоров А.Д. Витамин С и каротин в растительности Якутии. Якутск, 1954.

248 с. 40. Зайцева Т.А., Врублевская К.Г., Шапиро Т.Е. и др. // Физиолого-биохимическо-

го механизмы регуляции адаптационных реакций растений и агрофитоценозов: Мат-лы Всесоюз. симп. Кишинев, 1984. С. 133-134.

41. Захарова Н.М., Шубин В.В., Бухов Н.Г. и др. // Биофизика. 1982. Т. 27. № 4. С. 572-577.

42. Землянухин А.А. // Бюл. общ-ва естествоиспыт. при Воронежском ун-те. 1955. № 9. С. 19-22.

43. Землянухин А.А. // Физиология растений. 1956. Т. 3. № 4. С. 313-319. 44. Землянухнн А.А. // Физиология растений. 1964. Т. 11. № 6. С. 1047-1055. 45. Землянухин А.А. Регуляторы роста растений. Воронеж, 1964. С. 104-118. 46. Землянухин А.А. Физиологическая роль аскорбиновой кислоты и кислот три-

карбонового цикла в растениях: Дисс... д-ра биолог. наук. Воронеж, 1964. 501 с. 47. Зёдинг Г. Ростовые вещества растений. М., 1955. 388 с. 48. Золотухин И.Г., Лисовский Г.М., Баянова Ю.И. // Физиология и биохимия куль-

турных растений. 1979. Т. 11. № 2. С. 141-146. 49. Зубкова Е.К., Филиппова Л.А., Мамушина Н.С., Чупахина Г.Н. // Физиология

растений. 1988. Т. 35. Вып. 2. С. 254-259. 50. Иванов Б.Н., Шмелева В.Л., Пигулевская Т.К. // Физиология растений. 1984. Т.

31. № 2. С. 273-280. 51. Канивец Н.П., Волкова Н.В., Василёнок Л.И. и др. // Докл. АН УССР. 1980. Б.

№ 8. С. 37-39. 52. Карабанов Ю.В. // Тр. Житомирской науч.-исслед. селекц. ст. хмелеводства.

1959. Вып. 6. С. 211-215. 53. Карначук Р.А. // Физиология растений. 1987. Т. 34. № 4. С. 765-773. 54. Карначук Р.А., Постовалова В.М. // Всесоюз. совещ.: “Энергетика, метаболиче-

ские пути и их регуляция в фотосинтезе”. Тез. докл. Пущино, 1981. С. 24-25. 55. Карначук Р.А., Протасова Н.Н., Добровольский М.В. и др. // Физиология расте-

ний. 1987. Т. 34. № 1. С. 51-59. 56. Карпилов Ю.С., Керимов С.Х., Новицкая И.Л. и др. // Физиология и биохимия

культурных растений. 1978. Т. 10. № 5. С. 499-506.

109

57. Карпилов Ю.С., Опарина Л.А., Кузнецова Л.Г. и др. // Физиология и биохимия культурных растений. 1977. Т. 9. № 1. С. 93-99.

58. Колек Ю., Овчаров К.Е. Физиология растений. 1963. Т. 10. № 1. С. 84-89. 59. Колесников П.А., Эйнор Л.О. // Биохимия. 1964. Т. 29. № 3. С. 402-407. 60. Колотилова А.И., Глушанков Е.П. Витамины. Химия, биохимия и физиологиче-

ская роль. Л., 1976. 247 с. 61. Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности. М., 1986. 144 с. 62. Красновский А.А. // Докл. АН СССР. 1950. Т. 73. № 6. С.1239-1242. 63. Красновский А.А. // Докл. АН СССР. 1955. Т. 103. № 2. С.283-286. 64. Красновский А.А. // Фоторегуляция метаболизма и морфогенеза растений / Отв.

ред. А.А. Курсанов, Н.П. Воскресенская. М., 1975. С. 5-15. 65. Красновский А.А., Войновская К.К. // Биофизика. 1956. Т. 1. № 2. С. 120-126. 66. Красновский А.А., Умрихина А.В. // Докл. АН СССР. 1958. Т. 122. № 6. С.1061-

1064. 67. Красинский Н.П., Валутина В.А., Пряхина-Конькова Е.А. и др. // Физиология

растений. 1955. Т. 2. № 1. С. 62-69. 68. Кротов Е.Г. // Тр. Одесского технолог. ин-та пищевой и холодильной промыш-

ленности. 1955. № 6. С. 89-97. 69. Кудряшов Б.А. Биологические основы учения о витаминах. М.: Советская нау-

ка, 1948. 543 с. 70. Кузнецова-Зарудная Т.Н. // Проблема витаминов. Л., 1937. № 2. С. 57-80. 71. Лемеза Н.А. // Вестник Белорусского университета. 1981. Т. 2. № 1. С. 48-52. 72. Лемпицкий Л.П., Александрова Н.М. // Флористические исследования и зеленое

строительство на Кольском полуострове. Апатиты, 1975. С. 124-129. 73. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1974. 957 с. 74. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 2. 731 с. 75. Лимарь Р.С., Сахарова О.В. // Методы комплексного изучения фотосинтеза /

Отв. ред. О.Д. Быков. Л., 1973. Вып. 2. С. 260-267. 76. Липсиц Д.В. // Биохимия. 1958. Т. 23. № 4. С. 592-600. 77. Львов С.Д., Гуцевич Г.К., Пантелеев А.Н. // Уч. зап. Ленинградского ун-та. Сер.

биол. наук. 1945. № 75. Вып. 15. С. 48-79. 78. Мазурова Т.А. // Вестн. Ленинградского ун-та. 1973. № 21. С.89-94. 79. Малиновская Г.А. // Фотосинтез и продуктивность растений / Отв. ред.

М.М. Окунцов. Калининград, 1987. С. 49-52. 80. Мамушина Н.С., Филиппова Л.А., Зубкова Е.К. // Вопросы взаимосвязи фото-

синтеза и дыхания / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1988. С. 5-18. 81. Мартынова Т.Б., Максютова Н.Н., Тарчесский И.А. и др. // Физиология и био-

химия культурных растений. 1985. Т. 17. № 6. С. 539-543. 82. Меркис А.И. // Тр. АН Лит. ССР. 1959. Т. Б 3. № 19. С. 123-142. 83. Механик Ф.Я. // Ботанический журнал. 1952. № 1. С. 71-74. 84. Мецлер Д. Биохимия. М.: Мир, 1980. Т. 2. 606 с. 85. Мецлер Д. Биохимия. М.: Мир, 1980. Т. 3. 488 с. 86. Митев И.П., Белева-Стайкова Р. // I, II. Съобщ. Сб. тр. Висш. мед. ин-т. Плов-

див, 1958-1959. № 12. С. 81-88. 87. Могилева Г.А., Сахарова О.В., Зеленский М.И. // Труды по прикладной ботани-

ке, генетике и селекции. 1978. Т. 61. № 3. С. 111-118. 88. Моисеева М.Н. // Ботанический журн. 1961. Т. 46. № 9. С. 1339-1342.

110

89. Мор Г. // Теоретические основы фотосинтетической продуктивности / Отв. ред. А.А. Ничипорович. М., 1972. С. 323-343.

90. Мутускин А.А. // Известия АН СССР. Сер. биологич. 1970. № 5. С. 698. 91. Нечаева Е.П. // Уч. зап. Пермского пед. ин-та. 1974. № 124. С. 19-25. 92. Ничипорович А.А. // Тр. V Междунар. биохимического конгресса. Симпозиум

VI. М., 1962. С. 21-28. 93. Новак В.А., Миклашевич А.И. // Изв. АН СССР. Сер. биологич. 1985. № 6.

С.944-948. 94. Норбаев Н. // Радиобиология. 1975. № 3. С. 467-469. 95. Овчаров К.Е. Роль витаминов в жизни растений. М.: Изд-во АН СССР, 1958.

286 с. 96. Овчаров К.Е. Витамины растений. М.: Колос, 1969. 328 с. 97. Окунцов М.М., Верхотурова Г.С. // Биологические науки. 1971. № 10. С. 76-81. 98. Окунцов М.М., Котлярова Г.Н. // Вопросы фотосинтеза / Отв. ред. М.М. Окун-

цов. Томск, 1964. Вып. 1. С. 34-68. 99. Окунцов М.М., Плотникова А.Н. // Вопросы фотосинтеза / Отв. ред. М.М.

Окунцов. Томск, 1970. № 2. С. 218-224. 100. Окунцов М.М., Фролова Н.М. // Вопросы фотосинтеза / Отв. ред. М.М. Окун-

цов. Томск, 1964. Вып. 1. С. 5-33. 101. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. // Информ. бюл. СО АН СССР. Иркутск. 1968.

Вып. 3. С. 97-98. 102. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. // Вопросы фотосинтеза / Отв. ред. М.М. Окун-

цов. Томск. 1970. № 2. С 96-110. 103. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. // Биологические науки, 1970. № 7. С. 88-94. 104. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. // Биологические науки. 1972. № 10. С. 74-77. 105. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. // Специальный практикум по биохимии и фи-

зиологии растений. Калининград, 1981. С. 11-14. 106. Окунцов М.М., Карначук Р.А., Фролова Н.М. // Биологические науки. 1971.

№4. С. 78-82. 107. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н., Дубовик Е.Е. // Вопросы фотосинтеза. / Отв.

ред. М.М. Окунцов. Томск, 1970. Вып. 2. С. 111-123. 108. Окунцов М.М., Роньжина О.А., Симонова Е.И. и др. Физиология питания, рос-

та и устойчивости растений // Труды 1 конф. физиологов и биохимиков растений Сиби-ри и Дальнего Востока. М., 1963. С. 99-103.

109. Окунцов М.М., Роньжина О.А., Симонова Е.И., Чупахина Г.Н. // Вопросы фо-тосинтеза / Отв. ред. М.М. Окунцов. Томск, 1970. № 2. С. 124-136.

110. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н., Старченко Г.Ф. и др. // Биологические науки. 1974. № 5. С. 81-86.

111. Парибок Т.А. // Сб. трудов по агрономической физике. М., 1962. № 2. С. 137-144.

112. Пересыпкин В.Ф., Кирин Н.Н., Кошевский И.И. // Вестник сельскохозяйствен-ной науки. 1977. № 8. С. 25-31.

113. Петроченко Е.И., Колесников П.А. // Биохимия. 1961. Т. 26. № 4. С. 701-707. 114. Петрухин Ю.А., Степанова С.П. // Биологические науки. 1979. Т. 185. № 5.

С.89-91. 115. Поволоцкая К.Л. // Проблемы витаминов. 1937. Вып. 2. С. 29-57. 116. Полинг Л. Витамин С и здоровье. М., 1974. 80 с. 117. Полищук Л.К. // Вiсник Київськ. ун-ту. Сер. биол. 1962. Т.5. № 1. С. 33-41.

111

118. Полищук Л.К. // Физиология и биохимия культурных растений. 1970. Т. 2. №5. С.198-203.

119. Пономарева В.С. // Бюл. Гл. ботан. сада АН СССР. 1965. Вып. 59. С. 48-53. 120. Постовалова В.М., Карначук Р.А., Прохорова Е.В. // Физиология растений.

1984. Т. 31. № 4. С. 752-757. 121. Прохорчик Р.А., Чупахина Г.Н. // Тезисы докладов пятого Всесоюзного сим-

позиума по фенольным соединениям. Таллин, 1987. С. 120. 122. Проценко Д.Ф. // Рост и устойчивость растений. 1967. № 3. С. 215-222. 123. Рабинович Е. Фотосинтез. Т. 2. М., 1953. 652 с. 124. Ракитина Т.Я. // Доклады АН СССР. 1987, Т. 292. № 4. С. 1020-1024. 125. Рахманкулова 3.Ф. // Тр. 17 научн. конф. молодых ученых биол. фак. МГУ

"Проблемы современной биологии". М., 1986. С. 66. 126. Рзаев Н.Д. // Тр. Азерб. науч.-исслед. ин-та земледелия. 1966. Т. 13. С. 279-285. 127. Роговин В.В., Муравьев Р.А., Акимов Б.С. и др. // Физиология раст. 1987. Т.34.

№6. С. 1181-1186. 128. Рожковский А.Д., Бухов Н.Т., Воскресенская Н.П. // Физиология растений.

1985. Т. 32. № 6. С. 1046-1054. 129. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганиз-

мов. М., 1980. 159 с. 130. Рощина В.В. // Биохимия. 1979. Т. 44. № 3. С. 477-481. 131. Рощина В.В., Акулова Е.А. // Физиология растений. 1975. Т. 22. № 3. С. 471-

478. 132. Рощина В.В., Мутускин А.А. // Успехи биологической химии. М., 1983. Т. 24.

С. 214-232. 133. Рубин Б.А., Гавриленко В.Ф. Биохимия и физиология фотосинтеза. М.: Изд-во

Моск. ун-та, 1977. 326 с. 134. Рубин Б.А., Ладыгина М.Е. Физиология и биохимия дыхания растений. М.:

Изд-во Моск. ун-та, 1974. 512 с. 135. Рубин Б.А., Воронков Л.А., Живописцева И.В. // Докл. АН СССР. 1970. Т.190.

№ 6. С. 1483-1485. 136. Рубин Б.А., Чернавина И.А., Кренделева Т.Е. // Докл. АН СССР. 1962. Т. 147.

№ 1. С. 240-243. 137. Рубин Б.А., Чернавина И.А., Кренделева Т.Е. // Физиология растений. 1965.

Т.12. Вып. 2. С. 204-209. 138. Рубин Б.А., Арциховская Е.В., Спиридонова Н.С. и др. // Биохимия. 1939. Т. 4.

№ 3. С. 260-268. 139. Рубцова М.С., Кузнецова Т.Н. // Тр. Горьковского сельскохозяйственного ин-

та. 1976. Т. 91. С. 30-47. 140. Садыков А.С., Гусева Д.М. // Докл. АН УзССР. 1954. № 3. С. 31-34. 141. Самородова-Бианки Г.Б. // Физиология растений. 1965. Т. 12. № 2. С. 210-215. 142. Семененко Т.Н. // Биологические науки. 1962. № 4. С. 124-128. 143. Семихатова О.А., Заленский О.В. Физиология фотосинтеза. М.: Наука, 1982. С.

130-145. 144. Сергеев Л.И., Загидуллина Л.Н. // Витаминные растительные ресурсы и их ис-

пользование. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1977. С. 348-350. 145. Сидоренко I.Д. // Наук. працi. Кам'янець-Подiльськ. с лiськогоспод. iн-т. 1961.

№ 4. С. 12-18. 146. Симонова Е.И. // Физиология растений. 1987. Т. 34. № 4. С.758-764.

112

147. Скофенко А.О. // Наук. зап. Киёвськ. ун-та. 1957. Т. 16. № 1. С. 165-174. 148. Смирнов А.М., Овчаров К.Е. // Физиология растений. 1960. Т. 7. № 2. С. 240-

242. 149. Соболева Г.А., Бокучава М.А. // Успехи биологической химии. 1978. Т. 19.

С.209-225. 150. Солдатенков С.В. Биохимия органических кислот растений. Л.: Изд-во Ле-

нингр. ун-та, 1971. 142 с. 151. Спиридонова Н.С. // Физиология растений. 1965. Т. 12. № 2. С. 340-341. 152. Спиридонова Н.С. Аскорбиновая кислота в растениях. Свердловск: Средне-

Уральское книжное изд-во, 1968. 80 с. 153. Старцева А.В., Васильева В.Н. // Физиология водообмена и устойчивости раст.

Казань, 1972. Вып. 2. С. 74-78. 154. Степанова Ф.П., Самородова-Бианки Г.Б. // Тр. по прикладной ботанике, гене-

тике и селекции. 1981. Т. 70. № 3. С. 94-101. 155. Сэджер Р. Цитоплазматические гены и органеллы. М., 1975. 423 с. 156. Теренин А.Н. Фотохимия красителей и родственных органических соедине-

ний. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1947. 350 с. 157. Толибеков Д.Т. // 4 конф. биохимиков респ. Сред. Азии и Казахстана: Тез.

докл. Ашхабад, 1986. С. 307-309. 158. Труфанов А.В. Биохимия в физиология витаминов и антивитаминов. М.: Изд-

во сельхоз. лит-ры, 1959. 654 с. 159. Тульчинская К.С. // Тр. Всесоюз. конф. по витаминам. М., 1940. С. 62-63. 160. Федорова В.С. // Изв. Восточных филиалов АН СССР. 1957. № 7. С. 119-121. 161. Филиппова Л.А., Мамушина Н.С., Зубкова Е.К. и др. // Физиология растений.

1986. Т. 33. № 1. С. 66-73. 162. Франке Г., Хаммер К., Ханельт П. И др. Плоды земли. М.: Мир, 1979. 270 с. 163. Хавкин Э.Е. Формирование метаболических систем в растущих клетках расте-

ний. Новосибирск, 1977. 221 с. 164. Христин М.С., Акулова Е.А. // Докл. АН СССР. 1975. Т. 223. № 3. С. 758-761. 165. Христин М.С., Таукелева Ш.Н., Акулова Е.А. и др. // Сельскохозяйственная

биология. 1981. Т. 16. № 3. С. 407-411. 166. Чайлахян М.Х. // Докл. АН СССР. 1959. Т. 3. № 4. С.894-897. 167. Чернавина И.А. // Проблемы фотосинтеза: Доклады II Всесоюз. конф. по фото-

синтезу. М., 1959. С. 198-203. 168. Чикалова Е.А. // Витамины. Киев, 1959. Вып. 4. С. 206-208. 169. Чиркова Т.В. // Уч. зап. Тартуск. ун-та. 1966. Вып. 185. С. 290-294. 170. Читанова Г.В. // Тр. Сухум. ботан. сада. 1982. № 27. С. 49-56. 171. Чупахина Г.Н. Влияние света различного спектрального состава на биосинтез

АК в листьях растений. Дисс... канд. биолог. наук. Томск, 1967. 197 с. 172. Чупахина Г.Н. // Специальный практикум по биохимии и физиологии расте-

ний. Калининград, 1981. С. 17-20. 173. Чупахина Г.Н. // Тез. Всесоюз. симпозиума "Связь метаболизма углерода и

азота при фотосинтезе". Пущино, 1985. С. 88-89. 174. Чупахина Г.Н., Немирюк Л.В. // Физиология растений. 1984. Т. 31, № 4. С.

780-783. 175. Чупахина Г.Н., Савкина В.В. // Тез. Всесоюз. конф. "Проблемы фотоэнергети-

ки растений и повышение урожайности". Львов, 1984. С. 70-71.

113

176. Чупахина Г.Н., Свеженцева С.В. // Тез. докл. XXI науч. конф. Калининград-ского ун-та. Калининград, 1989. С. 105.

177. Чупахина Г.Н., Залящева М.В., Сивцова А.М. // Тез. Всесоюз. конф. "Пробле-мы фотоэнергетики растений и повышение урожайности". Львов, 1984. С. 69-70.

178. Чупахина Г.Н., Залящева М.В., Сивцова А.М. // Фотосинтез и продуктивность растений. / Отв. ред. М.М. Окунцов. Калининград, 1987. С. 33-39.

179. Чупахина Г.Н., Хлебодарова Т.Л. // Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыха-ния / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1988. С. 117-120.

180. Чупахина Г.Н., Брычева Н.А., Просекова Е.А. // Тр. V Всесоюз. межуниверсит. конф. "Биология клетки". Тбилиси, 1987. Ч. 1. С. 387-388.

181. Чупахина Г.Н., Окунцов М.М., Архипова Н.Д. // Физиология растений. 1978. Т. 25. № 6. С. 1179-1184.

182. Чупахина Г.Н., Христин М.С., Кузнецова Л.Г. // Физиология и биохимия куль-турных растений. 1985. Т. 17. № 5. С. 444-448.

183. Шатилов И.С., Розов Н.Ф., Клюкова В.А. // Изв. Тимирязевской с.-х. акад. 1973. № 1. С. 9-16.

184. Школьник М.Я., Стеклова М.М. // Тр. Ботан. ин-та АН СССР. 1958. Т. 4. № 12. С. 242-256.

185. Шлык А.А., Аверина Н.Г. // Физиология растений. 1973. Т. 20, № 4. С. 725-732. 186. Шматок Д.И. // Вопросы ботаники и почвоведения в Мурманской области".

М.; Л., 1962. С. 82-117. 187. Щербаков Б.И. // Докл. АН СССР. 1949. Т. 66. № 6. С. 1149 - 1152. 188. Юрова Г.Г. Свободная и связанная аскорбиновая кислота в сортах основных

плодово-ягодных культур Алтая: Автореф. дис... канд. биолог. наук. Томск, 1964. 23 с. 189. Юзбеков А.К., Магомедов И.М. // Вестн. Ленинград. ун-та. 1981. № 5. Сер.

биолог. Вып. 3. С. 91-94. 190. Явигиев Б.Г. Автоматизированный анализ колебательных процессов, возни-

кающих в растениях при колебательном возбуждении их светом. // Биофизика. М., 1987. 31 с. Деп. в ВИНИТИ 12.06.87., № 4292-В87.

191. Ядыкин А.А., Титлянов Э.А. // Биология моря. 1980. № 3. С. 74-79. 192. Aberg B. // Ann. Roy. Agr. Coll. Sweden. 1945. N 13. P. 239-273. 193. Aberg B. // Kgl. lantbrukshogs Kol. ann. 1953. Ann. 20. P. 125-138. 194. Abraham P.G., Dave J.C., Saxena O.P., Pandya R.B. // J. Indian Bot. Soc. 1970.

Vol. 49. N 1-4. P. 41-49. 195. Acatrinei G., Acatrinei C. // An. Stiint. Univ. Jasi. 1964. Sec. 2a. Vol. 10. N 1. P.

31-36. 196. Acton G.J., Drumm H., Mohr H. // Planta. 1974. Vol. 121. N 1. P. 39-50. 197. Akao A. // Nihon Univ. Med. J. 1958. Vol. 17. N 9. P. 1689-1699. 198. Aliotta G. // G. bot. ital. 1980. Vol. 114. N 5. P. 217-226. 199. Allen I.F., Hall D. // Biochem. and Biophys. Res. Commus 1973. Vol. 52. N 3.

P.856-862. 200. Alscher R.G. // Physiol. plant. 1989. Vol. 77. N 3. P. 457-464. 201. Anderson L.E. // Adv. Bot. Res. 1986. Vol. 12. P. 1-46. 202. Andrews I.E., Roberts D.W.A. // Canad. I. Bot. 1961. Vol. 39. N 3. P 503-512. 203. Arnon D.J., Whatley F.R., Allen M.B. // J. Amer. Chem. Soc. 1954. Vol. 76. N 24.

P. 6324-6329. 204. Arnon D.J., Whatley F.R., Allen M.B. // Biochim. Biophys. Acta. 1956. Vol. 20.

P.449-461.

114

205. Arrigoni O. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis. mat. e natur. 1957. T. 22. N 1. P. 77-84.

206. Arrigoni O., Arrigoni-Liso R., Calabrese G. // Science. 1976. Vol. 194. N 4262. P.332-333.

207. Arrigoni O., Arrigoni-Liso R., Calabrese G. // FEBS Lett. 1977. Vol. 82. N 1. P.135-138.

208. Arrigoni O., Zacheo G., Arrigoni-Liso R., B1eve-Zacheo T., Lamberti F. // Phytopa-thology. 1979. Vol. 69. N 6. P. 579-581.

209. Asselbergs E.A.M. // Plant physiology. 1957. Vol. 32. N 4. P. 326-329. 210. Attridge T.H. // Biochimica et Biophysica Acta. 1974. Vol. 362. N 3. P. 258-265. 211. Bakardjieva N.T. // The Reports of the Bulgarian Academy of Sciences. 1977.

Vol. 30. N 11 P. 1637-1640. 212. Bakardjieva N.T., Nikolova R. // The Reports of the Bulgarian Academy of Sci-

ences. 1988. Vol. 41. N 5. P. 101-104. 213. Bannister T.T. // Plant Physiol. 1959. Vol. 34. N 3. P. 246-254. 214. Bar-Akiva A., Sternbaum J. // Physiol. plantarum. 1966. Vol. 19. N 2. P. 422-428. 215. Barro F., Haba P., Maldonado J.M., Fontes A.G. // J. Plant. Physiol. 1989. Vol. 134.

N 5. P. 586-591. 216. Baszynski T. // Zesz. nauk. UJ. Pr. biol. mol. 1982. N 9. P. 47-59. 217. Beig M.M., Kelly S., Loewus F. // Plant Physiol. 1970. Vol. 46. N 2. P. 277-280. 218. Bhatt K.C., Vaishnav P.P., Singh Y.D., Chinoy J.J. // Ann. Bot. 1981. Vol. 47. N 3.

P. 321-328. 219. Bienger J., Schopfer P. // Planta. 1970. Bd. 93. N 2. S. 152-159. 220. Bogdanski K.A., Bogdanska H.W. // Bull. Acad. polon. Sci. Ser. Sci. biol. 1962.

T.10. N 8. S. 291-296. 221. Bohme H., Trebst A. // Biochim. et biophys. acta. 1969. Vol. 180. N 1. P. 137-148. 222. Bourqe D.P., McMillan P.N., Clingenpeel W.J., Naylor A.W. // Bot. Gaz. 1976.

Vol. 137. N 3. P. 279-284. 223. Bufler G., Bangerth F. // Plant Sci. Lett. 1982. Vol. 25. N 2. P. 227-237. 224. Castillo F.J., Celardin F.G.H. // Plant Growth Regul. 1984. Vol. 2. N 2. P. 69-75. 225. Chameldes W.Z. // Enviren. Sci. and Technol. 1989. Vol. 23. N 5. P. 595-600. 226. Chaturvedi N., Laloraya M.M. // Physiol. plant. 1984. Vol. 60. N 3. P. 315-320. 227. Chen Pin-Ching, Arnon D.J. // Physiol. veg. 1983. Vol. 21. N 3. P. 415-427. 228. Chia-Ping H. Yang // Biol. plant. 1982. Vol. 24. N 4. P. 296-302. 229. Chichiricco G., Ceru M.P., D'Alessandro A., Oratore A., Avigliano L. // Plant Sci.

1989. Vol. 64. N 1. P. 61-66. 230. Chinoy J.J., Singh Y.D. // Indian Agr. 1971. Vol. 15. N l-2, P. 33-48. 231. Chinoy J.J., Saxena O.P. // Proc. Jnt. Seed Test. Assoc. 1972. Vol. 37. N 3. P. 903-

910. 232. Chow W.S., Hachnel W., Anderson J.M. // Physiol. plant. 1987. Vol. 70. N 2. P.196-

202. 233. Clark W.G. // Bot. Gaz. 1937. Vol. 99. N 1. P. 116-124. 234. Cramer W.A., Whitrmarsh J., Widger W. // 5th Int. Congr. Photosynth., Halkidiki,

1980. Abstr. S. 1., s. a. P. 130. 235. Demirovska-Kepova K.N., Bakardjieva N.T., Georgiev G.H., Georgiev H.N.,

Gechov K.I. // The Reports of the Bulgarian Academy of Sciences. 1983. Vol. 36. N 1. P. 125.

236. Dhar A.C., Patel K.R., Shah C.K. // Histochemistry. 1980. Vol. 69. N 1. P. 101-109.

115

237. Dilova S., Popov K. // The Reports of the Bulgarian Academy of Sciences. 1970. Vol. 23. N 6. P. 735-738.

238. Drumm H., Bruning K., Mohr H. // Planta. 1972.. Vol. 106. N 3. P. 259-267. 239. El-Fouly M.M. // Ber. Dtsch. bot. Ges. 1965. Bd. 78. N 11. S. 75-82. 240. Esterbauer H., Grill D., Welt R. // Z. Pflanzenphysiol. 1980. Bd. 98. N 5. S. 393-

402. 241. Euler H. // Qualitas plant. et mater. veget. 1958. N 3-4. S. 157-160. 242. Filner P., Wray J.L., Vanner J.E. // Science. 1969. Vol. 165. N 3891. P. 358-367. 243. Foyer C., Rowell J., Walker D. // Planta. 1983. Vol. 157. N 3. P. 239-244. 244. Franke W. // Planta. 1955. Bd. 45. N 2. S. 166-197. 245. Franke W. // Ber. Dtsch. bot. Ges. 1957. Bd. 70. N 7. S. 297-304. 246. Franke W. // Planta. 1959. Bd. 53. N 6. S. 551-564. 247. Franke W. // Ber. Dtsch. bot. Ges., Sondernummer. 1964. Bd. 77. S. 143-145. 248. Freebairn H.T. // Physiol. plantarum. 1963. Vol. 16. N 3. P. 517-522. 249. Fuchtbauer W., Simonis W. // Naturwissenschaften. 1958. Vol. 45. N 21. P. 519. 250. Fujimura K., Ikeda S. // Mem. Res. Inst. Food Sci., Kycto Univ. 1957. N 12. P. 38-

44. 251. Gardestrom P., Bergman A., Ericson I., Sahlstrom S. // 5th Int. Congr. Photosynth.,

Halkidiki, 1980, Abstr. S. L., s. a. P. 199. 252. Garg O.P., Kappor V. // J. Exp. Bot. 1972. Vol. 23. N 76. P. 699-703. 253. Garg O.P., Swaraj K. // Symp. Contr. Mech. Cell. Process., Bombay, 1973. Abstrs.

S. L., s. a. P. 67. 254. Gaspar Th. et al. Peroxidases. Geneve, 1982. P. 91-97, 109-112. 255. Geyer R.P., Kydol S., Ryan M. // Arch. Biochem. and Biophys. 1957. Vol. 70. N 1.

P. 129-140. 256. Goldberg R., Kevers C., Gaspar T. // Biochem. und Physiol. Pflanz. 1989. Bd. 184.

N 1-2. S. 155-161. 257. Gottel W., Hallstein H. // Prax. Naturwiss. Chem. 1980. Bd. 29. N 10. S. 295-304. 258. Grill D., Esterbauer H., Welt R. // Phyton. 1980. Bd. 20. N 3-4. S. 251-259. 259. Grimme L.H., Lorenz E. // 5th Int. Congr. Photosynth., Halkidiki, 1980. Abstr. S. L.,

s. a. P. 228. 260. Grimstad Svein O. // Meld. Norg. landbruns-hogst. 1982. Vol. 61. N 3. P. 1-25. 261. Grise-Miron L., Brakier-Gingras L. // Eur. J. Biochem. 1982. Vol. 123. N 3. P. 643-

646. 262. Grob. K., Matile P. // Z. Pflanzenphysiol. 1980. Vol. 98. N 3. P. 235-243. 263. Gross E.L. // Arch. Biochem and Biophys. 1979. Vol. 195. N 1. P. 198-204. 264. Gutmanis K. // Tautsaimn. derigi augi. Riga, 1963. N 2. S. 103-112. 265. Haehnel W., Propper A., Krause H. // Biochim. et biophys. acta. 1980. Vol. 593.

N 2. P. 384-399. 266. Hagehe Ph. // C. r. Acad. Sci. 1958. Vol. 246. N 13. P. 2020-2023. 267. Hampp R., Goller M., Fullgraf H., Eberble I. // Plant Cell Physiol. 1985. Vol. 26.

N 1. P. 99-108. 268. Handell M. A., Mekellar P. // Photochem. and Photobiol. 1968. Vol. 7. N 2. P. 211-

224. 269. Hasapis X., MacLeod A. J. // Phytochemistry. 1982. Vol. 21. N 2. P. 291-296. 270. Heilinger F., Fischnich O., Breyhan Ò. // Landbauforsch. Volkenrode. 1961. Bd. 11.

N 3. S. 63-65. 271. Helsper J. P. F. G., Loewus F. A. // Plant Sci. 1985. Vol. 40. N 2. P. 105-109.

116

272. Helsper J. P. F. G., Saito K., Loewus F. A. // Planta. 1981. Vol. 152. N 2. P. 171-176.

273. Helsper J. P., Êàgàn L., Hilby Ñ. L., Maynard Ò. M., Frank A. // Plant Physiol. 1982. Vol. 69. N 2. P. 465-468.

274. Helsper J. P., Kagan L. H., Coral L., Maynard Ò. M., Loewus F. A. // Plant Physiol. 1982. Vol. 69. N 2. P. 465-468.

275. Helsper J. P., Kagan L., Hibby Ñ. L., Maynard Ò. M., Frank A. // Plant Physiol. 1982. Vol. 69. N 2. P. 465-468.

276. Henderson H. M., McEwen Ò. J. // Phytochemistry. 1972. Vol. 11. N 11. P. 3127-3133.

277. Hendry G. A. F., Houghton J. D., Jones Î. Ò. G. // Biochem. J. 1981. Vol. 196. N 3. P. 825-829.

278. Honda S. I. // Plant Physiol. 1957. Vol. 32. N 1. P. 23-31. 279. Horowitz I., Fabry E. M., Gerson Ñ. D. // Jama. 1976. Vol. 235. N 24. P. 2624-2625. 280. Horvath I., Feher I. V. // Acta bot. Acad. scient. hung. 1965. Vol. 11. N 1-2. P. 159-

164. 281. Huystee R. Â. // Annu. Rev. Plant Physiol. 1987. Vol. 38. P. 205-219. 282. Isherwood F. A., Mapson L. W. // Annals of the New York Academy of Sciences.

1961. Vol. 92. N 1. P. 6-20. 283. Isherwood F. A., Chen Y. Ò., Mapson L. W. // Biochem. J. 1954. Vol. 56. N 1. P. 1-

15. 284. lzumi H., Tatsumi Y., Murata T. // J. Jap-2 Soc. Food Sci. and Technol. 1984.

Vol. 31. N 11. P. 704-709. 285. Jabben M., Gerald F. D. // Photochem. and Photobiol. 1978. Vol. 27. N 6. P. 799-

802. 286. Jablonski P. P., Anderson J. W. // Plant Physiol. 1981. Vol. 67. N 6. P. 1239-1244. 287. Jackson G. A. D., Wood R. B., Prosser M. V. // Nature. 1961. Vol. 191. N 4785.

P.282-283. 288. Jain S. C., Nag T. N., Mohan S., Pushpa K. // Sci. and Cult. 1975. Vol. 41. N 6.

P.292-293. 289. Jensen W. A., Kavaljian L. G. // J. Biophys. and Biochem. Cytology. 1956. Vol. 2.

N 1. P. 87-92. 290. Jia Jing-Luan // J. Electron. Microsc. 1987. Vol. 35. N 4. P. 3279-3280. 291. Joshi A. K., Sharma N. S., Rathore K. S., Vaishnav P. P., Singh Y. D. // Biochem.

und Physiol. Pflanz. 1980. Bd. 175. N 3. S. 208-215. 292. Kalt-Torres M., Burke J. J., Anderson J. M. // Physiol plant. 1984. Vol. 61. N 2.

P.271-278. 293. Kenis J. D., Morlans J. D., Trippi V. S. // Physiol. Plant. 1989. Vol. 76. N 2. P. 216-

220. 294. Keul M. // Z. Pflanzenphysiol. 1976. Bd. 79. N 1. S. 40-52. 295. Khanna P., Khanna R., Sharma M. // Indian Exp. Riol. 1978. Vol. 16. N 1. P. 110-

112. 296. Klein R. M. //Plant Physiol. 1979. Vol. 63. N 1. P. 114-116. 297. Krstic B., Saric M. // Acta biol. et med. exp. 1986. Vol. 11. N 1. P. 29-34. 298. Kurihara K., Sukigara M., Toyoshima Y. // Biochim. et biophys. acta. 1979.

Vol. 547. N 1. P. 117-126. 299. Lazarovits G., Singh B. // Can. J. Bot. 1986. Vol. 64. N 8. P. 1675-1681. 300. Lee A. // Bull. Torrey Bot. Clud. 1955. Vol. 82. N 1. P. 1-8.

117

301. Lien S., San Pietro A. // Arch. Biochem. and Biophys. 1979. Vol. 194. N 1. P. 128-137.

302. Lino M., Carr D.J. // Plant Sci. Lett. 1981. Vol. 23. N 3. P. 263-268. 303. Liso R., Calabrese G., Chieppa M. //Phycologia. 1978. Vol. 17. N 2. P. 143-147. 304. Loewus F.A. // Annals of the New York Academy of Sciences. 1961. Vol. 92. N 1.

P. 57-78. 305. Loewus F.A. // Phytochemistry. 1963. Vol. 2. P. 109-128. 306. Loewus F.A. // The biochemistry of Plants: In 8 vol. - N.Y. a. o., 1980. Vol. 3.

Ch. 3. P. 77-99. 307. Loewus F.A., Baig M.M. // Methods Ensymol. 1970. Vol. 18. P. 22-29. 308. Loewus F.A., Jang R. // Biochim. et biophys. Acta. 1957. Vol. 23. N 1. P. 205-206. 309. Loewus F.A., Jang R. // J. Biol. Chem. 1958. Vol. 232. N 1. P. 505-519, 521-532. 310. Loweus F.A., Jang R., Seegmiller C.G. // J. Biol. Chem. 1958. Vol. 232. N 1. P.

533-541. 311. Loewus F.A., Finkle B.I., Jang R. // Biochim. et biophys. acta. 1958. Vol. 30. N 3.

P.629-635. 312. Loewus F.A., Jang R., Seegmiller C.G. // J. Biol. Chem. 1956. Vol. 222. N 2. P.

649-664. 313. Luger H. // Protoplasma. 1954. Vol. 44. N 2. P. 212-238. 314. Lyman H., Kaufman L. // 5th Int. Congr. Photosynth., Halkidiki, 1980. Abstr. S. L.,

s. a., P. 355. 315. Makovkova O., Sindelar L. // Biol. plant. Acad. Sci. bohemosl. 1975. T. 17. N 5.

S.329-334. 316. Makower R.U. // Plant Physiol. 1964. Vol. 39. N 4. P. 520-522. 317. Malavolta E., Leme I., Gurgel I.T.A., Sobro I.S. // Nature. 1956. Vol. 178. N 4530.

P. 424. 318. Malipiero U., Ruffner H.P., Rast D.M. // J. Plant Physiol. 1987. Vol. 129. N 1-2.

P.33-40. 319. Mancinelli A.L., Ku (Thi) P.K., Susinno R. // Photochem. Photobiol. 1974. Vol. 20.

P. 71-79. 320. Mancinelli A.L., Yang Chia-Ping, Lindquist P., Anderson O.R., Rabino I. // Plant

Physiol. 1975. Vol. 55. N 2. P. 251-257. 321. Mancinelli A.L., Yang Chia-Ping H., Rabino I., Kuzmanoff K.M. // Plant Physiol.

1976. Vol. 58. N 2. P. 214-217. 322. Mao Liang // Acta nutr. sinica. 1957. Vol. 2. N 3. P. 206-210. 323. Mapson L.W. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1961. Vol. 92. N 1. P. 21-35. 324. Mapson L.W. // Biochem. J. 1962. Vol. 85. N 2. P. 360-369. 325. Mapson L.W. // Phytochemistry. 1964. Vol. 3. N 3. P. 429-445. 326. Mapson L.W., Burton W.G. // Biochem. J. 1962. Vol. 82. N 1. P. 19-25. 327. Mapson L.W., Isherwood F.A. // Biochem J. 1956. Vol. 64. N 1. P. 13-22. 328. Mapson L.W., Moustafa E.M. // Biochem. J. 1956. Vol. 62. N 2. P. 248-259. 329. Mapson L.W., Swain T. // Phytochemistry. 1966. Vol. 5. N 5. P. 829-853. 330. Di Marco G., D'Ambrosio N., Giardi M.T., Massacci A., Tricoli D. // Photosynth.

Res. 1989. Vol. 21. N 2. P. 117-122. 331. Maroc J., Garnier J. // Plant and Cell Physiol. 1979. Vol. 20. N 6. P. 1029-1040. 332. Marre E., Arrigoni O. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur.

1955. Vol. 19. N 5. P. 320-324. 333. Marre E., Arrigoni O. // Biochim. et biophys. acta. 1958. Vol. 30. N 3. P. 453-457.

118

334. Marre E., Landi G. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1956. Vol. 20. N 1. P. 77 - 82.

335. Marre E., Arrigoni O., Rossi G. // Biochim. et biophys. acta. 1959. Vol. 36. N 1. P.56-64.

336. Marre E., Laudi G., Arrigoni O. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1955 (1956) . Vol. 19. N 6. P. 460-465.

337. Martinez-Cayuela M., Rodriguez-Vico F., Faus M.J., Gil A. // J. Plant Physiol. 1989. Vol. 133. N 6. P. 660-663.

338. Mathew T., Dave J.C., Gaur B.K. // Z. Pflanzenphysiol. 1978. Vol. 90. N 5. P. 391-396.

339. Mehner H., Franke W. // Planta. 1960. Bd. 54. N 6. S. 604-610. 340. Mertz D. // Plant Physiol. 1964. Vol. 39. N 3. P. 398-401. 341. Ming-Ching Yu C., Brand J.J. // Biochim. et biophys. acta. 1980. Vol. 591. N 2. P.

483-487. 342. Mirimanoff M.A. // Compt. Rend. Acad. Sci. 1938. Vol. 206. N 766. P. 1038-1040. 343. Mitsui A., Ohta T. // Plant and Cell Physiol. 1961. Vol. 2. N 1. P. 31-34. 344. Mitsui A., Oi Y. // Plant and Cell Physiol. 1961. Vol. 2. N 2. P. 99-104. 345. Moller J., Poucke M. // Phytochemistry. 1970. Vol. 9. N 9. P. 1803-1805. 346. Morimura Y., Aoki J., Aimi R. // Cэйбуцу конке mecэцу, Environ. Contr. Biol.

1982. Vol. 20. N 2-3. P. 53-56. 347. Naik M.S., Nicholas J.D. // Plant Cell Repts. 1986. Vol. 5. N 4. P. 259-261. 348. Nakatani M. // Bull. Agric. Chem. Soc. Japan. 1958. Vol. 22. N 4. P. 261-267. 349. Nasrulhag-Boyce A., Jones O.T.G. // Phytochemistry. 1981. Vol. 20. N 6. P. 1197-

1199. 350. Nath M.C., Belkhode M.L. // Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med. 1958. Vol. 99. N 2. P.

544-546. 351. Niva, Katajama // Japan J. Nutrition. 1955. Vol. 12. N 5-6. P. 44-46. 352. Noor S.M., Ehrenberg L., Naslund M. // Environ. and Exp. Bot. 1980. Vol. 20. N 4.

P. 379-387. 353. Oelmuller R., Mohr H. // Plant, Cell and Environ. 1985. Vol. 8. N 1. P. 27-31. 354. Olsen L.F., Cox R.P. // Eur. J. Biochem. 1979. Vol. 102. N 1. P. 139-145. 355. Olsen L.F., Cox R.P., Barber J. // FEBS Lett. 1980. Vol. 122. N 1. P. 13-16. 356. Ornstein L. // Enzyme Analysis. Canalco. 1963. P. 8. 357. Palmieri S., Giovinazzi F. // Physiol. plant. 1982. Vol. 56. N 1. P. 1-5. 358. Pazurkiewicz-Kocot K. // Pr. nauk. USL. Katowicach: Acta biol. 1984. N 16. S. 96-

103. 359. Penel C., Greppin H. // Saussurea. 1975. N 6. P. 287-291. 360. Peter K., Mohr H. // Z. Naturforsch. 1974. 29C. N 5-6. P. 222-228. 361. Pihakaski S., Pihakaski K. // J. Exp. Bot. 1978. Vol. 29. N 113. P. 1363-1369. 362. Pirson A., Zimmermann M.H. Encyclopedia of Plant Physiology. Berlin, Heidelberg

New York, Tokyo, 1985. Vol. 18. 522 p. 363. Pospisilova I., Toul V. // Vedec. prace Vyzkumn. ustavu zelinar. Olomouci. 1963.

N 2. S. 119-136. 364. Poucke M., Barthe F., Mohr H. // Naturwissenschaften. 1969. Vol. 56. P. 417. 365. Prabha C., Bharti S. // Indian. J. Plant Physiol. 1980. Vol. 23. N 3. P. 317-318. 366. Provasoli L., Hutner S.H., Schatz A. // Proc. Soc. Exp. Biol. 1948. Vol. 69. P. 279-

282. 367. Quetier F., Lejeune B. // C. R. Acad. agr. France. 1982. T. 68. N 11. P. 826-833.

119

368. Rao J.V.S., Rao G.R., Krishna C.M., Rao G.G. // Comp. Physiol. Ecol. 1979. Vol. 4. N 4. P. 243-245.

369. Rathore H.S., Chauhan R.A.S., Shukla R.M. // Indian. J. Exp. Biol. 1981. Vol. 19. N 3. P. 289-290.

370. Rau W., Schrott E.L. // Photochem. and Photobiol. 1979. Vol. 30. N 6. P. 755-765. 371. Ray S.N. // Biochem. J. 1934. Vol. 28. N 3. P. 996-1003. 372. Recalde L., Blesa A.C. // An. edafol. y agrobiol. 1961. Vol. 20. N 3. P. 119-128. 373. Reddy K.P., Subhani S.M., Khan P.A., Kumar K.B. // Plant and Cell Physiol. 1985.

Vol. 26. N 6. P. 987-994. 374. Reid M. // Amer. J. Bot. 1938. Vol. 25. N 11. P. 701-711. 375. Reid M. // Science. 1939. Vol. 89. N 2321. P. 587. 376. Renger G. // Biochim. et biophys. acta. 1979. Vol. 547. N l. P. 103-116. 377. Rode H.R. // Planta. 1961. Vol. 57. N 2. P. 138-155. 378. Rudolph E., Bukatsch F. // Planta. 1966. Bd. 69. N 2. S. 124-134 379. Ruge U. // Naturwissenschaften. 1957. Bd. 44. N 1. S. 13-14. 380. Ruyters G. Blue Light Effects in Biological Systems. Berlin e. a., 1984. S. 283-301. 381. Saito K., Kasai Z. // Plant and Cell Physiol. 1982. Vol. 32. N 3. P. 499-507. 382. Saito K., Kasai Z. // Plant Physiol. 1984. Vol. 76. N l. P. 170-174. 383. Saito K., Loewus F.A. // Plant and Cell Physiol. 1979. Vol. 20. N 8. P. 1481-1488. 384. Samuelsson G., Oquist G. // Plant and Cell Physiol. 1980. Vol. 21. N 3. P. 445-454. 385. Sandan T. // Bot. Mag. Tokyo. 1958. Vol. 71. N 838. P. 159-163. 386. Sandmann G., Boger P. // Planta. 1980. Vol. 147. N 4. P. 330-334. 387. Saric M.R., Krstic B., Milivojevic D. // 5th Int. Congr. Photosynth. Halkidiki, 1980.

Abstr. S. L., s. a. P. 498. 388. Sastry K., Sivarama P.S. // Biochem. J. 1956. Vol. 62. N 3. P. 451-455. 389. Savaprakasam K., Soumini Rajagopalan C.K., Vidhyasekaran P. // Madras Aqr. J.

1974. Vol. 61. N 3-4. P. 86-87. 390. Schmorl K. // Starke. 1957 (1958) . Bd. 9. N 12. S. 250-252. 391. Schopfer P. // Planta. 1966. Bd. 69. N 2. S. 158-177. 392. Schopfer P. // Planta. 1967. Bd. 74. N 3. S. 210-227. 393. Schreven D.A. // Plant and Soil. 1956. Vol. 8. N 2. P. 87-94. 394. Schwarz H., Schneider H.A.W. // J. Plant Physiol. 1985. Vol. 119. N 3. P. 281-284. 395. Schwerdt P.R. // Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 1975. Vol. 148. N 4. P. 1237-1243. 396. Severi A., Laudi G. // G. bot. ital. 1976. Vol. 110. N 3. P. 231-239. 397. Shaaltiel Y., Gressel J. // Pesticide Science and Biotechnology. Israel, 1987. P. 183-

186. 398. Shah C.K., Bhatt P.N., Suthar H.K. // Biol. Pflanz. 1974. Vol. 50. N 1. P. 121-135. 399. Sharma R., Riswal U.C. // Z. Pflanzenphysiol. 1976. Vol. 78. N 2. P. 169-172. 400. Sharma V.K., Singh R.P., Dua K.L. // Sci. and Cult. 1975. Vol. 41. N 8. P. 383-385. 401. Sharma R., Sopory S.K., Guha-Mukherjee S. // Plant Sci. Lett. 1976. Vol. 6. N 1.

P.69-75. 402. Shigeoka S. // Vitamins. 1981. Vol. 55. N 3. P. 127-140. 403. Shigeoka S., Nakano V., Kitaoka S. // Biochem. J. 1980. Vol. 186. N 1. P. 377-380. 404. Shigeoka S., Yokota A., Nakano Y., Kitaoka S. // Agric. Biol. Chem. 1979. Vol. 43.

N 10. P. 2053-2058. 405. Shizunori I. // Plant and Cell Physiol. 1961. Vol. 2. N 3. P. 291-299. 406. Singh B.B. // Radiat. Bot. 1974. Vol. 14. N 3. P. 195-199. 407. Skrabka H. // Acta. Soc. bot. Polon. 1965. T. 34. N 3. S. 479-490. 408. Skrabka H. // Acta. Soc. bot. Polon. 1965. T. 34. N 4. S. 713-718.

120

409. Smith I.K., Vierheller T.L., Thorne C.A. // Physiol. Plant. 1989. Vol. 77. N 3. P.449-456.

410. Soler A., Murcia L., Sabater F. // Rev. esp. fisiol. 1965. Vol. 24. N 4. P. 133-138. 411. Somerville C.R. // Annu. Rev. Plant Physiol. Vol. 37. Palo Alto, Calif., 1986. P.

467-507. 412. Srivastava G.C., Sirohi G.S. // Jndian. J. Exp. Biol. 1973. Vol. 11. N 5. P. 470-471. 413. Sugawara T. // Japanese Journal of botany. 1939. Vol. 10. N 1-2. P. 87-95. 414. Sugawara T. // Jap. J. Bot. 1939. Vol. 10. N 3. P. 171-185. 415. Sugawara T. // Japan. J. Bot. 1955. Vol. 15. N 1. P. 10-14. 416. Sugimura Y., Hoshino T., Karahashi A., Yoshizaki F., Shimokorijama M. // Proc.

Jap. Acad. 1983. Vol. B59. N 9. P. 300-303. 417. Suranyi D. // Acta. agron. Acad. Sci. hung. 1974. Vol. 23. N 1-2. P. 101-106. 418. Suzuki Yonezo, Ogiso Kazuko. // Physiol. plant. 1973. Vol. 29. N 2. P. 169-172. 419. Suzuki E., Ohnishi J., Kashiwagi M., Kanai R. // Plant and Cell Physiol. 1986.

Vol. 27. N 6. P. 1117-1125. 420. Tai Phang-C., Wallace B., Davis B.D. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. Vol. 75.

N 1. P. 275-279. 421. Tajiri Takashi // J. Jap. Soc. Food Sci. and Technol. 1981. Vol. 28. N 8. P. 430-436. 422. Takabe T., Niwa S., Ishikawa H., Miyakawa M. // J. Biochem. 1980. Vol. 87. N 1.

P.111-115. 423. Takaki M., Sartori P.A.A. // Arg. biol. e technol. 1987. Vol. 30. N 3. P. 431-435. 424. Tayal M.S. // J. Indian Bot. Soc. 1972. Vol. 51. N 3-4. P. 223-226. 425. Teruhiro T., Satsuki N., Hiroshi I., Masako M. // J. Biochem. 1980. Vol. 87. N l.

P.111-115. 426. Tewary B.K., Mookerjee A. // Indian J. Plant Physiol. 1982. Vol. 25. N 3. P. 258-

265. 427. Thangamani A., Sarma P.S. // J. Scient. and Industr. Res. 1956. Vol. 15. N 7. P. 157-

160. 428. Tognoli L., Marre E. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e. natur.

1959. Vol. 26. N 2. P. 278-283. 429. Tommasi F., De Gara L., Liso R., Arrigoni O. // Boll. Soc. ital. biol. sper. 1987.

Vol. 63. N 9. P. 779-786. 430. Tomma F., De Gara L., Liso R., Arrigoni O. // J. Plant Physiol. 1990. Vol. 135. N 6.

P. 766-768. 431. Tonzig S., Trezzi F. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1954.

T. 16. N 4. P. 434-443. 432. Tonzig S., Trezzi F. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1954

(1955) . T. 17. N 6. P. 324-331. 433. Tonzig S., Trezzi F. // Rapp. et communs. Nuitieme Congr. internat. bot., Paris.

1954. Sec. 11-12. P. 157-158. 434. Trezzi F. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1956. Vol. 21.

N 3-4. P. 220-228. 435. Trezzi F. // Nuovo giorn. bot. ital. 1956. T. 63. N 2-3. P. 345-354. 436. Tua C., Marre E. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1960.

T. 28. N 6. P. 910-916. 437. Uzumi H., Tatsumi V., Murata T. // J. Jap. Soc. Food Sci. and Technol. 1984.

Vol. 31. N 11. P. 704-709.

121

438. Vallon O., Hoyer-Hansen G., Simpson D.J. // Carlsberg Res. Commun. 1987. Vol. 52. N 6. P. 405-421.

439. Van'Lelyvela L.J. // Agroplantae. 1975. Vol. 7. N 3. P. 45-50. 440. Vaughn K.C., Lax A.R., Duke S.O. // Physiol. plant. 1988. Vol. 72. N 3. P. 659-665. 441. Vicente C., Garcia I. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1981. Vol. 100. N 1.

P. 17-22. 442. Vidhyasekaran P., Sivaprakasam K., Padmanabhan D. // Labdev J. Sci. and Technol.

1972. Vol. B 10. N 3-4. P. 120-122. 443. Vittoria A. // Boll. Soc. ital. biol. sperim. 1955. Vol. 31. N 6. P. 601-605. 444. Vos N.I. // Voeding. 1957. Vol. 18. N 2. P. 133-142. 445. Wagner G., Loewus F.A. // Plant Physiol. 1974. Vol. 54. N 5. P. 784-787. 446. Wasichy R. // Scientia pharmac. 1958. Bd. 26. N 2. S. 100-103. 447. Whitmarsh J., Cramer W.A. // Biophys. J. 1979. Vol. 26. N 2. P. 223-234. 448. Williams M., Saito K., Loewus F.A. // Phytochemistry. 1979. Vol. 18. N 6. P. 953-

956. 449. Wonger B. V. // Radiat. Bot. 1973. Vol. 13. N 6. P. 375-379. 450. Yamafuji K., Nakamura G., Omura A., Soeda T., Yyotoku K. // Z. Krebsforsci.

1971. Vol. 76. N 11. P. 1-7. 451. Yamazaki I. // J. Biol. Chem. 1962. Vol. 237. N 1. P. 242-247. 452. Yamazaki I., Piette L.H. // Biochim. et Biophys. Acta. 1961. Vol. 50. N 1. P. 62-69. 453. Yang J.C., Loewus F.A. // Plant Physiol. 1975. Vol. 56. N 2. P. 283-285. 454. Zucker M. // Annual Review Plant Physiol. 1972. Vol. 23. P. 133-156. 455. Гинс В.К., Гусейнова Т.И., Гамбарова Н.Т. // Тез. докл. III съезда Всерос. общ-

ва физиологов растений. СПб., 1993. С. 532. 456. Кефели В.И. Физиологические основы конструирования габитуса растений.

М.: Наука, 1994. 269 с. 457. Матвеева Н.М., Срослова А.А. Тез. докл. III Междунар. конф. “Регуляторы

роста и развития растений”. М., 1995. С.190. 458. Polle A., Eiblmeier M. // Bot. Acta. 1995. Vol. 108. N 5. P. 403-466. 459. Polle A., Wieser Y., Havranek W.M. // Plant, Cell and Enviroment. 1995. Vol. 18.

P. 681-688. 460. Polle A. // Planta. 1996. Vol. 198. P. 253-262. 461. Schwanz P., Picon C., Vivin P. and oth. Plant Physiol. 1996. Vol. 110. P. 393-402.

122

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение ............................................................................................................... 3

Список сокращений .............................................................................................. 5

Глава 1. Кислоты и ферменты системы аскорбиновой кислоты ........................ 6

Глава 2. Физиологическая роль аскорбиновой кислоты в жизни автотрофных организмов ......................................................................

10

2.1. Участие аскорбиновой кислоты в энергетических процессах растений ................................................................................................

10

2.2. Влияние аскорбата на экспрессию генома, ферментативную активность, водный режим, ростовые и другие процессы .................

13

2.3. Защитная функция аскорбиновой кислоты ......................................... 16

Глава 3. Биосинтез аскорбиновой кислоты и ее дериватов ............................... 18 3.1. Субстраты для новообразования аскорбата ......................................... 18 3.2. Химизм биосинтеза ............................................................................... 26 3.3. Компартментация процесса биосинтеза аскорбиновой,

дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот ..............................

30

Глава 4. Действие полихроматического и монохроматического света на биосинтез кислот системы аскорбиновой кислоты .........................

38

4.1. Светозависимый синтез аскорбиновой кислоты в зеленых и этиолированных проростках .............................................................

38

4.2. Биосинтез аскорбиновой кислоты проростками с измененным соотношением зеленых и желтых пигментов .....................................

54

4.3. Исследование способности альбиносных проростков накапливать аскорбиновую кислоту на свету ..........................................................

55

4.4. Субклеточная локализация аскорбиновой кислоты и ее окисленных форм в связи с освещением .............................................

64

4.5. Возможные фоторецепторы светозависимого синтеза аскорбиновой кислоты .........................................................................

71

Глава 5. Альбиносные проростки как модель для исследования светозависимых процессов, не связанных с фотосинтезом ................

75

Глава 6. Образование аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот при ингибировании дыхания и отдельных его этапов .........................................................................

79

Глава 7. Фоторегуляция активности ферментов, окисляющих аскорбиновую кислоту ..........................................................................

85

Заключение ........................................................................................................... 101

Библиографический список ................................................................................. 104

Система аскорбиновой кислоты растений: Монография

Documents